KR101352135B1

KR101352135B1 - 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법

Info

Publication number: KR101352135B1
Application number: KR1020110119197A
Authority: KR
Inventors: 백문창; 조영은; 김상현; 김은정; 정호상; 안준익
Original assignee: 대한민국 (식품의약품안전처장); 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2011-11-15
Filing date: 2011-11-15
Publication date: 2014-01-16
Also published as: KR20130053349A

Abstract

본 발명은 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것으로서, 상기 바이오마커 조성물 및 진단방법을 통해, 시스플라틴이 간독성을 일으켰는지의 여부를 용이하게 확인할 수 있다. 시스플라틴은 항암효과가 탁월함에도 불구하고, 간독성이 유발될 수 있어 항암치료에 일부 제한이 있었던 약물이었기에, 상기 방법을 통해 시스플라틴으로 인해 일어나는 간독성을 조기에 진단하여 항암치료 및 간독성 억제를 효과적으로 할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법 {Biomarker composition for diagnosis of hepatotoxicity induced by cisplatin and the method of diagnosis for thereof}

본 발명은 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.

간독성(肝毒性), 또는 간세포독성(肝細胞毒性)은 약물투여 등으로 인해 간이 손상된 상태를 의미한다. 간은 체내로 들어온 약물을 안전한 물질로 변환시켜 이에 대한 독성을 제거하는 역할을 하지만, 이러한 물질들이 체내로 과량 유입될 경우에는 간 독성이 일어날 수도 있다. 또한, 약물 이외에도 실험용이나 산업용으로 쓰이는 화학물질, 천연물 유래의 화합물, 약용식물 유래의 추출물들도 간독성을 유발할 수 있다. 한편, 약물로 인해 유도된 간독성, 즉, 약인성 간손상(DILI, drug-induced liver injury)은 급성 간독성의 주요 원인이라고 할 수 있다. 약인성 간손상은 정도가 아주 약한 간독성에서부터 급성간부전증(acute liver failure)까지를 모두 말할 수 있으며, 크게 내인성 간독성 및 특이체질성 간독성 현상으로 분류된다. 내인성 간독성은 주로 직접적인 약물 반응, 약물의 대사물에 대한 반응 등을 통해 유도되는 현상을 말하며, 특이체질성 간독성은 약물의 농도에 따라 유도되는 현상을 말한다.

프로테오믹스(proteomics)는 독성 현상을 분석하고 상기 독성 현상에 대한 새로운 바이오마커를 발견할 수 있는 방법 중의 하나로서, 2차원 겔 전기영동(2-DE, two-dimensional gel electrophoresis)과 질량분석법(mass spectrometry) 등을 이용해서 독성반응시 증감하는 단백질을 분석할 수 있으며, 이에 대한 신호전달 시스템을 분석하거나, 새로운 독성 모델을 예측할 수 있다. 이미 독성 모델에서 2차원 겔 전기영동을 이용하여, 항산화제를 이용할 때 발현되는 단백질이나, 생존과 관련된 여러 단백질의 발현 여부를 확인한 바 있으며, 최근에는 LC-MS/MS와 같은 기술의 발달에 따라, 이전보다 더 많은 독성 기작에 관계된 단백질을 분석할 수 있게 되었다. 약인성 간손상 현상 또한 프로테오믹스를 통해 다양한 생체 매커니즘의 분석이 가능해졌다. 예를 들어, 독소루비신(doxorubicin, 항암제)의 독성 현상을 2차원 겔 전기영동과 LC-MS/MS를 통해 분석한 바 있으며(Hammer, E. et al .), 아세트아미노펜(acetaminophen, 타이레놀)(Rueppm, S. U. et al .)과 프로피코나졸(propiconazole, 목재방부제나 농약으로 주로 사용됨)(Ortiz, P. A. et al .)의 독성 현상에 대해서도 단백질 발현량을 분석한 바 있다.

시스플라틴[cisplatin, cis-diamminechloroplatinum (II)]은 백금원자에 2개의 염소와 암모니아가 배위한 화합물로서, 강력한 항암효과가 있다고 알려져 있는 화합물이며, 다양한 암 치료에 이용되고 있다(Van Basten, J. P. et al . ; Saad, S. Y. et al .). 시스플라틴은 DNA에 반응하여 DNA 사슬 사이 혹은 사슬 내에서 가교를 형성하여 DNA 합성을 저해함으로써 다양한 암세포의 세포 증식 및 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 시스플라틴은 신장독성이나 간독성 등과 같은 부작용이 있어 항암제로서의 사용이 종종 제한되고 있다(Madias, N. E. and Harrington, J. T.). 한편, 시스플라틴이 일으키는 신장독성에 대해서는 분자생물학적 기작이 많이 알려져 있지만, 간독성에 대해서는 아직 알려진 바가 많지 않다. 다만, 시스플라틴이 간독성을 일으키면 혈청 아미노기 전이 효소(serum transaminases), 혈청 알칼리성 인산가수분해효소(serum alkaline phosphatase), 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase), 빌리루빈(bilirubin), c-글루타밀 트랜스펩티데이즈(c-glutamyl transpeptidase) 등이 증가된다고 보고된 바가 있다(Cavalli, F. et al .). 최근의 시스플라틴에 대한 연구는 시스플라틴으로 인해 유도될 수 있는 간독성을 억제하기 위해 셀레늄이나 비타민 E 등의 다양한 보조제를 이용하는 것에 집중되고 있는데, 이는 산화 스트레스가 간독성의 가장 중요한 메카니즘이라고 보고되었기 때문이다.

한편, 본 발명에서는 시스플라틴이 일으키는 간독성을 프로테오믹스(proteomics)와 지노믹스(genomics)를 이용하여 분석함으로써, 시스플라틴으로 인해 간독성이 유도될 때 증감하는 유전자들을 확인하였고, 이에 대한 분자생물학적 기작을 이해할 수 있게 되었으며, 시스플라틴으로 유도된 간독성을 진단할 수 있는 진단제와 진단방법을 제공할 수 있게 되었다.

Van Basten, J. P. et al., Current concept about testicular cancer. Eur. J. Surg. Oncol., 1997, 23, 354-360. Saad, S. Y. et al., Effects of gemcitabine on cisplatin-induced nephrotoxicity in rats: schedule-dependent study. Pharmacol. Res., 2001, 43, 193-198. Madias, N. E. and Harrington, J. T., Platinum nephrotoxicity., 1978, 65, 307-314. Cavalli, F. et al., Cisplatin-induced hepatic toxicity. Cancer Treat. Rep., 1978, 62, 21252126. Hammer, E. et al., Proteomic analysis of doxorubicin-induced changes in the proteome of HepG2cells combining 2-D DIGE and LC-MS/MS approaches. Proteomics, 2010, 10, 99-114. Rueppm, S. U. et al., Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver. Toxicol. Sci., 2002, 65, 135-150. Ortiz, P. A. et al., Proteomic analysis of propiconazole responses in mouse liver: comparison of genomic and proteomic profiles. J. Proteome Res., 2010, 9, 1268-1278. Figliomeni, M. L. and Abdel-Rahman, M. S., Ethanol does not increase the hepatotoxicity of cocaine in primary rat hepatocyte culture. Toxicology, 1998, 129, 125-135. Han, C. L., et al., A multiplexed quantitative strategy for membrane proteomics : opportunities for mining therapeutic targets for autosomal dominant polycystic kidney disease. Mol. Cell Proteomics, 2008, 7, 1983-1997. Kohler G. and Milstein C., Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion. European J. Immunology, 1976, 6, 511~519. Clackson, et al., Making antibody fragments using phage display libraries. Nature, 1991, 352, 624~628. Marks, et al., J. Mol. Biol., 1991, 222, 58, 1~597.

본 발명의 목적은 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 진단용 바이오마커 조성물은 하기 단백질 군에서 선택된 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함할 수 있다.

<시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 단백질>

fructose 1,6-bisphosphatase 1 (FBP1, Accession No. IPI00231745) ;

fatty acid synthase (FASN, Accession No. IPI00200661) ;

catalase (CAT, Accession No. IPI00231742) ;

peroxiredoxin-1 (PRDX1, Accession No. IPI00211779) ;

60kDa heat shock protein (HSPD1, Accession No. IPI00763910) ;

malate dehydrogenase 2 (MDH2, Accession No. IPI00197696) ;

arginase 1 (ARG1, Accession No. IPI00327518) ;

tropomyosin 1 (TPM1, Accession No. IPI00210945) ;

tropomyosin 3 (TPM3, Accession No. IPI00210941) ;

cathepsin B (CTSB, Accession No. IPI00212811).

상기 면역원성 단편은 본 발명의 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 단백질 단편을 의미한다.

상기 바이오마커 조성물은 3종 이상의 단백질의 발현을 비교함으로써, 1종 또는 2종의 단백질의 발현을 비교하는 것보다 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 현상을 보다 유의성 있고 정확하게 비교 분석할 수 있게 한다.

또한, 본 발명은 상기 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 단백질 군에서 선택된 3종 이상의 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 함유하는 진단제를 제공한다. 또한, 상기 진단제에는, 표지된 2차 항체, 발색단, 항체와 컨쥬게이트된 효소 및 그 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등이 포함될 수 있다. 상기 진단제는 3종 이상의 항체를 함유함으로써, 1종 또는 2종의 항체를 함유한 진단제를 이용하는 것보다 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 현상을 보다 유의성 있고 정확하게 비교 분석할 수 있게 한다.

상기 항체는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 바람직하게는 상기 항체는 본 발명의 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 폴리클론 항체, 모노클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다. 상기 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 상기 폴리클론 항체는 상기 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 유전자의 단백질(항원)을 동물에 주사한 뒤 채혈한 혈청에서 얻을 수 있다. 상기 동물로는 염소, 토끼, 돼지 등 임의의 동물 숙주를 이용할 수 있다. 상기 모노클론 항체는, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로, 하이브리도마 방법(Kohler G. and Milstein C.), 또는, 파지 항체 라이브러리(Clackson et al .; Marks et al .) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 하이브리도마 방법을 수행하기 위해서는 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포와, 암 또는 골수종 세포주를 이용할 수 있다. 이 후, 폴리에틸렌글라이콜 등을 이용하는 방법, 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로, 이러한 두 종류의 세포들을 융합시킨 후, 항체 생산 세포를 표준적인 조직 배양방법으로 증식시킬 수 있다. 이 후, 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후, 본 발명의 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양할 수 있다. 상기 파지 항체 라이브러리 방법은, 본 발명의 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 유전자의 단백질에 대한 항체 유전자를 획득하여, 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 상기 라이브러리로부터 본 발명의 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 유전자의 단백질과 결합하는 모노클론 항체를 분리 및 제작하여 수행할 수 있다. 상기 방법들에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.

상기 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, F(ab)2, Fv 등이 있다.

또한, 본 발명은 상기 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 단백질 군에서 선택된 3종 이상의 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 함유하는 진단방법을 제공한다.

상기 진단방법은,

(1공정) 분석할 시료에서 단백질을 분리하는 단계;

(2공정) 상기 1공정의 단백질과 상기 3종 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및,

(3공정) 상기 2공정에서 생성된 항원-항체 복합체를 정량 검출 및 분석하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 모든 절차에서는 시스플라틴으로 인해 간독성이 유도되었다고 의심되는 환자의 시료와 시스플라틴을 투여하지 않는 대조군 시료의 유전자 발현량을 비교 분석한다.

상기 1공정의 시료는 시스플라틴으로 인해 간독성이 유도되었을 것이라고 의심되는 환자, 또는, 시스플라틴을 투여하지 않는 대조군에게서 추출할 수 있으며, 바람직하게는, 상기 환자나 대조군의 조직, 세포 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 간세포(liver cells) 등일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 한편 시스플라틴을 투여하지 않는 대조군에서 단백질을 추출하는 대신 본 발명의 바이오마커 조성물에 포함된 단백질을 바로 사용할 수 있다.

상기 1공정에서 단백질을 분리하는 과정은 공지된 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 단백질의 양은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

상기 2공정의 항원-항체 복합체란 상기 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미한다. 즉, 상기 항원은 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 단백질을 뜻한다.

즉, 상기 분석방법을 통하여 대조군의 항원-항체 복합체의 형성량과 시스플라틴으로 인해 간독성이 유도되었을 것이라고 의심되는 환자의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 유전자의 단백질 발현량을 판단하여 실제 시스플라틴이 일으키는 간독성 여부를 진단할 수 있다.

상기 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호 크기를 통하여 정량적으로 측정할 수 있다. 상기 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으나, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 라벨로 효소를 사용하는 경우, 이용할 수 있는 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스터라아제, 글루코스 옥시다아제, 헥소키나아제 등이 있으나, 상기 기재된 범위로 제한되지는 않는다. 상기 형광물질로는 플루오레신, 피코시아닌, 플루오레스카민 등이 있으나, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 상기 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 발광물질로는 루시페린 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 미소입자로는 콜로이드, 금 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 레독스 분자로는 퀴논, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 방사선 동위원소에는 ³H, ¹⁴C 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 진단방법은, 웨스턴 블롯(western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), RIA(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오크털로니면역확산법(ouchterlony immunodiffusion), 로켓면역전기영동법(rocket immunoelectrophoresis), 조직면역염색법(immunohistochemistry), 면역침전분석법(immunoprecipitation), 보체고정분석법(complement fixation assay), FACS(fluorescense activated cell sorter), 단백질 칩(protein chip) 등에 적용할 수 있으나, 기재된 방법에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 진단용 바이오마커 조성물은 하기 유전자 군에서 선택된 3종 이상의 유전자를 유효성분으로 포함한다.

<시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 유전자>

glutathione S-transferase A2 (GSTA2, Genebank Accession No. NM_017013)

glutathione S-transferase, theta 2 (GSTT2, Genebank Accession No. NM_012796)

glutathione S-transferase Yc2 subunit (YC2, Genebank Accession No. AA945082)

thioredoxin reductase 1 (TXNRD1, Genebank Accession No. U63923)

cytochrome P450 2E1 (CYP2E1, Genebank Accession No. NM_031543)

cytochrome P450, family 2, subfamily c, polypeptide 13 (CYP2C13, Genebank Accession No. J02861)

cytochrome P450IID1 (CYP2D1, Genebank Accession No. AA8498905)

aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A7 (ALDH1A7, Genebank Accession No. M23995)

arginase type 1 (ARG1, Genebank Accession No. NM_017134)

arginase type 2 (ARG2, Genebank Accession No. NM_019168)

interleukin 6 (IL6, Genebank Accession No. NM_012589)

cytochrome P450, family 2, subfamily c, polypeptide 12 (CYP2C12, Genebank Accession No. BF397093)

cytochrome P450, family 26, subfamily b, polypeptide 1(CYP26B1, Genebank Accession No. BF397093)

tropomyosin 1 alpha chain isoform c (TPM1, Genebank Accession No. No. AF370889)

tropomyosin alpha-3 chain Isoform 2 (TPM3, Genebank Accession No. BI295970).

상기 바이오마커 조성물은 3종 이상의 유전자의 발현을 비교함으로써, 1종 또는 2종의 유전자의 발현을 비교하는 것보다 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 현상을 보다 유의성 있고 정확하게 비교 분석할 수 있게 한다.

또한, 본 발명은 상기 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 유전자 서열의 전부, 이의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 상보 가닥 분자가 3종 이상 집적된, 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 확인용 마이크로어레이 칩을 제공한다. 상기 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 유전자 서열의 전부, 이의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 상보가닥 분자는, 상기 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 유전자 서열의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩은 3종 이상의 유전자의 발현을 비교함으로써, 1종 또는 2종의 유전자의 발현을 비교하는 것보다 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 현상을 보다 유의성 있고 정확하게 비교 분석할 수 있다.

본 발명의 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 확인용 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 유전자 서열의 전부, 이의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 상보가닥 분자를 탐침 DNA 분자로 이용하여 마이크로어레이 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로파이펫팅법(micropipetting method) 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드글라스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 진단제에는 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 마이크로어레이 칩을 이용해 하기와 같은 과정을 포함하는 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 유전자를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 검출 방법은,

(1공정) 분석할 시료에서 RNA를 분리하는 단계;

(2공정) 상기 1공정의 RNA를 cDNA로 합성하면서 형광물질을 표지하는 단계;

(3공정) 상기 2공정의 형광물질로 표지된 cDNA를 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계; 및,

(4공정) 상기 3공정에서 혼성화된 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 1공정의 시료는 시스플라틴으로 인해 간독성이 유도되었을 것이라고 의심되는 환자, 또는, 시스플라틴을 투여하지 않는 대조군에게서 추출할 수 있으며, 바람직하게는, 상기 환자나 대조군의 조직, 세포 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 간세포(liver cells) 등일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 한편 시스플라틴을 투여하지 않는 대조군에서 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하는 대신 본 발명의 바이오마커 조성물의 유전자를 이용하여 합성한 cDNA를 바로 사용할 수 있다.

상기 RNA를 분리하는 과정은 공지된 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, RNA의 양은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

상기 2공정의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluoresceinisothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.

상기 4공정의 마이크로어레이 칩은 인간 게놈 중에서 본 발명에서 증감된 유전자가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 모두 사용 가능하지만, 본 발명의 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 4공정의 분석 방법은 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 유전자 군에서 선택된 3종 이상의 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 진단제를 제공한다. 상기 진단제는 3종 이상의 유전자의 발현을 비교함으로써, 1종 또는 2종의 유전자의 발현을 비교하는 진단제보다 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 현상을 보다 유의성 있고 정확하게 비교 분석할 수 있다.

상기 프라이머는 상기 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 유전자 서열에 상보적이면서, 증폭 산물이 100~300bps(base pairs)가 되도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머쌍은 모두 사용 가능하다.

상기 진단제에는, 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 상기 진단제를 이용한 진단방법을 제공하며, 자세하게는,

(1공정) 분석할 시료에서 RNA를 분리하는 단계;

(2공정) 상기 2공정의 RNA를 cDNA로 합성하는 단계;

(3공정) 상기 3공정의 cDNA를 대상으로, 본 발명의 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 유전자에 상보적이면서 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 또는 RT-PCR을 수행하는 단계; 및,

(4공정) 상기 3공정의 유전자 증폭물의 발현 정도를 확인하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 RNA를 분리하는 과정은 공지된 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, RNA의 양은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정할 수 있다. cDNA를 합성하는 단계 또한 공지된 공정을 이용하여 수행할 수 있다.

또한 본 발명은 시스플라틴으로 인해 증가된 단백질 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 시스플라틴으로 인해 발생한 간독성의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 주사제 등의 제형으로 제조되어 정맥주사 등으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 질환의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준으로 1일 0.001~100㎎의 단백질을 투여할 수 있다.

본 발명은 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것으로서, 상기 바이오마커 조성물 및 진단방법을 통해, 시스플라틴이 간독성을 일으켰는지의 여부를 용이하게 확인할 수 있었다. 시스플라틴은 항암효과가 탁월함에도 불구하고, 간독성이 유발될 수 있어 항암치료에 일부 제한이 있었던 약물이었기에, 상기 방법을 통해 시스플라틴으로 인해 일어나는 간독성을 조기에 진단하여 항암치료 및 간독성 억제를 효과적으로 할 수 있는 방법을 제공할 수 있게 되었으며, 시스플라틴으로 인해 일어나는 간독성의 생체 기작을 좀 더 효과적으로 이해할 수 있는 방법을 제시할 수 있었다.

도 1은 시스플라틴으로 인해 렛드 간세포에서 간독성이 유발되었음을 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2(A)는 웨스턴 블롯을 통해 FBP1(fructose 1,6-bisphosphatase 1), FASN(fatty acid synthase), MDH2(malate dehydrogenase 2), ARG1(arginase 1), PRDX1(peroxiredoxin-1), CAT(catalase), HSPD1(60kDa heat shock protein)가 증가하고, TPM1(tropomyosin 1), TPM3(tropomyosin 3), CTSB(cathepsin B)가 감소하는 것을 확인한 결과를 나타내는 데이터이며, 도 2(B)는 상기 웨스턴 블롯 결과와 LC-MS/MS 분석 결과가 일치하는 것을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3(A)는 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해, GSTA2(glutathione S-transferase A2), GSTT2(glutathione S-transferase, theta 2), YC2(glutathione S-transferase Yc2 subunit), TXNRD1(thioredoxin reductase 1), CYP2E1(cytochrome P450 2E1), CYP2C13(cytochrome P450, family 2, subfamily c, polypeptide 13), CYP2D1(cytochrome P450IID1), ALDH1A7(aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A7), ARG1(arginase type 1), ARG2(arginase type 2), IL6(interleukin 6)의 유전자 발현이 증가하는 것과, CYP2C12(cytochrome P450, family 2, subfamily c, polypeptide 12), CYP26B1(cytochrome P450, family 26, subfamily b, polypeptide 1), TPM1(tropomyosin 1 alpha chain isoform c), TPM3(tropomyosin alpha-3 chain isoform 2)이 감소하는 것을 확인한 결과를 나타내는 데이터이며, 도 3(B)는 RT-PCR 결과와 마이크로어레이 칩의 결과가 일치하는 것을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 시스플라틴으로 인해 간독성이 유도된 렛드 간세포에서 PRDX1, FASN, ARG1의 단백질 발현이 증가하는 것을 면역형광요법을 이용해 확인한 결과를 나타내는 사진이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1. 렛드 간세포의 분리, 배양 및 시스플라틴 처리>

Figliomeni, M. L. et al.의 방법을 따라, 렛드 간세포를 체중이 200~250g의 SD 렛드(Sprague-Dawley rat)로부터 분리하였다. 간독성의 생존률은 트립판 블루(trypan blue)를 이용하여 확인하였다. 상기 렛드 간세포는 5% FBS(fetal bovine serum), 100U/㎖ 페니실린, 100mg/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 William’s E 배지에서 배양하였으며, 렛드 테일 콜라겐이 코팅된 페트리 디쉬나 6웰 배양 플레이트에서 배양하였다. 시스플라틴의 처리를 위해서는 상기 렛드 간세포를 37˚C의 5% CO₂습윤 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, 배지를 교체하고 10% FBS, 100U/㎖ 페니실린, 100mg/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 William’s E 배지에서 시스플라틴이나 0.1% DMSO(dimethylsulfoxide, 대조군 : 시스플라틴 무처리군)를 넣어 배양하였으며 24시간 후, 각각의 실험에 사용하였다.

<실시예 2. 시스플라틴의 간독성 확인>

시스플라틴으로 인해 간독성이 일어났음은 3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)의 환원반응에 따른 MTT 어세이로 확인하였다. 이를 위해 96웰 플레이트의 각 웰에 1×10⁴개의 렛드 간세포(hepatocyte)를 분주하였고, 24시간 동안 5% CO₂, 37℃ 조건에서 유지시켰다. 24시간 후, 세포가 96웰 플레이트의 80% 정도 자라게 되면, 세포에 시스플라틴을 최대 2500μM까지 농도별로 24시간 동안 처리하였으며, 24시간 후, 20㎕의 MTT 용액(최종 농도:5㎍/㎖)을 넣고, 포마잔 크리스탈(formazan crystal)이 형성되도록 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 다음으로는 MTT 용액을 제거하고 DMSO를 각각의 웰에 넣고, 포마잔 크리스탈을 녹인 후, ELISA 분석기(Bio-Rad)를 이용해(Bio-Rad) 570nm에서 세포독성 결과를 확인하였으며 상기 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1의 결과를 참고하면, 시스플라틴에 대해 농도 의존적으로 렛드 간세포의 사멸이 확연하게 일어나, 간독성이 유발되었음을 알 수 있었다.

<실시예 3. 트립신을 이용한 단백질의 분해>

트립신을 이용한 단백분해를 수행하기 위해, 96웰 플레이트에 웰당 1×10⁴개의 렛드 간세포를 분주하고, 상기 6웰 플레이트 바닥의 80% 이상이 배양된 세포로 가득차게 되면, 282.37μM의 시스플라틴을 처리하여 24시간 동안 렛드 간세포와 반응시켰다. 이 때 시스플라틴이 처리된 농도는 세포독성 실험 결과에서 세포 사멸이 20% 이루어지는 농도를 선택하였다. 이 후, 상기 시스플라틴이 처리된 세포에서 세포 추출액(단백질)을 추출하기 위해, 세포 펠렛(pellet)에 단백분해효소 억제제가 포함된 RIPA 버퍼를 넣고 반응시켰다. * RIPA 버퍼 : 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM Na₂EDTA, 1mM Na₂EDTA, 1mM EGTA, 1% Triton, 2.5mM sodium pyrophosphate, 2.5mM sodium pyrophosphate, 1mM beta-glycerophosphate, 1mM Na₃VO₄, 1/㎖ leupeptin, 1mM Na₃VO₄

이 후, 상기 반응물을 얼음에서 15분간 둔 후 4℃, 12,000rpm 조건에서 5분간 원심분리하여 상등액(supernatants)만 수거하였다. 수거된 세포 추출액은 BCA 어세이 키트(Pierce)를 이용하여 단백질 정량을 하였다.

트립신 소화 방법(tryptic digestion)은 Han, C. L. et al.의 방법을 이용하여 수행하였다. 이를 위해, 상기 세포 추출액을 37℃에서 30분간 30㎕의 용해버퍼에 녹였으며(*용해버퍼:6M urea, 5mM EDTA, 2%(w/v) SDS in 0.1M TEABC[Triethylammonium bicarbonate]), 단백질이 용해되면, 3㎕의 10mM DTT(dithiothreitol)를 더하고, 3㎕의 50mM의 IAA(iodoactamide)를 30분간 더해 실온에서 반응시켰다. 이 후, 15㎕의 아크릴아마이드/비스아크릴아마이드 용액(30%, v/v, 29:1), 2.5㎕의 10%(w/v) APS(ammonium persulfate)와 1㎕의 100% TEMED(tetramethylethylene diamine)를 넣어 겔 상태로 중합시켰다. 중합된 겔은 작게 잘라 50% (v/v) ACN(acetonitrile)을 포함하는 1㎖의 TEABC 용액으로 3번 세척한 후, 탈수시켰으며, 이 후, 100% ACN으로 겔 샘플을 좀 더 탈수시킨 후, 완전하게 건조하였다. 이 후, 25mM TEABC에 녹여진 트립신(protein:trypsin = 50:1, g/g)을 이용해서 37℃에서 18시간 동안 반응시켜 단백분해를 하였다. 단백분해 이후에는 순차적인 용해과정을 통해 겔 샘플로부터 펩타이드를 추출하였다(*추출용매:100㎕ of 25mM TEABC, 100㎕ of 0.1% (v/v) TFA in water, 100㎕ of 0.1% (v/v) TFA in ACN, and 100㎕ of 100% ACN). 추출된 펩타이드 샘플은 스피드백(SpeedVac)을 이용해 농축한 후, LC-MS/MS를 수행하기 전까지 -20℃에서 보관하였다.

<실시예 4. LC-MS/MS를 통한 단백질의 분석>

실시예 3에서 분리된 1㎍의 펩타이드 샘플을 버퍼 A(0.1% FA in H₂O)에 현탁시킨 후, LC-MS/MS(WatersQ-TOF^TMPremier from Waters Corp, Manchester, UK)를 이용해 분석하였다. 컬럼의 온도는 40℃로 유지되었다.

A 이동상(mobile phase A)은 0.1% 포름산 수용액으로 구성되어 있으며 B 이동상(mobile phase B)은 0.1% 아세토나이트릴 수용액으로 구성하였다.

펩타이드는 B 이동상에서 120분 동안 용매의 0~80%의 농도 구배로 분리되었으며, 90% 농도 조건에서 25분간 세척되었다. 이 후, 보조 펌프를 이용하여 200nL/min의 유속으로 50fmol의 [Glu1]-Fibrinopeptide B/를 질량분석기의 나노 락 레퍼런스 스프레이로 이동시켰다. 모든 분석은 양이온 모드로 진행되었고 TOF 분석은 m/z 100~1990 범위에서 분석되었다.

<실시예 5. LC-MS/MS 결과에 대한 상대적 분석>

LC-MS/MS에서 분석된 단백질의 확인을 위해, LC-MS/MS의 미가공 결과 파일을 Mascot Distiller(Matrix Science; version 2.3.2)를 이용해 피크(peak) 리스트로 전환하였고, 모든 LC-MS/MS 샘플의 분석은 Mascot(Matrix Science; version 2.2.1)를 이용하여 분석하였다. 이를 위해, Mascot에서 IPI_Rat_3.70 database(version 3.70; 68,161 entries)의 결과를 찾아 분석결과와 비교 및 확인하였으며, Mascot에 대항하는 데이터베이스 검색은 0.05Da의 fragment ion mass tolerance 및 0.1Da의 parent ion tolerance를 이용하여 수행하였다.

분석결과에 대해서는 해당 단백질에 대해 95% 이상, 바람직하게는 99% 이상 일치하는 데이터만을 선별하였다. 단백질 동정에 대한 FDR(false discovery rate)의 측정을 위해서는, Mascot의 데이터베이스를 이용하였으며, 34 이상의 값을 선택하였다. 단백질 정량을 위해서는 LC-MS/MS 데이터의 분석이 가능한 IDEAL-Q software(version 1.0.1.1)를 이용하였다.

최종 분석 결과는 표 1에 나타내었으며, 단백질 레벨에서는 대조군(시스플라틴 무처리군)에 비해 시스플라틴의 처리로 인해 76개의 유전자의 발현이 증가되었고, 19개의 유전자의 발현이 줄어드는 것이 확인되었다.

< 실시예 6. 단백질의 발현 검증>

실시예 5에서 분석한 단백질 발현을 검증하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 이를 위해, 실시예 3과 동일한 조건으로 배양 및 시스플라틴이 처리된 된 렛드 간세포에 PBS(ice-cold phosphate-buffered saline)에 2회 헹군 후, 세포 추출액을 추출하기 위해, 세포 펠렛(pellet)을 단백분해효소 억제제가 포함된 RIPA 버퍼를 넣고 반응시켰다. * RIPA 버퍼 : 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM Na₂EDTA, 1mM Na₂EDTA, 1mM EGTA, 1% Triton, 2.5mM sodium pyrophosphate, 2.5mM sodium pyrophosphate, 1mM beta-glycerophosphate, 1mM Na₃VO₄, 1/㎖ leupeptin, 1mM Na₃VO₄

이 후, 상기 반응물을 얼음에서 15분간 둔 후 4°C, 12,000rpm 조건에서 5분간 원심분리하여 상등액(supernatants)만 수거하였다. 수거된 세포 추출액은 BCA 어세이 키트(Pierce)를 이용하여 단백질 정량을 한 후 5㎍의 단백질을 SDS 샘플 버퍼에서 불활성화한 후, 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동법을 이용하여 분리하였다. 분리된 단백질은 나이트로셀룰로오스 멤브레인으로 이동한 후(150mA 조건에서 60분), 이를 5% 스킴밀크(skim milk in PBST[PBS/0.1% Tween-20])로 블로킹하고, 각각의 1차 항체는 4°C에서 18시간 이상 반응시켰으며, 다음날 2차 항체를 반응시켰고, 각 항체의 세척은 PBST를 이용하였다. 이 후, ECL 용액을 이용해 각 단백질 밴드의 강도를 분석하였으며, 상기 분석결과를 도 2에 나타내었다.

도 2(A)의 결과를 확인하면 웨스턴 블롯을 통해 FBP1(fructose 1,6-bisphosphatase 1), FASN(fatty acid synthase), MDH2(malate dehydrogenase 2), ARG1(arginase 1), PRDX1(peroxiredoxin-1), CAT(catalase), HSPD1(60kDa heat shock protein)가 증가하고, TPM1(tropomyosin 1), TPM3(tropomyosin 3), CTSB(cathepsin B)가 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 도 2(B)에서는 상기 웨스턴 블롯 결과와 LC-MS/MS 분석 결과가 일치하는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 7. 시스플라틴으로 인한 간독성으로 증감된 RNA 의 발현 확인 - 마이크로어레이 칩 분석>

실시예 3과 동일하게 렛드 간세포를 배양 및 시스플라틴을 처리한 후, 상기 세포에서 RNA를 추출하였다. 렛드 간세포의 총 RNA는 RNeasyMiniKit(Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 추출하였다. 상기 총 RNA의 양은 Nanodrop spectrophotometer(ND-1000, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)와 RNA 6000 Nano kit(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)를 이용해 확인하였다.

RNA는 RIN(RNA integrity number) 수치가 9.0 이상인 손상되지 않는 온전한 상태이면서 A260/A280 흡광도 비율이 1.8~2.1 사이인 것을 cDNA 합성에 사용하였다.

유전자 발현 프로파일은 GeneChipRat Genome 230 2.0 Array(Affymetrix, Santa Clara, CA)를 이용하여 분석하였다. 상기 마이크로어레이 칩은 렛드 유전자에 대한 31,042개의 프로브(probe) 세트를 가지고 있다. 마이크로어레이의 절차로서, in vitro 전사과정에 따르는 바이오틴이 붙은 cDNA의 합성, 혼성화(hybridization), 세척, 스캐닝은 제시된 방법을 통해 확인하였다. 또한, 염색된 GeneChip 프로브는 GeneChipScanner 3000(Affymetrix) 7G를 이용해 570nm에서 확인하였으며 각각의 유전자 발현의 정도는 Expression Console™ software, Version1.1을 이용해 계산하였다. GenPlex software Version 3.0(ISTECH Inc., Goyang, Korea)은 CEL file data(Gene signal)의 분석에 이용되었다. MAS5 algorithm이 GeneChipRat Genome 230 2.0의 데이터 분석에 이용되었다. 이 후, 데이터의 노말라이제이션(global scaling normalization)이 수행되었으며, 노말라이제이션이 수행된 데이터는 base 2를 이용해 log 형식으로 변환되었다. 대조군(시스플라틴 무처리군)과 다르게 발현된 유전자(differentially expressed genes, DEGs)는 Welch’s t-test(p<0.05)를 이용해 2배 이상 차이가 나는 것을 시스플라틴으로 유도된 간독성에서 증감하는 유전자로 선택하였다. 발현량이 2배 이상 차이가 나는 유전자는 KEGG 데이터베이스를 바탕으로 계층군집화(hierarchical clustering) 작업을 수행하였다.

하기 표 2는 상기 마이크로어레이의 결과를 분석한 것으로, 72개의 유전자의 발현이 증가되었고, 385개의 유전자의 발현이 줄어드는 것으로 나타났다.

Genebank Accession No.	Gene	Ratio	p - value ^a	BH p - value ^b
NM_020091	Pochymosin	12.44	6.E-03	2E-02
M30689	Lymphocyte antigen 6 complex, locus B	7.76	2.E-04	3.E-03
NM_031971	Heatshock70kDprotein1A	4.63	3.E-04	4.E-03
BF410146	Heat shock protein 2	4.62	1.E-02	3.E-02
BI290034	Phospholamban	4.49	6.E-03	2.E-02
AI716200	Hypothetical gene supported by AF152002	4.10	4.E-03	1.E-02
NM_022407	Aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1	3.88	8.E-04	6.E-03
AI145454	Spermatogenesis associated 2-like	3.52	6.E-04	5.E-03
U22520	Chemokine (C-X-C motif) ligand 10	3.47	3.E-04	3.E-03
BE103324	Hyaluronan and proteoglycan link protein 3	3.45	2.E-02	3.E-02
BE095528	Low density lipoprotein receptor-related protein 11	3.38	3.E-05	7.E-04
AI409634	Radical S-adenosyl methionine domain containing 2	2.97	1.E-02	3.E-02
AW434961	Hemochromatosis type 2 (juvenile) (human homolog)	2.95	6.E-05	1.E-03
NM_020074	Serglycin	2.93	7.E-04	6.E-03
NM_017013	GlutathioneS-transferaseA2	2.92	8.E-04	6.E-03
BI278231	Heat shock 70kD protein 1B (mapped)	2.87	6.E-05	1.E-03
BE098713	Immunoglobulin superfamily, member 3	2.80	8.E-03	2.E-02
NM_012589	Interleukin 6	2.73	3.E-02	4.E-02
NM_019168	Arginase type II	2.69	1.E-03	8.E-03
NM_031045	Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A	2.66	1.E-02	3.E-02
J02679	NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1	2.64	2.E-04	2.E-03
AI235236	Similar to H2A histone family, member O	2.62	6.E-04	5.E-03
AA946147	ADAM metallopeptidase domain 8	2.59	9.E-04	6.E-03
AI639401	Trichohyalin	2.53	3.E-02	4.E-02
BG376804	Similartopeptidylglycinealpha-amidatingmonooxygenase COOH-terminalinteractor;peptidylglycinealpha-amidatingmonooxygenaseCOOH-terminalinteractorprotein-1	2.43	4.E-03	1.E-02
BI303019	Periplakin	2.43	1.E-04	2.E-03
NM_012796	Glutathione S-transferase, theta 2	2.43	3.E-04	3.E-03
BE099979	Cellular repressor of E1A-stimulated genes 1	2.42	3.E-04	4.E-03
NM_080399	DNA-damage-inducible transcript 4-like	2.42	2.E-03	9.E-03
AF411318	Metallothionein 1a	2.40	3.E-06	2.E-04
BE104595	Histone cluster 3, H2a	2.40	9.E-04	7.E-03
BM384139	Growth arrest specific 5	2.38	1.E-03	7.E-03
BF556949	Glutathione S-transferase, theta 2	2.37	3.E-04	3.E-03
NM_138916	Cdc2-related kinase, arginine/serine-rich	2.37	3.E-02	4.E-02
AI071319	Cisplatin resistance-associated overexpressed protein	2.36	2.E-03	1.E-02
AI172302	Sulfiredoxin 1 homolog (S. cerevisiae)	2.31	2.E-05	5.E-04
BM383531	Metallothionein 2A	2.29	7.E-03	2.E-02
AW532101	Phenazine biosynthesis-like protein domain containing	2.28	2.E-05	5.E-04
AF077195	Sertoli cell protein 1	2.26	1.E-03	7.E-03
AI010427	Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1)	2.25	4.E-04	4.E-03
BI288527	Hydroxysteroid dehydrogenase like 2	2.21	2.E-05	6.E-04
AI029175	Cellular repressor of E1A-stimulated genes 1	2.20	2.E-05	5.E-04
BG380575	Neuronal pentraxin receptor	2.18	2.E-03	9.E-03
BF398835	Zinc finger, SWIM domain containing 5	2.18	5.E-02	5.E-02
NM_022513	Sulfotransferase family, cytosolic, 1B, member 1	2.17	1.E-02	3.E-02
BF546013	Leucine rich repeat containing 51	2.16	6.E-03	2.E-02
NM_012580	Heme oxygenase (decycling) 1	2.15	1.E-03	7.E-03
BG377996	SimilartoDiphosphoinositolpolyphosphatephosphohydrolase3alpha(DIPP-3alpha)(DIPP3alpha)(Diadenosine5,5-P1,P6-hexaphosphatehydrolase3alpha)(Nucleosidediphosphate-linkedmoietyXmotif10)(Nudixmotif10)	2.15	9.E-03	2.E-02
BI294721	Similar to RAB7-like protein	2.14	2.E-03	1.E-02
NM_013215	Aldo-keto reductase family 7, member A3 (aflatoxin aldehyde reductase)	2.14	1.E-04	2.E-03
BF419505	Fetal Alzheimer antigen	2.12	8.E-03	2.E-02
AI072448	H1 histone family, member X	2.12	7.E-04	6.E-03
AI170382	Receptor-interacting serine-threonine kinase 4	2.12	4.E-03	1.E-02
AI072405	Aquaporin 11	2.11	5.E-04	5.E-03
BE119170	Thioredoxin domain containing 13	2.11	1.E-03	8.E-03
BE119170	family with sequence similarity 55, member B	2.10	2.E-03	9.E-03
AA964752	Hydroxysteroid dehydrogenase like 2	2.10	2.E-05	6.E-04
NM_012833	ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 2	2.10	4.E-05	9.E-04
BI282488	Acetyl-Coenzyme A acyltransferase 2	2.10	2.E-03	1.E-02
BF281987	Chemokine (C-X-C motif) ligand 11	2.08	3.E-04	4.E-03
BI295971	Sphingosine-1-phosphate receptor 1	2.07	2.E-03	9.E-03
AA996933	Abhydrolase domain containing 5	2.07	5.E-03	2.E-02
NM_019158	Aquaporin 8	2.07	5.E-03	2.E-02
AI710604	Antisense paternally expressed gene 3	2.07	6.E-03	2.E-02
NM_012578	H1 histone family, member 0	2.07	2.E-03	1.E-02
BF403998	Calcium and integrin binding family member 2	2.06	2.E-04	3.E-03
M23995	Aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A7	2.05	1.E-02	3.E-02
AA892572	Formation of mitochondrial complexes 1 homolog (S. cerevisiae)	2.04	2.E-03	1.E-02
BI294763	Hypothetical protein LOC678970	2.04	2.E-03	1.E-02
AA945082	Glutathione S-transferase Yc2 subunit	2.03	2.E-02	3.E-02
U63923	Thioredoxin reductase 1	2.02	7.E-04	6.E-03
AI235545	Isocitrate dehydrogenase 1 (NADP+), soluble	2.02	3.E-03	1.E-02
AF019973	Enolase 2, gamma, neuronal	0.50	1.E-03	8.E-03
BE110108	Dual specificity phosphatase 1	0.50	7.E-04	6.E-03
NM_017196	Allograft inflammatory factor 1	0.50	1.E-05	4.E-04
BF414998	Similar to RIKEN cDNA 2610318G18	0.49	2.E-03	9.E-03
AI410818	Similar to RIKEN cDNA 5730509K17 gene	0.49	2.E-02	3.E-02
NM_058208	Suppressor of cytokine signaling 2	0.49	1.E-02	3.E-02
AI177292	Integrin beta 2	0.49	3.E-04	3.E-03
BG378147	Dedicator of cyto-kinesis 1	0.49	4.E-03	1.E-02
AI230334	Transcription elongation factor A (SII)-like 8	0.49	2.E-04	2.E-03
BE111729	DIS3 mitotic control homolog (S. cerevisiae)-like 2	0.49	8.E-03	2.E-02
AW434912	Similar to UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase 2	0.49	4.E-02	4.E-02
BE107165	TOX high mobility group box family member 3	0.49	5.E-03	2.E-02
BM384057	ELK3, member of ETS oncogene family	0.49	2.E-05	7.E-04
BM384752	KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) containing 2	0.49	3.E-03	1.E-02
BG378827	Chloride channel 4-2	0.49	2.E-03	1.E-02
NM_022685	RAS (RAD and GEM) like GTP binding 2	0.49	4.E-03	2.E-02
AW252094	XK, Kell blood group complex subunit-related family, member 5	0.49	3.E-02	4.E-02
BE097659	Methionine adenosyltransferase I, alpha	0.49	8.E-05	1.E-03
BE108272	Solutecarrierfamily7(cationicaminoacidtransporter,y+system), member 1	0.49	1.E-04	2.E-03
NM_012715	Adrenomedullin	0.49	6.E-04	5.E-03
BF522954	Interleukin 18 receptor 1	0.49	4.E-02	4.E-02
BI281084	Galactosidase, beta 1-like 2	0.49	2.E-03	9.E-03
AA875198	Notch1-induced protein	0.49	2.E-03	9.E-03
BF288435	Zinc finger, CCHC domain containing 24	0.49	7.E-03	2.E-02
NM_012846	Fibroblast growth factor 1	0.48	2.E-05	6.E-04
AI178069	Zinc finger protein 36, C3H type-like 2	0.48	6.E-06	2.E-04
AI717707	Protein phosphatase 2 (formerly 2A), regulatory subunit B'', alpha	0.48	6.E-04	5.E-03
AI227598	Similar to RIKEN cDNA 2700081O15	0.48	3.E-03	1.E-02
BI295425	CASP2 and RIPK1 domain containing adaptor with death domain	0.48	3.E-03	1.E-02
AI232784	3-hydroxybutyrate dehydrogenase, type 2	0.48	7.E-04	6.E-03
NM_013044	Tropomodulin 1	0.48	3.E-03	1.E-02
BG375376	Protein kinase, cAMP dependent regulatory, type I, beta	0.48	4.E-03	1.E-02
NM_133524	Transcription factor E2a	0.48	5.E-02	5.E-02
BG375198	RAS-like family 11 member B	0.48	3.E-03	1.E-02
NM_021587	Latent transforming growth factor beta binding protein 1	0.48	1.E-04	2.E-03
BI291842	Cytokine inducible SH2-containing protein	0.48	3.E-03	1.E-02
NM_013128	Carboxypeptidase E	0.48	1.E-05	4.E-04
AA891759	Similar to RIKEN cDNA 2610528E23	0.48	1.E-02	3.E-02
NM_022220	Gulonolactone (L-) oxidase	0.48	1.E-03	8.E-03
BI294706	Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 6B	0.48	7.E-03	2.E-02
AW251506	Similar to talin 2	0.48	2.E-02	4.E-02
AW525428	Proteintyrosinephosphatase-like(prolineinsteadofcatalyticarginine), membera	0.48	1.E-04	2.E-03
BI293607	Transmembrane protein 163	0.48	4.E-02	4.E-02
AB049572	Sphingosine kinase 1	0.47	3.E-04	3.E-03
AI180253	Similar to ENSANGP00000020885	0.47	2.E-04	3.E-03
AI407095	Quinolinate phosphoribosyltransferase	0.47	2.E-05	6.E-04
BE111722	Fc fragment of IgE, high affinity I, receptor for; gamma polypeptide	0.47	3.E-05	7.E-04
AI235948	Nidogen 1	0.47	4.E-02	4.E-02
AI010430	Tribbles homolog 2 (Drosophila)	0.47	3.E-02	4.E-02
NM_080394	Reelin	0.47	7.E-03	2.E-02
AA850290	ATPase, class V, type 10D	0.47	2.E-02	4.E-02
AI011712	ADAM metallopeptidase domain 9 (meltrin gamma)	0.47	1.E-04	2.E-03
BI295776	Sorbin and SH3 domain containing 1	0.47	1.E-03	9.E-03
BI274408	Regulator of calcineurin 2	0.47	2.E-05	6.E-04
BI296250	Proteintyrosinephosphatase-like(prolineinsteadofcatalyticarginine), membera	0.47	1.E-04	2.E-03
BM391873	3-oxoacid CoA transferase 1	0.47	8.E-06	3.E-04
BF396302	mex3 homolog B (C. elegans)	0.47	5.E-03	2.E-02
BF288115	Similartopairedimmunoglobin-liketype2receptoralpha	0.46	1.E-03	8.E-03
AI105450	Aminopeptidase O	0.46	2.E-04	3.E-03
AW520784	Solute carrier family 30 (zinc transporter), member 3	0.46	7.E-04	6.E-03
AI169104	Platelet factor 4	0.46	7.E-04	6.E-03
NM_017029	Neurofilament, medium polypeptide	0.46	2.E-03	1.E-02
AW530825	Pre-B-cell leukemia homeobox 1	0.46	7.E-03	2.E-02
BG376529	Similar to mKIAA1045 protein	0.46	3.E-02	4.E-02
BG379295	RAB GTPase activating protein 1-like	0.46	4.E-04	4.E-03
BI276006	Similar to FLJ00128 protein	0.46	2.E-03	1.E-02
AW533075	T-box 15	0.46	1.E-02	3.E-02
BI278550	Neuronal PAS domain protein 2	0.46	1.E-03	7.E-03
NM_031783	Neurofilament, light polypeptide	0.46	2.E-04	3.E-03
AW252379	Similar to RNA binding protein gene with multiple splicing	0.46	2.E-04	3.E-03
BI278571	Peroxidasin homolog (Drosophila)	0.46	3.E-04	3.E-03
NM_031572	Cytochrome P450, family 2, subfamily c, polypeptide 12	0.46	4.E-03	1.E-02
BE107327	POU class 3 homeobox 3	0.46	1.E-02	3.E-02
AI600030	EGFR-coamplified and overexpressed protein	0.46	7.E-03	2.E-02
BF550890	Sialophorin	0.46	3.E-02	4.E-02
AW917760	Myoferlin	0.45	2.E-05	6.E-04
BI295197	Protease, serine, 32	0.45	4.E-02	5.E-02
AA924061	Centaurin, gamma 2	0.45	4.E-03	2.E-02
BM390477	Cut-like homeobox 1	0.45	2.E-03	1.E-02
NM_013057	Coagulation factor III (thromboplastin, tissue factor)	0.45	8.E-03	2.E-02
AB020967	Tribbles homolog 3 (Drosophila)	0.45	2.E-03	9.E-03
AI170535	Tumor protein p53 inducible protein 11	0.45	9.E-03	2.E-02
BE098732	Similar to Putative protein C21orf45	0.45	3.E-02	4.E-02
BI275741	Epithelial membrane protein 1	0.45	5.E-04	5.E-03
AW252094	XK, Kell blood group complex subunit-related family, member 5	0.45	3.E-02	4.E-02
BI274511	Polyamine-modulated factor 1	0.45	1.E-02	3.E-02
NM_031841	Stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase)	0.44	2.E-02	4.E-02
BM384537	Acyl-CoA synthetase long-chain family member 5	0.44	3.E-04	3.E-03
BI296287	Trafficking protein particle complex 9	0.44	2.E-03	9.E-03
BE097295	Hypothetical protein LOC682874	0.44	2.E-03	9.E-03
BI294844	CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 3	0.44	4.E-05	9.E-04
BI282616	Myelin protein zero-like 2	0.44	1.E-05	4.E-04
BF420629	PWWP domain containing 2B	0.44	5.E-03	2.E-02
AI059511	Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9	0.44	1.E-03	7.E-03
AF000942	Inhibitor of DNA binding 3	0.44	3.E-06	2.E-04
AW534908	Kruppel-like factor 7 (ubiquitous)	0.44	2.E-02	3.E-02
BG381021	Nerve growth factor receptor (TNFRSF16) associated protein 1	0.44	2.E-06	8.E-05
AI406305	Pleckstrin homology domain containing, family O member 1	0.44	2.E-04	3.E-03
NM_030858	SMAD family member 7	0.44	1.E-03	8.E-03
NM_017207	Transient receptor potential cation channel, subfamily V, member 2	0.44	2.E-02	3.E-02
AF042499	SMAD family member 7	0.44	1.E-03	8.E-03
BF387238	Similar to KIAA1409 protein	0.44	6.E-05	1.E-03
BG380285	Interferon induced transmembrane protein 1	0.44	7.E-03	2.E-02
NM_031677	Four and a half LIM domains 2	0.44	1.E-04	2.E-03
AI177322	Transcription factor Dp-2 (E2F dimerization partner 2)	0.44	3.E-03	1.E-02
BM391471	Activating transcription factor 5	0.44	3.E-03	1.E-02
BF389244	GINS complex subunit 1 (Psf1 homolog)	0.44	6.E-03	2.E-02
NM_019237	Procollagen C-endopeptidase enhancer	0.44	9.E-04	7.E-03
BI296499	Transmembrane 9 superfamily member 3	0.43	9.E-04	7.E-03
AW523537	Family with sequence similarity 101, member B	0.43	7.E-04	6.E-03
BF388060	G protein-coupled receptor 64	0.43	2.E-02	4.E-02
AI406520	Axl receptor tyrosine kinase	0.43	3.E-03	1.E-02
BM392116	Claudin 2	0.43	2.E-06	7.E-05
NM_024391	Hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 2	0.43	2.E-02	3.E-02
AI227742	BCL2-related ovarian killer	0.43	1.E-03	8.E-03
NM_133406	1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 4 (lysophosphatidic acid acyltransferase, delta)	0.43	2.E-03	1.E-02
AA800892	SH3 domain binding glutamic acid-rich protein	0.43	8.E-06	3.E-04
BM383428	Minichromosome maintenance complex component 3	0.43	4.E-03	1.E-02
BE111083	Mannan-binding lectin serine peptidase 1	0.43	1.E-03	7.E-03
BE113393	Synaptopodin 2	0.43	9.E-03	2.E-02
AI070935	Polymerase (DNA directed), epsilon 2 (p59 subunit)	0.43	1.E-02	2.E-02
BI288761	ASF1 anti-silencing function 1 homolog B (S. cerevisiae)	0.43	6.E-03	2.E-02
BM385445	Topoisomerase (DNA) II alpha	0.42	1.E-02	2.E-02
NM_053401	Nerve growth factor receptor (TNFRSF16) associated protein 1	0.42	2.E-06	8.E-05
BE120437	ATPase, class V, type 10A	0.42	1.E-02	2.E-02
NM_021909	FXYD domain-containing ion transport regulator 5	0.42	4.E-03	1.E-02
BI304009	Lysyl oxidase	0.42	8.E-05	1.E-03
BF281544	Reelin	0.42	7.E-03	2.E-02
AI072254	G protein-coupled receptor 177	0.42	4.E-04	4.E-03
BF282282	Phosphoserine phosphatase	0.42	2.E-04	3.E-03
BI286041	Breast cancer anti-estrogen resistance 3	0.42	5.E-03	2.E-02
BG374290	Microtubule-associated protein 2	0.42	1.E-04	2.E-03
BI302848	Similar to CG14803-PA	0.42	3.E-03	1.E-02
BF551426	EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 2	0.42	1.E-03	8.E-03
NM_053736	Caspase 4, apoptosis-related cysteine peptidase	0.42	9.E-07	3.E-05
NM_031027	Dihydropyrimidine dehydrogenase	0.42	8.E-04	6.E-03
NM_031024	Drebrin 1	0.42	3.E-03	1.E-02
NM_053894	Jun dimerization protein 2	0.42	1.E-04	2.E-03
NM_031140	Vimentin	0.41	2.E-05	6.E-04
NM_017061	Lysyl oxidase	0.41	8.E-05	1.E-03
NM_133416	B-cell leukemia/lymphoma 2 related protein A1d	0.41	5.E-04	5.E-03
AA894330	Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II delta	0.41	3.E-02	4.E-02
BF394235	G protein-coupled receptor 177	0.41	4.E-04	4.E-03
AW251654	SERTA domain containing 4	0.41	1.E-03	8.E-03
U13253	Fatty acid binding protein 5, epidermal	0.41	4.E-04	4.E-03
NM_032083	Chimerin (chimaerin) 1	0.41	1.E-02	3.E-02
AW915173	Caveolin 1, caveolae protein	0.41	1.E-04	2.E-03
AI556884	Protein tyrosine phosphatase, receptor type, G	0.41	4.E-03	1.E-02
NM_012523	Cd53 molecule	0.41	9.E-06	3.E-04
NM_012620	Serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade E, member 1	0.41	4.E-04	4.E-03
U25684	Thymosin beta-like protein 1	0.41	3.E-04	3.E-03
BF281848	Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase (NADP+ dependent) 1-like	0.40	5.E-04	5.E-03
BM389934	Similar to FLJ46082 protein	0.40	6.E-03	2.E-02
BM391545	Similar to mirror-image polydactyly 1	0.40	1.E-02	2.E-02
BF405298	Solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; phosphate carrier), member 23	0.40	1.E-02	2.E-02
AW435036	Smoothelin	0.40	2.E-02	3.E-02
BG380482	Exocyst complex component 4	0.40	2.E-05	5.E-04
BI275904	LIM and senescent cell antigen like domains 2	0.40	2.E-06	1.E-04
BI295085	G protein-coupled receptor 125	0.40	1.E-02	3.E-02
BF411904	Eph receptor A4	0.40	3.E-04	4.E-03
NM_017325	Runt related transcription factor 1	0.40	2.E-03	1.E-02
AI144646	Gap junction protein, beta 2	0.40	2.E-04	3.E-03
AI103600	Filamin C, gamma (actin binding protein 280)	0.39	2.E-04	3.E-03
NM_031345	TSC22 domain family, member 3	0.39	3.E-03	1.E-02
AI177099	Protease, serine, 23	0.39	3.E-05	8.E-04
AI071227	RAD51 homolog (RecA homolog, E. coli) (S. cerevisiae)	0.39	5.E-04	5.E-03
BF282961	Leukocyteimmunoglobulin-likereceptor,subfamilyB,member4	0.39	4.E-04	4.E-03
M83745	Proprotein convertase subtilisin/kexin type 1	0.39	2.E-02	3.E-02
AA799328	Family with sequence similarity 111, member A	0.39	1.E-03	8.E-03
U06434	Chemokine (C-C motif) ligand 4	0.39	4.E-02	5.E-02
AI178222	Glycoprotein, alpha-galactosyltransferase 1	0.39	3.E-03	1.E-02
AW532566	PDZ domain containing RING finger 3	0.39	3.E-03	1.E-02
AA859768	Minichromosome maintenance complex component 5	0.39	2.E-03	1.E-02
BF560816	G protein-coupled receptor 125	0.39	1.E-02	3.E-02
NM_012812	Cytochrome c oxidase, subunit VIa, polypeptide 2	0.39	1.E-04	2.E-03
AW143798	Cyclin D1	0.38	1.E-04	2.E-03
AI411760	Ubiquitin associated and SH3 domain containing, B	0.38	5.E-03	2.E-02
U07202	Asparagine synthetase	0.38	3.E-06	1.E-04
BI290883	DAZ interacting protein 1-like	0.38	1.E-02	3.E-02
AI179828	Kelch-like 13 (Drosophila)	0.38	2.E-03	9.E-03
BF285164	Popeye domain containing 2	0.38	5.E-06	2.E-04
AI112985	Syndecan 3	0.38	4.E-02	4.E-02
NM_133440	SH3 and multiple ankyrin repeat domains 2	0.38	1.E-04	2.E-03
AI228231	Tetraspanin 2	0.38	5.E-04	5.E-03
NM_013080	Protein tyrosine phosphatase, receptor-type, Z polypeptide 1	0.38	1.E-02	3.E-02
NM_013220	Ankyrin repeat domain 1 (cardiac muscle)	0.38	2.E-04	2.E-03
BI296047	Similar to Thrombospondin-3 precursor	0.38	7.E-03	2.E-02
BM384279	PFTAIRE protein kinase 1	0.37	2.E-03	1.E-02
AA965058	Hypothetical LOC305552	0.37	2.E-04	3.E-03
BM390379	Sialic acid binding Ig-like lectin G	0.37	2.E-02	3.E-02
AW918650	Coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 6	0.37	8.E-07	2.E-05
AI072459	Eph receptor A4	0.37	3.E-04	4.E-03
BF420007	Zinc finger and BTB domain containing 7C	0.37	1.E-02	2.E-02
AI454854	Guanine nucleotide binding protein, alpha 14	0.37	2.E-05	4.E-04
BF418957	Complement component 1, q subcomponent, alpha polypeptide	0.37	6.E-03	2.E-02
BE096686	Podocan	0.37	6.E-04	5.E-03
BI289045	Guanine nucleotide binding protein, alpha 14	0.37	2.E-05	4.E-04
NM_031530	Chemokine (C-C motif) ligand 2	0.37	6.E-06	2.E-04
AF095585	PDZ and LIM domain 7	0.37	2.E-06	9.E-05
BM390710	Maternal embryonic leucine zipper kinase	0.37	3.E-05	8.E-04
NM_013155	Very low density lipoprotein receptor	0.37	2.E-04	3.E-03
AI011757	Fc fragment of IgG, low affinity IIIa, receptor	0.37	7.E-05	1.E-03
AA926048	FGGY carbohydrate kinase domain containing	0.37	6.E-05	1.E-03
BM392211	SAP30-like	0.37	2.E-03	1.E-02
NM_053995	3-hydroxybutyrate dehydrogenase, type 1	0.37	1.E-03	8.E-03
BF417638	Cell division cycle associated 3	0.37	4.E-03	2.E-02
BI278186	Cysteine-rich C-terminal 1	0.37	7.E-03	2.E-02
BI294855	LIM domain containing 2	0.37	4.E-04	4.E-03
AA997640	Pyrroline-5-carboxylate reductase 1	0.37	5.E-04	5.E-03
BM392135	ELK3, member of ETS oncogene family	0.37	2.E-05	7.E-04
AI409259	Rac GTPase-activating protein 1	0.36	1.E-03	7.E-03
BG668812	Dysferlin	0.36	2.E-05	5.E-04
BI279862	Transforming growth factor beta 1 induced transcript 1	0.36	2.E-04	2.E-03
BI296317	ADP-ribosylation factor-like 11	0.36	3.E-02	4.E-02
NM_019184	Cytochrome P450, subfamily IIC (mephenytoin 4-hydroxylase)	0.36	6.E-04	5.E-03
BI288565	SimilartoCG2919-PA	0.36	4.E-03	2.E-02
BF391914	Interleukin 1 receptor accessory protein	0.36	5.E-06	2.E-04
AI578135	Epithelial cell transforming sequence 2 oncogene	0.36	6.E-03	2.E-02
AI599423	Growth arrest and DNA-damage-inducible, gamma	0.36	2.E-05	7.E-04
AA874943	CDC42 effector protein (Rho GTPase binding) 3	0.36	1.E-03	9.E-03
AI410864	Malic enzyme 3, NADP(+)-dependent, mitochondrial	0.36	4.E-03	1.E-02
NM_031556	Caveolin 1, caveolae protein	0.35	1.E-04	2.E-03
X64589	Cyclin B1	0.35	1.E-04	2.E-03
AI704285	ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 15	0.35	2.E-02	3.E-02
NM_013037	Interleukin 1 receptor-like 1	0.35	3.E-05	7.E-04
BI289035	Exostoses (multiple)-like 1	0.35	2.E-02	3.E-02
AW526032	Wingless-type MMTV integration site family, member 11	0.35	7.E-03	2.E-02
BF396607	Dystrobrevin alpha	0.35	1.E-02	3.E-02
L81174	Ankyrin repeat domain 1 (cardiac muscle)	0.35	2.E-04	2.E-03
BF284305	Musashi homolog 2 (Drosophila)	0.34	4.E-04	4.E-03
AI179588	Family with sequence similarity 176, member B	0.34	7.E-03	2.E-02
BI296084	Ubiquitin-conjugating enzyme E2C	0.34	1.E-03	7.E-03
BI277043	Melanoma cell adhesion molecule	0.34	1.E-02	3.E-02
AI575277	Similar to RIKEN cDNA A930038C07	0.34	2.E-02	3.E-02
AW251860	Transcription factor 7, T-cell specific	0.34	3.E-02	4.E-02
BI285449	Caveolin 1, caveolae protein	0.34	1.E-04	2.E-03
X04440	Protein kinase C, beta	0.34	9.E-03	2.E-02
AA849857	Very low density lipoprotein receptor	0.34	2.E-04	3.E-03
AW140475	CUG triplet repeat, RNA binding protein 2	0.34	7.E-03	2.E-02
NM_012608	Membrane metallo endopeptidase	0.33	8.E-04	6.E-03
BG373566	Butyryl Coenzyme A synthetase 1	0.33	2.E-03	9.E-03
AW251849	Defective in sister chromatid cohesion 1 homolog (S. cerevisiae)	0.33	2.E-04	3.E-03
BM384217	SET and MYND domain containing 3	0.33	7.E-03	2.E-02
NM_021989	TIMP metallopeptidase inhibitor 2	0.33	2.E-05	6.E-04
BF290193	Tensin 1	0.33	5.E-03	2.E-02
AI229404	Anillin, actin binding protein	0.33	5.E-04	5.E-03
BF409874	HRAS-like suppressor family, member 5	0.33	5.E-04	5.E-03
BF282469	Nucleotide binding protein-like	0.33	4.E-04	4.E-03
BG377391	Family with sequence similarity 101, member B	0.33	7.E-04	6.E-03
AW141858	Dysferlin	0.33	2.E-05	5.E-04
AI411057	Coactosin-like 1 (Dictyostelium)	0.33	2.E-03	1.E-02
AW524822	Ca++-dependent secretion activator 2	0.33	1.E-03	8.E-03
AI409042	Protein tyrosine phosphatase, receptor type, D	0.33	5.E-04	5.E-03
BF396282	Kinesin family member 15	0.33	3.E-02	4.E-02
BF394170	Jun dimerization protein 2	0.33	1.E-04	2.E-03
AI103939	GRINL1A complex locus	0.33	7.E-03	2.E-02
BE109163	Similar to TPR repeat-containing protein KIAA1043	0.32	3.E-02	4.E-02
BI295861	Cyclin D1	0.32	1.E-04	2.E-03
AI176034	Tenascin C	0.32	6.E-03	2.E-02
NM_019340	Regulator of G-protein signaling 3	0.31	1.E-02	3.E-02
BE102969	Ets variant 4	0.31	2.E-03	1.E-02
NM_031609	Neuroblastoma, suppression of tumorigenicity 1	0.31	8.E-03	2.E-02
BG378161	Similar to hypothetical protein FLJ23451	0.31	7.E-05	1.E-03
BM387903	GlycoproteinIb(platelet),betapolypeptide	0.31	3.E-03	1.E-02
AI045400	Carbonic anhydrase 14	0.31	2.E-04	3.E-03
AI412803	Protein tyrosine phosphatase, receptor type, D	0.31	5.E-04	5.E-03
BE116198	Exonuclease 1	0.31	1.E-02	3.E-02
NM_053307	Methionine sulfoxide reductase A	0.31	5.E-03	2.E-02
BF281153	NS5A (hepatitis C virus) transactivated protein 9	0.31	3.E-04	3.E-03
NM_053329	Insulin-like growth factor binding protein, acid labile subunit	0.31	3.E-03	1.E-02
AI717613	MRV integration site 1 homolog (mouse)	0.31	2.E-03	1.E-02
NM_031620	Phosphoglycerate dehydrogenase	0.30	6.E-04	5.E-03
AI170665	ChaC, cation transport regulator homolog 1 (E. coli)	0.30	4.E-05	1.E-03
AA800004	Septin 4	0.30	3.E-04	4.E-03
NM_012548	Endothelin 1	0.30	8.E-03	2.E-02
AI231564	Villin 1	0.30	9.E-05	2.E-03
AW915567	ATPase family, AAA domain containing 2	0.30	4.E-04	4.E-03
NM_012513	Brain derived neurotrophic factor	0.30	1.E-03	8.E-03
AF200684	Solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter, y+ system), member 7	0.30	1.E-04	2.E-03
BF288000	Septin 6	0.30	1.E-02	3.E-02
NM_012974	Laminin, beta 2	0.30	1.E-04	2.E-03
BG381486	Like-glycosyltransferase	0.30	4.E-05	1.E-03
NM_053611	Nuclear protein 1	0.30	4.E-07	9.E-06
AA998516	Cyclin A2	0.29	9.E-04	6.E-03
AI102745	Similar to 2310014H01Rik protein	0.29	2.E-04	3.E-03
AA956005	Poly(rC) binding protein 3	0.29	3.E-04	3.E-03
BG379338	Ribonucleotide reductase M2	0.29	9.E-05	2.E-03
BF285466	Family with sequence similarity 171, member A1	0.29	1.E-03	8.E-03
NM_012587	Integrin binding sialoprotein	0.29	1.E-03	8.E-03
AI069972	GTP binding protein (gene overexpressed in skeletal muscle)	0.29	8.E-04	6.E-03
BE108276	Similar to Shc SH2-domain binding protein 1	0.28	1.E-03	7.E-03
BF283627	Growth factor receptor bound protein 10	0.28	2.E-03	1.E-02
AF255888	SH3-domain kinase binding protein 1	0.28	6.E-03	2.E-02
BG663422	G protein-coupled receptor 176	0.28	8.E-06	3.E-04
BF397093	Cytochrome P450, family 26, subfamily b, polypeptide 1	0.27	4.E-05	9.E-04
NM_012561	Follistatin	0.27	4.E-05	1.E-03
BM390141	Integrin alpha 9	0.27	3.E-02	4.E-02
NM_012987	Nestin	0.27	6.E-03	2.E-02
AI230228	Phosphoserine aminotransferase 1	0.27	3.E-03	1.E-02
AI029143	Cd5 molecule-like	0.26	5.E-05	1.E-03
BF398599	Diaphanous homolog 3 (Drosophila)	0.26	8.E-04	6.E-03
NM_031815	Inhibin beta E	0.26	3.E-03	1.E-02
AA799423	Nexilin (F actin binding protein)	0.26	1.E-03	8.E-03
NM_053633	Early growth response 2	0.26	2.E-04	3.E-03
AI178618	SLAM family member 6	0.26	1.E-04	2.E-03
AB030829	Carbonic anhydrase 3	0.26	4.E-05	9.E-04
BE097028	Phospholipase C, beta 1 (phosphoinositide-specific)	0.26	2.E-05	5.E-04
NM_022589	Tetraspanin 2	0.25	5.E-04	5.E-03
BF565151	Single-stranded DNA binding protein 2	0.25	4.E-03	1.E-02
BG373314	Potassium channel tetramerisation domain containing 15	0.25	2.E-03	9.E-03
BF285026	Endothelial cell adhesion molecule	0.25	3.E-06	1.E-04
BG377887	GDNF family receptor alpha 3	0.25	3.E-03	1.E-02
BI284296	G protein-coupled receptor 126	0.25	2.E-03	1.E-02
NM_017210	Deiodinase, iodothyronine, type III	0.25	5.E-05	1.E-03
NM_133303	Basic helix-loop-helix family, member e41	0.24	1.E-06	4.E-05
AI169398	Cholesterol 25-hydroxylase	0.24	1.E-03	7.E-03
BF551984	Prion protein 2 (dublet)	0.24	3.E-03	1.E-02
U36476	Matrix metallopeptidase 9	0.23	3.E-04	3.E-03
NM_013155	Very low density lipoprotein receptor	0.23	2.E-04	3.E-03
NM_021774	Fragile histidine triad gene	0.23	5.E-04	5.E-03
NM_053977	Cadherin 17	0.23	2.E-03	1.E-02
BE095824	Chemokine (C-C motif) ligand 6	0.23	6.E-04	5.E-03
AI102790	Branched chain aminotransferase 1, cytosolic	0.22	2.E-02	3.E-02
BM390519	GULP, engulfment adaptor PTB domain containing 1	0.22	4.E-04	4.E-03
BI276252	Microtubule associated monoxygenase, calponin and LIM domain containing 1	0.22	3.E-04	4.E-03
BE109711	Lymphocyte cytosolic protein 1	0.22	2.E-03	1.E-02
BI285092	Family with sequence similarity 25, member A	0.22	3.E-04	3.E-03
BG670559	Allograft inflammatory factor 1-like	0.22	1.E-05	4.E-04
X63434	Plasminogen activator, urokinase	0.21	2.E-03	1.E-02
NM_019904	Lectin, galactoside-binding, soluble, 1	0.21	2.E-03	1.E-02
AI579422	Brain expressed gene 1	0.21	9.E-06	3.E-04
BE107033	Ecotropic viral integration site 1	0.21	4.E-03	1.E-02
AI171288	Similar to RIKEN cDNA 1700040L02	0.21	2.E-02	3.E-02
AF239219	Solute carrier organic anion transporter family, member 3a1	0.21	2.E-04	3.E-03
AA956005	Poly(rC) binding protein 3	0.20	3.E-04	3.E-03
AW251324	Methylenetetrahydrofolatedehydrogenase(NADP+dependent)2, methenyltetrahydrofolatecyclohydrolase	0.20	5.E-04	5.E-03
NM_053963	Matrix metallopeptidase 12	0.19	2.E-06	1.E-04
NM_130752	Fibroblast growth factor 21	0.19	1.E-02	3.E-02
BF388757	Similar to RIKEN cDNA 1700025G04 gene	0.19	2.E-05	5.E-04
BI279044	Myosin, light chain 9, regulatory	0.19	1.E-06	5.E-05
BF419899	Chemokine (C-C motif) ligand 7	0.18	2.E-03	9.E-03
AW252401	BEN domain containing 5	0.18	4.E-02	4.E-02
AI013470	Lysyl oxidase-like 2	0.18	8.E-05	1.E-03
BM386789	Regulator of G-protein signaling 1	0.18	1.E-03	7.E-03
BE109802	Similar to RIKEN cDNA 2810433K01	0.18	3.E-02	4.E-02
BE099756	Rho/rac guanine nucleotide exchange factor (GEF) 2	0.18	3.E-04	3.E-03
AI411227	Attractin like 1	0.18	2.E-02	3.E-02
BF289229	Phospholipase A2 receptor 1	0.18	1.E-05	4.E-04
NM_031055	Matrix metallopeptidase 9	0.18	3.E-04	3.E-03
AF056034	Nexilin (F actin binding protein)	0.18	1.E-03	8.E-03
NM_031688	Synuclein, gamma (breast cancer-specific protein 1)	0.17	5.E-05	1.E-03
AF035963	Hepatitis A virus cellular receptor 1	0.17	6.E-06	3.E-04
AI044651	Lysyl oxidase-like 2	0.17	8.E-05	1.E-03
NM_053365	Fatty acid binding protein 4, adipocyte	0.17	4.E-04	4.E-03
AA901038	Midline 1	0.16	6.E-04	5.E-03
BF415939	FBJ osteosarcoma oncogene	0.16	4.E-04	4.E-03
AW144120	Carbonic anhydrase 3	0.16	4.E-05	9.E-04
AA801238	Spondin 2, extracellular matrix protein	0.15	7.E-03	2.E-02
NM_016991	Adrenergic, alpha-1B-, receptor	0.15	7.E-04	6.E-03
AI101171	Solute carrier organic anion transporter family, member 3a1	0.15	2.E-04	3.E-03
AI501346	Similar to cDNA sequence AF397014	0.15	2.E-02	3.E-02
BI286025	Leiomodin 1 (smooth muscle)	0.14	1.E-02	2.E-02
NM_024353	Phospholipase C, beta 4	0.14	2.E-05	5.E-04
AI602501	LIM and cysteine-rich domains 1	0.14	3.E-05	7.E-04
NM_017217	Solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter, y+ system), member 3	0.13	5.E-02	5.E-02
AA875261	Filamin binding LIM protein 1	0.12	2.E-03	1.E-02
NM_017128	Inhibin beta-A	0.11	2.E-03	1.E-02
BI274644	Similar to serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade B, member 9	0.11	1.E-04	2.E-03
AA012755	Tropomyosin 2	0.11	6.E-03	2.E-02
NM_053469	Hepcidin antimicrobial peptide	0.10	3.E-05	7.E-04
AB001382	Secreted phosphoprotein 1	0.10	1.E-04	2.E-03
BI294669	Similar to Transmembrane protein 16B	0.10	3.E-03	1.E-02
NM_021769	Sulfotransferase family 1D, member 1	0.10	2.E-02	3.E-02
AA957260	Ribonucleotide reductase M2	0.09	9.E-05	2.E-03
AI411594	Phospholipid scramblase 2	0.09	9.E-03	2.E-02
BE098153	Solute carrier family 24 (sodium/potassium/calcium exchanger), member 3	0.09	6.E-04	5.E-03
NM_053428	Fibroblast growth factor 13	0.08	6.E-03	2.E-02
AA944898	Aminoadipate-semialdehyde synthase	0.08	8.E-07	3.E-05
BF552084	Chondroitin sulfate synthase 3	0.07	6.E-05	1.E-03
NM_012598	Lipoprotein lipase	0.06	1.E-04	2.E-03
BE112921	Similar to chromosome 14 open reading frame 145	0.06	5.E-03	2.E-02
NM_019292	Carbonic anhydrase 3	0.06	4.E-05	9.E-04
BE110883	Ttk protein kinase	0.06	3.E-02	4.E-02
NM_031747	Calponin 1, basic, smooth muscle	0.05	2.E-06	1.E-04
BI286775	Ankyrin 2, neuronal	0.03	3.E-02	4.E-02

< 실시예 8. 마이크로어레이 칩 분석에서 확인된 RNA 발현 검증>

실시예 3의 조건과 동일하게 렛드 간세포를 배양 및 시스플라틴을 처리하였다. 상기 렛드 간세포에서 총 RNA는 Trizol 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 추출하였다. Taq DNA 폴리머레이즈, dNTPs, Tris-HCl(pH 9.0), 총 RNA 1㎍, KCl, MgCl₂, Oligo-p(dT) 1X 랜덤 프라이머를 최종 부피 20㎕로 맞추어 역전사 반응(reverse transcription reactions)을 수행하였고(reverse transcription kit 이용, Bioneer, Daejeon, Korea), 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다. 이 후, 상기 cDNA를 이용하여 하기 조건으로 각각의 특정 유전자에 대하여 표 3의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다(mixture kit 이용, Bioneer, Daejeon, Korea).

PCR 조건 : 1 싸이클 : 95℃ - 2분

30 싸이클 : 95℃ - 30초, 54℃ - 45초, 72 - 1 분

1 싸이클 : 72℃ - 5분

PCR 생성물은 1.8% 아가로오스 겔에서 분리하였으며 각 밴드(band)의 강도는 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)와 비교하여 측정하였으며, 도 3에 상기 결과를 나타내었다.

GSTA2(glutathione S-transferase A2), GSTT2(glutathione S-transferase, theta 2), YC2(glutathione S-transferase Yc2 subunit), TXNRD1(thioredoxin reductase 1), CYP2E1(cytochrome P450 2E1), CYP2C13(cytochrome P450, family 2, subfamily c, polypeptide 13), CYP2D1(cytochrome P450IID1), ALDH1A7(aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A7), ARG1(arginase type 1), ARG2(arginase type 2), IL6(interleukin 6)의 유전자 발현이 증가하는 것과, CYP2C12(cytochrome P450, family 2, subfamily c, polypeptide 12), CYP26B1(cytochrome P450, family 26, subfamily b, polypeptide 1), TPM1(tropomyosin 1 alpha chain isoform c), TPM3(tropomyosin alpha-3 chain isoform 2)이 감소하는 것을 확인할 수 있으며, 도 3(B)의 결과를 참고하면, RT-PCR 결과와 실시예 7에서 수행한 마이크로어레이 칩의 분석 결과가 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 유전자들은, 마이크로어레이 칩에서 유전자 발현이 2배 이상 차이가 나는 것(표 2의 유전자)을 우선적으로 선택하였고, 마이크로어레이 칩 분석 결과에서 유전자 발현이 2배까지는 차이가 나지는 않지만, LC-MS/MS 및 웨스턴 블롯을 통해서 단백질 발현이 2배 이상 차이가 났던 유전자들도 일부 선택하였다.

< 실시예 9. 면역형광요법 >

LC-MS/MS 및 웨스턴 블롯을 통해 확인된 단백질의 발현을 좀 더 확인하기 위해, PRDX1(peroxiredoxin-1), FASN(fatty acid synthase), ARG1(arginase 1)에 대한 면역형광요법을 수행하였다. 이를 위해, 렛드 간세포를 1형 콜라겐(collagen type I)으로 코팅한 챔버 슬라이드 위에서 배양하였다. 상기 세포는 실시예 3과 세포 수 및 배양접시 크기 등을 동일하게 하여 배양하였고, 시스플라틴 또한 동일한 농도 및 시간으로 처리하였다. 배양된 세포는 3.7% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 이용해 고정하였으며, 실온에서 30분간 세포배양배지를 반응시켰고, PBS로 15분간 세척하였다. 이후에는 0.3% Triton X-100 용액으로 블로킹(blocking)하였으며, 1.5% BSA가 포함된 PBS를 추가해 15분간 반응시켰다. 블로킹된 세포는 4℃에서 18시간 이상 1:300으로 희석된 1차 항체와 반응시켰으며, 2차 항체와 반응시킨 후, DNA 염색을 위해 1mg/㎖ DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)에 5분간 반응시켰으며, 마운팅하였다(VECTASHIELD mounting medium 이용, [Vector Laboratories, Burlingame, CA]). 형광 이미지는 공초점 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용해 측정하였으며 이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4를 참고하면, PRDX1, FASN, ARG1이 시스플라틴을 처리한 렛드 간세포에서 현저하게 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 LC-MS/MS 및 웨스턴 블롯과 동일한 패턴으로 단백질이 발현되고 있음을 입증할 수 있었다.

Claims

하기 유전자 군에서 선택된 3종 이상의 단백질을 유효성분으로 포함하는 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 진단용 바이오마커 조성물.
<시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 단백질>
fructose 1,6-bisphosphatase 1 (FBP1, Accession No. IPI00231745) ;
fatty acid synthase (FASN, Accession No. IPI00200661) ;
catalase (CAT, Accession No. IPI00231742) ;
peroxiredoxin-1 (PRDX1, Accession No. IPI00211779) ;
60kDa heat shock protein (HSPD1, Accession No. IPI00763910) ;
malate dehydrogenase 2 (MDH2, Accession No. IPI00197696) ;
arginase 1 (ARG1, Accession No. IPI00327518) ;
tropomyosin 1 (TPM1, Accession No. IPI00210945) ;
tropomyosin 3 (TPM3, Accession No. IPI00210941) ;
cathepsin B (CTSB, Accession No. IPI00212811)
제 1 항에 기재된 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 단백질 군에서 선택된 3종 이상의 단백질을 인식하는 항체를 함유하는 진단제.
하기 유전자 군에서 선택된 3종 이상의 유전자를 유효성분으로 포함하는 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 진단용 바이오마커 조성물.
<시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 유전자>
glutathione S-transferase A2 (GSTA2, Genebank Accession No. NM_017013)
glutathione S-transferase, theta 2 (GSTT2, Genebank Accession No. NM_012796)
glutathione S-transferase Yc2 subunit (YC2, Genebank Accession No. AA945082)
thioredoxin reductase 1 (TXNRD1, Genebank Accession No. U63923)
cytochrome P450 2E1 (CYP2E1, Genebank Accession No. NM_031543)
cytochrome P450, family 2, subfamily c, polypeptide 13 (CYP2C13, Genebank Accession No. J02861)
cytochrome P450IID1 (CYP2D1, Genebank Accession No. AA8498905)
aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A7 (ALDH1A7, Genebank Accession No. M23995)
arginase type 1 (ARG1, Genebank Accession No. NM_017134)
arginase type 2 (ARG2, Genebank Accession No. NM_019168)
interleukin 6 (IL6, Genebank Accession No. NM_012589)
cytochrome P450, family 2, subfamily c, polypeptide 12 (CYP2C12, Genebank Accession No. BF397093)
cytochrome P450, family 26, subfamily b, polypeptide 1(CYP26B1, Genebank Accession No. BF397093)
tropomyosin 1 alpha chain isoform c (TPM1, Genebank Accession No. No. AF370889)
tropomyosin alpha-3 chain Isoform 2 (TPM3, Genebank Accession No. BI295970).
제 3 항의 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 유전자 군에서 선택된 3종 이상의 유전자 서열의 전부, 이의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 상보 가닥 분자가 집적된 마이크로어레이 칩.
제 3 항의 시스플라틴으로 인해 유도된 간독성 환자에게서 증감하는 유전자 군에서 선택된 3종 이상의 유전자 서열에 상보적이면서 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 함유하는 진단제.
제 2 항 또는 제 5 항의 진단제를 이용하여 시스플라틴으로 인해 유도된 인간을 제외한 포유동물의 간독성을 진단하는 방법.
제 4 항의 마이크로어레이를 이용하여 시스플라틴으로 인해 유도된 인간을 제외한 포유동물의 간독성을 진단하는 방법.