KR101346552B1 - 헤파티티스 ｃ 바이러스가 감염된 간세포의 검출 방법 및 키트 - Google Patents
헤파티티스 ｃ 바이러스가 감염된 간세포의 검출 방법 및 키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 형광 화합물을 이용하여 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포와 정상세포를 구별하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따르면, 본 발명의 방법은 (E)-2-((2E,4E)-5-(1-에틸-3,3-디메틸-5-술포-3H-인돌-1-이움-2-일)펜타-2,4-디엔-1-일이덴)-3,3-디메틸-1-(8-옥소-8-((2-(비닐술포닐)에틸)아미노)옥틸)인돌린-5-술포네이트에 결합하는 단백질 패턴을 비교하여 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포와 정상세포를 구별하므로, 쉽고 빠르며 정확한 동정 결과를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 형광 화합물을 이용하여 정상 간세포 및 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포를 구별하는 방법에 관한 것이다.
세포 동정은 감염성 질병 진단의 가장 중요한 과정 중의 하나이다. 기존의 세포 동정 방법은 많은 검사 종목과 특수 배지나 시약을 필요하고, 상용화된 동정 키트는 간단하고 비교적 빠른 결과를 얻을 수 있으나, 키트의 가격이 비싸며 제품에 따라서는 정확한 동정이 이루어지지 않을 수도 있다.
C형 간염 치료제 개발등에 사용되는 모델시스템으로 C형 간염 바이러스의 Replicon 시스템이 알려져 있다. 각 세포주 상태에 따라 단백체 중 형광 프로브와 공유 결합을 이룰 수 있는 단백질 군의 차이를 이용하여 감염된 세포주와 비교군 세포주를 구별하는 방법에 대해서는 아직까지 알려진 바가 없다.
따라서, 본 발명에서는 형광 화합물을 사용하여 간단하고, 빠르며, 정확하게 정상 간세포 및 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포를 서로 구별하는 방법을 제공하고자 한다.
일 구체예는 형광 화합물을 이용하여 정상 간세포 및 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포를 서로 구별하는 방법에 관한 것이다.
다른 구체예는 형광 화합물을 포함하는 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포 검출용 키트에 관한 것이다.
일 양상은 정상 간세포 및 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포의 세포 추출물을 수득하는 단계;
상기 세포 추출물과 (E)-2-((2E,4E)-5-(1-에틸-3,3-디메틸-5-술포-3H-인돌-1-이움-2-일)펜타-2,4-디엔-1-일이덴)-3,3-디메틸-1-(8-옥소-8-((2-(비닐술포닐)에틸)아미노)옥틸)인돌린-5-술포네이트를 접촉시키는 단계; 및
상기 접촉된 결과물을 전기영동하여 상기 세포 추출물의 단백질 패턴을 확인하는 단계를 포함하는 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포의 검출 방법을 제공한다.
본 발명자들은 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포와 정상세포를 서로 쉽게 구별할 수 있는 방법을 연구한 결과, 특정 형광 화합물이 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포와 정상세포에서 서로 다른 단백질들에 결합하여 서로 다른 단팩질 패턴을 나타낸다는 사실을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.
상기 방법은 먼저, 정상 간세포 및 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포의 세포 추출물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "세포 추출물"은 구별하고자 하는 대상인 정상 간세포 및 헤파티티스 C 바이러스 내에 포함되어 있는 단백체 전체 집단을 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 세포 추출물은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라, 세포를 용해할 수 있는 키트를 이용하거나, 초음파를 이용하여 세포를 분쇄하고 원심분리를 통해 세포 내 단백체만 얻는 방법 등을 통해 수득할 수 있다.
본 발명은 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포 또는 정상세포 내에 포함되어 있는 일부 단백질들과 특이적으로 결합하는 형광 화합물인 (E)-2-((2E,4E)-5-(1-에틸-3,3-디메틸-5-술포-3H-인돌-1-이움-2-일)펜타-2,4-디엔-1-일이덴)-3,3-디메틸-1-(8-옥소-8-((2-(비닐술포닐)에틸)아미노)옥틸)인돌린-5-술포네이트를 이용하는 것으로, 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포와 정상세포를 서로 구별할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 간세포는 Huh 세포일 수 있으며, 예를 들어, 상기 세포 추출물은 Huh7.5 세포로부터 수득할 수 있다.
헤파티티스 C 바이러스(Hepatitis C Virus, HCV)는 플라비비리데(flaviviridae) 패밀리의 헤파시바이러스(hepacivirus)속에 속하며, 외피를 가진 외가닥의 RNA 바이러스이다. HCV는 간세포를 감염시켜 염증을 유발시키고, 간 손상을 초래하는 병원체로 알려져 있다. 상기 헤파티티스 C 바이러스는 6가지의 유전자형으로 구분되며, 예를 들어, HCV genotype 1, HCV genotype 2, HCV genotype 3, HCV genotype 4, HCV genotype 5 및 HCV genotype 6 타입일 수 있다. HCV는 예를 들어, HCV 2a, HCV 2b 및 HCV 2c와 같이 더욱 다양한 아종으로 구분될 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 헤파티티스 C 바이러스는 HCV genotype 2일 수 있으며, 가장 바람직하게는 HCV 2a일 수 있다.
다음으로, 상기 세포 추출물과 (E)-2-((2E,4E)-5-(1-에틸-3,3-디메틸-5-술포-3H-인돌-1-이움-2-일)펜타-2,4-디엔-1-일이덴)-3,3-디메틸-1-(8-옥소-8-((2-(비닐술포닐)에틸)아미노)옥틸)인돌린-5-술포네이트를 접촉시키는 단계를 거치게 된다.
본 발명에서 사용되는 형광 화합물인 (E)-2-((2E,4E)-5-(1-에틸-3,3-디메틸-5-술포-3H-인돌-1-이움-2-일)펜타-2,4-디엔-1-일이덴)-3,3-디메틸-1-(8-옥소-8-((2-(비닐술포닐)에틸)아미노)옥틸)인돌린-5-술포네이트((E)-2-((2E,4E)-5-(1-ethyl-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indol-1-ium-2-yl)penta-2,4-dien-1-ylidene)-3,3-dimethyl-1-(8-oxo-8-((2-(vinylsulfonyl)ethyl)amino)octyl)indoline-5-sulfonate)는 하기 화학식 I의 화학식으로 나타낼 수 있다.
화학식 I
마지막으로, 상기 방법은 상기 접촉된 결과물을 전기영동하여 상기 세포 추출물의 단백질 패턴을 확인하는 단계를 거치게 된다.
상기 형광 화합물은 상기 접촉된 결과물을 전기영동한 후, 상기 형광 화합물을 검출할 수 있는 스캐너를 이용하여 검출할 수 있으며, 상기 형광 화합물이 결합된 단백질 또는 상기 단백질의 패턴을 서로 비교함으로써, 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포와 정상세포를 서로 구별할 수 있다.
다른 양상은 (E)-2-((2E,4E)-5-(1-에틸-3,3-디메틸-5-술포-3H-인돌-1-이움-2-일)펜타-2,4-디엔-1-일이덴)-3,3-디메틸-1-(8-옥소-8-((2-(비닐술포닐)에틸)아미노)옥틸)인돌린-5-술포네이트를 포함하는 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포 검출용 키트를 제공한다.
일 구체예에 따른 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포 검출용 키트는 (E)-2-((2E,4E)-5-(1-에틸-3,3-디메틸-5-술포-3H-인돌-1-이움-2-일)펜타-2,4-디엔-1-일이덴)-3,3-디메틸-1-(8-옥소-8-((2-(비닐술포닐)에틸)아미노)옥틸)인돌린-5-술포네이트 및 이를 안정화시킬 수 있는 버퍼 등을 포함할 수 있으며, 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포와 정상세포를 서로 구별하는 용도로서 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 키트는 HCV genotype 2에 감염된 간세포, 가장 바람직하게는 HCV 2a에 감염됨 간세포를 구별하기 위한 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 본 발명의 방법은 (E)-2-((2E,4E)-5-(1-에틸-3,3-디메틸-5-술포-3H-인돌-1-이움-2-일)펜타-2,4-디엔-1-일이덴)-3,3-디메틸-1-(8-옥소-8-((2-(비닐술포닐)에틸)아미노)옥틸)인돌린-5-술포네이트에 결합하는 단백질 패턴을 비교하여 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포와 정상세포를 구별하므로, 쉽고 빠르며 정확한 동정 결과를 제공할 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 방법에 의해 Huh7.5 세포주와 HCV 2a 감염 Huh7.5 세포주의 단백질 패턴을 비교한 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법 및 실험 결과
(1) 세포주의 배양
Huh7.5 세포주 (Cat#: APC49, Apath, inc.)와 HCV 2a 감염 Huh7.5 세포주 (Cat#: APC140, Apath inc.)의 단백체를 준비하기 위하여, 상기 세포주를 Apath inc.로부터 구매하였다. 세포는 Apath에서 제공하는 프로토콜을 따라 37℃, 5% CO2 조건으로 인큐베이터 내에서 배양하였다. Huh7.5 세포의 배양을 위해서 10% Fetal Bovine Serum(FBS), 0.01 mM non-essential amino acids(NEAA), 1X Penicilin/Streptomycin을 포함한 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM) 배양액을 사용하였으며, HCV 2a 감염 Huh7.5 세포주는 10% FBS, 1X NEAA, 1 g/L G418, 1X Penicilin/Streptomycin을 포함한 DMEM 배양액을 사용하였다.
(2) 형광 화합물 처리 및 SDS-PAGE 이미지 분석
상기 각각의 세포를 24시간 동안 배양한 후, 상기 세포가 배양액에 담긴 상태에서 DMSO 1%에 포함된 20 uM (E)-2-((2E,4E)-5-(1-에틸-3,3-디메틸-5-술포-3H-인돌-1-이움-2-일)펜타-2,4-디엔-1-일이덴)-3,3-디메틸-1-(8-옥소-8-((2-(비닐술포닐)에틸)아미노)옥틸)인돌린-5-술포네이트를 처리한 다음, 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 1시간 동안 다시 배양하였다. 이후. 1X 트립신/EDTA를 처리한 다음, 원심분리 하여 상층액을 버리고, PBS 용액(pH 7.4)으로 2번 씻어 준 후, SigmaAldrich 사의 CellLyticTM M kit(Cat #: C2978)를 이용하여 단백질 혼합물 용액을 얻었다. 상기 단백질 혼합물 용액에 Laemmli 샘플 버퍼를 넣고, 95℃에서 2분 동안 가열한 다음, 15% SDS가 포함된 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하여 전기영동(120V 20분, 이어서 180V 60분)한 후, 상기 형광 화합물로 표지된 단백질의 패턴을 형광 SDS-PAGE Scanner(TyphoonTM 9400, GE Health Science)로 확인하였다. 이때, (E)-2-((2E,4E)-5-(1-에틸-3,3-디메틸-5-술포-3H-인돌-1-이움-2-일)펜타-2,4-디엔-1-일이덴)-3,3-디메틸-1-(8-옥소-8-((2-(비닐술포닐)에틸)아미노)옥틸)인돌린-5-술포네이트의 표지 단백질 이미지는 TyphoonTM 9400 기기의 ex: 488 nm, em: 526-SP 조건에서 얻었다. 상기 각 세포주의 구별은 단백질 분자량(molecular weight) 축에 대한 패턴을 이용하였다.
도 1에서 보는 바와 같이, SDS-PAGE 결과로부터 Huh7.5 세포와 HCV 2a 감염 Huh7.5 세포주에서 오른쪽 Coomassie 염색에서는 단백체의 정량적 차이가 분명하지 않으나, 왼쪽 형광 영상에서는 확연한 형광 표지 패턴의 차이가 나타남을 확인할 수 있었다.
Claims (5)
- 정상 간세포 및 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포의 세포 추출물을 수득하는 단계;
상기 세포 추출물과 (E)-2-((2E,4E)-5-(1-에틸-3,3-디메틸-5-술포-3H-인돌-1-이움-2-일)펜타-2,4-디엔-1-일이덴)-3,3-디메틸-1-(8-옥소-8-((2-(비닐술포닐)에틸)아미노)옥틸)인돌린-5-술포네이트를 접촉시키는 단계; 및
상기 접촉된 결과물을 전기영동하여 상기 세포 추출물의 단백질 패턴을 확인하는 단계를 포함하는 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포의 검출 방법. - 제1항에 있어서, 상기 간세포는 Huh7.5 세포인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 헤파티티스 C 바이러스는 HCV genotype 2인 것인 방법.
- (E)-2-((2E,4E)-5-(1-에틸-3,3-디메틸-5-술포-3H-인돌-1-이움-2-일)펜타-2,4-디엔-1-일이덴)-3,3-디메틸-1-(8-옥소-8-((2-(비닐술포닐)에틸)아미노)옥틸)인돌린-5-술포네이트를 포함하는 헤파티티스 C 바이러스가 감염된 간세포 검출용 키트.
- 제4항에 있어서, 상기 헤파티티스 C 바이러스는 HCV genotype 2인 것인 키트.
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| KR1020120047596A KR101346552B1 (ko) | 2012-05-04 | 2012-05-04 | 헤파티티스 ｃ 바이러스가 감염된 간세포의 검출 방법 및 키트 |
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| KR1020120047596A KR101346552B1 (ko) | 2012-05-04 | 2012-05-04 | 헤파티티스 ｃ 바이러스가 감염된 간세포의 검출 방법 및 키트 |
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-
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Non-Patent Citations (3)
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| Gardner, Jason P., et al. PNAS, 100권, 8호, 4498-4503페이지 (2003) * |
| Lindenbach, Brett D. et al., Nature, 436권, 7053호, 933-938페이지(2005) * |
| 조효손, 미생물학회지, 47권, 4호, 342-347페이지(2011) * |
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