KR101345876B1

KR101345876B1 - 피마사르탄을 함유하는 세포, 조직 또는 장기 보존용 조성물

Info

Publication number: KR101345876B1
Application number: KR1020120009702A
Authority: KR
Inventors: 김형규; 김나리; 한진; 이성률
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2012-01-31
Filing date: 2012-01-31
Publication date: 2013-12-30
Also published as: KR20130088460A

Abstract

본 발명은 피마사르탄 (Fimasartan)을 포함하며 허혈손상 또는 재관류손상을 예방하는 세포, 조직 또는 장기 보존용 조성물 및 피마사르탄을 포함하는 허혈 또는 재관류에 의한 손상 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 피마사르탄 (Fimasartan)은 미토콘드리아의 칼슘통로를 차단하여 미토콘드리아의 기능을 조절함으로 세포, 조직 또는 장기에서 세포자살을 억제할 수 있기 때문에, 상기 피마사르탄은 허혈손상 또는 재관류 손상의 예방 또는 치료용 조성물로 효과적일 뿐만 아니라, 세포, 조직 또는 장기의 저온보관, 이식수술 또는 이식 후 발생하는 재관류에 의한 손상을 예방하는 세포, 조직 또는 장기 보존용 조성물로 활용할 수 있다.

Description

피마사르탄을 함유하는 세포, 조직 또는 장기 보존용 조성물 {Composition for preserving cells, tissue or organs containing Fimasartan}

본 발명은 허혈손상 또는 재관류손상을 예방하는 세포, 조직 또는 장기 보존용 조성물 및 허혈손상 또는 재관류손상 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

허혈 (Ischemia)이란 생리적 기능에 요구되는 산소 요구량보다 산소공급이 부족한 상태로서 국소적 혈류의 감소를 말한다. 재관류 (Reperfusion)란 혈액이 다시 조직에 공급되는 것으로, 허혈성 조직의 생존에 필수적이나, 허혈 동안 산화성 손상에 매우 민감한 경향이 있는 조직들의 재산화로 인해 조직의 손상을 더욱 가속화시킨다. 이를‘허혈 및 재관류 (I/R) 손상’이라고 부른다.

허혈 및 재관류의 결과는 가역적 및 비가역적 세포 조직 손상, 세포 치사 및 기관 기능의 효율감소 등으로 나타난다. 허혈 및 재관류는 인간의 생명과 직결되는 질병 즉, 심장관련사망의 주원인인 허혈성 심질환, 뇌졸중, 쇼크뿐만 아니라 암 및 노화 등과 밀접하게 관련 인간의 세포나 조직은 장시간에 걸쳐 허혈에 빠지면 위독한 피해를 입고 최종적으로는 세포사에 다다른다. 한편 일정시간의 허혈 재관류에 의해 급격히 산소부하가 가해진 경우에 있어서는 더욱 위독한 장해를 야기할 수 있다. 이러한 허혈 재관류 장해는 임상적으로는 장기이식이나 심근경색에 대한 관혈행 재건술시 볼 수 있는 질환으로서 종래부터 알려져 있지만, 고양이의 소장을 사용한 허혈 재관류에 의한 조직장해에 자유라디칼반응이 관여하고 있다는 사실이 지적된 이래 (Granger, D.N. et.al.: Superoxide radicals in feline intestinal ischemia. Gastroentero1. 22-29, 1981), 이 분야의 연구는 크게 확대되어 소장 뿐 아니라 뇌, 심장, 위, 간장, 신장 등에서도 허혈 재관류 장해와 활성산소·자유라디칼의 관여도 보고되고 있다.

대사성 조직의 장기간의 허혈 (이십분 이상) 및 계속해서 이어지는 재관류로 인해 일군의 복잡한 사건들이 일어나는 것이 알려져 있다. 허혈이 진행되는 기간동안 초기에는 초산화물 디스무타제 (SOD), 카탈라제, 및 글루타티온의 활성을 포함하여, 세포내 항산화제 효소활성이 감소하며, 글루타티온 산화효소 활성도 허혈 동안 혈관 내피조직에서 부수적으로 증가하였으며, 이러한 허혈성 세포에서의 산소 자유 라디칼의 증가 후, 그 상태로 재관류가 일어난다면 허혈성 세포에서 산화성 파열 및 허혈성 재관류된 기관 매트릭스를 구성하는 다른 세포에 대해 가역적 및 비가역적 손상을 초래할 수 있다. 예를 들어 만약 심장 기관을 고려하여 보면 가역적인 산화성 손상은 심근 기절 (stunning)에 기여하는 한편, 비가역적인 손상은 심근경색으로서 심장 자체에 나타나게 된다. 이러한 허혈성 심근조직의 재관류는 또한 잠재적인 치사 부정맥을 포함한 전기생리학적 변화를 유발할 수 있다.

본 발명은 피마사르탄 (Fimasartan)을 포함하며 허혈손상 또는 재관류손상을 예방하는 세포, 조직 또는 장기 보존용 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 본 발명은 피마사르탄 (Fimasartan)을 포함하는 허혈 또는 재관류에 의한 손상 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 피마사르탄 (Fimasartan)을 포함하며 허혈손상 또는 재관류손상을 예방하는 세포, 조직 또는 장기 보존용 조성물을 제공한다.

상기 피마사르탄은 미토콘드리아 칼슘통로를 차단할 수 있다.

상기 피마사르탄은 세포, 조직 또는 장기에서의 세포자살을 억제할 수 있다.

상기 조성물은 세포, 조직 또는 장기의 생체외 보관, 개복술 중 세포, 조직 또는 장기의 보존, 이식수술 또는 이식 후 세포, 조직 또는 장기의 보존을 위한 것일 수 있다.

본 발명은 피마사르탄 (Fimasartan)을 포함하는 허혈 또는 재관류에 의한 손상 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 손상은 심장, 뇌 및 소장으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 장기의 손상일 수 있다.

상기 심장의 손상은 심근경색, 심부전, 심실세동 또는 부정맥이 포함될 수 있다.

본 발명의 피마사르탄 (Fimasartan)은 미토콘드리아의 칼슘통로를 차단하여 미토콘드리아의 기능을 조절함하고 세포, 조직 또는 장기에서 세포자살을 억제할 수 있기 때문에, 상기 피마사르탄은 허혈손상 또는 재관류 손상의 예방 또는 치료용 조성물로 효과적일 뿐만 아니라, 세포, 조직 또는 장기의 저온보관, 이식수술 또는 이식 후 발생하는 재관류에 의한 손상을 예방하는 세포, 조직 또는 장기 보존용 조성물로 활용할 수 있다.

도 1A 및 1B는 피마사르탄 처리여부에 따른 좌심실 (left ventricle; LV)과 손상위험부 (area at risk; AAR) 부위의 경색증의 크기를 나타낸 것이다 (sham group; n=7, control group; n=9, and fimasartan group; n=9).
도 2는 피마사르탄 처리여부에 따른 좌심실 심근변형패턴 (LV myocardial strain patterns)을 나타낸 것이다.
도 3A는 세포자살을 나타내는 DNA 분절 정도를 나타낸 것이고, 도 3B 및 3C는 심장과 심근세포주 (H9c2) 세포 (18-hour hypoxia and 48-hour reoxygenation)에 대한 TUNEL 분석과 이의 상대적인 비율을 각각 나타낸 것으로, 도 3B는 허혈/관류 후 경계지역에서의 TUNEL 분석결과를 나타낸 것이고, 도 3C는 H9c2 세포의 저산소화/재산소화에서 피마산탄의 항자살효과를 나타낸 것이다.
도 4는 LV에서 TUNEL 염색의 대표적 이미지를 나타낸 것으로, 도 4A는TUNEL 분석방법을 간단히 모식한 것이고, 도4B는 sham을, 도 4C 대조군을, 도 4D 피마산탄 처리된 그룹으로 어둡게 염색된 세포자살 반응물이 메틸그린의 배경에 보여졌고, 화살표는 세포자살 세포를 나타낸 것이다.
도 5는 H9c2 세포에서의 TUNEL 염색사진을 나타낸 것으로, 도 5A는 18시간 동안 저산소화/ 48시간동안 재산소화과정을 모식한 것이고, 도 5B는 DAPI 염색으로부터의 이미지, TUNEL 분석 및 좌패널로부터 배양된 H9c2의 두가지 이미지의 혼합을나타내 것이다.
도 6은 피마사르탄 처리여부에 따른 Bax, Bcl-2 및 Bax/Bcl-2 비율 (n=4)을 면역블롯팅을 통해 확인한 것이다.
도 7A는 Langndorff 시스템에서의 실험 프로토콜을 나타낸 것으로, 베이스라인 (a), 30분간의 전뇌허혈 (global ischemia) (b), 30분간의 재관류 (c)시의 샘플들을 나타낸 것이고, 도 7B는 피마사르탄으로 처리된 분리된 심장에서의 포스포-Akt, 포스포-글리코겐 합성효소 키나아제 3β (glycogen synthetase kinase 3β, GSK-3β)에 대한 면역블롯팅과 이들의 상대적 비율을 나타낸 것이고, 도 7C는 30분간 재관류시 p53, Bcl-2에 대한 면역블롯팅과 이들의 상대적 비율을 나타낸 것이다. 피마산탄을 50μmol/L를 사용하였고 대조군을 100%로 설정하였다.
도 8A은 분리된 심장근세포에서 피마사르탄의 존재 또는 부재하에 전세포패치클램프 (whole cell patch-clamp)를 이용하여 I _Ca _,L 를 측정한 것이고, 도 8B는 막커페시턴스 (membrane capacitance)에 대해 표준화된 피크 내부전류 (pA/pF) 그래프를 나타낸 것으로, GSK-3β는 글리코겐합성효소 키나아제-3β (glycogen synthase kinase-3β)를; I _Ca _,L 는 L-타입 Ca² ⁺전류를 나타낸 것이다 (N=5~7/group. *p<0.05 vs control).
도 9A는 섬유광학산소전극을 사용하여 상태 3 (active) 및 상태 4 (rest)에서의 미토콘드리아 산소소비률을 나타낸 것이고, 도 9B는 호흡조절지수 (respiration control index) (state3/state4)를 나타낸 것이고, 도 9C는 루시퍼라아제 분석키트에 의해 측정된 미토콘드리아에서의 ATP함량을 나타낸 것이다.
도 10A 내지 10C는 공초점현미경을 사용하여 베이스라인부터 재산소화까지의 미토콘드리아 특이적 MitoSox red (O² ^- 생산) (도 10A), TMRE (막 포텐셜) (도 10B) 및 Rhod2 AM (칼슘) (도 10C) intensities를 나타낸 것으로, 심장근육세포가 피마사르탄이 없을 때 (a,b, 및 c) 및 존재할 때 (d, e 및 f) 저산소화 (15분간)와 재산소화 (30분간)를 수행한 것으로, (a) 와 (d)는 베이스라인 (baseline)을 나타내며; (b)와 (e)는 저산소화 (hypoxia)를 나타내고; (c)와 (f)는 재산소화 (reoxygenation)를 나타낸 것이다.
도 11은 피마사르탄의 처리여부에 따른 히스타민 (MCU activator)으로 유도된 Rhod2-AM intensity를 나타낸 것이다 (N=4~6/group, *p<0.05 vs control).

본 발명은 피마사르탄 (Fimasartan)을 포함하며 허혈손상 또는 재관류손상을 예방하는 세포, 조직 또는 장기 보존용 조성물 및 피마사르탄 (Fimasartan)을 포함하는 허혈 또는 재관류에 의한 손상 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 피마사르탄은 2-n-부틸-5-디메틸아미노티오카르보닐메틸-6-메틸-3-[[2'-(1H-테트라졸-5-일)비페닐-4-일]메틸]피리미딘-4(3H)-원 (2-n-butyl-5-dimethylaminothiocarbonylmethyl-6-methyl-3-[[2'-(1H-tetrazol-5-yl)biphenyl-4-yl]methyl]pyrimidin-4(3H)-one으로 명명되는 ARB (angiotensin receptor blocker) 계열의 화합물로서, 상기 화합물은 혈관 평활근에 대한 안지오텐신 II (angiotensin II)의 효과를 차단하여 직접적인 항고혈압효과를 나타내고, 또한 나트륨과 체액의 저류, 혈관 탄력에 작용하는 안지오텐신 II의 영향을 차단함으로써 간접적인 항고혈압효과를 가진다고 알려져 있으며, 화학식 1로 표시될 수 있다.

[화학식 1]

미토콘드리아 (mitochondria)는 세포 내 소기관으로 대부분의 진핵세포에 존재하며, 핵 DNA와 분리되는 자체적인 DNA인 미토콘드리아 DNA (mtDNA)를 가지며, 세포 내 에너지원인 ATP를 생성하여 다양한 에너지-요구 생합성 및 여러 가지 대사 활성을 추진시키는 데 사용될 수 있다. 또한, 미토콘드리아는 세포 내 신호전달에 중요한 역할을 하는 칼슘이온을 기질 내에 저장하고 있다가 필요시에 세포질로 공급하며, 이 밖에도 세포 사멸, 증식, 대사 등을 조절하는 역할을 할 수 있다.

본 발명의 피마사르탄은 미토콘드리아 기능을 조절할 수 있는데, 상기 기능 조절은 미토콘드리아 칼슘통로를 차단함으로 이루어질 수 있다. 피마사르탄 처리는 L-타입 Ca² ⁺전류 (I_Ca _,L) 및 미토콘드리아 칼슘 유니포터 (mitochondrial calcium uniporter, MCU)를 통해 가능한 미토콘드리아 Ca² ⁺ overload를 억제할 수 있다.

또한, 상기 피마사르탄은 p53 감소 및 Akt와 GSK-3의 활성화와 관련된 Bcl-2의 감소를 최소화함으로 세포, 조직 또는 장기에서의 세포자살을 억제할 수 있다. 본 발명의 실시예에 나타난 바와 같이, 허혈-재관류시 피마사르탄의 처리에 의해 DNA 분쇄가 억제되었고, 상기 피마사르탄 처리에 의해 세포자살에서의 중요 결정자 (determinant)인 Bax/Bcl-2가 현저히 감소 되었고, 미토콘드리아 O² ^- 생산 및 재산소화에 대한 막 포텐셜의 붕괴가 크게 약화 되었다.

이와 같이, 피마사르탄은 Bcl-2를 조절하고 Ca² ⁺ overload를 억제함으로, 허혈 또는 재관류시 미토콘드리아의 기능이상 및 세포자살을 예방할 수 있다.

상기 허혈손상은 혈류량 감소 또는 심한 혈류 차단에 의하여 초래되는 세포, 조직 또는 장기의 손상일 수 있다.

상기 재관류손상은 신체부위에 대한 혈액의 흐름이 일시적으로 중단 (허혈)된 다음 다시 재개 (재관류)되는 경우, 허혈손상을 받은 조직을 재관류시킴으로 조직손상이 가속화시키는 것일 수 있다.

조직의 허혈 및 재관류손상의 기전은 완전히 밝혀지지는 않았지만 중요한 발병요인으로 산소라디칼 반응, 칼슘의 유입, 프로스타글란딘 (Prostaglandin)의 증가, 백혈구 활성증가에 따른 염증반응, 혈관 내피손상에 따른 혈류저하 등이 있으며, 이로 인해 야기되는 세포자살이 주요원인으로 간주 될 수 있는데, 본 발명의 피마사르탄 처리는 산소라디칼 반응, 칼슘의 유입 등을 차단할 뿐만 아니라, 세포자살을 억제함으로 세포, 조직 또는 장기의 허혈손상 또는 재관류손상을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 조성물은 허혈손상 또는 재관류손상을 예방하기 위한 모든 경우에 적용이 가능하며, 일례로 세포, 조직 또는 장기의 생체외 보관, 개복술 중 세포, 조직 또는 장기의 보존, 이식수술 또는 이식 후 세포, 조직 또는 장기의 보존시 허혈손상 또는 재관류손상을 예방하기 위해 사용할 수 있다.

상기 장기이식은 (1) 장기 적출, (2) 적출 장기의 냉보관, (3) 이식과정에서의 허혈기간, (4) 재관류 과정으로 수행될 수 있다. 상기과정 중 보관과 이식과정에서 이식장기는 허혈손상을 받을 수 있기 때문에 빠른 시간 내에 이식을 완료하여야만 이식장기의 기능이나 높은 생존율을 보장받을 수 있다. 그러나 장기의 보관이나 이식시간이 지체되면 조직허혈이 진행되어 허혈손상을 받을 뿐만 아니라 이식 후 재관류시 재관류손상이라는 심각한 후유증이 발생할 수 있다.

본 발명의 조성물은 이식장기의 보관, 생체외 세포, 조직 또는 장기의 보존 용도 이외에 개복술 동안 생체내 세포, 조직 또는 장기의 보존을 위해 유용성이 높을 뿐만 아니라, 개복술을 포함하여 여러 유형의 수술 동안 또는 이후에도 혈액대체물 등에 상기 피마사르탄을 첨가하여 사용함으로 허혈손상 또는 재관류손상을 예방할 수 있다.

상기 조성물은 인간을 포함한 포유류 등의 동물의 세포, 조직 또는 장기를 허혈손상 또는 재관류손상을 예방하기 위해 적절할 수 있다.

상기 조성물은 물, 당류, pH 완충물질, 항산화제를 포함할 수 있는데, 일례로 설탕, 라피노즈 (raffinose), 마니톨 (mannitol) 등의 당류, 인산나트륨, 인산칼륨 등의 pH 완충물질, 항산화물질을 포함하여 장기보존 효율을 보다 높일 수 있으나, 이러한 첨가물에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 세포, 조직 또는 장기 보존용 조성물을 얻는 일례로, 피마사르탄을 당업계에 공지된 세포, 조직 또는 장기 보존용 조성물에 첨가하여 얻어질 수 있는데, 상기 공지된 보존용 조성물은 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니며, 콜린스 (Collins)액, 유로콜린스 (Euro-Collins, 이하 EU)액, Sacks액, HTK 용액, 위스콘신대학에서 개발한 UW액 등을 포함할 수 있다.

상기와 같이 허혈 손상 및 재관류 손상으로부터 세포, 조직 또는 장기를 보존하는 것은 큰 가치가 있다. 우선적으로, 수술 또는 이식 후 상기 조직 또는 장기의 기능이 유지되어 수용자의 생존률을 높일 수 있고, 보존기간을 연상시킬 수 있어 HLA 매치를 잘 시킬 수 있으며, 매치된 수용자에게 더 긴 거리로 조직, 장기의 운반이 가능하게 할 수 있다.

본 발명의 피마사르탄은 미토콘드리아 칼슘통로를 차단하며, 세포자살을 억제함으로 허혈 또는 재관류에 의한 손상을 예방 또는 치료할 수 있다.

상기 허혈 또는 재관류에 의한 손상은 생체내 내부적 손상에 의해 야기된 것일 수 있으며, 또는 조직이식, 수술 등의 인위적인 외부적 치료 과정 중 발생한 모든 손상을 포함할 수 있다.

상기 허혈 또는 재관류에 의한 손상은 그 손상부위에 있어 특별히 한정된 것은 아니며, 심장, 위, 소장, 간장, 췌장, 신장, 뇌, 안구, 피부 등 각 부위의 손상이나 장기이식시의 장기 등일 수 있으며, 바람직하게는 심장, 뇌 및 소장으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 장기의 손상일 수 있다.

상기 허혈 또는 재관류에 의한 뇌손상은 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 허혈성 뇌부종, 뇌졸중, 알츠하이머 또는 파킨슨병 등이 포함될 수 있다.

상기 허혈 또는 재관류에 의한 심장손상은 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 심근경색, 심부전, 심실세동 또는 부정맥 등이 포함될 수 있다.

상기 허혈 또는 재관류에 의한 소장손상은 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 쇼크, 대사성 산증 또는 탈수 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 피마사르탄은, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 99중량%로 포함할 수 있으며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 피마사르탄을 함유하는 허혈 또는 재관류에 의한 손상 예방 또는 치료용 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 본 발명의 목적에 위배되지 않는 한, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다 (예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science], 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA).

본 제제를 경구 투여용으로 사용하는 경우에는, 상기 피마사르탄을 적당한 첨가제, 예컨대 유당, 자당, 만니톨, 옥수수 전분, 합성 또는 천연고무, 결정셀룰로오스의 부형제, 전분, 셀룰로오스 유도체, 아라비아고무, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 전분, 콘 스타치, 알긴산나트륨 등의 붕해제, 탈크, 스테아린산마그네슘, 스테아린산나트륨 등의 활택제, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 인산칼슘, 인산나트륨 등의 충전제 또는 희석제 등과 적절히 혼합하여 정제, 산제 (분말), 환제 및 과립제 등의 고형제제로 할 수 있다.

또한 본 발명의 허혈손상 또는 재관류손상 예방 또는 치료용 조성물을 비경구 투여용으로 하는 경우에는 피마사르탄을 정제수, 인산 완충액 등의 적당한 완충액, 생리적 식염수, 링거용액, 로크용액 등의 생리적 염류용액, 에탄올, 글리세린 및 통상 사용되는 계면활성제 등과 적당히 조합한 멸균된 수용액, 비수용액, 현탁액, 리포좀 또는 에멀젼으로서, 바람직하게는 주사용 주입용 또는 분무용 멸균 수용액으로서 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 장내, 기관지내 등에 투여될 수 있다. 이때 액상 제제는 생리학적인 pH, 바람직하게는 6∼8의 범위내의 pH를 갖는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명의 조성물 투여량, 즉 성인 1일당 유효성분인 피마사르탄의 통상적인 투여량은 10 내지 500mg일 수 있고, 바람직하게는 60 내지 120mg일 수 있으나, 이는 환자의 연령, 병태, 증상에 따라 적절히 증감하는 것이 바람직한 것으로 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 1 일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일 간격으로 간헐 투여해도 된다. 본 발명의 조성물의 상기 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니된다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1: 시료의 준비

수컷 Sprague-Dawley (SD) 쥐 (SPF class, 250-350 g)를 미국 찰스리버사 (Charles River Laboratories International Inc)로부터 구입하였다.

피마사르탄은 앞서 BR-A-657 [2-butyl-5-dimethylaminothiocarbonylmethyl- 6-methyl-3-[[2'-(1H-tetrazol-5-yl)biphenyl-4-yl]methyl]pyrimidin-4(3H)-one (molecular formula, C27H31N7OS; molecular weight 501.65)]으로 알려진 것으로, 보령제약으로부터 구입하였다.

투여시, 피마사르탄을 증류수에 용해시켰다. 무작위적으로 한 그룹당 15 마리의 쥐가 포함되게 하여 3 그룹으로 분류하였다. 그룹 1 및 2는 sham 대조군과 허혈/재관류 (ischemia/reperfusion) 대조군으로 역할을 하는 vehicle (증류수)로 처리되었다. 그룹 3은 30분간의 ligation 30분 전에 3mg/kg용량으로 주입기 (PILOT-C, Fresenius Vial, FRANCE)를 사용하여 정맥내로 피마사르탄을 투여하였다.

히스타민, 프로테아제 저해제 칵테일 (protease inhibitor cocktail) 및 포스파타아제 저해제 칵테일 (phosphatase inhibitor cocktail)을 Sigma Chemical (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 테트라메틸로다민, 에틸에스테르 (Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), MitoSoxRed 및 Rhod2-AM을 Molecular probes (Eugene, OR)로부터 얻었다. 기타 화합물은 시그마로부터 구입하였다. 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA)로부터 얻었다.

실시예 2: 외과적 과정 ( Surgical procedure )

좌하행관상동맥 (left anterior descending coronary artery, LAD)의 외과적 결찰법 (Standard surgical ligation)이 수행되었다.간단히, 졸레틸 (zoletil, 50 mg/kg) 및 자일라진 (xylazine, 3mg/kg)으로 동물들을 마취하였고, 기관절제술 (tracheotomy)후에 소형 설치류의 호흡기를 사용하여 10 ml/kg체중의 일호흡용적 (tidal volume)으로, 80/minute의 호흡률에서 호흡기계를 사용하여 호흡 (ventilation)시켰다. 혈압은 압력전송기 (pressure transducer)를 사용하여 좌총경동맥 (common carotid artery)으로부터 기록하였으며, 심전도 (electrocardiogram, ECG)를 사용하여 심박수 (heart rate)를 기록되었다.

4-0 견봉합사 (silk suture)로 LAD의 봉합을 통해 심근허혈 (Myocardial ischemia)이 유도되고, 허혈지역 (ischemia zone)을 탈색 (discoloration)하여 확인하였다. 허혈에 의해 유도된 ST-T segment의 변화를 위해 심전도를 모니터하였다. 30분간 허혈 후, 관상순환 (coronary circulation)을 회복함으로 심근을 재관류하기 위해 봉합을 풀고, 심근 재관류는 이 상태에서 심근의 색상의 변화로 확인되었다. 봉합 (suture)은 프로토컬의 마지막까지 그대로 두었다. 흉부를 닫고 쥐들을 마취로부터 회복시켰다. 재관류 후 24시간에 쥐들을 다시 마취시키고 심초음파검사 (Echocardiography)를 수행한 다음 Mikro-Tip Catheter Transducer(2F, Millar Instruments, Inc. Houston, Texas, USA)를 사용하여 심박률, 압력, 부피 및 LV의 dP/dT을 측정하고 쥐들은 포화 KCl로 깊게 마취시킨 다음 안락사하였다.

좌심실 (left ventricle) 표본을 분석을 위해 수거하였다. 모의 대조군 (sham control)은 심근 허혈/ 재관류를 유도시키는 것을 제외하고 동일한 과정을 수행하여 얻었다.

실시예 3: 심장초음파 ( Echocardiograms )

심장초음파를 선적배열변환기 (linear array transducer, 14 MHz)가 장착된 상업적으로 이용가능한 초음파 시스템 (Acuson Sequoi 512C system, Siemens, Mountain View, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. 흉부를 면도하고 뒤로 누운 자세에서 전기패드 (heating pad)상에 동물을 위치시켰다. 하나의 채널의 심장초음파를 영상시스템 상에서 얻었다.

이차원적 초음파 cine loops와 3개의 지속적 맥박 (consecutive beats)에 대한 M-모드 영상이 얻어졌다. Imaging depth는 30 또는 40 mm으로 조정되며, 100 내지 150 Hz에서 temporal resolution를 얻었다.

M-모드 기록 (recordings)을 위해, 흉골 장축 영상 (parasternal long-axis view)이 사용되었다. 좌심실 확장기말 직경 (left ventricular end-diastolic dimension, LVIDd), 좌심실 수축기말 직경 (left ventricular end-systolic dimension, LVIDs), 심실 사이막 두께 (interventricular septum thickness, IVSd), 좌심실 후벽 두께 (left ventricular posterior wall thickness, LVPWd)의 M-모드 측정이 수행되었다. 상기 측정으로부터, 좌심실 확장기말 용적 (left ventricular end diastolic volume, LVEDV), 좌심실 수축기말 용적 (left ventricular end systolic volume, LVESV), 분획단축률 (fractional shortening, FS), 박출계수 (ejection fraction, EF), 1회박출량 (stroke volume, SV), 심박출량 (cardiac output, CO)이 얻어졌다.

초기심장확장기 전이혈류속도 (early diastolic transmitral flow velocity, E wave), 후기심장확장기 전이혈류속도 (late diastolic transmitral flow velocity, A wave), E/A ratio 및 E 감속시간 (deceleration time)의 도플러 (Doppler) 측정은 심첨4방도 뷰어 (apical four-chamber view)를 사용하여 측정되었다.

도 2에서 나타난 바와 같이, LV internal 파라미터, 박출계수 (ejection fraction) 및 구획단축률 (fractional shortening)은 피마사르탄 처리된 그룹에서 더 적게 변화되었고, 또한 피마사르탄 그룹에서는 심근경색 (myocardial infarction, MI) 후에도 LV 심근 변형패턴 (LV myocardial strain patterns)이 유지되었다.

실시예 4: 경색크기의 측정 ( Determination of infarct size )

재관류 후 24시간에, 각각 그룹의 쥐들에서 경색부위를 측정하였다. 가슴을 다시 열고 관상동맥 (coronary artery)을 다시 봉합하고 1.5 ml의 Evan' blue dye 5%을 하대정맥 (inferior vena cava)에 주입하였다. 심장을 절개하고 대략 2 mm 두께의 5 내지 6개 조각으로 횡단절개한 다음, 37℃에서 20분간 1% 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) 인산버퍼 (pH 7.4)에서 배양하였다.

허혈심근 (uncolored by the blue dye), 괴사부위 (necrotic zone, unstained by TTC), 및 비허혈성 부위 (non-ischemic zones, colored by blue dye)을 확인하기 위해 상기 조각들을 확대하여 디지털 카메라로 촬영하였다. 각 조각들에서 허혈부위 및 정상적으로 관류된 부위, 그리고 괴사성 및 비괴사성 부위를 이미지 분석시스템 (Image-Pro Plus 3.0; Media Cybernetics, Silver Spring, MD)이 부착된 컴퓨터로 확인하였다. 경색 크기는 좌심실 무게의 퍼센티지 (%, infarct size/left ventricular) 또는 Evans blue (%, infarct size/myocardium at risk)로 염색되지 않은 심근의 퍼센티지로서 표현되었다.

도 1A 및 도 1B에서 나타난 바와 같이, 대조군의 경색부위의 크기는 좌심실의 30.4±5.6%이고 손상위험부 (area at risk, AAR)의 47.3±7.9%이었으나, 피마사르탄 전처리시 좌심실 (left ventricle, LV) 및 AAR에서 경색증의 크기가 각각 14.5±6.0% 및 25.2±7.6%로 크게 감소되었다.

실시예 5: 세포자살의 확인

세포자살에서 피마사르탄의 효과를 결정하기 위해, 모의군 (sham), 대조군 (control) 및 비동위원소버전을 사용한 피마사르탄 심장에서 DNA 래더링 (laddering)을 분석하였다. 허혈성 부위 및 비허혈성 경계 부위로부터 수득한 신선한 LV 조직 샘플을 용해버퍼에서 균질화하였다. 얻어진 DNA를 20㎕ DNA 현탁버퍼 (suspension buffer)에서 용해시켰다. 동일한 양의 DNA를 1.8% 아가로오스젤에서 확인하였다. DNA ladders은 UV transilluminator와 520nm 필터가 장착된 카메라로 촬영하였다.

도 3A에서 나타난 바와 같이, 세포자살을 나타내는 DNA분절은 대조군 그룹에서 분명히 보였으나, 피마사르탄 처리된 그룹에서는 크게 감소되었다.

실시예 6: 조직의 TUNEL 분석 ( TUNEL assay in tissue )

세포자살 수와 형태를 분석하기 위해 TUNEL (deoxynuclotidyl transferase [TdT] mediated dUTP in situ nick end labeling) 분석이 사용되었다. 5mm 횡단 LV 부위를 중성 포르말린 (4% formaldehyde in 0.15 mol/L phosphate buffer, pH7.4)으로 고정한 다음, 파라핀에 함입시켜 절단하고 분석하였다.

밀랍을 제거하고 재수화한 다음, 5㎛ 조직 조각을 실온에서 10분간 메탄올/아세톤 (1:1)으로 투과시키고, PBS로 헹군 다음, 50 mmol/Tris/HCl (pH7.5), 5 mmol/l CaCl₂ 내의 50 ㎍/ml 프로테아제 K (Sigma)와 함께 37℃에서 15분간 배양하였다.

내생적 퍼록시다아제를 실온에서 5분간 2% H₂O₂와 배양하여 불활성화시켰다. DNA 조각을 ApopTag 키트를 사용하여 분석하였다. 양성 대조군 (by pretreating the sections with 1U/ml DNase for 15 minutes at 37℃) 및 음성 대조군 (no digoxigenin-dUTP or TdT)을 이용하였다.

도 3 B 및 도 4에서 나타난 바와 같이, 허혈/관류 (ischemia/reperfusion) 후 경계지역에서의 TUNEL분석 결과 피마사르탄 그룹에서 세포자살 심장근 세포가 더 적게 보임을 확인하였다.

실시예 7: H9c2 심장근아세포 ( cardiomyoblast )상에서 저산소화 ( hypoxia )/재산소화 ( reoxygenation )후 세포자살량의 측량

H9c2 세포를 75% confluence에서 6개의 웰의 조직배양플레이트에 3×10⁵/well로 깔고, 글루코오스와 FBS 없이 DMEM에서 저산소화 (hypoxia)/재산소화 (reoxygenation)하기 전에 24시간 동안 피마사르탄 (50 μmol/L) 또는 vehicle으로 선처리하였다. 18시간 산소결핍 처리 (95% N₂, 5% CO₂)에 이어, 재산소화 (reoxygenation, 95% O₂, 5% CO₂)가 48시간 동안 수행되었다. 밀착된 세포들을 4% 파라포름알데하이드로 고정한 다음, 세포자살 세포죽음을 In Situ Cell Death Detection 키트 (Roche, Mannheim, Germany)로 확인하였다.

고정된 세포들을 얼음에서 2분간 투과 (permeabilization) 용액으로 처리하였다. PBS로 두번 세포들을 헹군 다음, 상기 세포에 TUNEL 반응 혼합액을 첨가하고 암실에서 37℃, 60분간 습도가 있는 상태에서 세포들을 배양하였다. PBS로 세포들을 헹군다음, 세포자살 세포들을 현광 현미경하에서 직접적으로 분석하였다.

도 3C 및 도5에서 나타난 바와 같이, H9c2 세포상의 저산소화/재산소화에서 피마사르탄의 항세포자살효과를 확인할 수 있었다.

실시예 8: 분리된 쥐 심장의 관류

Male Wistar 쥐 (250 내지 350 g)를 펜토바르비탈 나트륨 (Pentobarbital sodium, 100 mg/kg, i.p.)로 마취시켰다. 심장을 빠르게 제거하고 Langendorff 기기에 올렸다. 심장을 118.5 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 MgSO₄, 1.8 CaCl₂, 24.8 NaHCO₃, 1.2 KH₂PO₄, 및 10 글루코오스 (in mmol/L)를 함유하는 Krebs-Henseleit 버퍼로 관류시켰는데, 이를 37℃에서 95% O₂/5% CO₂ 가스를 주입하면서 수행하였다.

모든 심장은 적어도 20분간 안정화시켰다. 파마산탄 (50 μmol/L)을 30분간 전처리하고 전뇌허혈 (global ischemia)(30분) 및 재관류 (30분)을 도입하였다. 기준치에서 심장조직샘플을 취하고, 허혈 및 재관류를 phospho-AKt (ser473), phospho-glycogen synthetase kinase-3β(ser9), p53 및 Bcl-2에 대해 면역블롯팅하였다.

도 6에서 나타난 바와 같이, 피마사르탄 처리된 쥐의 심장은 상대적으로 Bcl-2 (anti-apoptotic)를 증가시켰고 Bax (pro-apoptotic)단백질을 감소시켰으며, 그 결과 경색증 지역에서 Bcl-2/Bax의 비율은 눈에 띄게 증가된 결과를 나타내었다.

도 7에서 나타난 바와 같이, Langndorff 모델 (도 7A)에서, 피마사르탄으로 처리된 분리된 심장은 Akt 인산화(at Ser473) 및 생존을 위한 키나아제로 알려진, 글리코겐 합성효소 키나아제 3β (glycogen synthetase kinase 3β, GSK-3β) 인산화 (at Ser9)를 증가시켰다 (도 7B). 피마사르탄 전처리는 현저하게 쥐심장 조직에서 재관류 (reperfusion)시 Akt 및 GSK-3β를 증가시켰다. 전뇌허혈 (global ischemia) 후 재관류된 심장은 피마사르탄 그룹보다 p53 수준을 증가시키고 Bcl-2수준을 감소시켰다 (도 7C).

실시예 9: 미토콘드리아의 분리, 산소 소비 및 ATP 함량

저산소화 (hypoxia)/재산소화 (reoxygenation) 실험 모델에서, 안정화 후 심장은 연속적으로 30분간 피마사르탄 (50 μmol/L)의 존재 또는 부존재하에서 NT 용액으로 관류하였다. 이후, 관류 버퍼를 30분간 허혈성 용액 (pH 6.0, adjusted using NaOH and equilibrated with 100% N₂ at 135-140 mmHg)으로 바꾸고, Tyrode 용액으로 1시간 동안 관류하였다.

ATP 함량 및 산소 소모량을 측정하기 위해 심장 조직 및 미토콘드리아를 각각 사용하였다. 쥐의 심장에서 ATP 생산을 adenosine 5'-triphosphate bioluminescent 분석키트 (Sigma)를 사용하여 측정하였다.

상기 조직을 2.5% 트리클로로아세트산 (Trichloroacetic acid, v/v)에서 균질화하고, 10,000g에서 5분간 원심분리한 다음, 상층액을 ATP생산을 측정하기 위해 사용하였다. ATP측정은 Lmax luninometer (Molecular Devices)을 사용하여 96-well 플레이트에서 수행되었다.

미토콘드리아는 medium-fitting glass-Teflon Potter-Elvehjem 균질기를 사용하여 분리하였다. 심장조직은 0.1% 소혈청알부민 (Bovine serum albumin), 프로테아제 저해제 칵테일 (protease inhibitor cocktail) (pH 7.4)가 첨가된 5 MOPS, 50 수크로스 (sucrose), 200 만니톨 (mannitol), 5 인산칼륨 (potassium phosphate), 1 EGTA (in mmol/L)를 함유한 미토콘드리아 분리 버퍼에서 균질화되었다.

균질물은 4℃에서 5분간 1000×g에서 원심분리하여 얻어진 상층액을 10분간 10,000×g에서 원심분리하고, 미토콘드리아 필렛을 수거한 다음 3배의 미토콘드리아 분리 버퍼로 희석하였다. 미토콘드리아 산소 소비를 실온의 600-㎕ air-saturated chamber에서 섬유광학산소전극 (fiber optic oxygen electrode, OceanOptics, Inc., Dunedin, FL)를 사용하여 측정하였다.

호흡배지 (respiration medium)는 pH 7.4에서 145 mmol/L KCl, 30 mmol/L HEPES, 5 mmol/L KH₂PO₄, 3 mmol/L MgCl₂, 0.1 mmol/L EGTA, 및 0.1% 소혈청 알부민 (Bovine serum albumin)으로 구성된다. 미토콘드리아 상태 4 (resting) 호흡 (respiration)은 기질로서 5 mmol/L 글루타메이트 (glutamate)/말레이트 (malate)를 사용하여 분석된다. 상태 3 (active) 호흡 (respiration)은 배지에 0.5 mmol/L 아데노신 이인산 (ADP)을 첨가하여 측정되었다. 산소 소비는 nmol O₂/min/mg 미토콘드리아 단백질로서 표현된다. 호흡 조절 인덱스 (respiratory control index, RCI)는 resting (상태 4) 호흡에 대한 ADP-자극된 (상태 3) 호흡의 비율이다.

도 9에서 나타난 바와 같이, I/R (ischemia/reperfusion)의 분리된 쥐심장 모델에서, 상태 3 (active state)호흡만이 대조군에서 크게 손상되었으나 (도 9A 및 9B), 상기 호흡기 손상은 피마사르탄 전처리에 의해 크게 억제되었다 (대조군 vs 피마사르탄; 22.3±2.3 vs 30.9±2.0). 게다가, 피마사르탄 처리된 미토콘드리아에서 호흡 조절인텍스 (respiration control index)가 크게 향상되었고, 대조군보다 ATP함량을 더 잘 보존하였다 (도 9C).

실시예 10: 워스턴 블롯팅 ( Western blotting )

25 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6), 150 mmol/L NaCl, 1% NP-40, 1% 쇼듐데옥시콜레이트 (sodium deoxycholate), 0.1% SDS, 및 프로테아제 저해제 칵테일 (protease inhibitor cocktail) 및 포스파타아제 저해제 칵테일 (phosphatase inhibitor cocktail)을 함유한 RIPA 버퍼에서 심근 조직으로부터 얻은 단백질 추출물을 균질화되었다.

상기 균질환된 샘플을 초음파처리한 다음, 4℃에서 30분간 13,500 g에서 원심분리하였다. BCA 분석키트 (Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 동량의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 젤에 로딩하여 전기영동하고 PVDF막에 옮겼다.

막들을 일차항체로 탐지하였다. 각 일차항체 결합은 이차항체로 탐지하고 ECL 방법에 의해 가시화하였다. 각 샘플의 로딩은 항튜불린 또는 항베타액틴과의 막을 탐침함으로 확인하였다.

실시예 11: 하나의 심장 근세포의 분리

심장 근세포의 분리가 수행되었다. 쥐들을 마취시킨 다음 흉강 (chest cavity)을 노출시키고 대동맥 (aorta)에 유리카눌라 (glass cannula)를 삽입하였다. 심장을 빠르게 개흉술 (thoracotomy)을 통해 절단하고 Tyrode 용액을 사용하여 비순환 Langendorff 시스템에서 관류한 다음, 10분간 37℃에서 95% O₂와 5% CO₂로 균형을 유지시키고 모든 혈액을 제거하였다.

안정화 단계 (20 minutes perfusion in normal Tyrode' solution)가 지난 후, 심장을 8분간 Ca² ⁺-free Tyrode 용액으로 관류시키고, 10분간 0.01% 콜라게나아제 (collagenase)를 첨가한 Ca² ⁺-free Tyrode 용액으로 관류시켰다. 다음, 심장을 15분간 산소화시킨 Kraft-Bruhe 용액 (pH 7.4)으로 세척하였다. 심방 (Atria)을 제거하고, 좌심실벽과 격막 (septum)을 작게 자른 다음 Kraft-Bruhe 용액에서 교반하여 심장근세포를 분리하였다.

실시예 12: L-타입 Ca ² ⁺ 전류의 전세포패치클램프 ( Whole - cell patch clamp recording )

L-타입 Ca² ⁺전류를 기록하기 위해, 내부용액 및 외부용액에 Cs⁺ 를 첨가하여 K⁺ 전류를 억제하였다. 테트로도톡신 (20 μmol/L) 및 -50 mV의 holding 포텐셜을 적용하여 Na+ 및 T-type Ca² ⁺ 전류를 억제하였다. 근세포를 도립현미경 (inverted microscope)에 넣고 143 NaCl, 5.4　KCl, 0.33 NaH₂PO₄, 1.8 CaCl₂, 0.5 MgCl₂, 5.0 HEPES, 및 16.6　글루코오스 (adjusted to pH 7.4 with NaOH) (as mmol/L)을 포함한 세포외 용액으로 지속적으로 관류하였다.

32 CsCl, 100 Cs-Asp, 10 EGTA, 10 HEPES, 5 MgATP (adjusted to pH 7.25 with CsOH)(as mmol/L)으로 구성된 스탠다드 내부용액으로 채워서 bath solution에 넣었을 때, bath solution 저항성은 2 내지 3MΩ이었다. Whole-cell patch clamp recording은 Axon interface 및 Axonpatch 1C amplifier (Axon Instruments, Union City, CA)은 제조되었다.

실시예 13: 심장 및 근세포 관류

근세포를 실온에서 30분간 0.1 μmol/L TMRE(excitation/emission: 564/580 nm)로 염색하였다. 세척후, 세포들을 관류챔버 (perfusion chamber)에 두었다. MitoSOX Red (5 μmol/L; excitation/emission: 510/580 nm)를 미토콘드리아에서 미토콘드리아 초과산화물 변화를 검출하기 위해 사용하였다.

세포들을 염색 (30 분, 37℃)한 다음, Kraft-Bruhe 용액으로 세척하였다. 현광강도는 공초점 현미경을 사용하여 측정하였다. 미토콘드리아 칼슘을 측정하기 위해 Rhod-2AM (5 μmol/L; excitation/emission: 533/576 nm)을 사용하였다. 염색 (cool-warm) 후에, 세포들을 Kraft-Bruhe용액으로 세척하였다. 근세포를 50 μmol/L 피마사르탄이 첨가된 Tyrode 용액으로 15분간 및 허혈 용액 (pH 6.0, adjusted using NaOH and equilibrated with 100% N₂ at 135-140 mm Hg)으로 20분간 연속적으로 관류하고, Tyrode 용액에서 30분간 재관류 하였다. ×200배율의 레이저 스캔 공초점 현미경을 사용하여 매 30초마다 현광을 측정하였다. 이미지를 LSM-510 META 소프트웨어 (Carl Zeiss, Jena, Germany)를 사용하여 분석하였다. 미토콘드리아 칼슘 유니포터의 활성을 통해 미토콘드리아 Ca² ⁺을 운반하기 위해 히스타민 (Histamine, 100 μmol/L)을 사용하였다.

도 10A 내지 10C에서 나타난 바와 같이, 심장근세포에서 재산소화로 유도된 미토콘드리아 O₂ ^- 생산 및 Ca² ⁺ overload가 크게 약화되었고, 대조군과 비교시 파마산틴에서 △Ψm (indirect index of permeability transition)이 더욱 잘 보존되었다.

도 8A 및 8B에서 나타난 바와 같이, 심장근세포에서 피마사르탄의 처리는 미토콘드리아에서 I_ca _,L 활성을 억제하였고, 도 11에서 나타난 바와 같이, 심장근세포에서 피마사르탄의 처리는 미토콘드리아에서 히스타민 (MCU activator) 유도된 칼슘의 증가를 억제하였다.

Claims

피마사르탄 (Fimasartan)을 포함하며 허혈손상 또는 재관류손상을 예방하는 세포, 조직 또는 장기 보존용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 피마사르탄은 미토콘드리아 칼슘통로를 차단하는, 세포, 조직 또는 장기 보존용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 피마사르탄은 세포, 조직 또는 장기에서의 세포자살을 억제하는, 세포, 조직 또는 장기 보존용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 세포, 조직 또는 장기의 생체외 보관, 개복술 중 세포, 조직 또는 장기의 보존, 이식수술 또는 이식 후 세포, 조직 또는 장기의 보존을 위한, 세포, 조직 또는 장기 보존용 조성물.
피마사르탄 (Fimasartan)을 포함하는 허혈 또는 재관류 손상에 의한 심근경색, 심부전, 심실세동 또는 부정맥 예방 또는 치료용 조성물.
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