KR101355809B1 - Composition for inducing a bone differentiation and method for enhancing a bone differentiation using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 줄기세포의 골세포 분화 유도시 분화 유도효과를 증가시키는 것으로 골 형성 단백질에서 유래하는 아미노산 서열로 이루어진 골분화 및 골형성 촉진용 합성 펩타이드 또는 그의 상동체, 상기 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골분화 유도용 조성물 또는 약학적 조성물, 이들을 포함하는 배지 조성물, 그리고 이를 이용한 골분화 증가방법에 관한 것으로, 본 발명의 줄기세포의 골분화 유도용 합성 펩타이드는 서열번호 1 내지 20의 아미노산 서열을 가지는 CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30에서 선택된 하나 이상의 펩타이드 또는 그의 상동체로 구성됨을 특징으로 한다.
상기와 같이 구성되는 본 발명의 줄기세포의 골분화 유도용 조성물은 특정한 서열을 가지는 골형성촉진용 합성 펩타이드를 제공하고 이들 합성 펩타이드는 줄기세포(MSC)의 골아 세포로 분화를 촉진하는데 현저한 효과가 있어 상기 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학조성물은 골다공증, 골결손질환 및/또는 골관절염의 치료에 우수한 효과가 있어, 종래 고가의 BMP를 대체할 수 있게 할 뿐 아니라, 이를 이용한 골분화 증가방법은 보다 용이하고 저렴하게 골분화를 유도할 수 있는 유용한 발명이다.The present invention is to increase the differentiation-inducing effect of inducing osteoblast differentiation of stem cells comprising a synthetic peptide or homologs thereof for promoting bone differentiation and bone formation consisting of amino acid sequences derived from bone-forming protein as an active ingredient The composition or the pharmaceutical composition for inducing bone differentiation, and a medium composition comprising the same, and a method for increasing bone differentiation using the same, the synthetic peptide for inducing bone differentiation of stem cells of the present invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 20 Branches are composed of one or more peptides or homologs selected from CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30 It is characterized by.
The composition for inducing osteogenic differentiation of the present invention constituted as described above provides a synthetic peptide for promoting bone formation having a specific sequence and the synthetic peptide has a remarkable effect in promoting the differentiation of stem cells (MSCs) into osteoblasts The pharmaceutical composition of the present invention comprising the synthetic peptide as an active ingredient is excellent in the treatment of osteoporosis, bone defect disease and / or osteoarthritis, and thus can replace the expensive BMP in the past, The increase method is a useful invention which can induce bone differentiation easily and inexpensively.
Description
본 발명은 줄기세포의 골분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 골분화 증가방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 줄기세포의 골세포 분화 유도시 분화 유도효과를 증가시키는 것으로 골 형성 단백질에서 유래하는 아미노산 서열로 이루어진 골분화 및 골형성 촉진용 합성 펩타이드 또는 그의 상동체, 상기 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골분화 유도용 조성물 또는 약학적 조성물, 이들을 포함하는 배지 조성물, 그리고 이를 이용한 골분화 증가방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for inducing osteogenic differentiation of stem cells and a method for increasing osteogenic differentiation using the same. More particularly, the present invention relates to a composition for inducing osteogenic differentiation of stem cells, A synthetic peptide or a homologue thereof for promoting bone differentiation and osteogenesis, a composition or a pharmaceutical composition for inducing bone differentiation comprising the synthetic peptide as an active ingredient, a medium composition containing the same, and a bone formation differentiation method using the same.
뼈를 구성하는 세포는 뼈의 항상성을 유지하는 골세포(osteocyte), 뼈를 형성하는 골모세포(osteoblast), 뼈를 흡수하는 파골세포(osteoclast), 그리고 뼈의 말단의 관절기능을 담당하는 연골세포(chondrocyte) 등이 있으며, 성장이 완료된 골(骨)에서도 해면골은 파골세포에 의해서 흡수되면 다른 표면에서는 골모세포에 의해서 새로운 골이 형성되면서 재형성되게 된다. 이러한 골형성과 골흡수의 균형이 깨어지면 골질환으로 진행되는데, 이러한 골질환으로는 골다공증(osteoporosis), 불유합(non-union) 골절, 골괴사증(osteonecrosis), 골연화증(osteomalacia), 골결손 등이 있으며, 이러한 골질환은 이제까지는 주로 골질환의 예방제 및/또는 치료제로서, 칼슘 제제, 에스트로겐 제제, 선택적 에스트로겐 수용체 조절약(SERM), 활성형 비타민 D3 제제, 비타민 K 제제, 이프리플라본 제제, 칼시토닌 제제, 비스포스포네이트 제제, 부갑상선 호르몬 제제, 단백 동화 호르몬 제제, 골형태 유도 인자(BMP), 또는 섬유아세포 증식 인자(FGF) 등이 임상적으로 사용되거나, 또는 임상 응용이 시도되어 왔으나, 이와 같이 다수의 약제가 사용되고 있음에도 불구하고, 골질환의 환자수는 해마다 증가되고 있는 실정이며, 따라서 이런 난치성 골 질환을 효율적으로 치료하기 위한 새로운 개념의 치료제 개발이 절실히 요구되고 있다. The cells that make up the bones are osteocytes that maintain the homeostasis of the bones, osteoblasts that form the bones, osteoclasts that absorb the bones, and cartilage cells that play the joint functions of the ends of the bones (chondrocyte), and in the bone that has been grown, the cancellous bone is absorbed by the osteoclasts, and on the other surface, the new bone is formed by the osteoblasts and is reformed. When the balance between bone formation and bone resorption is broken, the disease progresses to bone disease. Osteoporosis, non-union fracture, osteonecrosis, osteomalacia, bone defect, etc. In the past, such bone diseases are mainly preventive and / or therapeutic agents for bone diseases such as calcium preparations, estrogen preparations, selective estrogen receptor modulators (SERMs), active vitamin D3 preparations, vitamin K preparations, ifriflavone preparations, calcitonin preparations, Bisphosphonate preparations, parathyroid hormone preparations, anabolic hormone preparations, bone morphogenic inducer (BMP), or fibroblast proliferation factor (FGF) and the like have been clinically used, or clinical applications have been attempted, Despite being used, the number of patients with bone disease is increasing year by year, and thus the effectiveness of these intractable bone diseases The development of new therapeutic concepts for the treatment are urgently required.
골 질환에 대한 전통적인 치료법으로는 자가골 이식(autografting)과 동종골 이식(allografting) 그리고 인조골 이식(artificial bone grafting) 등이 있지만, 골 채취 부위의 감염, 혈종 등과 같은 합병증 유발(자가골이식), 공여자로부터의 질병 전염 가능성(동종골 이식), 근본적인 골 생성이 되지 않는(인조골 이식) 문제점을 가지고 있다. 따라서, 이런 단점을 해결하여 난치성 골질환을 치료하기 위한 조직공학적인 골형성 연구가 활발히 진행되고 있다. 조직공학에 의한 골조직의 형성을 위해서는 골생성을 유도하는 골아전구세포와 이런 세포들을 적당한 위치에서 증식 분화시킬 수 있는 지지체, 그리고 골조직 형성의 유도분화를 촉진하는 골유도 성장인자들이 필요하다.Traditional therapies for bone disease include autografting, allografting, and artificial bone grafting. However, complications such as infections at the site of bone harvesting, hematomas (autogenous bone graft) (Allograft), and a problem that does not result in fundamental bone formation (artificial bone graft). Therefore, studies on tissue engineering bone formation to treat refractory bone diseases have been actively researched. For the formation of bone tissue by tissue engineering, osteoprogenitor cells that induce bone formation, supporters capable of multiplying and differentiating these cells at appropriate positions, and bone-inducing growth factors promoting induction of bone formation are required.
이들 중 골 형성 단백질(Bone morphogenetic protein: BMP)은 형질전환성장인자(transforming growth factor: TGF) β-상과(superfamily)의 일원으로 조골세포 전구세포로부터 조골세포로의 분화를 촉진하고 생체 내(in vivo) 및 생체 외(in vitro) 모두에서 뼈 형성을 증가시키는 효과를 나타내는 것이 보고(Mol Biol Cell. 1999; 10: 3801-13, Bone. 2001; 28: 491-8 참고)되어 있으며, 특히 BMP-2 단백질은 골형성유도 단백질로 골형성을 촉진하는데 탁월한 효과가 있으나, 이러한 우수한 효과를 가지는 BMP는 만족할만한 효과를 나타내기 위해서는 짧은 반감기로 인해 다량이 필요하고 이로 인해 투여시 고가의 비용으로 인하여 많은 환자에게 쓰이지 못하고 있다는 단점이 있다.Bone morphogenetic protein (BMP), a member of the transforming growth factor (TGF) β-phase and superfamily, promotes differentiation from osteoblast progenitor cells to osteoblasts, in vivo) and is reported Biol (Mol both in vitro (in vitro) showing the effect of increasing bone formation, Cell 1999; 10:. 3801-13, Bone 2001; 28:. 491-8 and reference) are, in particular BMP -2 protein has an excellent effect in promoting bone formation by inducing bone formation, but a BMP having such excellent effects requires a large amount due to a short half-life in order to exhibit a satisfactory effect, and therefore, It has a disadvantage that it can not be used for many patients.
따라서, 이러한 단점을 해결하기 위해 다양한 연구가 시도되어 왔는데, 특히 공지된 BMP의 특정 부분 펩타이드 서열을 이용하므로 BMP와 같은 효과 또는 그 이상의 효과를 얻을 수 있는지에 대해 연구되어 왔으며 지속적으로 연구되어 지고 있는 실정이다. 이러한 골형성 촉진에 대한 연구로, 예를 들어, 대한민국 특허출원 제2007-0055211호는 "골형성 촉진 펩타이드를 함유하는 주입형 골재생재"라는 명칭으로, 골형성 촉진 펩타이드가 함유된 주입형 골재생재를 개시하고 있는데, 이 발명은 키토산, 알긴산, 실크피브로인, 프로필렌글리콜, 프로필렌글리콜 알긴산, 폴록사머, 황산 콘드로이틴 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 젤형성 기제에 서열번호 1 내지 서열번호 7 중 하나 이상의 아미노산 서열을 필수적으로 함유하는 골 형성 촉진 펩타이드가 결합 또는 혼합되어 있는 것을 특징으로 하는 주입형 골재생재에 대해 개시하고 있다. 여기서 사용한 골형성 촉진 펩타이드는 세포외 기질을 구성하는 단백질에서 활성부위의 아미노산 배열을 분리추출한 것으로, 상기 펩타이드는 가토의 bone sialoprotein1 (BSP1) 85-105위치의 아미노산 서열 YRLKRSKS(서열번호1), KMFHVSNAQYPGA(서열번호2), YRLKRSKSKMFHVSNAQYPGA(서열번호3), 사람의 bone sialoprotein I149-169 위치의 아미노산 서열 YGLRSKS (서열번호4), KKFRRPDIQYPDAT (서열번호5), YGLRSKSKKFRRPDIQYPDAT (서열번호6) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 필수적으로 함유하고, 사람의 bone sialoprotein I (Osteopontin) 150-177 위치의 아미노산 서열 GLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHM (서열번호 7)을 함유하는 것을 개시하고 있다.Therefore, various studies have been attempted to solve such shortcomings. Especially, it has been studied whether or not the effect of BMP or the like can be obtained by using a specific partial peptide sequence of known BMP, and it has been studied continuously It is true. For example, Korean Patent Application No. 2007-0055211, entitled " Injection Type Aggregate Biomaterial Containing Bone Formation Promoting Peptide ", discloses an implantable aggregate containing biodegradable peptide- Wherein the present invention relates to a gel forming agent selected from the group consisting of chitosan, alginic acid, silk fibroin, propylene glycol, propylene glycol alginic acid, poloxamer, chondroitin sulfate and combinations thereof. Wherein the bone formation promoting peptide essentially containing the above amino acid sequence is bound or mixed. The peptide used herein is an extract of the amino acid sequence of the active site in the protein constituting the extracellular matrix, and the peptide is the amino acid sequence YRLKRSKS (SEQ ID NO: 1) at the position of the bone sialoprotein 1 (BSP1) 85-105 of the rabbit, KMFHVSNAQYPGA (SEQ ID NO: 2), YRLKRSKSKMFHVSNAQYPGA (SEQ ID NO: 3), amino acid sequence of human bone sialoprotein I149-169, YGLRSKS (SEQ ID NO: 4), KKFRRPDIQYPDAT (SEQ ID NO: 5), YGLRSKSKKFRRPDIQYPDAT And contains the amino acid sequence GLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHM (SEQ ID NO: 7) of human bone sialoprotein I (Osteopontin) 150-177 position.
또 다른 발명으로는, 대한민국 특허출원 제2010-0018148호에서 "조골세포 분화능을 증진시키는 올리고펩타이드"라는 명칭으로, BMP-특이적 수용체에 대한 반응 특이성이 매우 높은 올리고펩타이드를 개발함으로써 조골세포 분화도 및 석회화도가 증가되어 개선된 골유착 및 골형성능을 가능하게 하기 위해, 조골세포 분화능을 증진시키는 올리고펩타이드로서 PEP7(서열번호 1), PEP71(서열번호 2), PEP72(서열번호 3), PEP73(서열번호 4), PEP74(서열번호 5), PEP75(서열번호 6) 및 PEP76(서열번호 7)로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 임플란트에 적용가능한 올리고펩타이드를 개시하고 있다.As another invention, Korean Patent Application No. 2010-0018148 entitled "Oligopeptide for Enhancing Osteoblast Differentiation Potency ", which has developed oligo peptide having a very high reaction specificity for BMP-specific receptor, PEP7 (SEQ ID NO: 1), PEP71 (SEQ ID NO: 2), PEP72 (SEQ ID NO: 3) and PEP73 (SEQ ID NO: 3) as oligopeptides for enhancing the osteoblast differentiation ability in order to increase the degree of calcification, SEQ ID NO: 4), PEP74 (SEQ ID NO: 5), PEP75 (SEQ ID NO: 6) and PEP76 (SEQ ID NO: 7).
또한, 상기한 특허출원된 발명들 외에, "Biomaterials 26 (2005) 5648-5657"에서는 P-15 펩타이드가 배아세포 부착의 고양에 의해 그리고 어팝토시스의 조절을 통해 세포 수 및 조직 구조를 조절할 수 있는 것과, 최근의 연구 결과가 비유기성 골 기질(ABM)/P-15 복합체가 골 재생을 촉진하기 위한 주입형 생체유사 기질로서 사용될 수 있다는 것을 제시한다( Hanks T, Atkinson BL . Comparison of cell viability on anorganic bone matrix with or without P-15 cell binding peptide . Biomaterials 2004;25(19):4831-6.) ( Nguyen H, Qian JJ , Bhatnagar RS , Li S. Enhanced cell attachment and osteoblastic activity by P-15 peptide - coated matrix in hydrogels . Biochem Biophys Res Commun 2003;311(1):179-86)고 개시하고 있으며, "Regulatory Peptides 142 (2007) 16-23"에서는 OGP 및 OGP(10-14)는 정상 및 골조소증 실험 동물에 투여될 때 골형성 및 해면골밀도를 증가하고 그리고 골절 치료를 고무하고, 그리고 골아세포 및 다른 골수의 기조직 세포의 배양에 있어서, OGP는 증식, 알카린 포스파타제 활성 및 매트릭스 무기질화를 조절한다( Bab I, Gazit D, Chorev M, Muhlrad A, Shteyer A, Greenberg Z, Namdar M, Kahn A. Histone H4 - related osteogenic growth peptide ( OGP ): a novelcirculating stimulator of osteoblastic activity . EMBO J 1992;11:1867-73.)는 것을 개시하고 있다.In addition to the above-mentioned patent applications, Biomaterials 26 (2005) 5648-5657 discloses that P-15 peptides can regulate cell number and tissue structure by enhancing embryonic cell adhesion and controlling apoptosis (ABM) / P-15 complex can be used as an injectable bioequivalent substrate to promote bone regeneration ( Hanks T, Atkinson & lt ; RTI ID = 0.0 & gt ; BL . Comparison of cell viability on anorganic bone matrix with or without P-15 cell binding peptide . Biomaterials 2004; 25 (19): 4831-6.) ( Nguyen H, Qian JJ , Bhatnagar RS , Li S. Enhanced cell attachment and osteoblastic activity by P-15 peptide - coated matrix in hydrogels . Biochem Biophys Res Commun. 2003; 311 (1): 179-86) . In Regulatory Peptides 142 (2007) 16-23, OGP and OGP (10-14) OgP regulates proliferation, alkaline phosphatase activity and matrix mineralization in increasing bone marrow and bone marrow density and in promoting fracture treatment and in the culture of osteoblast and other bone marrow stromal cells ( Bab I, Gazit D, Chorev M, Muhlrada , Shteyera , Greenberg Z, Namdar M, Kahn A. Histone H4 - related 오세제성 growth peptide ( OGP ): a novelcirculating stimulator of osteoblastic activity . EMBO J 1992; 11: 1867-73) .
또한, "Biomaterials 30 (2009) 3532-3541"에서는, OPD 펩타이드는 BMP-2로부터 동정되어 지고, 그리고 BMP 수용체에 친화성을 가지며, 이에 의해 골아세포 안으로 인간의 골수의 기조직 세포의 분화를 유도한다는 것을 개시하고 있으며, "J Korean Med Sci 2005; 20: 438-44"에서 Mundy 등은 먼저 스타틴류(statins)가 뼈에 동화작용의 효과를 가질 수 있는 것을 보여주는 증거를 보고하였고, 여기서 스타틴류는 설치류에서 유의성 있게 신생 골 형성을 자극하였다는 것을 개시하고 있으며, 또한 스타틴은 골아세포에서 지질합성 경로에 작용하고 그리고 골형성 단백질-2(BMP-2)의 발현을 증진한다는 것이 보고되어 있다 ( Mundy , G. R., Regulation of bone formation by bone morphogenetic proteins and other growth factors . Clin Orthop Relat Res (324), 24 (1996)). BMP-2 상향조절은 스타틴류의 골 형성 효과를 조정하는 것으로 여겨진다. 부가적으로, 스타틴류는 감소된 단백질 프레닐화를 이끄는, 정상의 골아세포 기능에 필수적인 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-코엔자임 A (HMG-CoA)의 저해를 통해 골아세포에서 비스포스포네이트의 동일한 업스트림 경로에 작용한다는 것을 보고되어 있다( Chen , P. Y. et al ., Simvastatin promotes osteoblast viability and differentiation via Ras / Smad / Erk / BMP -2 signaling pathway. Nutr Res 30 (3), 191.).
In addition, in "Biomaterials 30 (2009) 3532-3541 ", OPD peptides are identified from BMP-2 and have affinity for BMP receptors, thereby inducing the differentiation of human bone marrow stem cells into osteoblasts Mundy et al. In "J Korean Med Sci 2005; 20: 438-44" first reported evidence that statins can have an effect of assimilation on bone, where statins there is disclosed that enables significantly stimulated new bone formation in a rodent, and statins are reported to act on the lipid synthesis pathway in osteoblastic cells, and promote the expression of bone morphogenetic protein -2 (BMP-2) ( Mundy , GR, Regulation of bone formation by bone morphogenetic proteins and other growth factors . Clin Orthop Relat Res (324), 24 (1996)) . BMP-2 upregulation is thought to modulate the osteogenic effects of statins. Additionally, the statins inhibit the binding of bisphosphonates from osteoblasts through inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA), essential for normal osteoblastic function, leading to reduced protein prenylation. Have been reported to act on the same upstream pathway ( Chen , PY et al ., Simvastatin promotes osteoblast viability and differentiation via Ras / Smad / Erk / BMP- 2 signaling pathway. Nutr Res 30 (3), 191.).
상기한 바와 같이 종래의 골형성 메카니즘 및 이들 메카니즘에 작용하여 골형성에 효과적으로 기여하는 물질들에 대해 지속적으로 연구되어 왔으며 이들 연구 성과가 어느 정도 얻어지고 있으나, 상기한 특허발명 및 연구 보고서를 포함하는 종래의 기술은 아직까지 보다 효과적으로 골분화를 유도하고 그리고 저렴한 비용으로 제공할 수 있는 물질에 대한 연구가 필요한 실정이며, 따라서 본 발명자 등은 이러한 필요성에 부응하기 위해 예의 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.
As described above, the conventional bone formation mechanisms and materials that act on these mechanisms and contribute effectively to bone formation have been continuously studied and the results of these studies have been obtained to some extent. However, The present inventors have conducted intensive studies to fulfill this need, and as a result, they have completed the present invention as a result of intensive study to find out a substance that can induce bone differentiation and provide it at a low cost more effectively. .
따라서, 본 발명은 상기한 종래의 실정을 감안하여 된 것으로, 본 발명의 제일 목적은 줄기세포의 골세포 분화 유도시 분화 유도효과를 증가시키는 새로운 펩타이드를 보다 효과적이고 간단하게 제공할 수 있게 하기 위한 것이다.DISCLOSURE Technical Problem Accordingly, the present invention has been made keeping in mind the above problems occurring in the prior art, and it is a primary object of the present invention to provide a novel peptide for increasing the differentiation inducing effect upon induction of bone cell differentiation of stem cells, will be.
본 발명의 다른 목적은 BMP에서 유래하는 아미노산 서열로 이루어진 것으로 골형성 촉진에 효과적이며 경제성을 가지는 새로운 골형성 촉진용 합성 펩타이드를 제공하기 위한 것이다.Another object of the present invention is to provide a synthetic peptide for promoting bone formation, which is composed of an amino acid sequence derived from BMP, and which is effective for promoting bone formation and is economical.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 새로운 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물로 특히는 줄기세포의 골분화 유도에 효과적인 조성물을 제공하기 위한 것이다.It is still another object of the present invention to provide a composition comprising the novel synthetic peptide as an active ingredient, and in particular, a composition effective for inducing bone differentiation of stem cells.
본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포의 골분화 유도용 약학적 조성물 및 배지 조성물을 제공하고 그리고 이를 이용한 골분화 증가방법을 제공하기 위한 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition and a medium composition for inducing bone differentiation of stem cells and to provide a method for increasing bone differentiation using the same.
본 발명은 또한 상기한 명확한 목적 이외에 이러한 목적 및 본 명세서의 전반적인 기술로부터 이 분야의 통상인에 의해 용이하게 도출될 수 있는 다른 목적을 달성함을 그 목적으로 할 수 있다.
The present invention may also be directed to accomplish these and other objects, which can be easily derived by those skilled in the art from the overall description of the present specification, in addition to the above-mentioned and obvious objects.
상기한 본 발명의 목적들은, 비록 BMP-2의 골형성 특징이 보고되어져 있지만 BMP-2의 결정적인 수용체-결합 시퀀스 뿐만 아니라 이들의 골형성 영역은 여전히 완전히 밝혀지지 않고 있는 상태에서, 하기 본 발명에 따른 특정한 아미노산 시퀀스를 갖는 골형성촉진용 합성 펩타이드가 줄기세포(MSC)의 골아 세포로 분화를 촉진하는데 현저한 효과가 있음을 밝혀내고 상기 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학조성물이 골다공증, 골결손질환 및/또는 골관절염의 치료에 우수한 효과가 있음을 밝혀냄에 의해 달성되었다.
The above objects of the present invention are also achieved by the present invention, in a state in which not only the critical receptor-binding sequence of BMP-2 but also their osteogenic region is still completely unknown, although the bone formation characteristics of BMP- Has a remarkable effect in promoting the differentiation of osteoblasts of stem cells (MSC) having a specific amino acid sequence according to the present invention, and that the pharmaceutical composition of the present invention comprising the synthetic peptide as an active ingredient is effective for osteoporosis, A bone defect disease and / or an osteoarthritis of the present invention.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 줄기세포의 골분화 유도용 합성 펩타이드는:In order to accomplish the above object, the present invention provides a synthetic peptide for inducing bone differentiation of stem cells, comprising:
다음의 서열을 가지는 CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30에서 선택된 하나 이상의 펩타이드 또는 그의 상동체로 구성됨을 특징으로 한다:At least one peptide selected from CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30 It is characterized by its homology:
CP1: KWIVAYNK-NH2 CP1: KWIVAYNK-NH 2
CP2: DWIVAYNK-NH2 CP2: DWIVAYNK-NH 2
CP3: YGFGLYNK-NH2 CP3: YGFGLYNK-NH 2
CP4; KGFGLYNK -NH2 CP4; KGFGLYNK -NH 2
CP5: YGPGLYNK-NH2 CP5: YGPGLYNK-NH 2
CP6: YGFGLYGK-NH2 CP6: YGFGLYGK-NH 2
CP7: YVLALYNK-NH2 CP7: YVLALYNK-NH 2
CP8: YGGLYNK-NH2 CP8: YGGLYNK-NH 2
CP9: YGbALYNK-NH2 CP9: YGbALYNK-NH 2
CP10: YGFIYNK-NH2 CP10: YGFIYNK-NH 2
CP11: YGFIYW-NH2 CP11: YGFIYW-NH 2
CP16: WYGFYNK-NH2 CP16: WYGFYNK-NH 2
CP20: WYGFGLYNKW-NH2 CP20: WYGFGLYNKW-NH 2
CP22: DWYGFGLYNK-NH2 CP22: DWYGFGLYNK-NH 2
CP23: RYGFGGYW-NH2 CP23: RYGFGGYW-NH 2
CP25: RGYDFGYNK-NH2 CP25: RGYDFGYNK-NH 2
CP27: DYWF-βA-YH-NH2 CP27: DYWF-βA-YH-NH 2
CP28: KWF-βA-HGW-NH2 CP28: KWF-βA-HGW-NH 2
CP29: KWIVGFNR-NH2 CP29: KWIVGFNR-NH 2
CP30: KY-βA-βA-YNK-NH2 CP30: KY-βA-βA-YNK-NH 2
여기서, A는 Ala, G는 Gly, K는 Lys, V는 Val, I는 Ile, F는 Phe, Y는 Tyr, W는 Trp, S는 Ser, D는 Asp을 나타냄.
Where A is Ala, G is Gly, K is Lys, V is Val, I is Ile, F is Phe, Y is Tyr, W is Trp, S is Ser, and D is Asp.
본 발명의 다른 구성에 따르면, 상기 골분화 유도용 합성 펩타이드는 상기의 서열을 가지는 CP1, CP2, CP3, CP5, CP7, CP8, CP10, CP16, CP23, CP27 또는 CP30의 펩타이드임을 특징으로 한다.According to another configuration of the present invention, the osteogenic differentiation peptide is characterized in that the peptide of CP1, CP2, CP3, CP5, CP7, CP8, CP10, CP16, CP23, CP27 or CP30 having the above sequence.
본 발명의 또 다른 구성에 따르면, 상기 골분화 유도용 합성 펩타이드는 상기의 서열을 가지는 CP1, CP2, CP5, CP8, CP23, CP27 또는 CP30의 펩타이드임을 특징으로 한다.According to another configuration of the present invention, the osteogenic differentiation inducing peptide is characterized in that the peptide of the CP1, CP2, CP5, CP8, CP23, CP27 or CP30 having the above sequence.
본 발명의 또 다른 구성에 따르면, 상기 CP계열의 상동체는 모든 펩타이드의 N-, C-말단이 치환된 것을 포함한다.
According to another configuration of the present invention, the homolog of the CP series includes the N-, C-terminus of all the peptides are substituted.
상기 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 골분화 유도용 조성물은: To achieve these and other advantages and in accordance with the purpose of the present invention, as embodied and broadly described herein,
유효성분으로 상기의 서열을 가지는 CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30에서 선택된 하나 이상의 펩타이드 또는 그의 상동체와 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 포함함을 특징으로 한다.One selected from CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30 It is characterized in that it comprises a pharmaceutically acceptable excipient with the above peptides or homologs thereof.
본 발명의 다른 구성에 따르면, 상기 유효성분은 상기의 서열을 가지는 CP1, CP2, CP3, CP5, CP7, CP8, CP10, CP16, CP23, CP27 또는 CP30의 펩타이드임을 특징으로 한다.According to another configuration of the present invention, the active ingredient is characterized in that the peptide of CP1, CP2, CP3, CP5, CP7, CP8, CP10, CP16, CP23, CP27 or CP30 having the above sequence.
본 발명의 또 다른 구성에 따르면, 상기 유효성분은 상기의 서열을 가지는 CP1, CP2, CP8, CP23 또는 CP30의 펩타이드임을 특징으로 한다.
According to another configuration of the invention, the active ingredient is characterized in that the peptide of the CP1, CP2, CP8, CP23 or CP30 having the above sequence.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은: According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for preventing or treating osteoporosis comprising:
유효성분으로 상기의 서열을 가지는 CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30에서 선택된 하나 이상의 펩타이드 또는 그의 상동체와 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 포함함을 특징으로 한다.One selected from CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30 It is characterized in that it comprises a pharmaceutically acceptable excipient with the above peptides or homologs thereof.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 골결손질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은: According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for preventing or treating a bone defect disease comprising:
유효성분으로 상기의 서열을 가지는 CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30에서 선택된 하나 이상의 펩타이드 또는 그의 상동체와 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 포함함을 특징으로 한다. One selected from CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30 It is characterized in that it comprises a pharmaceutically acceptable excipient with the above peptides or homologs thereof.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 저인산효소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은: According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for preventing or treating hypophosphoremia, comprising:
유효성분으로 상기의 서열을 가지는 CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30에서 선택된 하나 이상의 펩타이드 또는 그의 상동체와 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 포함함을 특징으로 한다.One selected from CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30 It is characterized in that it comprises a pharmaceutically acceptable excipient with the above peptides or homologs thereof.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 베제트병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은: According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for preventing or treating veterinary medicine, comprising:
유효성분으로 상기의 서열을 가지는 CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30에서 선택된 하나 이상의 펩타이드 또는 그의 상동체와 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 포함함을 특징으로 한다.One selected from CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30 It is characterized in that it comprises a pharmaceutically acceptable excipient with the above peptides or homologs thereof.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대퇴골두무혈성 괴사증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은: According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for preventing or treating osteonecrosis of the femoral head comprising:
유효성분으로 상기의 서열을 가지는 CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30에서 선택된 하나 이상의 펩타이드 또는 그의 상동체와 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 포함함을 특징으로 한다.One selected from CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30 It is characterized in that it comprises a pharmaceutically acceptable excipient with the above peptides or homologs thereof.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은: Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoarthritis of the present invention for achieving the above another object is:
유효성분으로 상기의 서열을 가지는 CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30에서 선택된 하나 이상의 펩타이드 또는 그의 상동체와 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 포함함을 특징으로 한다.
One selected from CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30 It is characterized in that it comprises a pharmaceutically acceptable excipient with the above peptides or homologs thereof.
상기와 같이 구성되는 본 발명의 줄기세포의 골분화 유도용 조성물은 특정한 서열을 가지는 골형성촉진용 합성 펩타이드를 제공하고 이들 합성 펩타이드는 줄기세포(MSC)의 골아 세포로 분화를 촉진하는데 현저한 효과가 있어 상기 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학조성물은 골다공증, 골결손질환 및/또는 골관절염의 치료에 우수한 효과가 있어, 종래 고가의 BMP를 대체할 수 있게 할 뿐 아니라, 이를 이용한 골분화 증가방법은 보다 용이하고 저렴하게 골분화를 유도할 수 있는 유용한 발명이다.
The composition for inducing osteogenic differentiation of the present invention constituted as described above provides a synthetic peptide for promoting bone formation having a specific sequence and the synthetic peptide has a remarkable effect in promoting the differentiation of stem cells (MSCs) into osteoblasts The pharmaceutical composition of the present invention comprising the synthetic peptide as an active ingredient is excellent in the treatment of osteoporosis, bone defect disease and / or osteoarthritis, and thus can replace the expensive BMP in the past, The increase method is a useful invention which can induce bone differentiation easily and inexpensively.
도 1은 골 형성 세포의 분화 초기 마커인 ALP(alkaline phosphatase)를 이용하여 본 발명에 따라 얻어진 합성 펩타이드 CP5, CP23 및 CP27의 줄기세포 골분화 효과를 염색 시험한 사진으로, 여기서 10F는 줄기세포 배양 배지(음성대조군)이고, ODM은 골분화 배지(양성대조군)이고, ODM + CP5, ODM + CP23 및 ODM + CP27는 각각 CP5, CP23 및 CP27 펩타이드가 첨가된 골분화 배지(시험군)이고,
도 2는 본 발명에 따른 합성 펩타이드의 줄기세포 골분화 효과를 비교하기 위하여 조골세포의 초기 분화 마커인 ALP 활성을 비교하여 나타내는 그래프로, 여기서, "10F"은 음성 대조군이고, TGF-beta, OGP 및 BOPD는 골재생이 알려져 있는 물질이고,
도 3은 본 발명에 따른 합성 펩타이드의 줄기세포 골분화 효과를 확인하기 위해서 세포외 기질의 석회화 정도를 평가하기 위한 AIRS(Alizarin Red S) 염색법의 결과를 나타낸 그래프로, 여기서, "10F"은 음성 대조군이고, TGF-beta, OGP 및 BOPD는 골재생이 알려져 있는 물질이고,
도 4는 본 발명에 따른 합성 펩타이드 물질의 유효성을 평가하기 위해 동물 두개골을 이용하여 파라핀 블록을 5um 두께로 잘라 조직 표본을 얻은 후 신생골 형성 정도를 파악하기 위해 각각 H&E(hematoxylin and eosin) 염색을 한 사진이고,
도 5는 새로 형성된 신생골의 면적을 각각 측정한 후 음성대조군(10% DMEM)을 기준으로 백분율로 계산한 결과를 나타낸 큰 막대그래프이다.1 is a photograph of staining test of the stem cell bone differentiation effect of the synthetic peptides CP5, CP23 and CP27 obtained according to the present invention using ALP (alkaline phosphatase), an early marker of differentiation of bone forming cells, wherein 10F is a stem cell culture and medium (negative control), and, ODM is bone differentiation medium (positive control) and, ODM + CP5, ODM + CP23 and ODM + CP27 are respectively CP5, CP23 and the bone differentiation medium (test group) was added CP27 peptide,
Figure 2 is a graph showing the comparison of ALP activity, an early differentiation marker of osteoblasts, to compare the stem cell osteogenic differentiation effect of the synthetic peptide according to the present invention, where "10F" is a negative control, TGF-beta, OGP And BOPD is a substance for which bone regeneration is known,
Figure 3 is a graph showing the results of AIRS (Alizarin Red S) staining to evaluate the degree of calcification of the extracellular matrix in order to confirm the stem cell bone differentiation effect of the synthetic peptide according to the present invention, where "10F" is negative Control, TGF-beta, OGP and BOPD are known to be bone regeneration,
Figure 4 is a paraffin block cut to 5um thickness using an animal skull in order to evaluate the effectiveness of the synthetic peptide material according to the present invention was obtained by staining H & E (hematoxylin and eosin) to determine the degree of new bone formation, respectively It is a photograph,
Figure 5 is a large bar graph showing the results of calculating the percentage of the new control of the newly formed new bone area after the negative control (10% DMEM).
이하, 본 발명을 첨부도면을 참고로 바람직한 실시형태에 의해 보다 자세하게 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of preferred embodiments with reference to the accompanying drawings.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 본 발명에 따른 줄기세포의 골분화 유도용 조성물을 제공하기 위해 본 발명은 먼저, 1) 줄기세포의 골분화 유도시 사용되는 배양 조건을 확립하고, 2) 상기 배양 조건에서 CP5 등을 첨가하여 효율적인 골분화 유도효과를 얻었다.According to a preferred embodiment of the present invention, in order to provide a composition for inducing bone differentiation of stem cells according to the present invention, the present invention firstly, 1) to establish the culture conditions used for inducing bone differentiation of stem cells, 2) CP5 and the like were added under the above culture conditions to obtain an effective bone differentiation inducing effect.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 CP1 내지 CP30으로 나타내어 지는 올리고펩타이드는 이 기술분야에서 당업자들에게 알려진 방법에 따라 쉽게 합성이 가능한 것으로, 본 발명의 하기 실시예에서 사용된 올리고 펩타이드는 고체상 합성기를 이용하여 합성된 것을 사용하였다.According to another preferred embodiment of the present invention, the oligopeptides represented by CP1 to CP30 can be easily synthesized according to methods known to those skilled in the art, the oligopeptides used in the following examples of the present invention What was synthesized using the synthesizer was used.
하기 실시예에서는 대조군 대비 본 발명의 CP5, CP23 및 CP27의 골분화 효과에 대한 실험을 실시하고 그 결과를 개시하였다. In the following examples, experiments on the bone differentiation effect of CP5, CP23 and CP27 of the present invention compared to the control group and the results are disclosed.
줄기세포(MSC)의 골분화 유도시 본 발명에 따른 CP5, CP23 및 CP27를 첨가한 경유에 대조군에 비해 유의성 있는 결과를 얻을 수 있었다.Induced bone differentiation of stem cells (MSC) was able to obtain a significant result compared to the control via the addition of CP5, CP23 and CP27 according to the present invention.
상기 본 발명에 따른 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물을 함유하는 식품, 식품첨가제 또는 의약 조성물을 제조할 수 있으며, 그 제조에는 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 또한, 상기 본 발명에 따른 조성물은 단독으로 또는 골다공증 치료제로서의 효능 증진을 위해 다른 약학적 활성성분과 조합하여 투여될 수 있다. The food, food additive or medicinal composition containing the composition for preventing or treating osteoporosis according to the present invention can be prepared, and the preparation can further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used. In addition, the composition according to the present invention may be administered alone or in combination with other pharmacologically active ingredients for enhancing the efficacy as a therapeutic agent for osteoporosis.
상기 본 발명에 따른 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물은 식품, 식품첨가제 또는 의약 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 더 포함할 수 있다.The composition for preventing or treating osteoporosis according to the present invention may be a carrier, an excipient and a diluent which may be contained in a food, a food additive or a pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch , Hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropylmethyl cellulose, hydroxypropylmethyl cellulose, hydroxypropylmethyl cellulose, hydroxypropylmethyl cellulose, hydroxypropylmethyl cellulose, hydroxypropylmethylcellulose, As shown in FIG.
또 다른 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 현탁제, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형물로 사용될 수 있다. 또한, 상기 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 의약 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 이의 제형은 사용 방법에 따라 달라질 수 있으므로 상기 기술한 바에 한정되는 것은 아니다.According to another embodiment, the composition for preventing or treating osteoporosis according to the present invention may be used as oral formulations such as powders, granules, tablets, suspensions, emulsions and syrups according to a conventional method. In addition, the pharmaceutical composition containing the composition of the present invention as an active ingredient can be administered orally or parenterally, and the dosage form thereof may be varied depending on the method of use, and thus is not limited thereto.
상기 경구형 제형은 경구 투여를 위한 고형제제와 액상제제를 포함하는 의미이며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 포함하여 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수도 있다.
The oral formulations are meant to include both solid and liquid formulations for oral administration and solid formulations for oral administration may include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, At least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used. Examples of liquid formulations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweetening agents, It is possible.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범주가 이들 실시예에 한정되는 것이 아님은 물론이다.
Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, of course, the scope of the present invention is not limited to these Examples.
실시예Example 1. 줄기세포의 1. Stem Cells 골분화능Bone vertebrae 평가: 염색시험 평가 Evaluation: Dyeing test evaluation
본 연구에서는 골 형성 세포의 석회화능 염색시험법인 ARS(Alizarin Red S) 염색법을 이용하여 본 발명에 따라 얻어진 합성 올리고펩타이드가 골 형성 세포의 분화에 미치는 영향을 관찰하였다.In this study, the effects of synthetic oligopeptides obtained according to the present invention on the differentiation of bone forming cells were examined using ARS (Alizarin Red S) staining.
골 형성 세포의 분화능을 비교하기 위해 양성 대조군으로 아스코빅 산(ascorbic acid), β-글리세로포스페이트(Glycerophosphate), 덱사메타손(Dexamethasone)을 포함한 분화용 배지 ODM(osteogenic differentiation medium)을 사용하였고(Develop . Grewth Differ . 50,553-564, 2008.), 음성 대조군으로는 10% FBS(10% FBS가 포함된 줄기세포 배양용 배지)를 사용하였다. 실험군은 각각의 배지에 본 발명에 따른 합성 펩타이드를 첨가하여 진행하였다. 세포배양용 플레이트(12 well culture plate)에 MSC를 웰(well) 당 1×104 세포씩 분주하여 37℃에서, CO2 배양기에 배양하였다. 배양 3일마다 신선한 배지로 교체하였으며 배양 14일째 ALP 및 ARS 염색법으로 골분화능을 비교하였으며, 그 결과를 도 1에 나타냈다.Osteogenic differentiation medium containing ascorbic acid, β-glycerophosphate and Dexamethasone was used as a positive control to compare the differentiation ability of osteogenic cells ( Develop . Grewth Differ . 50,553-564, 2008. ) and 10% FBS (culture medium for stem cell culture containing 10% FBS) was used as a negative control group. The experimental group was prepared by adding the synthetic peptide according to the present invention to each medium. MSCs were injected into 12 well culture plates at 1 × 10 4 cells per well and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. Every 3 days of culture, fresh medium was replaced and bone differentiation capacity was compared by ALP and ARS staining on
도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 연구에서 본 발명에 따른 합성 펩타이드 CP5, CP23 및 CP27은 양성 대조군인 ODM과 비교시 이들을 첨가한 각 실험군에서 ALP 및 ARS 염색이 월등히 염색되었음을 알 수 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 합성 펩타이드는 줄기세포의 조골세포로의 분화능을 현저하게 개선함을 확인할 수 있다.
As can be seen in Figure 1, the synthetic peptides CP5, CP23 and CP27 according to the present invention in the present study it can be seen that the ALP and ARS staining was significantly stained in each experimental group to which they were added compared to the positive control ODM. Thus, it can be confirmed that the synthetic peptide according to the present invention remarkably improves the ability to differentiate stem cells into osteoblasts.
실시예Example 2. 합성 2. Synthesis 펩타이드Peptides 물질의 유효성 평가: 초기 Assessment of substance effectiveness: Initial 세포분화능Cell division ability 평가(골수 줄기세포의 Evaluation of Bone Marrow Stem Cells 골분화능Bone vertebrae 평가) evaluation)
본 연구는 조골세포의 초기 분화 마커인 ALP(alkaline phosphatase) 활성을 비교하여 본 발명에 따른 합성 올리고펩타이드가 조골세포의 분화에 미치는 영향을 관찰하기 위한 것이다.The purpose of this study is to observe the effect of synthetic oligopeptide according to the present invention on osteoblast differentiation by comparing ALP (alkaline phosphatase) activity, an early differentiation marker of osteoblasts.
본 발명에 따른 합성 펩타이드의 조골세포 분화능을 비교하기 위하여, MSC를 96 웰 플레이트에 4×103/웰 세포씩 분주하여 1일간 배양한 후 분화용 배지 ODM에 본 발명의 합성 펩타이드 CP1 내지 CP30, 양성대조군인 TGF-베타, OGP 및 BOPD를 각각 처리하여 37℃, CO2 배양기에 배양하였다. 배지는 3일마다 교체하였으며 배양 4일째 ALP 활성을 측정하여 그 결과는 도 2에 나타냈다.In order to compare the osteoblast differentiation ability of the synthetic peptides according to the present invention, MSCs were cultured in 96 well plates by 4 × 10 3 / well cells and cultured for 1 day, followed by the synthesis peptides CP1 to CP30 of the present invention in differentiation medium ODM, Positive control TGF-beta, OGP and BOPD were respectively treated and cultured in 37 ℃, CO 2 incubator. The medium was changed every 3 days and ALP activity was measured on
이 연구에서 본 발명에 따른 합성 펩타이드는 종래 TGF-베타, OGP 및 BOPD에 비해 적어도 그와 동등하거나 약 30%까지 증가된 ALP 활성을 나타냄으로써, 본 발명에 따른 합성 펩타이드는 조골세포의 분화능을 현저히 개선할 수 있음을 확인할 수 있다.
In this study, the synthetic peptides according to the present invention exhibited ALP activity increased by at least equivalent to about 30% or more compared to conventional TGF-beta, OGP and BOPD, whereby the synthetic peptides according to the present invention significantly increased the differentiation capacity of osteoblasts. It can be seen that it can be improved.
실시예Example 3. 합성 3. Synthesis 펩타이드Peptides 물질의 유효성 평가: Evaluation of the efficacy of the substance: 석회화능Calcification ability 평가 evaluation
본 발명에 따른 합성 펩타이드에 의한 조골세포의 골분화가 잘 진행되었는지를 확인하기 위하여 세포외 기질의 석회화 정도를 본 연구에서 관찰하였다. The degree of calcification of the extracellular matrix was observed in this study to confirm whether osteoblast osteoblastization progressed well by synthetic peptides according to the present invention.
석회화능 평가를 위한 배양 조건은 상기 실시예 2와 동일하며 배양 14일째 ARS 염색법으로 석회화 정도를 비교 평가하여 그 결과를 도 3에 나타냈다. 실험 결과 배양 14일째에서 본 발명에 따른 합성 펩타이드 CP5의 석회화능은 양성대조군에 비해 상당히 증가하였으며, 기타의 CP계열의 펩티드도 유의적으로 높았다. 이들 결과로부터 본 발명에 따른 합성 올리고펩타이드에 의한 골분화가 개선된 양태로 진행될 수 있음을 확인할 수 있다.
The culture conditions for evaluating the calcification ability were the same as in Example 2, and the degree of calcification was evaluated by ARS staining at 14 days of culture, and the results are shown in FIG. As a result, on
실시예Example 4. 합성 4. Synthesis 펩타이드Peptides 물질의 유효성 평가: 동물 두개골이용 효능 평가 Evaluation of the efficacy of substances: Evaluation of animal skull utilization efficacy
본 실시예에서는 본 발명에 따른 합성 펩타이드의 신생골 형성의 효능을 평가하기 위하여 생후 4일된 마우스의 두개골을 이용한 생체외(ex vitro) 골생성 효능 평가 실험을 하였다.In this example, ex vivo ( ex ex) using the skull of 4 days old mice to evaluate the efficacy of new bone formation of the synthetic peptides according to the present invention vitro ) were evaluated.
생체외 골생성 효능 평가를 위해, 생후 4일된 마우스의 두개골을 적출한 뒤 시상봉합(sagittal suture)을 기준으로 반으로 분리한다. 2조각으로 분리된 두개골을 10% FBS가 포함된 줄기세포 배양용 배지에서 약 15시간 동안 안정화시켰다. 안정화 완료 후 분화용 배지 ODM(osteogenic differentiation medium)에 CP5(1uM)와 CP10(0.01uM, 1uM)을 각각 첨가한 배지를 두개골에 넣어준다. 음성대조군으로는 10% FBS를 포함한 줄기세포 배양용 배지를 처리한 두개골을 사용하였고, 양성대조군으로는 분화용 배지(ODM)를 처리해준 두개골을 사용하였다. 배양기간 3일마다 신선한 배지로 교체해주었다. For evaluation of in vitro bone formation efficacy, the skull of a 4-day-old mouse is removed, and the half is separated based on the sagittal suture. The two-piece skulls were stabilized for about 15 hours in a culture medium for stem cell culture containing 10% FBS. After stabilization is complete, differentiation medium ODM (osteogenic differentiation medium) is added to the skull medium added CP5 (1uM) and CP10 (0.01uM, 1uM), respectively. As a negative control group, skulls treated with medium for stem cell culture containing 10% FBS were used, and skulls treated with differentiation medium (ODM) were used as a positive control group. The culture medium was replaced with fresh medium every 3 days.
14일 동안 배양 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액에 두개골 조직을 24시간 고정시킨다. 고정이 끝나면 10% EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) pH7.2~7.4 용액을 이용하여 24시간 동안 탈회과정을 거친다. 탈회과정이 끝나면 수돗물에 수세하고 에탄올을 이용한 탈수과정을 거치고, 파라핀 용액에 포매하고 블록을 만든다. 탈수와 포매과정은 조직 염색 처리기(tissue stain processor) 기계를 이용하였다. After 14 days of incubation, the cranial tissue is fixed in 4% paraformaldehyde solution for 24 hours. After the fixation, it is demineralized for 24 hours using 10% EDTA (pH 7.2-7.4) solution. After the demineralization process, the tap water is washed with water, dehydrated using ethanol, embedded in a paraffin solution, and a block is formed. The dehydration and embedding process was performed using a tissue stain processor machine.
파라핀 블록을 5um 두께로 잘라 조직 표본을 얻은 후 신생골 형성정도를 파악하기 위해 H&E(hematoxylin and eosin) 염색을 하였으며, 그 결과를 도 4에 나타냈다. 도 4에 도시된 H&E 염색에서 신생골은 붉은색으로 염색된 부분으로 신생골의 형성 정도를 파악할 수 있다. 실험 결과 양성대조군인 분화용 배지(ODM)에서 배양한 두개골 조직보다 본 발명에 따른 합성 펩타이드를 함께 처리해준 두개골 조직에서 골형성이 확연히 증가하는 것을 확인할 수 있다. 새로 형성된 신생골의 면적을 각각 측정한 후 그것을 음성대조군(10% DMEM)을 기준으로 백분율로 계산한 결과를 큰 막대그래프로 그리고 양성대조군(ODM)보다 증가한 신생골의 양의 백분율을 작은 파란색 막대 그래프로 하여 도 5에 나타냈다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 양성대조군(ODM)보다 본 발명에 따른 CP5, CP23 및 CP27은 신생골의 생성을 크게 증가함을 도 5을 통해 확인할 수 있다.
After cutting the paraffin block to a thickness of 5um to obtain a tissue specimen was stained with H & E (hematoxylin and eosin) to determine the degree of new bone formation, the results are shown in FIG. In the H & E staining shown in Figure 4, the new bone can be grasped the formation of the new bone as a portion stained in red. As a result of the experiment, it can be confirmed that bone formation is significantly increased in the skull tissue treated with the synthetic peptide according to the present invention, compared to the skull tissue cultured in the positive control group (ODM). Measure the area of newly formed new bone and calculate it as a percentage based on the negative control (10% DMEM) .The result is a large bar graph and a small blue bar graph showing the percentage of new bone that has increased over the positive control (ODM). 5 is shown. As can be seen in Figure 5, the positive control group (ODM) CP5, CP23 and CP27 according to the present invention can be confirmed through Figure 5 significantly increases the production of new bone.
상기 각 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 합성 올리고펩타이드 CP1 내지 CP30은 골재생을 유도하는 데 가장 많이 쓰이는 용액인 ODM과 비교하여 인산화효소의 활성증가를 보였다. 그리고, 종래의 골재생이 알려져 있는 물질인 BOPD, OGP와 비교하여 우수하게 증가된 결과를 보였다.As can be seen in each of the above examples, the synthetic oligopeptides CP1 to CP30 according to the present invention showed an increase in the activity of kinase compared to ODM, the solution most used to induce bone regeneration. In addition, compared to the conventional bone regeneration known material BOPD, OGP showed an excellent result.
골재생에 중요한 실험인 석회화능 평가에서도 활성증가의 결과를 보였으며, 그리고, 종래의 골재생이 알려져 있는 물질인 BOPD, OGP와 비교하여도 우수하게 증가된 결과를 보였다.In the evaluation of calcification ability, which is an important experiment for bone regeneration, the activity was increased, and compared with BOPD and OGP, which are known to be known as bone regeneration, the results were excellently increased.
그리고, 동물의 두개골을 이용한 생체외 신생골 형성 효능 평가 실험에서도 양성대조군인 줄기세포 분화배지(ODM)에서만 배양한 두개골 조직보다 CP계열의 경우 신생골의 면적이 우수하게 증가하는 결과를 보였다.In addition, in vitro evaluation of new bone formation efficacy using skulls of animals showed that the area of new bone increased in the CP series than the skull tissue cultured only in the stem cell differentiation medium (ODM), which is a positive control group.
따라서, 상기 결과로부터 상기 서열을 가지는 본 발명에 따른 합성 펩타이드 CP1 내지 CP30, 특히 CP5, CP 23 및 CP27은 줄기세포의 골세포 분화 유도에 효과적으로 작용하는 유용한 골분화 유도용 조성물을 형성할 수 있음을 알 수 있다.
Therefore, from the above results, the synthetic peptides CP1 to CP30 according to the present invention having the sequence, in particular CP5,
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Claims (17)
In CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP28, CP29, CP30 having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1-20 Synthetic peptide for inducing bone differentiation of stem cells, characterized in that consisting of one or more selected peptides.
The method according to claim 1, wherein the osteogenic differentiation peptide is CP1, CP2, CP3, CP5, having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 15, 17, 20, A synthetic peptide for inducing bone differentiation of stem cells, characterized in that the peptide of CP7, CP8, CP10, CP16, CP23, CP27 or CP30.
The method of claim 1, wherein the osteogenic differentiation peptide is a peptide of CP1, CP2, CP5, CP8, CP23, CP27 or CP30 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 5, 8, 15, 17 and 20 A synthetic peptide for inducing bone differentiation of stem cells.
CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP29 having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1-20 as an active ingredient , One or more peptides selected from CP30 and a pharmaceutically acceptable excipient comprising a composition for inducing bone differentiation.
The method of claim 4, wherein the peptide is CP1, CP2, CP5, CP8, CP23, CP27 or CP30 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 15, 17, 20 Composition for inducing bone differentiation, characterized in that the peptide.
CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP29 having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1-20 as an active ingredient A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoporosis, characterized in that it comprises one or more peptides selected from CP30 and a pharmaceutically acceptable excipient.
The method of claim 6, wherein the peptide is CP1, CP2, CP5, CP8, CP23, CP27 or CP30 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 15, 17, 20 Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoporosis, characterized in that the peptide.
CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP29 having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1-20 as an active ingredient A pharmaceutical composition for preventing or treating bone defect disease, comprising at least one peptide selected from CP30 and a pharmaceutically acceptable excipient.
The method of claim 8, wherein the peptide is CP1, CP2, CP5, CP8, CP23, CP27 or CP30 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 15, 17, 20 Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of bone defect diseases, characterized in that the peptide.
CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP29 having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1-20 as an active ingredient A pharmaceutical composition for preventing or treating hypophosphatase, characterized in that it comprises one or more peptides selected from CP30 and a pharmaceutically acceptable excipient.
The method of claim 10, wherein the peptide is CP1, CP2, CP5, CP8, CP23, CP27 or CP30 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 15, 17, 20 Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hypophosphatase, characterized in that the peptide.
CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP29 having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1-20 as an active ingredient , At least one peptide selected from CP30 and a pharmaceutically acceptable excipient.
The method of claim 12, wherein the peptide is CP1, CP2, CP5, CP8, CP23, CP27 or CP30 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 15, 17, 20 Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of Bejett disease, characterized in that the peptide.
CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP29 having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1-20 as an active ingredient A pharmaceutical composition for preventing or treating femoral head avascular necrosis, characterized in that it comprises a pharmaceutically acceptable excipient with at least one peptide selected from CP30.
The method of claim 14, wherein the peptide is CP1, CP2, CP5, CP8, CP23, CP27 or CP30 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 15, 17, 20 Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of femoral head avascular necrosis, characterized in that the peptide.
CP1, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6, CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP16, CP20, CP22, CP23, CP25, CP27, CP29 having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1-20 as an active ingredient A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoarthritis, comprising at least one peptide selected from CP30 and a pharmaceutically acceptable excipient.
The method of claim 16, wherein the peptide is CP1, CP2, CP5, CP8, CP23, CP27 or CP30 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 15, 17, 20 Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoarthritis, characterized in that the peptide.
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