KR102073333B1 - Porous polymer microsphere for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases, and preparation method thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 다공성 고분자 마이크로스피어는 손상된 골 조직 또는 연골 조직의 재생에 효과적인 약물을 치료가 요구되는 환부에 직접 주사가 가능하다. 또한, 약물이 천천히 배출되기 때문에 장시간에 걸쳐 원하는 양의 약물을 환부에 전달할 수 있으면서도 우수한 재생효과를 골 조직에서 직접 발현시킬 수 있고, 생분해성 재료로 구성되기 때문에 부작용이 없다. 또한, 본 발명에 따른 다공성 고분자 마이크로스피어는 환부의 상태에 따라 다공도의 조절 및 담지된 약물의 농도조절을 통해 약물이 배출되는 속도 및 배출되는 양을 조절할 수 있으므로 맞춤형 진료를 제공할 수 있다. The present invention relates to a porous polymeric microsphere for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases and a method of manufacturing the same.
Porous polymer microspheres according to the present invention can be injected directly into the affected area to be treated with drugs effective for the regeneration of damaged bone tissue or cartilage tissue. In addition, since the drug is slowly discharged, it is possible to deliver a desired amount of drug to the affected area for a long time, but can express the excellent regenerative effect directly in the bone tissue, and since it is composed of a biodegradable material, there are no side effects. In addition, the porous polymer microsphere according to the present invention can provide a personalized treatment because it can adjust the rate and amount of the drug is discharged through the control of the porosity and the concentration of the supported drug according to the affected part.
Description
본 발명은 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a porous polymeric microsphere for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases and a method of manufacturing the same.
골(뼈)은 신체를 지지하는 단단한 조직으로 내부 골격을 구성하고 장기를 보호하는 기능을 한다. 골(뼈) 조직은 신체를 지지하는 단단한 조직으로 내부 골격을 구성하고 장기를 보호하는 기능을 하는 곳으로 생리학적으로는 생체 내에서 혈중 칼슘농도가 일정하도록 항상성을 유지하는 중요한 조직이다. 이러한 항상성을 유지하기 위해서 골은 조골세포에 의한 골 형성과 파골세포에 의한 골 흡수가 순차적으로 유지되어야 하는데, 이러한 균형이 깨지면 골 질환이 유발된다. 골 질환 중의 하나인 골다공증은 그 원인들 중에 파골세포의 과도한 활성이 골량의 감소와 골강도의 약화로 골절의 위험성을 증가시키는 요인으로 잘 보고 되어 있다. 대한골대사학회(골다공증의 진단 및 치료 지침, 2013년)에 보고된 바에 따르면, 골다공증 대퇴골절후 약 50%의 환자는 골절전의 기동 능력과 독립성을 회복할 수 없고, 25%의 환자는 오랜 기간 보호가 필요하며, 1년내 사망률도 평균 20%에 이른다고 밝혔다. 때문에 골다공증의 치료법으로 대한골대사학회에서는 다양한 치료방법을 제시하고 있다. 먼저 여성호르몬요법의 경우, 폐경 후 에스트로겐 결핍으로 인해 유발되는 골다공증을 막기 위한 치료법으로 에스트로겐을 패치, 겔, 경구투여 방법으로 주입하여 골밀도가 유의하게 증가함을 보고하였으나 부종, 유방통, 담석증, 하지 경련 등을 유발하는 이상 반응도 보고하고 있다. 다음으로 전 세계적으로 가장 많이 처방되는 약제인 비스포스포네이트는 경구용과 정맥주사를 통한 주입방법이 있다. 비스포스포네이트는 인체에 존재하지 않는 합성 물질로 뼈로 이동하고 파골세포내로 들어가 분화 및 작용을 억제한다. 그러나 경구용 비스포스포네이트는 식도염, 위궤양이 생길수 있으며 장기간 사용시 턱뼈괴사를 일으킬수 있고, 정맥주사의 경우에도 두통, 근육통, 신기능 장애를 유발한다고 알려져 있다. 또 다른 치료제로 부갑상선 호르몬(PTH)이 있다. PTH는 84개의 아미노산으로 이루어져 있으나 치료제로는 아미노 말단의 34개의 아미노산으로 구성된 PTH1-34를 미국과 유럽, 국내에서 승인되어 사용되고 있다. PTH는 적은 용량으로 간헐적 투여시 골형성이 촉진되는 반면, 고농도로 유지할 경우 골흡수가 증가되므로 주의를 요하고 있다. 또한, 이상 반응으로 오심, 두통, 다리경련이 경미하게 생길수 있으며, 일시적으로 고칼슘혈증이 있을수 있다고 보고하였다. 이처럼 대한골대사학회에서 보고된 치료방법들은 골다공증 치료제로 사용되고 있으나, 이상 반응도 동반될 수 있기에 현재까지도 새로운 치료방법이 요구되고 있다.Bone (bone) is a solid tissue that supports the body to form the internal skeleton and to protect the organs. Bone (bone) tissue is a hard tissue that supports the body, which constitutes the internal skeleton and functions to protect organs. It is physiologically important to maintain homeostasis to maintain a constant blood calcium level in vivo. In order to maintain this homeostasis, bone has to maintain bone formation by osteoblasts and bone resorption by osteoclasts in sequence. If this balance is broken, bone disease is caused. Osteoporosis, one of bone diseases, has been reported to be one of the causes of excessive activity of osteoclasts to increase the risk of fracture due to a decrease in bone mass and weak bone strength. According to the Korean Society of Bone Metabolism (Guideline for Diagnosis and Treatment of Osteoporosis, 2013), approximately 50% of patients after osteoporotic femoral fractures cannot restore pre-fracture maneuverability and independence, and 25% of patients have long-term protection. The average mortality rate in one year is 20%. Therefore, as a treatment for osteoporosis, the Korean Society of Bone Metabolism suggests various treatment methods. First, in the case of female hormone therapy, estrogen was injected by patch, gel, oral administration to prevent osteoporosis caused by postmenopausal estrogen deficiency, and bone mineral density was significantly increased, but edema, breast pain, cholelithiasis, and leg cramps were reported. Adverse reactions causing backs are also reported. Next, bisphosphonate, the most prescribed drug in the world, is injected by oral and intravenous injection. Bisphosphonates are synthetic substances that do not exist in the human body, move to bone and enter osteoclasts to inhibit differentiation and action. However, oral bisphosphonates are known to cause esophagitis, gastric ulcers, prolonged jaw bone necrosis and prolonged headaches, muscle pain and renal dysfunction. Another treatment is parathyroid hormone (PTH). PTH consists of 84 amino acids, but PTH1-34, consisting of 34 amino acids at the amino terminus, has been approved and used in the United States, Europe and Korea. PTH promotes bone formation during intermittent administration at low doses, while maintaining high concentrations requires increased bone resorption. In addition, adverse reactions may result in mild nausea, headache, and leg cramps, and temporary hypercalcemia. The treatment methods reported by the Korean Society of Bone Metabolism have been used as a treatment for osteoporosis, but new treatment methods are still required because they can be accompanied by adverse reactions.
골다공증은 직접적인 파골세포의 활성으로 인한 골감소 유발 외에도 암세포의 골전이로도 유발된다. 유방암, 전립선암, 대장암 등의 다양한 암세포들은 골(뼈)로도 전이되며, 폐, 간에 이어 골(뼈)은 세 번째로 흔한 전이 장소라고 알려져 있다. 이러한 암들의 골(뼈) 전이는 단순한 전이 뿐 아니라, 골수에서 골의 생성에 관여하는 조골세포와 골의 흡수에 관여하는 파골세포에 영향을 미쳐 궁극적으로는 과도한 골 흡수를 야기시키고, 이것이 다시 암세포에 영향을 주어 암세포의 증식을 촉진시키는 일련의 악순환 과정을 유도하게 된다(Yoneda T, Tanaka S, Hata K. Role of RANKL/RANK in primary and secondary breast cancer. World J Orthop 2013 18;4(4):178-85. doi: 10.5312/wjo.v4.i4.178). Osteoporosis is caused by bone metastasis of cancer cells in addition to bone loss caused by direct osteoclast activity. Various cancer cells, such as breast cancer, prostate cancer and colon cancer, also metastasize to the bones (bones), and the lungs and livers (bones) are known as the third most common metastases. Bone metastasis of these cancers not only causes metastasis, but also affects osteoblasts involved in bone formation in bone marrow and osteoclasts involved in bone resorption, ultimately leading to excessive bone resorption, which in turn leads to cancer cells. Induces a series of vicious cycles that promote cancer cell proliferation (Yoneda T, Tanaka S, Hata K. Role of RANKL / RANK in primary and secondary breast cancer.World J Orthop 2013 18; 4 (4) Doi: 10.5312 / wjo.v4.i4.178).
현재까지 개발된 대표적인 골다공증 치료제는 파골세포(골 흡수에 관여하는 세포)의 기능을 약화시켜 뼈 손실을 막아주는 비스포스포네이트(Bisphosphonates) 제제가 주류를 이루며, 머크사(社)의 '포사맥스', 프록터갬블사(社)의 '악토넬' 등이 있다. 하지만 이들 치료제는 뼈의 형성을 촉진하는 것이 아닌 분해 억제제로서, 지속적인 사용시 뼈를 푸석푸석하게 하여 추가적인 골절을 유도할 수 있기 때문에 근본적인 치료는 될 수 없는 상황으로 대체제가 절실한 실정이다(Datamonitor Research Reports, 2007).
Representative osteoporosis therapeutics developed so far are mainly bisphosphonates, which weaken the function of osteoclasts (cells involved in bone resorption) and prevent bone loss, and Merck's 'Posamax' and Procter Gamble Inc.'s 'Actonnell'. However, these therapeutic agents are not inhibitors of bone formation, but degrading inhibitors, which can lead to additional fractures by shattering bones in continuous use, which is why there is an urgent need for alternatives (Datamonitor Research Reports, 2007).
한편, 관절 연골에는 혈관, 신경, 임파 조직이 없기 때문에 관절에 손상을 입게 되면 손상된 관절 연골은 자생적으로 재생되기가 어렵다. 따라서 관절 연골에서는 작은 손상이어도 상처가 진전, 관절의 퇴화 현상이 일어날 수 있다. 그러므로, 골, 연골 조직의 기능을 회복, 유지하기 위해서 의학적으로 여러 가지 방법이 도모되고 있는 실정이다.On the other hand, because articular cartilage has no blood vessels, nerves, or lymphatic tissue, damaged joint cartilage is difficult to regenerate spontaneously. Therefore, even in small damage in the articular cartilage, the wound may progress, the degeneration of the joint may occur. Therefore, in order to restore and maintain the function of bone, cartilage tissue, medically, various methods are being planned.
연골은 발생학적으로 경골조직과 같은 중배엽에서 기원한 조직으로, 뼈와 함께 내골격을 형성한다. 또한, 연골 손상이 심한 경우 연골뿐만 아니라 연골 밑의 골조직까지 손상을 입는 경우도 있다. 이처럼 연골과 뼈는 유기적으로 작용하는 조직이지만 종래의 연골과 뼈의 조직공학적 치료는 이들을 각각 치료하였다. 구체적으로 기존의 임상적으로 연골을 재생시키는 수술 방법으로는 (1) 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 방법, (2) 골, 연골 조직, 자가 혹은 동종의 연골조직으로 연골 결손 부위에 이식하는 방법, (3) 연골 결손 부위의 표면에 연골을 유도할 수 있는 조직(연골막, 골막) 혹은 화합물 등을 이식하는 방법, (4) 연골 세포 이식술로 연골 결손부위에 연골 세포를 이식함으로써 연골 재생을 유도하는 방법 등 연골만을 재생시키는 방법이 사용되고 있다.Cartilage is a tissue derived from mesoderm, such as tibial tissue, which forms an endoskeleton with bone. In addition, when cartilage damage is severe, not only cartilage but also bone tissue under the cartilage may be damaged. As described above, cartilage and bone are organic tissues, but conventional tissue and cartilage treatment of cartilage and bone treated them. Specifically, conventional clinical methods for regenerating cartilage include (1) inducing differentiation of stem cells into chondrocytes, and (2) cartilage defects in bone, cartilage tissue, autologous or homogenous cartilage tissue. Implantation method (3) implantation of cartilage-inducing tissue (cartilage, periosteum) or compound on the surface of the cartilage defect site, (4) cartilage cell transplantation to the cartilage defect site by cartilage cell transplantation A method of regenerating only cartilage has been used, such as a method of inducing regeneration.
그러나, 앞서 살펴본 바와 같이 연골과 골이 유기적으로 작용하는 조직이기 때문에 연골과 뼈를 각각 별개로 치료하는 종래 방법의 경우 골, 연골과의 결합력이 약하고, 회복시 시간이 오래 걸리는 문제점이 있었다.
However, as described above, since the cartilage and the bone are organic tissues, the conventional method of treating cartilage and bone separately has a weak binding force between bone and cartilage, and takes a long time to recover.
이에 따라, 최근 자기 복제능력이 있고 여러 조직으로 분화할 수 있으며 많은 양을 공여부의 기능 장애 없이 쉽게 채취할 수 있는 장점이 있는 줄기세포가 세포 치료에 이상적인 세포원으로 인식되어 이에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 아직까지 연골형성을 위한 인자, 환경 등에 대한 명확한 지식이 부족한 상태이다.As a result, stem cells, which have self-replicating ability, can be differentiated into various tissues and can be easily collected without a large amount of donor dysfunction, have been recognized as an ideal cell source for cell therapy. However, there is still a lack of clear knowledge about factors, environment, etc. for cartilage formation.
관절연골 재생을 위한 줄기세포는 자가 증식능과 특정 조직을 이루는 세포로 분화되는 분화능이 특징이며 최근 관절 연골 치료에 적용하기 위한 새로운 세포 원으로 제시되고 있다. 따라서 이론적으로는 기존의 연골 세포를 이용한 세포 치료법이 가지고 있던 제한점들을 해결하고 전반적인 관절 연골의 퇴행과 손상에도 적용할 수 있는 가능성 있다. 또한, 성체 간엽 줄기 세포 및 간엽 전구 세포는 윤리적 문제점과, 동종 이식시 생체 내 거부 반응이 없는 장점이 있다.Stem cells for articular cartilage regeneration are characterized by self-proliferative capacity and differentiation ability to differentiate into cells forming specific tissues and have recently been proposed as a new cell source for application to articular cartilage treatment. Therefore, theoretically, it is possible to solve the limitations of the conventional cell therapy using chondrocytes and to apply to the degeneration and damage of the articular cartilage as a whole. In addition, adult mesenchymal stem cells and mesenchymal progenitor cells have the advantages of ethical problems and no rejection in vivo upon allogeneic transplantation.
그러나 모든 성체간엽줄기세포가 동시에 완전히 연골세포로 분화되지는 않으며, 따라서 이들의 균일 연골세포로의 분화 유도방법이 필요한 실정이다.
However, not all adult mesenchymal stem cells are completely differentiated into chondrocytes at the same time, and thus, a situation in which a method of inducing differentiation into uniform chondrocytes is required.
골(뼈)/연골의 형성 또는 골/연골 조직의 재생을 촉진하기 위한 방법으로 약물의 경구투여나 환부에 약물을 직접 주사하는 방법이 있으나, 약물을 경구 투여하는 방법은 골 분화를 필요로 하는 환부에 전달되는 약물의 양이 극히 일부분에 불과하여 재생효과가 크지 못하며, 환부에 약물을 직접 주사하는 방법은 많은 양의 약물이 한번에 주입되기 때문에 부작용의 문제가 있다. As a method for promoting bone / cartilage formation or regeneration of bone / cartilage tissue, there are methods for oral administration of drugs or direct injection of drugs into affected areas, but methods for oral administration of drugs require bone differentiation. The amount of drug delivered to the affected part is only a fraction, so the regenerative effect is not great, and the direct injection of the drug into the affected part has a problem of side effects because a large amount of drug is injected at one time.
이러한 문제점을 개선하기 한 방법으로 생분해성 다공성 고분자 지지체를 이용하는 조직공학적 접근이 대안으로 대두되었다. 생분해성 다공성 고분자 지지체는 천연적인 세포외 매트릭스를 모방하며, 조골/연골세포의 형성 및 분화, 골/연골 조직의 재생 등에 매우 우호적인 것으로 알려져 있다. 이들은 세포접착성이 높은 장점을 가지지만 기계적 물성이 열악하며, 조골/연골세포의 형성 및 분화 속도, 또는 골/연골 조직의 재생 속도가 느리다는 문제점이 있다. As a way to alleviate this problem, a histological approach using biodegradable porous polymeric scaffolds has emerged as an alternative. Biodegradable porous polymeric supports mimic the natural extracellular matrix and are known to be very favorable for the formation and differentiation of osteoblasts and chondrocytes, regeneration of bone and cartilage tissue. They have the advantages of high cell adhesion, but poor mechanical properties, there is a problem that the formation and differentiation rate of osteoblasts and chondrocytes, or the rate of regeneration of bone / cartilage tissue is slow.
이에 조골/연골세포 형성 및 분화 촉진 효과, 또는 골/연골 조직의 재생 촉진 효과를 나타내면서 부작용의 문제가 없는 새로운 치료약물의 개발이 요구되고 있다. Accordingly, there is a need for development of a new therapeutic drug having no problem of side effects while showing osteoblast / chondrocyte formation and differentiation promoting effects, or bone / cartilage tissue regeneration promoting effects.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 골 질환 또는 연골 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약물이 탑재된 다공성 고분자 마이크로스피어를 제공하는 것이다. The problem to be solved by the present invention is to provide a porous polymer microsphere loaded with drugs that can prevent or treat bone diseases or cartilage diseases.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for producing the porous polymer microspheres.
상기한 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 크기가 5 내지 100 ㎛인 기공들이 서로 연결되어 있는 3차원 그물구조의 생분해성 고분자 지지체; 및 상기 생분해성 고분자 지지체의 그물구조 내에 포섭되는 골 질환 또는 연골 질환의 치료용 약물;을 포함하는 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어를 제공한다.One aspect of the present invention for achieving the above object is a biodegradable polymer support of a three-dimensional network structure in which pores having a size of 5 to 100 ㎛ are connected to each other; And it provides a porous polymer microspheres for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases comprising; and a drug for the treatment of bone diseases or cartilage diseases contained in the network structure of the biodegradable polymer support.
본 발명에 의하면, 상기 다공성 고분자 마이크로스피어는 생체적합성 고분자 10 중량부에 대하여 상기 약물이 2 내지 30 중량부로 함유된 것일 수 있다.According to the present invention, the porous polymer microspheres may contain 2 to 30 parts by weight of the drug based on 10 parts by weight of the biocompatible polymer.
본 발명에 의하면, 상기 다공성 고분자 마이크로스피어는 다공도(porosity)가 10 내지 90 %이며, 입자의 크기가 200 내지 1000 ㎛일 수 있다.According to the present invention, the porous polymer microspheres may have a porosity of 10 to 90% and a particle size of 200 to 1000 μm.
본 발명에 의하면, 상기 다공성 고분자 마이크로스피어는 다공도(porosity)가 60 내지 90 %이고, 기공의 크기가 10 내지 40 ㎛이며, 입자의 크기가 200 내지 500 ㎛일 수 있다.According to the present invention, the porous polymer microsphere may have a porosity of 60 to 90%, a pore size of 10 to 40 μm, and a particle size of 200 to 500 μm.
본 발명에 의하면, 상기 골 질환 또는 연골 질환의 치료용 약물은 골형성단백질-2, 표피성장인자(epidermal growth factor), 골형성 단백질-7, 실라스타틴(cilastatin), 나이스타틴(nystatin), 로바스타틴(lovastatin), 소마토스타틴(somatostatin), 프라바스타틴(pravastatin), 심바스타틴(simvastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 아토바스타틴 (atorvastatin), 세르바스타틴(cervastatin), 울리나스타틴(ulinastatin), 로슈바스타틴(rosuvastatin), 피타바스타틴(pitavastatin), 글루코사민(glucosamine), 콘드로이틴(chondroitin), 메바스타틴(mevastatin), 카르토게닌(kartogenin), 형질전환성장인자-베타1(transforming growth factor-β1), 형질전환성장인자-베타3, 6-브로모인딘-3-옥심(6-bromoindirubin-3-oxime), 술폰아미드(sulfonamide), 퍼모르파민(purmorphamine), 메비놀린(mevinolin), 게니스테인(genistein), 이카린(icariin), 멜라토닌(melatonin), 메트포민(metformin), 알렌드로네이트(alendronate), 졸레드로네이트(zoledronate), 에티드로네이트(etidronate), 클로드로네이트(clodronate), 티루드로네이트(tiludronate), 파미드로네이트(pamidronate), 네리드로네이트(neridronate), 올파드로네이트(olpadronate), 이반드로네이트(ibandronate), 리제드로네이트(risedronate), 프로스타글란딘(prostaglandins), 덱사메타손(dexamethasone), 골형성 단백질-4, 인슐린 유사 성장인자-1(insulin-like growth factor-1), 섬유모세포성장인자-2(fibroblast growth factor-2), 섬유모세포성장인자-18, 섬유아세포 성장인자, 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 것일 수 있다.According to the present invention, the drug for the treatment of bone diseases or cartilage diseases is bone forming protein-2, epidermal growth factor (epidermal growth factor), bone forming protein-7, cilastatin, nystatin (nystatin), lovastatin (lovastatin), somatostatin, sovastatin, pravastatin, simvastatin, fluvastatin, atorvastatin, cervastatin, ulvastatin, ulstatatin, roschvastatin rosuvastatin, pitavastatin, glucosamine, glucosamine, chondroitin, mevastatin, mevastatin, kartogenin, transforming growth factor-beta1, transformation Growth factor-beta3, 6-bromoindirubin-3-oxime, sulfonamide, permorphamine, mevinolin, genistein, Icariin, melatonin, metmet Metformin, alendronate, zoldronate, etidronate, clodronate, tirudronate, pamidronate, neridro Neridronate, olpadronate, ibandronate, risedronate, prostaglandins, dexamethasone, dexamethasone, bone-forming protein-4, insulin-like growth factor-1 ( insulin-like growth factor-1), fibroblast growth factor-2, fibroblast growth factor-18, fibroblast growth factor, or a mixture thereof.
본 발명에 의하면, 상기 생체적합성 고분자는 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리아미노산, 폴리락타이트, 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리오르소에스테르, 폴리히드록시발레이트, 폴리히드록시부티레이트, 히아루론산, 셀룰로오스, 헤파린, 콜라겐, 알지네이트 및 키토산 중에서 선택되는 어느 하나; 이들 둘 이상이 블랜딩된 고분자; 및 이들 둘 이상의 공중합체로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.According to the present invention, the biocompatible polymer is polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), polylactide-co-glycolide (PLGA), polycaprolactone (PCL), polyamino acid, polylactite, poly Any one selected from phosphazine, polyiminocarbonate, polyphosphoester, polyanhydride, polyorthoester, polyhydroxyvalate, polyhydroxybutyrate, hyaluronic acid, cellulose, heparin, collagen, alginate and chitosan; Polymers in which two or more of these are blended; And it may be one selected from the group consisting of two or more copolymers.
본 발명에 의하면, 상기 골 질환은 성장기 발육부진, 골감소증, 골 취약증, 골 괴사, 골절, 과도한 파골세포의 골 흡수에 의한 골다공증(osteoporosis), 골형성부전증, 뼈의 손상, 외상에 의한 관절손상, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사성 골질환, 신성골이영양증(renal osteodystrophy), 치주질환(periodontal disease), 파제트병(Paget disease) 및 전이성 골암(metastatic bone cancers)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, 상기 연골 질환은 퇴행성 관절염(degenerative arthritis), 염증성 관절염(inflammatory arthritis), 골연골종증(osteochondromatosis), 염좌(distortion), 윤활낭염(bursitis), 반월상 연골 손상(menstruation), 원판형 반월상 연골파열(meniscal tear), 반월상 연골 낭포(meniscus cyst), 측부 인대 손상(collateral ligamentrupture), 전방십자인대 손상(anterior cruciate ligament injury), 후방뒤십자인대 손상(posterior cruciate ligament injury), 관절 내 유리체(intra-articular vitreous), 박리성 뼈연골염(exfoliation osteochondritis), 추벽 증후군(plica syndrome), 내반슬(genu varum), 외반슬(knock-knee) 및 발음성 슬관절(snapping knee)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.According to the present invention, the bone disease is a growth stage of development, osteopenia, bone fragility, bone necrosis, fracture, osteoporosis due to bone absorption of excessive osteoclast (osteoporosis), bone dysplasia, bone damage, joint damage due to trauma , Osteomalacia, rickets, fibrous osteoarthritis, aplastic bone disease, metabolic bone disease, renal osteodystrophy, periodontal disease, Paget disease, and metastatic bone cancers Cartilage disease is degenerative arthritis, inflammatory arthritis, osteochondromatosis, distortion, bursitis, meniscus, meniscus Plate-shaped meniscal tear, meniscus cyst, collateral ligamentrupture, anterior cruciate ligament injury, posterior Posterior cruciate ligament injury, intra-articular vitreous, exfoliation osteochondritis, plica syndrome, genu varum, knuckle-knee and pronunciation It may be selected from the group consisting of snapping knee.
본 발명에 의하면, 상기 다공성 고분자 마이크로스피어는 생체 내에 주입되어 상기 골 질환 또는 연골 질환의 치료용 약물을 방출하는 것일 수 있다.According to the present invention, the porous polymer microspheres may be injected into a living body to release a drug for treating the bone disease or cartilage disease.
또한, 본 발명은 1) 생체적합성 고분자; 및 골 질환 또는 연골 질환의 치료용 약물;을 유기용매에 용해시켜 고분자용액을 제조하는 단계; 2) 상기 고분자용액 및 젤라틴(gelatin) 수용액을 첨가하고 균질화하여 에멀젼을 제조하는 단계; 3) 상기 에멀젼을 불연속상(discontinuous phase)으로 사용하고, 폴리비닐알콜 용액을 연속상(continuous phase)로 사용하여 유체 장치(fluidic device)에서 흘려주어, 생체적합성 고분자, 골 질환 또는 연골 질환의 치료용 약물 및 젤라틴을 포함하는 고분자 미소구체를 제조하는 단계; 및 4) 38 내지 50℃의 물에 상기 고분자 미소구체를 넣고 교반하여 고분자 미소구체로부터 젤라틴을 용출시키는 단계;를 포함하는 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention 1) biocompatible polymer; And a drug for treating a bone disease or a cartilage disease; dissolving it in an organic solvent to prepare a polymer solution. 2) preparing an emulsion by adding and homogenizing the polymer solution and gelatin solution; 3) Treatment of biocompatible polymers, bone disease or cartilage disease by using the emulsion as a discontinuous phase and using a polyvinyl alcohol solution as a continuous phase to flow in a fluidic device. Preparing a polymeric microsphere comprising a drug and gelatin; And 4) adding the polymer microspheres in water at 38 to 50 ° C. and stirring to elute gelatin from the polymer microspheres. The method for preparing a porous polymer microsphere for preventing or treating bone diseases or cartilage diseases, including: do.
본 발명에 따른 다공성 고분자 마이크로스피어는 손상된 골 조직 또는 연골 조직의 재생에 효과적인 약물을 치료가 요구되는 환부에 직접 주사가 가능하다. 또한, 약물이 천천히 배출되기 때문에 장시간에 걸쳐 원하는 양의 약물을 환부에 전달할 수 있으면서도 우수한 재생효과를 골 조직에서 직접 발현시킬 수 있고, 생분해성 재료로 구성되기 때문에 부작용이 없다. 또한, 본 발명에 따른 다공성 고분자 마이크로스피어는 환부의 상태에 따라 다공도의 조절 및 담지된 약물의 농도조절을 통해 약물이 배출되는 속도 및 배출되는 양을 조절할 수 있으므로 맞춤형 진료를 제공할 수 있다. Porous polymer microspheres according to the present invention can be injected directly into the affected area to be treated with drugs effective for the regeneration of damaged bone tissue or cartilage tissue. In addition, since the drug is slowly discharged, it is possible to deliver a desired amount of drug to the affected area for a long time, but can express the excellent regenerative effect directly in the bone tissue, and since it is composed of a biodegradable material, there are no side effects. In addition, the porous polymer microsphere according to the present invention can provide a personalized treatment because it can adjust the rate and amount of the drug is discharged through the control of the porosity and the concentration of the supported drug according to the affected part.
도 1은 실시예 1의 다공성 고분자 마이크로스피어(SIM/PMSs)의 주사전자현미경 이미지이다.
도 2는 실시예 1의 다공성 고분자 마이크로스피어(SIM/PMSs)의 약물 방출 거동 테스트 결과이다.
도 3은 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조과정에서 첨가되는 젤라틴의 농도에 따라 서로 다른 기공 크기를 가지는 마이크로스피어의 주사전자현미경 이미지이다.
도 4는 서로 다른 기공 크기를 가지는 다공성 고분자 마이크로스피어에서의 세포증식 정도를 측정하여 나타낸 결과이다.1 is a scanning electron microscope image of porous polymeric microspheres (SIM / PMSs) of Example 1. FIG.
FIG. 2 shows the drug release behavior test results of porous polymeric microspheres (SIM / PMSs) of Example 1. FIG.
3 is a scanning electron microscope image of microspheres having different pore sizes according to the concentration of gelatin added during the preparation of the porous polymer microspheres.
Figure 4 is a result of measuring the degree of cell proliferation in porous polymer microspheres having different pore size.
이하, 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the drawings.
본 발명은 크기가 5 내지 100 ㎛인 기공들이 서로 연결되어 있는 3차원 그물구조의 생분해성 고분자 지지체; 및 상기 생분해성 고분자 지지체의 그물구조 내에 포섭되는 골 질환 또는 연골 질환의 치료용 약물;을 포함하는 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어를 제공한다.The present invention provides a biodegradable polymer support having a three-dimensional network structure in which pores having a size of 5 to 100 μm are connected to each other; And it provides a porous polymer microspheres for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases comprising; and a drug for the treatment of bone diseases or cartilage diseases contained in the network structure of the biodegradable polymer support.
본 발명에 따른 다공성 고분자 마이크로스피어는 생체 내에 주입되어 상기 골 질환 또는 연골 질환 치료용 약물을 방출하는 것일 수 있다. 상기 약물의 방출은 다공성 고분자 마이크로스피어의 기공을 통해 방출되거나 또는 생분해성 고분자 지지체(이하, 고분자 지지체)가 생체 내에서 분해되면서 배출되는 것일 수 있다. Porous polymer microspheres according to the present invention may be injected into a living body to release the drug for treating the bone disease or cartilage disease. The drug may be released through the pores of the porous polymer microspheres, or may be released while the biodegradable polymer support (hereinafter, referred to as the polymer support) is decomposed in vivo.
상기 약물의 방출은 상기 고분자 지지체를 형성하는 고분자의 종류, 그물구조의 밀도, 다공도 및 기공의 크기에 따라 약물의 방출량 및 방출속도가 조절될 수 있다. 따라서 치료하고자 하는 환부의 중증도에 따라 다공성 고분자 마이크로스피어의 다공도, 기공크기 및 포섭된 약물의 농도를 적절히 조절하여 환자에게 적용할 수 있다.The release of the drug may be controlled by the amount and release rate of the drug according to the type of the polymer forming the polymer support, the density of the network structure, porosity and pore size. Therefore, according to the severity of the affected area to be treated, the porosity, pore size, and concentration of the drug contained in the porous polymer microspheres may be appropriately adjusted and applied to the patient.
본 발명에 따른 다공성 고분자 마이크로스피어는 생체적합성 고분자 10 중량부에 대하여 상기 약물이 2 내지 30 중량부로 함유될 수 있다. 상기 약물의 함량이 상기범위 미만이면 약물의 양이 너무 적고, 상기 범위를 초과하면 단시간에 방출되는 약물의 양이 너무 많아 바람직하지 않다. The porous polymer microsphere according to the present invention may contain 2 to 30 parts by weight of the drug based on 10 parts by weight of the biocompatible polymer. If the amount of the drug is less than the above range, the amount of the drug is too small, and if it exceeds the above range, the amount of the drug to be released in a short time is too high, which is not preferable.
본 발명에 따른 다공성 고분자 마이크로스피어는 다공도(porosity)가 10 내지 90 %이며, 입자의 크기가 200 내지 1000 ㎛일 수 있다. 입자의 크기가 상기 범위 미만이면 담지될 수 있는 약물의 양이 너무 적어 생체 내에서 지속적으로 배출되기 어려워, 약물을 자주 투여해야하는 불편함이 있고, 입자의 크기가 상기 범위를 초과하면 마이크로스피어의 제조가 용이하지 않다. The porous polymer microspheres according to the present invention have a porosity of 10 to 90% and a particle size of 200 to 1000 μm. If the size of the particles is less than the above range, the amount of drug that can be supported is too small to be continuously discharged in vivo, there is the inconvenience of frequent drug administration, and if the size of the particles exceeds the above range, the production of microspheres Is not easy.
특히, 상기 다공성 고분자 마이크로스피어는 다공도(porosity)가 60 내지 90 %이고, 기공의 크기가 10 내지 40 ㎛이며, 입자의 크기가 200 내지 500 ㎛인 것이 바람직하다. 상기 범위인 것이 생체 내에서 약물의 배출이 용이하게 이루어질 수 있다. In particular, the porous polymer microspheres have a porosity of 60 to 90%, a pore size of 10 to 40 μm, and a particle size of 200 to 500 μm. Within this range, the drug can be easily released in vivo.
본 발명에 따른 다공성 고분자 마이크로스피어는 기공의 크기가 5 내지 100 ㎛일 수 있다. 기공의 크기가 상기 범위 미만이면 기공의 크기가 너무 작아 약물의 방출이 용이하지 않으며, 기공의 크기가 상기 범위를 초과하면 약물이 한꺼번에 방출되는 문제가 있다. 특히 바람직한 기공의 크기는 10 내지 80 ㎛일 수 있다. Porous polymer microspheres according to the present invention may have a pore size of 5 to 100 ㎛. If the pore size is less than the above range, the pore size is too small to release the drug, and if the pore size exceeds the above range, there is a problem that the drug is released at once. Particularly preferred pore sizes may be 10 to 80 μm.
본 발명에 따른 상기 골 질환 또는 연골 질환 치료용 약물은 골형성 단백질-2, 표피성장인자, 골형성 단백질-7, 실라스타틴(cilastatin), 나이스타틴(nystatin), 로바스타틴(lovastatin), 소마토스타틴(somatostatin), 프라바스타틴(pravastatin), 심바스타틴(simvastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 아토바스타틴 (atorvastatin), 세르바스타틴(cervastatin), 울리나스타틴 (ulinastatin), 로슈바스타틴(rosuvastatin), 피타바스타틴(pitavastatin), 글루코사민(glucosamine), 콘드로이틴(chondroitin), 메바스타틴(mevastatin), 카르토게닌, 형질전환성장인자-베타1, 형질전환성장인자-베타3, 6-브로모인딘-3-옥심, 술폰 아미드, 퍼모르파민, 메비놀린, 게니스테인, 이카린, 멜라토닌, 메트포민, 알렌드로네이트, 졸레드로네이트, 에티드로네이트, 클로드로네이트, 티루드로네이트, 파미드로네이트, 네리드로네이트, 올파드로네이트, 이반드로네이트, 리제드로네이트, 프로스타글란딘, 덱사메타손, 골형성 단백질-4, 인슐린 유사 성장인자-1, 섬유모세포성장인자-2, 섬유모세포성장인자-18, 섬유아세포 성장인자, 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 것일 수 있다.The drug for treating a bone disease or cartilage disease according to the present invention is bone forming protein-2, epidermal growth factor, bone forming protein-7, cilastatin (cilastatin), nystatin (nystatin), lovastatin (lovastatin), somatostatin (somatostatin) ), Pravastatin, simvastatin, simvastatin, fluvastatin, atorvastatin, cervastatin, cerinastatin, ulinastatin, rosuvastatin, pitavastatin ( pitavastatin, glucosamine, chondroitin, mevastatin, cartogenin, transforming growth factor-beta1, transforming growth factor-beta3, 6-bromoindine-3-oxime, sulfone Amides, permorphamines, mebinolin, genistein, iccarin, melatonin, metformin, allendronate, zoleronate, ethidronate, cladronate, tyrudronate, pamidronate, neridronate, Olpadronate, ibandronate, lizdronate, prostaglandin, dexamethasone, bone morphogenetic protein-4, insulin-like growth factor-1, fibroblast growth factor-2, fibroblast growth factor-18, fibroblast growth factor, or It may be selected from a mixture thereof.
본 발명에 따른 상기 다공성 고분자 마이크로스피어의 상기 생체적합성 고분자는 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리아미노산, 폴리락타이트, 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리오르소에스테르, 폴리히드록시발레이트, 폴리히드록시부티레이트, 히아루론산, 셀룰로오스, 헤파린, 콜라겐, 알지네이트 및 키토산 중에서 선택되는 어느 하나; 이들 둘 이상이 블랜딩된 고분자; 및 이들 둘 이상의 공중합체로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다. The biocompatible polymer of the porous polymer microsphere according to the present invention is polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), polylactide-co-glycolide (PLGA), polycaprolactone (PCL), polyamino acid, Among polylactite, polyphosphazine, polyiminocarbonate, polyphosphoester, polyanhydride, polyorthoester, polyhydroxyvalate, polyhydroxybutyrate, hyaluronic acid, cellulose, heparin, collagen, alginate and chitosan Any one selected; Polymers in which two or more of these are blended; And it may be one selected from the group consisting of two or more copolymers.
본 발명에 따른 특히, 바람직한 상기 골 질환 또는 연골 질환의 치료용 약물은 심바스타틴, 프라바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 골형성 단백질-2, 섬유아세포 성장인자, 카르토게닌, 덱사메타손, 알렌드로네이트, 파미드로네이트, 리제드로네이트, 프로스타글란딘, 또는 이들 둘 이상의 혼합물일 수 있다. Particularly preferred according to the present invention, the drug for treating bone disease or cartilage disease is simvastatin, pravastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, bone morphogenic protein-2, fibroblast growth factor, cartogenin, dexamethasone, allendronate, Parmidronate, rezedronate, prostaglandin, or a mixture of two or more thereof.
본 발명에 따른 상기 골 질환은 성장기 발육부진, 골감소증, 골 취약증, 골 괴사, 골절, 과도한 파골세포의 골 흡수에 의한 골다공증(osteoporosis), 골형성부전증, 뼈의 손상, 외상에 의한 관절손상, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사성 골질환, 신성골이영양증(renal osteodystrophy), 치주질환(periodontal disease), 파제트병(Paget disease) 및 전이성 골암(metastatic bone cancers)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, 상기 연골 질환은 퇴행성 관절염(degenerative arthritis), 염증성 관절염(inflammatory arthritis), 골연골종증(osteochondromatosis), 염좌(distortion), 윤활낭염(bursitis), 반월상 연골 손상(menstruation), 원판형 반월상 연골파열(meniscal tear), 반월상 연골 낭포(meniscus cyst), 측부 인대 손상(collateral ligamentrupture), 전방십자인대 손상(anterior cruciate ligament injury), 후방뒤십자인대 손상(posterior cruciate ligament injury), 관절 내 유리체(intra-articular vitreous), 박리성 뼈연골염(exfoliation osteochondritis), 추벽 증후군(plica syndrome), 내반슬(genu varum), 외반슬(knock-knee) 및 발음성 슬관절(snapping knee)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The bone disease according to the present invention is a growth stage of undergrowth, osteopenia, bone weakness, bone necrosis, fracture, osteoporosis due to bone absorption of excessive osteoclasts (osteoporosis), bone dysplasia, bone damage, joint damage by trauma, From the group consisting of osteomalacia, rickets, fibrous osteoarthritis, aplastic bone disease, metabolic bone disease, renal osteodystrophy, periodontal disease, Paget disease and metastatic bone cancers The cartilage disease is selected, degenerative arthritis, inflammatory arthritis, osteochondromatosis, sprain, distortion, bursitis, meniscus, discoid Meniscal tear, meniscus cyst, collateral ligamentrupture, anterior cruciate ligament injury, posterior posterior dorsal Posterior cruciate ligament injury, intra-articular vitreous, exfoliation osteochondritis, plica syndrome, genu varum, knock-knee and pronunciation It may be selected from the group consisting of snapping knee, but is not limited thereto.
본 발명에 따른 다공성 고분자 마이크로스피어는 특히, 조골세포 또는 연골세포의 형성 또는 분화를 촉진함으로써, 골/연골감소성 질환 또는 골/연골결손 질환의 예방 또는 치료에 효과적일 수 있다.The porous polymeric microspheres according to the present invention may be particularly effective in the prevention or treatment of bone / chondrogenic diseases or bone / cartilage defect diseases by promoting the formation or differentiation of osteoblasts or chondrocytes.
본 발명에 있어서, 상기 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료란 조골/연골세포의 형성을 촉진하거나 조골/연골세포의 분화를 촉진함으로써 골 또는 연골 조직의 재생을 촉진하거나, 염증을 억제하는 것일 수 있다.
In the present invention, the prevention or treatment of the bone disease or cartilage disease may be to promote the formation of osteoblasts or chondrocytes or to promote the differentiation of osteoblasts or chondrocytes to promote the regeneration of bone or cartilage tissues or to inhibit inflammation. have.
한편, 본 발명에 따른 상기 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어는 1) 생체적합성 고분자; 및 골 질환 또는 연골 질환 치료용 약물;을 유기용매에 용해시켜 고분자용액을 제조하는 단계; 2) 상기 고분자용액 및 젤라틴(gelatin) 수용액을 첨가하고 균질화하여 에멀젼을 제조하는 단계; 3) 상기 에멀젼을 불연속상(discontinuous phase)으로 사용하고, 폴리비닐알콜 용액을 연속상(continuous phase)로 사용하여 유체 장치(fluidic device)에서 흘려주어 생체적합성 고분자, 골 질환 치료용 약물 및 젤라틴을 포함하는 고분자 미소구체를 제조하는 단계; 및 4) 38 내지 50℃의 물에 상기 고분자 미소구체를 넣고 교반하여 고분자 미소구체로부터 젤라틴을 용출시키는 단계;를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.On the other hand, the porous polymer microspheres for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases according to the present invention is 1) a biocompatible polymer; And preparing a polymer solution by dissolving a drug for treating a bone disease or a cartilage disease in an organic solvent. 2) preparing an emulsion by adding and homogenizing the polymer solution and gelatin solution; 3) The emulsion is used as a discontinuous phase and the polyvinyl alcohol solution is used as a continuous phase to flow in a fluidic device, thereby preparing biocompatible polymers, drugs for treating bone diseases, and gelatin. Preparing a polymeric microsphere comprising; And 4) adding the polymer microspheres to water at 38 to 50 ° C. and stirring to elute gelatin from the polymer microspheres.
상기 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조방법은 먼저, 생체적합성 고분자 10 중량부에 대하여 상기 약물을 2 내지 30 중량부로 혼합하여 유기용매에 용해시킴으로써 고분자용액을 제조한다. In the method of preparing the porous polymer microsphere, a polymer solution is prepared by first mixing 2 to 30 parts by weight of the drug with respect to 10 parts by weight of the biocompatible polymer and dissolving it in an organic solvent.
상기 유기용매는 디메틸설폭사이드, 디클로로메탄, 테트라하이드로퓨란 및 N,N-디메틸포름아미드 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상일 수 있으나 이제 제한되는 것은 아니다. The organic solvent may be one or two or more selected from dimethyl sulfoxide, dichloromethane, tetrahydrofuran and N, N-dimethylformamide, but is not limited thereto.
다음으로 제조된 고분자용액과 젤라틴 수용액을 첨가하고 균질화하여 에멀젼을 제조한다. Next, the prepared polymer solution and gelatin aqueous solution are added and homogenized to prepare an emulsion.
상기 젤라틴 수용액은 1 내지 10 중량%의 젤라틴 수용액일 수 있다. 젤라틴의 함량이 상기 범위 미만이면 젤라틴의 함량이 너무 낮아 마이크로스피어의 기공발달이 용이하지 않고, 상기범위를 초과하면 마이크로스피어의 제조가 용이하지 않을 뿐만 아니라 기공의 크기가 상대적으로 넓어 세포 증식이 저하되는 문제점이 발생한다. The gelatin aqueous solution may be 1 to 10% by weight gelatin aqueous solution. If the gelatin content is less than the above range, the gelatin content is too low to facilitate the development of pores of the microspheres, and if the gelatin content exceeds the above ranges, the microspheres are not easily prepared, and the pore size is relatively wide, thereby decreasing cell proliferation. Problem occurs.
본 발명에 의하면, 상기 균질화에서 에멀젼 안정화제를 더 포함할 수 있다. 상기 에멀젼 안정화제는 통상적으로 사용되는 에멀젼 안정화일 수 있으며, 바람직하게는 폴리비닐알콜일 수 있다. According to the present invention, the homogenization may further include an emulsion stabilizer. The emulsion stabilizer may be a emulsion stabilizer commonly used, preferably polyvinyl alcohol.
본 발명에 의하면, 상기 2) 단계의 균질화는 생체적합성 고분자 10 중량부에 대하여 젤라틴 3 내지 15 중량부를 첨가하는 것일 수 있다. 생체적합성 고분자에 대하여 젤라틴의 함량이 상기 범위 미만이면, 기공의 발달이 용이하지 않고, 목적하는 다공도를 달성하기 어렵다. 상기 범위를 초과하면 기공이 너무 커서 약물의 담지가 용이하지 않다. According to the present invention, the homogenization of step 2) may be added to 3 to 15 parts by weight of gelatin based on 10 parts by weight of the biocompatible polymer. If the content of gelatin for the biocompatible polymer is less than the above range, the development of pores is not easy, and it is difficult to achieve the desired porosity. If it exceeds this range, the pores are too large to support the drug.
본 발명에 의하면, 상기 생체적합성 고분자 10 중량부에 대하여 에멀젼 안정화제 0.5 내지 3 중량부를 첨가하는 것일 수 있다. 에멀젼 안정화제의 함량이 상기범위를 벗어나는 경우에는 본 발명에서 목적하고자 하는 크기의 마이크로스피어 형성이 용이하지 않다. According to the present invention, 0.5 to 3 parts by weight of the emulsion stabilizer may be added to 10 parts by weight of the biocompatible polymer. When the content of the emulsion stabilizer is out of the above range, it is not easy to form a microsphere of the desired size in the present invention.
또한, 상기 생체적합성 고분자의 함량 대비 상기 젤라틴, 상기 약물 또는 이들 둘의 함량을 조절하여 약물의 배출량 및 배출속도를 적절히 조절할 수 있다. In addition, by controlling the content of the gelatin, the drug or both of the content of the biocompatible polymer, it is possible to appropriately control the discharge and discharge rate of the drug.
또한, 상기 균질화는 균질기를 사용하여 8,000 내지 20,000 rpm으로 30초 내지 10분간 균질화하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. In addition, the homogenization may be to homogenize for 30 seconds to 10 minutes at 8,000 to 20,000 rpm using a homogenizer, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 생체적합성 고분자 및 골 질환 또는 연골 질환의 치료용 약물은 앞에서 제시한 바와 같다. In the present invention, the biocompatible polymer and the drug for treating bone disease or cartilage disease are as described above.
다음으로, 상기 에멀젼을 불연속상으로 사용하고, 폴리비닐알콜을 연속상으로 사용하여 유체장치에서 흘려줌으로써 목적하는 고분자 미소구체를 제조할 수 있다. 상기 제조된 미소구체는 38 내지 50℃의 물에 넣고 교반하게 되면, 미소구체 내의 젤라틴 성분들이 미소구체로부터 빠져나오게 되면서 젤라틴이 있던 곳에 기공이 형성되므로 다공성 고분자 마이크로스피어가 형성되게 된다. Next, the desired polymer microspheres can be prepared by using the emulsion in a discontinuous phase and using polyvinyl alcohol in a continuous phase and flowing it in a fluid apparatus. When the prepared microspheres are stirred in water at 38 to 50 ° C., the gelatin components in the microspheres are released from the microspheres, thereby forming pores where gelatin was present, thereby forming a porous polymer microsphere.
이때, 상기 불연속상 및 연속상의 유속은 각각 0.2 내지 1 mL/min일 수 있으며, 바람직하게는 0.5 mL/min일 수 있다. 상기 유속인 것이 다공도의 분산도가 우수하며, 목적하는 크기 및 다공도를 가지는 마이크로스피어의 제조가 가능하다. At this time, the flow rate of the discontinuous phase and the continuous phase may be 0.2 to 1 mL / min, respectively, preferably 0.5 mL / min. The flow rate is excellent in the degree of dispersion of porosity, it is possible to manufacture a microsphere having a desired size and porosity.
이러한 방법으로 제조된 마이크로스피어는 다공도(porosity)가 10 내지 90%이며, 기공의 크기가 5 내지 100 ㎛이고, 입자의 크기가 200 내지 1000 ㎛일 수 있으며, 바람직하게는 다공도가 60 내지 90 %이며, 형성된 기공의 크기가 10 내지 40 ㎛이고, 입자의 크기가 100 내지 400 ㎛인 마이크로스피어일 수 있다.The microspheres prepared in this way may have a porosity of 10 to 90%, a pore size of 5 to 100 μm, a particle size of 200 to 1000 μm, and preferably a porosity of 60 to 90%. It may be a microsphere having a pore size of 10 to 40 ㎛, the particle size of 100 to 400 ㎛.
본 발명에 따른 상기 다공성 고분자 마이크로스피어를 유효량 투여하여 골 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. An effective amount of the porous polymer microspheres according to the present invention can be administered to prevent or treat bone diseases.
여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001 g/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.As used herein, the term “effective amount” means the amount of an active ingredient or pharmaceutical composition that induces a biological or medical response in a tissue system, animal or human, as thought by a researcher, veterinarian, doctor or other clinician, Amounts that induce alleviation of the symptoms of the disease or disorder. The effective amount and frequency of administration for the active ingredient of the present invention may vary depending on the desired effect. Therefore, the optimum dosage to be administered can be readily determined by one skilled in the art and includes the type of disease, the severity of the disease, the amount of active ingredients and other ingredients contained in the composition, the type of formulation, and the age, weight, general health of the patient. It may be adjusted according to various factors, including the condition, sex and diet, time of administration, route of administration and rate of composition, duration of treatment, and drugs used simultaneously. In the prophylactic, therapeutic or ameliorating method of the present invention, it is preferable that an adult is administered at a dose of 0.001 g / kg to 1 g / kg when administered once to several times a day.
본 발명에 따른 상기 다공성 고분자 마이크로스피어는 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 비타민, 책색제, 중진제, 펙트산, 전해질제, 알긴산, 유기산, 탄산화제, 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.The porous polymer microspheres according to the present invention may be prepared using pharmaceutically acceptable and physiologically acceptable auxiliaries in addition to the active ingredient, and the auxiliaries include vitamins, colorants, neutralizing agents, pectic acids and electrolytes. , Alginic acid, organic acid, carbonation agent, excipient, disintegrant, sweetener, binder, coating agent, swelling agent, lubricant, glidant or flavoring agent and the like can be used.
상기 다공성 고분자 마이크로스피어는 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.The porous polymeric microspheres may be preferably formulated into a pharmaceutical composition including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredients described above for administration.
상기 다공성 고분자 마이크로스피어의 제제형태는 통상의 약제학적 조성물의 제제형태이면 특별히 제한은 없으나 바람직하게는 주사 가능한 액제(액상 용액)일 수 있으며, 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.The preparation form of the porous polymer microspheres is not particularly limited as long as it is in the form of a conventional pharmaceutical composition, but may preferably be an injectable liquid (liquid solution), and as an acceptable pharmaceutical carrier in a composition formulated into a liquid solution. As sterile and biocompatible, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components may be mixed and used. Other conventional additives, such as antioxidants, buffers, bacteriostatics, can be added accordingly. Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
본 발명에 따르면, 상기 다공성 고분자 마이크로스피어에 함유된 약물의 바람직한 농도는 1 ng/ml 내지 500 mg/ml 일 수 있으며, 함유된 약물의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상기 약물의 종류가 연골 또는 골의 재생을 위한 것이라면 바람직한 약물의 농도는 1 pg/ml 내지 20 mg/ml 일 수 있으며, 상기 약물의 종류가 염증 억제를 위한 것이라면 바람직한 약물의 농도는 1 ㎍/ml 내지 20 mg/ml 일 수 있으나, 환부의 경중에 따라 용이하게 달라질 수 있음은 자명한 사실이다.
According to the present invention, the preferred concentration of the drug contained in the porous polymer microspheres may be 1 ng / ml to 500 mg / ml, it may vary depending on the type of drug contained. For example, if the type of drug is for regeneration of cartilage or bone, the preferred drug concentration may be 1 pg / ml to 20 mg / ml, and if the type of drug is for inflammation inhibition, the preferred drug concentration may be It can be 1 μg / ml to 20 mg / ml, but it is obvious that it can easily vary depending on the weight of the affected area.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example
실시예Example 1. 다공성 고분자 1. Porous Polymer 마이크로스피어의Microsphere 제조( Produce( 심바스타틴Simvastatin 함유) contain)
디클로로메탄 7g에 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA) 140 mg을 용해시켜 2 중량% PLGA solution을 제조하였다. 750 mg의 젤라틴을 증류수 10 g에 용해시켜 7.5 중량% 젤라틴 수용액을 제조하였다. PLGA:젤라틴을 고형분을 기준으로 7:3 중량비로 혼합하고, 심바스타틴의 함량이 각각 1, 5 및 10 mM(2.94 g, 14.7 g 및 29.4 g)(2.1, 10.5 및 21 중량%)이 함유되도록 디메틸설폭사이드에 용해시킨 심바스타틴을 첨가하여 균질기(homogenizer, Ultra-Turrax T-25 Basic, IKA)를 사용하여 13,500 rpm으로 1분간 균질화하여 에멀젼을 제조하였다. A 2 wt% PLGA solution was prepared by dissolving 140 mg of polylactide-co-glycolide (PLGA) in 7 g of dichloromethane. 750 mg of gelatin was dissolved in 10 g of distilled water to prepare a 7.5 wt% gelatin aqueous solution. PLGA: gelatin is mixed in a 7: 3 weight ratio based on solids and dimethyl so that simvastatin contains 1, 5 and 10 mM (2.94 g, 14.7 g and 29.4 g) (2.1, 10.5 and 21 wt%), respectively An emulsion was prepared by adding simvastatin dissolved in sulfoxide and homogenizing at 13,500 rpm for 1 minute using a homogenizer (homogenizer, Ultra-Turrax T-25 Basic, IKA).
유체 장치에서 불연속상으로 상기 에멀젼을 이용하고, 연속상으로 0.5 중량% 폴리비닐알콜을 사용하여 0.5 mL/min의 유속으로 흘려주어 미소구체를 제조하였다. 제조된 미소구체에 증류수를 첨가하고 40 ℃의 증류수에서 교반하여 미소구체 내의 젤라틴을 용출시킴으로써 심바스타틴이 함유된 다공성 고분자 마이크로스피어를 제조하였다.
Microspheres were prepared by using the emulsion as a discontinuous phase in a fluid apparatus and flowing it at a flow rate of 0.5 mL / min using 0.5 wt% polyvinyl alcohol in a continuous phase. Distilled water was added to the prepared microspheres and stirred in distilled water at 40 ° C. to elute gelatin in the microspheres, thereby preparing a porous polymer microsphere containing simvastatin.
실시예Example 2. 다공성 고분자 2. Porous Polymer 마이크로스피어의Microsphere 제조( Produce( 프라바스타틴Pravastatin 함유) contain)
실시예 1과 동일하게 실시하되, 심바스타틴 대신 프라바스타틴을 첨가하여 다공성 고분자 마이크로스피어를 제조하였다.
In the same manner as in Example 1, but instead of simvastatin pravastatin was added to prepare a porous polymeric microsphere.
실시예Example 3. 다공성 고분자 3. Porous Polymer 마이크로스피어의Microsphere 제조(메바스타틴 함유) Manufacture (with mevastatin)
실시예 1과 동일하게 실시하되, 심바스타틴 대신 메바스타틴을 첨가하여 다공성 고분자 마이크로스피어를 제조하였다.
In the same manner as in Example 1, but instead of simvastatin, mevastatin was added to prepare a porous polymeric microsphere.
실시예Example 4. 다공성 고분자 4. Porous Polymer 마이크로스피어의Microsphere 제조(알렌드로네이트 함유) Manufacture (with Alendronate)
실시예 1과 동일하게 실시하되, 심바스타틴 대신 알렌드로네이트를 첨가하여 다공성 고분자 마이크로스피어를 제조하였다.
In the same manner as in Example 1, a porous polymer microsphere was prepared by adding allendronate instead of simvastatin.
실시예Example 5. 다공성 고분자 5. Porous Polymer 마이크로스피어의Microsphere 제조(덱사메타손 함유) Manufacture (with dexamethasone)
실시예 1과 동일하게 실시하되, 심바스타틴 대신 덱사메타손을 첨가하여 다공성 고분자 마이크로스피어를 제조하였다.
In the same manner as in Example 1, dexamethasone was added instead of simvastatin to prepare a porous polymer microsphere.
비교예Comparative example . 다공성 고분자 . Porous polymer 마이크로스피어의Microsphere 제조(약물 Manufacture 무함유Free ))
디클로로메탄 7g에 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA) 140 mg을 용해시켜 2 중량% PLGA solution을 제조하였다. 750 mg의 젤라틴을 증류수 10 g에 용해시켜 7.5 중량% 젤라틴 수용액을 제조하였다. PLGA:젤라틴을 고형분을 기준으로 7:3 중량비로 혼합하고, 균질기(homogenizer, Ultra-Turrax T-25 Basic, IKA)를 사용하여 13,500 rpm으로 1분간 균질화하여 에멀젼을 제조하였다. A 2 wt% PLGA solution was prepared by dissolving 140 mg of polylactide-co-glycolide (PLGA) in 7 g of dichloromethane. 750 mg of gelatin was dissolved in 10 g of distilled water to prepare a 7.5 wt% gelatin aqueous solution. The emulsion was prepared by mixing PLGA: gelatin in a 7: 3 weight ratio based on solids and homogenizing for 1 minute at 13,500 rpm using a homogenizer (homogenizer, Ultra-Turrax T-25 Basic, IKA).
유체 장치에서 불연속상으로 상기 에멀젼을 이용하고, 연속상으로 0.5 중량% 폴리비닐알콜을 사용하여 0.5 mL/min의 유속으로 흘려주어 미소구체를 제조하였다. 제조된 미소구체에 증류수를 첨가하고 40 ℃의 증류수에서 교반하여 미소구체 내의 젤라틴을 용출시킴으로써 다공성 고분자 마이크로스피어를 제조하였다.
Microspheres were prepared by using the emulsion as a discontinuous phase in a fluid apparatus and flowing it at a flow rate of 0.5 mL / min using 0.5 wt% polyvinyl alcohol in a continuous phase. Distilled water was added to the prepared microspheres, and stirred in distilled water at 40 ° C. to elute gelatin in the microspheres, thereby preparing a porous polymer microsphere.
시험예Test Example 1. 형태분석 1. Morphology Analysis
시험예Test Example 1.1. 주사전자현미경 관측 1.1. Scanning electron microscope observation
실시예 1의 방법으로 제조된 다공성 고분자 마이크로스피어의 형태를 확인하기 위하여 주사전자현미경으로 관측하였으며, 이를 하기 도 1에 나타내었다. In order to confirm the morphology of the porous polymer microsphere prepared by the method of Example 1 was observed by a scanning electron microscope, which is shown in Figure 1 below.
도 1은 실시예 1에 따른 심바스타틴 함유 다공성 고분자 마이크로스피어(이하, '마이크로스피어'라 한다) 및 비교예에 따른 심바스타틴을 함유하지 않은 다공성 고분자 마이크로스피어를 비교하여 나타낸 이미지이다. 각 농도별 마이크로스피어의 표면 및 기공의 크기들은 유사한 형태를 나타내었으며, 약물의 농도에 따라서 유의적인 수준의 차이를 나타내었다.
FIG. 1 is an image showing a comparison of simvastatin-containing porous polymer microspheres according to Example 1 (hereinafter referred to as “microspheres”) and porous polymer microspheres containing no simvastatin according to a comparative example. The surface and pore size of the microspheres at each concentration showed a similar shape and showed a significant level difference depending on the concentration of the drug.
한편, 약물의 농도에 따른 기공크기 변화를 확인하기 위하여 심바스타틴의 농도를 1에서 10 %까지 단계적으로 증가시키면서 마이크로스피어를 제조하였으며, 주사전자현미경으로 측정하여 하기 도 1 및 표 1에 나타내었다.On the other hand, the microspheres were prepared by increasing the concentration of simvastatin step by step from 1 to 10% in order to confirm the pore size change according to the concentration of the drug, it is shown in Figure 1 and Table 1 measured by a scanning electron microscope.
표 1을 참고로 하면, 약물의 농도에 따라 기공의 크기가 증가되는 것을 확인하였다.
Referring to Table 1, it was confirmed that the pore size increases with the concentration of the drug.
시험예Test Example 2. 약물방출 거동 2. Drug Release Behavior
실시예 1에서 제조한 마이크로스피어의 약물방출 거동을 확인하였다. 구체적으로, 각각의 마이크로스피어를 1 ml의 PBS 버퍼(pH 7.4)에 넣고, 37 ℃에서 100 rpm으로 교반하면서 시간(1시간, 3시간, 6시간, 10시간, 1일, 3일, 5일, 7일, 10일, 14일, 21일 및 28일)에 따른 약물 방출량을 확인하였으며, 측정 후에는 새로운 버퍼로 교환하였다. 방출된 약물은 250 nm에서 흡광도를 측정하여 방출량을 분석하였으며, 이를 하기 도 2에 나타내었다. The drug release behavior of the microspheres prepared in Example 1 was confirmed. Specifically, each microsphere was placed in 1 ml of PBS buffer (pH 7.4) and stirred at 100 rpm at 37 ° C. for 1 hour, 3 hours, 6 hours, 10 hours, 1 day, 3 days, 5 days , 7 days, 10 days, 14 days, 21 days and 28 days) was confirmed, and after the measurement was replaced with fresh buffer. The released drug was analyzed by measuring the absorbance at 250 nm, which is shown in Figure 2 below.
도 2을 참고로 하면, 심바스타틴의 농도에 의존적으로 약물의 방출량이 증가하였다.
Referring to FIG. 2, the amount of drug released increased depending on the concentration of simvastatin.
시험예Test Example 3. 조골세포 분화 촉진 효과 검증 3. Verification of osteoblast differentiation promoting effect
시험예Test Example 3.1. 알칼리성 3.1. Alkaline 포스파타제Phosphatase 활성도 평가 Activity evaluation
조골세포의 초기 골 분화 지표인 알칼리성 포스파타제 활성도 측정을 통해 실시예 1 에 따른 심바스타틴이 함유 된 다공성 고분자 마이크로스피어의 골융합 효능을 평가하였다. The bone fusion efficacy of the porous polymer microspheres containing simvastatin according to Example 1 was evaluated by measuring alkaline phosphatase activity, an early bone differentiation index of osteoblasts.
각각의 실시예 및 비교예의 마이크로스피어에 1×105 개의 줄기세포를 분주한 후, 3일, 7일, 10일 및 14일 동안 분화 및 배양하였다. 줄기세포가 분주된 곳에 배양 후, 세포를 PBS 버퍼로 세척한 뒤, 상기 세포에 1×RIPA 버퍼를 주입하고 4 ℃에서 110 W로 1분 동안 초음파 처리하였다. 다음으로, 용해된 세포를 4 ℃에서 3분 동안 13,500 rpm으로 원심분리한 뒤, 상층액에 p-니트로페닐포스파테이트 용액을 첨가하여 37 ℃에서 30분 동안 배양한 후, 500 mL의 1 N NaOH로 반응을 종결시켰다. 405 nm에서 흡광도를 측정하였으며 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
After dispensing 1 × 10 5 stem cells into the microspheres of each Example and Comparative Example, they were differentiated and cultured for 3 days, 7 days, 10 days and 14 days. After culturing where the stem cells were dispensed, the cells were washed with PBS buffer, 1 × RIPA buffer was injected into the cells and sonicated for 1 minute at 110 W at 4 ° C. Next, the lysed cells were centrifuged at 13,500 rpm for 3 minutes at 4 ° C., and then incubated at 37 ° C. for 30 minutes by adding p-nitrophenylphosphate solution to the supernatant, followed by 500 mL of 1 N. The reaction was terminated with NaOH. Absorbance was measured at 405 nm and the results are shown in Table 2 below.
표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 내지 5에 따른 다공성 고분자 마이크로스피어에서 조골세포로 분화한 줄기세포에 대한 초기 골 분화 지표인 알칼리성 포스파타제 활성도가 비교예와 비교하여 유효성 있게 증가하는 것으로 평가되었다. As shown in Table 2, the alkaline phosphatase activity, which is an initial bone differentiation index for stem cells differentiated into osteoblasts in the porous polymer microspheres according to Examples 1 to 5, was effectively increased as compared with the comparative example.
시험예 3.2. 칼슘 침착 평가Test Example 3.2. Calcium Deposition Assessment
조골세포의 후기 골 분화 지표인 칼슘 침착 농도 측정을 통해 실시예 1 에 따른 심바스타틴이 함유 된 다공성 고분자 마이크로스피어의 골융합 효능을 평가하였다. The bone fusion efficacy of the porous polymer microspheres containing simvastatin according to Example 1 was evaluated by measuring calcium deposition concentration, which is a late bone differentiation index of osteoblasts.
구체적으로, 실시예 1 및 비교예 1의 마이크로스피어에 1×105 개의 줄기세포를 분주한 후, 7일, 14일 및 21일 동안 분화 및 배양하였다. 배양 후, 세포를 PBS 버퍼로 세척한 뒤, Tris-EDTA 용액으로 각각의 나노입자로부터 세포를 떼어내었다. 떼어낸 세포는 13,500 rpm으로 1분간 원심분리한 뒤, 0.1 % 트리톤 X-100 용액을 세포에 넣고, 65 ℃에서 3시간 보관 후 초음파를 가하여 세포의 막을 분쇄하고, 원심분리를 하였다. 상층액을 분리한 뒤, QuantiChrom TM Calcium Assay 키트를 이용하여 612nm에서 흡광도를 측정 비교하여 칼슘 침착 정도를 분석하였으며, 이를 하기 표 3에 나타내었다. Specifically, 1 × 10 5 stem cells were dispensed into the microspheres of Example 1 and Comparative Example 1, and then differentiated and cultured for 7 days, 14 days, and 21 days. After incubation, the cells were washed with PBS buffer and then cells were removed from each nanoparticle with Tris-EDTA solution. The separated cells were centrifuged at 13,500 rpm for 1 minute, 0.1% Triton X-100 solution was added to the cells, stored at 65 ° C. for 3 hours, and then ultrasonically applied to crush the membranes of the cells, followed by centrifugation. After separating the supernatant, using a QuantiChrom Calcium Assay kit was measured by comparing the absorbance at 612nm to analyze the calcium deposition degree, it is shown in Table 3 below.
표 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 내지 5의 다공성 고분자 마이크로스피어에서 조골세포로 분화한 줄기세포에 대한 칼슘 침착 농도가 비교예와 비교하여 유효성 있게 증가하는 것으로 평가되었다. As shown in Table 3, it was evaluated that the calcium deposition concentration for stem cells differentiated into osteoblasts in the porous polymer microspheres of Examples 1 to 5 was increased effectively compared to the comparative example.
시험예Test Example 4. 연골세포 분화 촉진 효과 검증 4. Verification of cartilage cell differentiation promoting effect
시험예Test Example 4.1. 4.1. GAGGAG 분석 analysis
연골세포의 분화 마커인 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG)를 측정하여 실시예 1 에 따른 심바스타틴이 함유된 다공성 고분자 마이크로스피어의 연골세포 분화를 평가하였다. 구체적으로, 실시예 1 및 비교예 1의 마이크로스피어에 1×105 개의 줄기세포를 분주한 후, 7일, 14일 및 21일 동안 분화 및 배양하였다. 배양 후, 세포를 PBS 버퍼로 세척한 뒤, Tris-EDTA 용액으로 각각의 나노입자로부터 세포를 떼어내었다. 떼어낸 세포는 13,500 rpm으로 1분간 원심분리한 뒤, 0.1 % 트리톤 X-100 용액을 세포에 넣고, 4 ℃에서 1분간 초음파를 가하여 세포의 막을 분쇄하고, 원심분리를 하였다. qG-DEX™ IIc Genomic DNA Extraction Kit를 이용하여 DNA를 분리하고, NanoDrop을 통해 260/280 nm에서 DNA 농도를 측정하였다. 그리고, Dimethylmethylene blue(DMMB) assay를 한 후 525nm에서 흡광도를 측정하고 GAG를 정량 분석하여, 하기 표 4에 나타내었다. Glycosaminoglycan (GAG), which is a differentiation marker of chondrocytes, was measured to evaluate chondrocyte differentiation of the porous polymer microspheres containing simvastatin according to Example 1. Specifically, 1 × 10 5 stem cells were dispensed into the microspheres of Example 1 and Comparative Example 1, and then differentiated and cultured for 7 days, 14 days, and 21 days. After incubation, the cells were washed with PBS buffer and then cells were removed from each nanoparticle with Tris-EDTA solution. The separated cells were centrifuged at 13,500 rpm for 1 minute, 0.1% Triton X-100 solution was added to the cells, and ultrasonic membrane was applied at 4 ° C. for 1 minute to crush the membranes of the cells, followed by centrifugation. DNA was isolated using qG-DEX ™ IIc Genomic DNA Extraction Kit and the DNA concentration was measured at 260/280 nm via NanoDrop. In addition, after performing a dimethylmethylene blue (DMMB) assay, the absorbance was measured at 525 nm, and the quantitative analysis of GAG is shown in Table 4 below.
표 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 내지 5의 다공성 고분자 마이크로스피어에서 연골세포로 분화한 줄기세포에 대한 GAG/DNA 농도가 비교예와 비교하여 유효성 있게 증가하는 것으로 평가되었다. As shown in Table 4, the GAG / DNA concentrations of the stem cells differentiated into chondrocytes in the porous polymer microspheres of Examples 1 to 5 were evaluated to increase effectively compared with the comparative example.
시험예Test Example 5.2. 유전자 발현 분석 5.2. Gene expression analysis
연골세포의 후기 분화 마커 유전자(Aggrecan, COL1A1, COL2A1 및 COL10A1)의 발현 분석을 통해 실시예에 따른 다공성 고분자 마이크로스피어의 연골세포 분화를 평가하였다. 구체적으로, 실시예 및 비교예의 마이크로스피어에 1×105 개의 줄기세포를 분주한 후, 21일 동안 분화 및 배양하였다. 배양 후, 세포를 PBS 버퍼로 세척한 뒤, Tris-EDTA 용액으로 각각의 마이크로스피어로부터 세포를 떼어내었다. 떼어낸 세포는 13,500 rpm으로 1분간 원심분리한 뒤, 세포에 Trizol 시약 용액과 클로로포름을 넣어주고, 4 ℃에서 1분간 초음파를 가하여 세포를 분리한 뒤, 원심분리를 하였다. 상층액을 분리한 뒤, RNeasy Mini kit(RNeasy mini kit; Qiagen, Doncaster, VIC, Austraila)를 이용하여 NanoDrop 260/280 nm에서 RNA 농도를 측정하였다. 분리된 RNA는 AccuPower RT-PCR PreMix(Bioneer, Korea)이용하여 cDNA 합성 및 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)으로 분석하여 각 유전자의 발현양을 하기 표 5에 나타내었다.
Chondrocyte differentiation of the porous polymeric microspheres according to the examples was evaluated through expression analysis of late differentiation marker genes (Aggrecan, COL1A1, COL2A1 and COL10A1) of chondrocytes. Specifically, 1 × 10 5 stem cells were dispensed into the microspheres of Examples and Comparative Examples, and then differentiated and cultured for 21 days. After incubation, the cells were washed with PBS buffer and then cells were removed from each microsphere with Tris-EDTA solution. The separated cells were centrifuged at 13,500 rpm for 1 minute, and then Trizol reagent solution and chloroform were added to the cells, and the cells were separated by ultrasonication at 4 ° C. for 1 minute, followed by centrifugation. After the supernatant was separated, RNA concentration was measured at NanoDrop 260/280 nm using RNeasy Mini kit (RNeasy mini kit; Qiagen, Doncaster, VIC, Austraila). The isolated RNA was analyzed by cDNA synthesis and real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) using AccuPower RT-PCR PreMix (Bioneer, Korea).
GAPDHAggrecan /
GAPDH
표 5에 나타낸 바와 같이, 비교예는 연골분화에 관련된 유전자의 발현이 없었으나, 본 발명에 따른 실시예 1 내지 5의 다공성 고분자 마이크로스피어에서 연골세포로 분화한 줄기세포에 대한 연골분화(aggrecan, COL10A1, COL1A1 및 COL2A1) 관련된 후기 마커 유전자들의 발현이 증가하였다. 따라서, 본 발명에 따른 실시예 의 약물 탑재 다공성 고분자 마이크로스피어는 연골분화에 효과적임을 입증하였다.
As shown in Table 5, the comparative example did not have expression of genes related to cartilage differentiation, but cartilage differentiation for stem cells differentiated into chondrocytes in the porous polymer microspheres of Examples 1 to 5 according to the present invention (aggrecan, COL10A1, COL1A1 and COL2A1) increased expression of related late marker genes. Thus, the drug-loaded porous polymer microspheres of the examples according to the present invention proved effective in cartilage differentiation.
시험예 6. 염증 억제 효과 검증Test Example 6 Verification of Inhibitory Effect
염증 마커 유전자의 발현 분석을 통해 실시예 1 내지 5에 따른 다공성 고분자 마이크로스피어의 염증 효능을 평가하였다. Inflammation efficacy of the porous polymer microspheres according to Examples 1 to 5 was evaluated through expression analysis of the inflammatory marker genes.
실시예 및 비교예의 마이크로스피어에 1×105 개의 줄기세포를 분주한 후, 1, 및 3일 동안 분화 및 배양하였다. 배양 후, Trizol 시약 용액과 클로로포름을 넣어주고, 4 ℃에서 30분간 초음파를 가하여 세포를 분리한 뒤, 원심분리를 하였다. 상층액을 분리한 뒤, RNeasy Mini kit(RNeasy mini kit; Qiagen, Doncaster, VIC, Austraila)를 이용하여 NanoDrop 260/280 nm에서 RNA 농도를 측정하였다. RNA를 분리한 뒤, 분리된 RNA는 AccuPower RT-PCR PreMix(Bioneer, Korea)이용하여 cDNA 합성 및 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)으로 분석하였으며, 염증 마커인 COX-2, IL-6 및 TNF-α의 발현양을 측정하여 하기 표 6에 나타내었다.After dispensing 1 × 10 5 stem cells into microspheres of Examples and Comparative Examples, they were differentiated and cultured for 1 and 3 days. After incubation, Trizol reagent solution and chloroform were added, and the cells were separated by ultrasonication at 4 ° C. for 30 minutes, followed by centrifugation. After the supernatant was separated, RNA concentration was measured at NanoDrop 260/280 nm using RNeasy Mini kit (RNeasy mini kit; Qiagen, Doncaster, VIC, Austraila). After RNA was isolated, the isolated RNA was analyzed by cDNA synthesis and real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) using AccuPower RT-PCR PreMix (Bioneer, Korea), and COX-2 and IL-6 as inflammatory markers. And TNF-α expression was measured and shown in Table 6 below.
표 6을 참조로 하면, 비교예는 염증이 유지되는 반면, 본 발명에 따른 실시예의 다공성 고분자 마이크로스피어에서는 염증 마커인 COX-2, IL-6 및 TNF-α이 심바스타틴의 농도에 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.Referring to Table 6, while the comparative example is maintained inflammation, the inflammation markers COX-2, IL-6 and TNF-α in the porous polymer microsphere of the embodiment according to the present invention is reduced depending on the concentration of simvastatin It was confirmed.
시험예 7. 다공성 고분자 마이크로스피어의 기공 크기에 따른 세포 증식도Test Example 7 Cell Proliferation According to Pore Size of Porous Polymer Microspheres
본 발명의 다공성 고분자 마이크로스피어는 제조 과정에서 첨가되는 젤라틴(gelatin)의 농도에 따라 기공 크기 및 탑재되는 약물의 용량을 조절할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 마이크로스피어의 제조 과정에서 첨가되는 젤라틴 수용액에서의 젤라틴 농도(1 중량%, 7.5 중량% 및 15 중량%)에 따라 서로 다른 기공 크기를 가지는 마이크로스피어에서의 세포증식 정도를 측정하고자 하였다. 도 3은 젤라틴의 농도(1 중량%, 7.5 중량% 및 15 중량%)에 따라 서로 다른 기공 크기를 가지는 마이크로스피어의 주사전자현미경 이미지이다. Porous polymer microspheres of the present invention has the advantage of controlling the pore size and the dose of drug to be loaded according to the concentration of gelatin (gelatin) added during the manufacturing process. Therefore, the degree of cell proliferation in microspheres having different pore sizes was determined according to the gelatin concentration (1 wt%, 7.5 wt% and 15 wt%) in the gelatin aqueous solution added during the preparation of the microspheres. 3 is a scanning electron microscope image of microspheres having different pore sizes depending on the concentration of gelatin (1 wt%, 7.5 wt% and 15 wt%).
이를 위하여 먼저, 1×105개의 성체줄기세포를 서로 다른 기공 크기를 가진 다공성 입자에 조심스럽게 넣고 1일, 3일, 및 7일을 배양하였다. 배양 1일, 3일 및 7일 후, 세포를 인산완충용액을 이용하여 세척하였다. 세척 후, CCK-8 증식 키트 시약(Tetrazolium salt 시약, Cell Counting kit-8, Dojindo, 미국)을 넣고 1시간 배양한 후에, 배양액을 96-웰 플레이트에 조심스럽게 옮긴 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 도 4에 나타내었다.To this end, 1 × 10 5 adult stem cells were carefully placed in porous particles having different pore sizes, and then cultured for 1 day, 3 days, and 7 days. After 1, 3 and 7 days of culture, the cells were washed with phosphate buffer solution. After washing, add CCK-8 growth kit reagent (Tetrazolium salt reagent, Cell Counting kit-8, Dojindo, USA) and incubate for 1 hour, and then carefully transfer the culture to a 96-well plate and measure the absorbance at 450 nm. 4 is shown.
도 4를 참조하면, 젤라틴의 농도(1 중량%, 7.5 중량% 및 15 중량%)에 따른 서로 다른 기공 크기를 가진 다공성 입자에서 배양된 성체줄기세포는 1일, 3일 및 7일 후에 점진적으로 세포가 활발하게 증식이 되었으나, 다른 그룹(젤라틴 1 중량% 및 7.5 중량%)에 비해 고농도 젤라틴(15 중량%)에 의해 만들어진 다공성 입자는 기공의 크기가 상대적으로 넓기 때문에 세포 증식이 저하되는 것을 확인할 수 있었다.
Referring to FIG. 4, adult stem cells cultured in porous particles having different pore sizes according to the concentration of gelatin (1% by weight, 7.5% by weight and 15% by weight) are gradually grown after 1 day, 3 days and 7 days. Cells proliferated vigorously, but porous particles made by high concentration of gelatin (15% by weight) compared to other groups (1% by weight and 7.5% by weight of gelatin) showed that the cell proliferation was reduced due to the relatively large pore size. Could.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to preferred examples. However, these examples are intended to illustrate the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited thereto.
Claims (23)
2) 상기 고분자용액 및 젤라틴(gelatin) 수용액을 첨가하고 균질화하여 에멀젼을 제조하는 단계;
3) 상기 에멀젼을 불연속상(discontinuous phase)으로 사용하고, 폴리비닐알콜 용액을 연속상(continuous phase)로 사용하여 유체 장치(fluidic device)에서 흘려주어 생체적합성 고분자, 골 질환 또는 연골 질환의 치료용 약물인 심바스타틴, 프라바스타틴, 메바스타틴 또는 덱사메손, 및 젤라틴을 포함하는 고분자 미소구체를 제조하는 단계; 및
4) 38 내지 50℃의 물에 상기 고분자 미소구체를 넣고 교반하여 고분자 미소구체로부터 젤라틴을 용출시키는 단계;를 포함하는 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조방법.1) biocompatible polymers; And preparing a polymer solution by dissolving simvastatin, pravastatin, mevastatin or dexamethasone in an organic solvent as a drug for treating bone disease or cartilage disease.
2) preparing an emulsion by adding and homogenizing the polymer solution and gelatin solution;
3) The emulsion is used as a discontinuous phase and the polyvinyl alcohol solution is used as a continuous phase to flow in a fluidic device for treating biocompatible polymers, bone diseases or cartilage diseases. Preparing a polymeric microsphere comprising a drug simvastatin, pravastatin, mevastatin or dexamethone, and gelatin; And
4) Method of preparing a porous polymer microsphere for preventing or treating bone diseases or cartilage diseases comprising the step of eluting gelatin from the polymer microspheres by stirring the polymer microspheres in water at 38 to 50 ℃.
상기 생체적합성 고분자 10 중량부에 대하여 상기 약물 2 내지 30 중량부로 함유되는 것을 특징으로 하는 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조방법.The method of claim 10,
Method for producing a porous polymer microspheres for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases, characterized in that it contains 2 to 30 parts by weight of the drug with respect to 10 parts by weight of the biocompatible polymer.
상기 생체적합성 고분자 10 중량부에 대하여 상기 젤라틴 3 내지 15 중량부를 첨가하여 균질화하는 것을 특징으로 하는 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조방법.The method of claim 10,
Method for producing a porous polymer microspheres for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases characterized in that the homogenization by adding 3 to 15 parts by weight of the gelatin with respect to 10 parts by weight of the biocompatible polymer.
상기 생체적합성 고분자는 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리아미노산, 폴리락타이트, 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리오르소에스테르, 폴리히드록시발레이트, 폴리히드록시부티레이트, 히아루론산, 셀룰로오스, 헤파린, 콜라겐, 알지네이트 및 키토산 중에서 선택되는 어느 하나; 이들 둘 이상이 블랜딩된 고분자; 및 이들 둘 이상의 공중합체로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조방법.The method of claim 10,
The biocompatible polymer is polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), polylactide-co-glycolide (PLGA), polycaprolactone (PCL), polyamino acid, polylactite, polyphosphazine, polyimino Carbonate, polyphosphoester, polyanhydride, polyorthoester, polyhydroxyvalate, polyhydroxybutyrate, hyaluronic acid, cellulose, heparin, collagen, alginate and chitosan; Polymers in which two or more of these are blended; And a method for producing a porous polymeric microsphere for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases, characterized in that selected from the group consisting of two or more copolymers.
상기 2) 단계는 에멀젼 안정화제 0.5 내지 3 중량부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조방법.The method of claim 10,
Step 2) is a method for producing a porous polymer microspheres for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases, characterized in that further comprises 0.5 to 3 parts by weight of an emulsion stabilizer.
다공도(porosity)가 10 내지 90 %이며, 기공의 크기가 5 내지 100 ㎛이고, 입자의 크기가 200 내지 1000 ㎛인 것을 특징으로 하는 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조방법.The method of claim 10,
Preparation of porous polymeric microspheres for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases, characterized in that the porosity is 10 to 90%, the pore size is 5 to 100 ㎛, the particle size is 200 to 1000 ㎛ Way.
다공도(porosity)가 60 내지 90 %이며, 기공의 크기가 10 내지 40 ㎛이고, 입자의 크기가 100 내지 400 ㎛인 것을 특징으로 하는 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조방법.The method of claim 10,
Preparation of porous polymeric microspheres for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases characterized in that the porosity (60 to 90%), the pore size is 10 to 40 ㎛, the particle size is 100 to 400 ㎛ Way.
상기 골 질환은 성장기 발육부진, 골감소증, 골 취약증, 골 괴사, 골절, 과도한 파골세포의 골 흡수에 의한 골다공증(osteoporosis), 골형성부전증, 뼈의 손상, 외상에 의한 관절손상, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사성 골질환, 신성골이영양증(renal osteodystrophy), 치주질환(periodontal disease), 파제트병(Paget disease) 및 전이성 골암(metastatic bone cancers)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고,
상기 연골 질환은 퇴행성 관절염(degenerative arthritis), 염증성 관절염(inflammatory arthritis), 골연골종증(osteochondromatosis), 염좌(distortion), 윤활낭염(bursitis), 반월상 연골 손상(menstruation), 원판형 반월상 연골파열(meniscal tear), 반월상 연골 낭포(meniscus cyst), 측부 인대 손상(collateral ligamentrupture), 전방십자인대 손상(anterior cruciate ligament injury), 후방뒤십자인대 손상(posterior cruciate ligament injury), 관절 내 유리체(intra-articular vitreous), 박리성 뼈연골염(exfoliation osteochondritis), 추벽 증후군(plica syndrome), 내반슬(genu varum), 외반슬(knock-knee) 및 발음성 슬관절(snapping knee)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조방법.The method of claim 10,
The bone diseases include growth stage development, osteopenia, bone weakness, bone necrosis, fractures, osteoporosis due to excessive absorption of osteoclasts (osteoporosis), bone dysplasia, bone damage, joint damage due to trauma, osteomalacia, rickets, Fibrous osteoarthritis, aplastic bone disease, metabolic bone disease, renal osteodystrophy, periodontal disease, paget disease and metastatic bone cancers,
The cartilage diseases include degenerative arthritis, inflammatory arthritis, osteochondromatosis, sprain, bursitis, meniscus, discoid meniscus tear meniscal tear, meniscus cyst, collateral ligamentrupture, anterior cruciate ligament injury, posterior cruciate ligament injury, intratraarticular vitreous -articular vitreous, exfoliation osteochondritis, plica syndrome, genu varum, knock-knee and pronounced knee Method for producing a porous polymer microspheres for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases.
상기 2) 단계는 균질기로 8,000 내지 20,000 rpm으로 30초 내지 10분간 균질화하는 것을 특징으로 하는 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조방법. The method of claim 10,
Step 2) is a method for producing a porous polymer microspheres for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases, characterized in that homogenizing for 30 seconds to 10 minutes at 8,000 to 20,000 rpm with a homogenizer.
생체적합성 고분자의 함량 대비 젤라틴, 약물 또는 이들 둘의 함량을 조절하여 약물의 배출량 및 배출속도가 조절되는 것을 특징으로 하는 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조방법. The method of claim 10,
Method for producing a porous polymer microsphere for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases, characterized in that by controlling the content of the gelatin, drug or the content of the biocompatible polymer to control the discharge and discharge rate of the drug.
상기 젤라틴 수용액은 1 내지 10 중량% 젤라틴 수용액인 것을 특징으로 하는 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조방법.The method of claim 10,
The gelatin aqueous solution is a method for producing a porous polymer microspheres for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases, characterized in that 1 to 10% by weight gelatin aqueous solution.
상기 불연속상 및 연속상의 유속은 각각 0.2 내지 1 mL/min인 것을 특징으로 하는 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조방법.The method of claim 10,
The flow rate of the discontinuous phase and the continuous phase is 0.2 to 1 mL / min, respectively, a method for producing a porous polymer microspheres for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases.
상기 유기용매는 디메틸설폭사이드, 디클로로메탄, 테트라하이드로퓨란 및 N,N-디메틸포름아미드 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 골 질환 또는 연골 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어의 제조방법.The method of claim 10,
The organic solvent is one or two or more selected from dimethyl sulfoxide, dichloromethane, tetrahydrofuran, and N, N-dimethylformamide, wherein the porous polymer microspheres for the prevention or treatment of bone diseases or cartilage diseases Manufacturing method.
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