KR101338521B1

KR101338521B1 - 만성 가려움증 또는 아토피성 피부염 유발 쥐 및 이를 이용한 치료용 화합물의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101338521B1
Application number: KR1020110114435A
Authority: KR
Inventors: 나흥식; 백승근; 정근영; 이재희
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2011-11-04
Filing date: 2011-11-04
Publication date: 2013-12-10
Also published as: KR20130049424A

Abstract

본 발명은 만성 가려움증 또는 아토피성 피부염 유발 쥐 및 이를 이용한 치료용 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 출생 직후에 TRPV1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1) 효현제를 과량 주사한 쥐는 사람의 만성 가려움증 및 아토피성 피부염과 유사한 증상을 나타내므로 관련기전의 연구와 치료용 화합물의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

만성 가려움증 또는 아토피성 피부염 유발 쥐 및 이를 이용한 치료용 화합물의 스크리닝 방법{Rats having chronic itch or atopic dermatitis and screening method for itch and dermatitis}

본 발명은 만성 가려움증 또는 아토피성 피부염 유발 쥐 및 이를 이용한 치료용 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

아토피성 피부염(atopic dermatitis)은 피부소양증(skin pruritus)을 동반하여 만성적으로 호전과 악화를 반복하는 비전염성(non-contagious), 염증성(inflammatory) 피부질환이다[비특허문헌 1]. 습진(eczema)의 한 유형으로서 천식(asthma), 알레르기성 비염(allergic rhinitis)과 함께 대표적인 알레르기성 질환으로, 최근 산업화 사회(industrial society)를 중심으로 그 발병률이 꾸준히 증가하고 있다. 환자의 70~80%에서 개인력 또는 가족력이 있는 것으로 미루어 아토피성 피부염의 발병에 유전적 소인이 깊이 관련되어 있는 것으로 짐작된다[비특허문헌 2]. 아토피성 피부염은 질병 자체의 심각성뿐만 아니라 외상에서 오는 사회적, 정신적 스트레스로 인하여 온전한 사회생활의 영유에 치명적인 지장을 초래한다. 또한, 만성 불안 및 우울증과 같은 정신질환을 동반하기 때문에 심각한 임상적 문제로 인식되고 있다.

아토피성 피부염은 전세계적으로 만연한 질병으로 현저한 증가추이를 보이고 있다[비특허문헌 3] 아토피성 피부염은 소아습진(infantile eczema)이라고도 알려질 정도로 영유아와 아동에서 그 발병률이 매우 높다. 아토피성 피부염은 전 연령대에서 발병하지만 대부분의 경우 나이가 들면서 대체로 발병률은 줄어들지만, 성인에 이르기까지 호전과 악화의 반복적인 만성적 경과를 보이기도 한다. 전체 소아인구의 약 20%가 성인기 이전에 아토피성 피부염을 경험하며 이중 약 60% 소아환자는 성장 후에도 아토피성 피부염으로 고통을 받고 있다는 유행병학적(epidemiological) 보고가 있다[비특허문헌 4].

아토피성 피부염의 원인은 아직 정확히 알려져 있지 않다. 그러나, 환자의 유전적 소인과 함께 면역학적 이상, 피부보호막의 이상, 병원성 박테리아의 감염 및 환경적 요인 등 여러 원인이 복합적으로 작용하는 유발되는 다원성 피부질환(multifactorial skin disease)인 것으로 밝혀지고 있다[비특허문헌 5]. 최근 연구결과들에 의하면 영유아기 아토피성 피부염을 경험한 환자 중 일부는 천식이나 알레르기성 비염 등의 다른 알레르기성 질환으로 이행하는 아토피행진(atopic march)의 경과를 보이기도 한다.

아토피성 피부염의 증상은 환자마다 매우 다양하게 나타나지만, 피부건조(dryness), 피부발진(rash)과 가려움증(itch)은 아토피성 피부염의 대표적 증상으로 알려져 있다. 가려움증은 긁거나 문지르는 등의 물리적 자극을 환부에 가함으로써 피부염증을 악화시킬 수 있기 때문에 아토피성 피부염 관리 또는 치료에서 매우 중요한 요소로 인식되고 있다. 가려움증은 피부를 긁어 통증을 유발함으로써 억제될 수 있다. 그러나, 아토피성 피부염 환자는 가려움증에 민감하여 이를 억제하기 위해 정상인에 비해 장시간의 긁는 자극을 필요로 한다. 따라서, 극심한 가려움증은 환자로 하여금 환부를 매우 심하게 긁게 하며 이러한 자극은 오히려 가려움증을 더욱 증가시켜 질병을 악화시킬 수 있다[비특허문헌 6]. 습진성 피부염(eczematous dermatitis)과 함께 표피(epidermis)의 비후(hyperplasia) 또는 각질세포의 비후(hyperkeratosis)는 아토피성 피부염의 대표적인 조직학적 특성이다. 피부의 염증 또는 면역학적 이상이 아토피성 피부염의 병인으로 알려져 있다. 전체 환자의 약 80%에서 혈중 면역글로블린E(IgE)가 증가되는 것으로 알려져 있으며[비특허문헌 7], 이와 관련된 비만세포(mast cell) 활성화를 통한 염증, 면역작용이 아토피성 피부염을 유발 또는 악화시킨다고 보고되어 있다[비특허문헌 8]. IgE는 인터루킨(interleukin, IL)-4 또는 IL-13과 같은 Th2 계열의 싸이토카인(cytokine)에 의해 합성이 촉진되는 것으로 알려진 바[비특허문헌 9], 아토피성 피부염 환자의 피부조직 내에서 증가된 IL-4 또는 IL-13이 비만세포(mast cell) 활성화와 함께 관찰된다. 아토피성 피부염 환자에서 일반적으로 나타나는 피부건조는 표피투과장벽기능(epidermal permeability barrier function) 이상과 밀접하게 관련되어 있다. 표피투과장벽기능은 표피투과수분 손실량(transepidermal water loss)의 측정을 통해 간접적으로 평가될 수 있는데[비특허문헌 10], 정상인의 피부에 비해 아토피성 피부염 환자에서의 수분손실량이 현저히 증가되어 있는 것으로 알려져 있다[비특허문헌 11]. 표피투과장벽기능의 이상은 병원성 미생물 또는 알레르기 유발물질에 대한 피부노출 가능성을 증가시킨다. 실제로 아토피성 피부염 환자의 경우 박테리아 감염에 취약한 것으로 알려져 있다. 아토피성 피부염 환자의 90%에서 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus , S. aureus)이 관찰되며, 피부염의 정도가 피부 내 S. aureus 밀도와 비례하는 것으로 알려져 있다[비특허문헌 12-13]. 황색 포도상구균에 대한 항생제 투여가 피부염을 호전시킨다는 보고가 있다.

아토피성 피부염은 적절한 피부관리 또는 생활습관의 변화를 통해서도 충분히 호전될 수 있으나, 질환이 심각한 환자의 경우, 현재 통용되는 치료법에 적절히 치료되지 않는 난치성(intractability)을 보인다. 일반적으로 스테로이드제 또는 타크로리무스(Tacrolimus)와 피메크로리무스(Pimecrolimus) 연고(ointment)와 같은 면역조절자(immune modulator)를 치료에 사용하고 있으나, 그 효과에 대한 의구심과 심각한 약물부작용은 안전성을 담보한 효과적인 치료제 개발을 요구하고 있다.

현대의학은 동물실험을 바탕으로 하여 발전하여 왔다. 인간을 대상으로 하는 연구는 윤리적 문제, 안전성 및 조건통제의 어려움 등으로 심층적 연구가 제한적이기 때문에 실험동물을 이용한 전임상 연구는 인간의 질병을 이해하는데 중요한 정보를 제공하여 왔다. 다른 질병의 예와 같이 아토피성 피부염에 대한 연구도 실험동물모델의 개발과 함께 본격화 되었다. 1997년 자발적인 아토피성 습진(atopic eczema) 증상을 보이는 NC/Nga 마우스가 아토피성 피부염 모델로 처음 보고된 이래 다양한 모델이 개발되었으며[비특허문헌 14], 이러한 실험동물 모델을 통한 연구는 아토피성 피부염 유발 원인에 대한 많은 정보를 제공하고 있다. 그러나, 아토피성 피부염의 원인 및 증상의 다양성을 고려할 때, 더욱 다양한 실험 동물 모델의 개발은 질병의 원인 규명 및 치료제 개발에 기여할 것이다.

캡사이신(capsaicin)은 고추 속 식물의 유효성분 중 하나로 'TRPV1' 채널 활성을 통해 매운 맛을 감지하게 한다. 1878년 헝가리인 Hogyes의 최초 보고 이래 캡사이신의 다양한 약리적 및 생리학적 효과들이 보고 되어 있다. 캡사이신의 수용체로 알려진 TRPV1 채널은 주로 통증을 전달하는 말초신경(nociceptive primary afferent)에 발현되며, 통각에 중요한 역할을 한다. 최근 캡사이신은 'Qutenza'라는 이름으로 대상포진 감염 후 통증(postherpetic neuralgesia)에 대한 진통제로 시장에 출시되기도 하였다.

다량의 캡사이신을 출생 직후의 실험동물에 주사하면 TRPV1 채널을 발현하는 통각신경의 손실이 초래되며, 그 결과 영구적으로 통증자극에 대한 둔감화가 발생한다[비특허문헌 15]. 따라서, 상기 캡사이신 투여방법은 오랫동안 통각신경의 기능연구에 유용하게 사용되어 왔다. 상기 방법에 의해 소실되는 말초신경의 대부분은 CGRP(calcitonin gene related peptide)와 SP(substance P)와 같은 펩타이드(peptide)를 신경전달물질로 사용하는 신경으로 피부에 광범위하게 분포한다. CGPR는 각질세포 내 cAMP의 생성을 촉진함으로써 각질세포의 증식에 기여하는 것으로 알려져 있다[비특허문헌 16]. 따라서, 캡사이신에 의한 펩타이드성(peptidergic) 신경의 소실은 피부조직 구성에 문제를 야기할 수 있다. 각질세포는 표피투과장벽(skin permeability barrier) 구성에 중요한 역할을 수행하기 때문에 캡사이신에 의한 신경손상과 그로 인해 예상되는 표피투과장벽기능 상의 문제는 아토피성 피부염과 같이 병원성 박테리아 또는 알레르기 유발물질에 대한 피부 민감도를 증가시킬 개연성이 크다. 상기 서술에서와 같이 출생 직후 다량의 캡사이신이 투여된 동물에서는 자발적인 긁기(scratching)와 피부손상이 나타난다는 보고가 있다[비특허문헌 17-19]. 소수의 이전 보고는 이러한 현상의 원인을 신경학적 이상(neurological disorder)에 기초하여 설명하고 있지만, 정확한 유발기전은 규명된 바 없다.

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이에, 본 발명자들은 캡사이신 또는 그의 유사체를 출생 직후의 흰쥐 새끼에 주사한 후 자발적인 긁기(scratching)와 피부손상 정도의 시간추이 특성은 물론, 시간경과에 따른 피부 조직의 병태생리학적(pathophysiological) 변화가 아토피성 피부염 환자에서 관찰되는 특성과 일치함을 최초로 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 만성 가려움증 또는 아토피성 피부염 유발 쥐, 이의 제작방법 및 이를 이용한 가려움증 또는 아토피성 피부염 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은

출생 직후의 쥐(rat) 새끼에 TRPV1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1) 채널의 효현제(agonist)를 과량 주사하여 TRPV1 발현 말초신경이 제거된 만성 가려움증 또는 아토피성 피부염 유발 쥐(rat)를 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은

출생 직후의 쥐(rat) 새끼에 TRPV1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1) 채널의 효현제(agonist)를 과량 주사하여 말초신경을 제거하는 단계;

TRPV1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1) 효현제 주사 시 유발되는 무호흡(apnea)을 치료하는 단계; 및

쥐를 성장시키는 단계

를 포함하는 만성 가려움증 및 아토피성 피부염 유발 쥐(rat)의 제작방법을 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은

정상 쥐와 상기 만성 가려움증 유발 쥐의 가려움증 정도를 측정하는 단계;

상기 만성 가려움증 유발 쥐에 시험제제를 투여하고 가려움증 정도를 측정하는 단계; 및

상기 시험제제를 투여하기 전과 투여한 후의 가려움증 정도를 비교하여 만성 가려움증 유발 쥐에서 가려움증을 감소시키는 제제를 선별하는 단계

를 포함하는 가려움증 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

정상 쥐와 상기 아토피성 피부염 유발 쥐의 피부염 정도를 측정하는 단계;

상기 아토피성 피부염 유발 쥐에 시험제제를 투여하고 피부염 정도를 측정하는 단계; 및

상기 시험제제를 투여하기 전과 투여한 후의 피부염 정도를 비교하여 아토피성 피부염 유발 쥐에서 피부염 증상을 감소시키는 제제를 선별하는 단계

를 포함하는 아토피성 피부염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서 출생 직후 다량의 TRPV1 효현제를 투여한 쥐가 가려움증을 동반하는 만성 아토피성 피부염 증상을 나타내므로 관련 기전(mechanism)을 규명하고 이들 질환을 억제하는 화합물의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 출생 직후의 흰쥐 새끼에 캡사이신을 투여하고 6주 후 TRPV1 신경세포의 감소와 캡사이신에 의한 매운 맛 감지능력 및 통증 민감도를 측정한 결과이다[*: P<0.05에서 통계적으로 유의적인 차이가 있음; a: TRPV1 항체를 이용한 제1 천수후근신경절(S1 dorsal root ganglion)의 면역형광염색 결과. Cap-treated: 출생 후 캡사이신을 투여한 동물군; Vehicle-treated: 출생 후 캡사이신이 생략된 대조약물을 투여한 동물군. 비례막대(scale bar)=100 ㎛; b: 상기 a에 대한 통계분석 결과 그래프. n, 사용된 동물 수; c: 제5 요수후근신경절(L5 dorsal root gnalia)에서 시행된 TRPV1 mRNA의 실시간역전사(Real-time Reverse Transcription) PCR 결과 그래프; d: 캡사이신이 포함된 음료(Capsaicin)와 대조음료(Vehicel)의 1일 섭취량을 나타낸 그래프; e: 상기 d에 대한 상대적 섭취비율을 나타낸 그래프; f: 뒷발바닥에 열 자극(IR₅₀)을 가한 경우의 회피잠복기를 나타낸 그래프; g: 꼬리에 열 자극(48℃)을 가한 경우의 회피잠복기를 나타낸 그래프].
도 2는 PGP9.5 항체를 이용한 피부의 면역조직화학적 결과이다[화살표: PGP9.5 면역반응 신경섬유; Cap-treated: 출생 후 캡사이신을 투여한 동물군; Vehicle-treated: 출생 후 캡사이신이 생략된 대조약물을 투여한 동물군; #W: 주령. 비례막대(scale bar)=100 ㎛].
도 3은 출생 직후 흰쥐 새끼에 캡사이신을 투여한 후 나타나는 만성 가려움증 및 피부염의 시간경과에 대한 결과이다[**:P<0.001; *:P<0.05에서 통계적으로 유의적인 차이가 있음; a: 캡사이신 투여 후 시간경과에 따라 긁는 회수를 나타낸 그래프. Cap-treated: 출생 후 캡사이신을 투여한 동물군; Vehicle-treated: 출생 후 캡사이신이 생략된 대조약물을 투여한 동물군; Postnatal weeks: 주령; b: 캡사이신 투여 후 시간경과에 따른 피부염의 정도를 나타낸 그래프. N: 사용된 동물 수; c: 캡사이신 투여 6주 후 얼굴, 귀, 목, 등에서 관찰되는 피부질환을 나타낸 사진; d: 캡사이신 투여 20주 후 재발한 피부질환을 나타낸 사진].
도 4는 캡사이신 투여 후 3주와 6주에 나타나는 피부의 병리조직학적 특성에 대한 결과이다[**:P<0.001에서 통계적으로 유의적인 차이가 있음; a: 캡사이신 투여 3 주 후 아직 피부손상이 유발되지 않은 동물의 피부 조직학 및 비만세포의 개수에 대한 결과. Cap-treated: 출생 후 캡사이신을 투여한 동물군; Vehicle-treated: 출생 후 캡사이신이 생략된 대조약물을 투여한 동물군; n: 사용된 동물 수; section; 비만세포수 측정에 사용된 피부절편 수; HE, 헤마톡실린과 에오신(hematoxylin and eosin) 염색; TB, 톨루이딘 블루(toluidine blue) 염색. 비례막대(scale bar)=100 ㎛; b: 캡사이신 투여 6 주 후 피부손상이 유발된 동물의 피부 조직학 및 비만세포의 개수에 대한 결과. 비례막대(scale bar)=100 ㎛].
도 5는 캡사이신 투여 후 시간경과에 따른 혈청학적 및 피부 면역학적 변화에 대한 결과이다[**:P<0.001; *:P<0.05에서 통계적으로 유의적인 차이가 있음; a: 캡사이신 투여 후 시간경과에 따른 혈청 IgE 양의 변화를 나타낸 그래프. Cap-treated: 출생 후 캡사이신을 투여한 동물군; Vehicle-treated: 출생 후 캡사이신이 생략된 대조약물을 투여한 동물군; n, 사용된 동물수; Non-lesional: 피부손상이 관찰되지 않은 시기; Lesional: 피부손상이 관찰된 시기; Postnatal weeks: 주령; b: 캡사이신 투여 후 시간경과에 따른 피부 NGF 양의 변화를 나타낸 그래프;
c: 캡사이신 투여 후 시간경과에 따른 피부 IL-4 mRNA 발현량의 변화를 나타낸 그래프. Cap-IL4: 캡사이신 투여 쥐의 피부조직에서 발현된 IL-4 mRNA; Vehicle-IL4: 출생 후 캡사이신이 생략된 대조약물을 투여한 쥐의 피부조직에서 발현된 IL-4 Mrna; d: 캡사이신 투여 후 시간경과에 따른 피부 IL-13 mRNA 발현량의 변화를 나타낸 그래프. Cap-IL13: 캡사이신 투여 쥐의 피부조직에서 발현된 IL-13 mRNA; Vehicle-IL13: 출생 후 캡사이신이 생략된 대조약물을 투여한 쥐의 피부조직에서 발현된 IL-13 mRNA].
도 6은 캡사이신 투여 후 시간경과에 따른 표피투과 수분 손실량(transepidermal water loss, TEWL)의 변화에 대한 결과이다[**:P<0.001; *:P<0.05에서 통계적으로 유의적인 차이가 있음; Cap-treated: 출생 후 캡사이신을 투여한 동물군; Vehicle-treated: 출생 후 캡사이신이 생략된 대조약물을 투여한 동물군; n: 사용된 동물 수; Non-lesional: 피부손상이 관찰되지 않은 시기; Lesional: 피부손상이 관찰된 시기; Postnatal weeks: 주령].
도 7은 출생 직후 흰쥐 새끼에 레시니페라톡신(resiniferatoxin, RTX)을 투여한 후 나타나는 만성 피부염의 시간경과에 대한 결과이다[**:P<0.001; *:P<0.05에서 통계적으로 유의적인 차이가 있음; RTX-treated: 출생 후 레시니페라톡신을 투여한 동물군; Vehicle-treated: 출생 후 레시니페라톡신이 생략된 대조약물을 투여한 동물군; Postnatal weeks: 주령; n: 사용된 동물 수].

본 발명은 출생 직후의 쥐(rat) 새끼에 TRPV1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1) 채널의 효현제(agonist)를 과량 주사하여 TRPV1 발현 말초신경이 제거된 만성 가려움증 또는 아토피성 피부염 유발 쥐(rat)에 관한 것이다.

본 발명에 따른 만성 가려움증 또는 아토피성 피부염 유발 쥐(rat)는 정상 쥐에 비하여 통계적으로 유의하게 많이 긁어(scratching) 가려움증을 유발되고, 탈모증(alopecia), 건조증(dryness), 표피침식(superficial erosion), 찰과상(excoriation), 출혈(hemorrhage) 또는 상처(scar)와 같은 피부질환이 관찰된다.

본 발명에서 "출생 직후"라 함은 출생 후부터 48시간 내를 의미한다.

본 발명에서 TRPV1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1) 채널의 효현제(agonist)는 캡사이신(capsaicin) 또는 이의 유사체(analogue)로서, 상기 유사체로는 레시니페라톡신, 논이브아마이드(nonivamide) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 "과량 주사"라 함은 TRPV1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1) 효현제를 쥐 체중 1 g당 5 내지 100 ㎍ (바람직하게는 7 내지 60 ㎍) 피하에 주사(subcutaneous injection)하는 것을 의미한다.

본 발명은 또한,

출생 직후의 쥐(rat) 새끼에 TRPV1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1) 효현제를 과량 주사하여 말초신경을 제거하는 단계;

TRPV1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1) 채널의 효현제(agonist) 주사 시 유발되는 무호흡(apnea)을 치료하는 단계; 및

쥐를 성장시키는 단계

를 포함하는 만성 가려움증 및 아토피성 피부염 유발 쥐(rat)의 제작방법에 관한 것이다.

본 발명은 TRPV1 채널의 효현제(agonist)를 출생 직후의 실험동물에 주사하여 TRPV1 채널을 발현하는 말초신경을 제거하여 만성 가려움증과 피부염을 유발하는 동물을 제공한다.

먼저, 출생 직후의 쥐(rat) 새끼에 TRPV1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1) 채널의 효현제를 과량 주사하여 말초신경을 제거하는 단계로, 출생 후 48시간 이전의 쥐(rat) 새끼의 등쪽 피하에 Tween 80과 에탄올(ethanol)이 포함된 생리식염수에 정제된 TRPV1 채널의 효현제를 을 녹여 체중 1 g 당 5 내지 100 ㎍/10 ㎕를 주사한다.

상기 주사로 인해 TRPV1 발현 말초신경이 제거되며, 이를 척수후근신경절(dorsal root ganglia) 또는 피부에서 하기와 같은 3가지 방법으로 검사한다:

1) PGP9.5에 대한 항체를 이용한 피부의 일반적인 면역조직화학법(immunohistochemistry)

2) TRPV1에 대한 항체를 이용한 후근신경절의 일반적인 면역형광염색법(immunofluorescent staining)

3) 실시간 역전사 PCR(Real-time reverse transcription polymerase chain reaction) 기법을 이용한 TRPV1 mRNA 정량법.

다음 단계는 상기 주사 후 유발되는 무호흡증(apnea)을 치료하는 단계로, 자발적인 호흡이 재개될 때까지 수회에 걸쳐 흉부를 압박하는 방식으로 극복한다.

마지막으로, 무호흡증이 치료된 쥐 새끼를 성장시키는 단계로, 무호흡 치료 후 어미에 돌려주고 3주령에 암수를 구분하여 실험종료일까지 성장시킨다.

출생 직후 TRPV1 채널 효현제가 투여된 동물의 행동학적 표현형(behavioral phenotype)은 당업계에 공지된 방법에 따라 측정할 수 있다. 예를 들어, 캡사이신 용액과 대조용액에 대한 섭취선호도(intake preference) 조사는 1.65 μM 캡사이신 용액(0.05% 에탄올이 포함된 증류수를 용매 함)과 대조용액(0.05% 에탄올이 포함된 증류수)을 각각의 병에 담아 우리에 설치하고 각 용액의 일일섭취량을 분석하여 실시될 수 있다(Simons et al, Chem Senses 26:491-497, 2001). 또한, 통증 민감도는 동물의 꼬리를 고온의 물에 넣어 회피 잠복기(withdrawal latency)를 측정하는 방법, 동물의 뒷발바닥에 적외선 열자극 장치(390 plantar test, IITC Inc, CA, USA)로 열자극을 가해 회피 잠복기를 측정하는 방법(Hargreaves et al, Pain 32:77-88, 1998)으로 평가할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 만성 가려움증 또는 아토피성 피부염 유발 쥐를 사용한 가려움증 또는 아토피성 피부염 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

보다 상세하게 본 발명은

를 포함하는 가려움증 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 가려움증 정도는 당분야에서 사용하는 가려움증 측정방법이라면 모두 가능하나, 본 발명에서는 하기와 같은 방법으로 평가하였다.

만성 가려움증의 시간추이는 매주 한 시간에 걸쳐 긁는 행동을 디지털 비디오 촬영 후 재생하는 과정에 그 횟수를 정량하여 조사한다. 긁는 행동의 판정과 정량은 현재 당업계에 공지된 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 뒷발을 바닥에서 떼어 다시 바닥에 내려 놓을 때까지 피부를 긁는 연속된 행동을 일회 긁기로 판정하여 1 시간 동안 관찰되는 횟수를 가려움증 정도의 척도로 사용한다. 가려움증 치료용 화합물의 효과는 약물 투여 전후의 긁기 횟수를 비교하여 판정할 수 있다.

본 발명은 또한,

상기 피부염 정도는 당분야에서 사용하고 있는 피부염 측정방법이면 모두 가능하나, 본 발명에서는 조직학적 검사, 표피투과장벽(skin permeability barrier) 기능의 평가, 황색포도상구균의 피부감염 검사, 혈중(blood) 또는 피부조직(skin tissue) 내에 함유된 면역글로블린, 싸이토카인 및 관련 단백질의 양 또는 단백질의 mRNA 정량을 측정하여 평가하였다.

아토피성 피부염의 평가방법 중 하나인 조직학적 검사는 구체적으로, 출생 후(TRPV1 효현제 투여 후 시간과 일치) 3주와 6주에 피부의 생체검사법(biopsy)을 통해 헤마톡실린과 에오신(hematoxylin and eosin) 또는 톨루이딘블루(toluidine blue) 염색법으로 조직학적 검사가 가능하다.

또한, 표피투과장벽(skin permeability barrier) 기능의 평가는 당업계에서 통용되는 기기를 사용하여 표피투과수분손실량(transepidermal water loss)을 측정하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 온도와 습도가 조절된 공간에서 측정기(Twwameter TM210, Courage & Khazaka GmbH, Cologne, Germany)를 이용하여 동물의 등에서 표피투과수분손실량을 측정하여 단위면적시간당 수분증발량(g/m²/h)으로 표시한다.

또한, 황색포도상구균의 피부감염여부 및 정량은 당업계에서 일반적으로 사용하는 방법에 따라 조사될 수 있다.

또한, 혈중(blood) 또는 피부조직(skin tissue) 내에 함유된 면역글로블린, 싸이토카인 및 관련 단백질의 양은 당업계에서 일반적으로 사용하는 ELISA 방법 또는 역전사 PCR을 이용한 해당 단백질의 mRNA 정량으로 측정될 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 만성 가려움증 또는 아토피성 피부염 유발 쥐의 제작

출생 후 48시간 이전의 흰쥐(rat) 새끼의 등쪽 피하에 10% Tween 80과 10% 에탄올(ethanol)이 포함된 생리식염수(0.9% saline)에 정제된 캡사이신(50 mg/kg) 또는 이의 유사체인 레시니페라톡신(resiniferatoxin, 10 mg/kg)을 녹여 체중 1 g당 10 ㎕를 주사하였다. 캡사이신 또는 레시니페라톡신의 피하 주사 후 유발되는 무호흡증(apnea)은 자발적인 호흡이 재개될 때까지 수회에 걸쳐 흉부를 압박하는 방식으로 극복하여 어미에 돌려주고 3주령이 되어 암수를 구분할 때까지 동일 우리에서 키웠다.

실시예 2: 출생 직후 캡사이신의 투여에 의한 TRPV1 발현 신경세포의 소실 평가

상기 실시예 1에서와 같이 출생 직후 투여한 캡사이신이 TRPV1 발현신경세포에 미치는 영향을 면역형광염색법과 Real-time RT PCR 방법으로 조사하였다. 출생 후(여기에서는 캡사이신 투여 후와 일치) 6주령의 동물을 희생시켜 제1 천수후근신경절(S1 dorsal root ganglia) 및 등 피부 조직을 획득하여 냉동절편기로 잘라 TRPV1 항체(#ab5566, Chemicon, CA, USA) 및 PGP9.5 항체(#ab9724, Chemicon, CA, USA)를 이용하여 면역형광염색 또는 면역조직화학법을 실시하였다. 후근신경절에서 면역반응을 보이는 세포 수를 측정하여 정상동물과 비교하였으며, 피부조직에서 면역반응 신경섬유의 분포를 관찰하였다. 획득한 제5 요수후근신경절(L5 dorsal root ganglia)은 Real-time RT PCR 방법과 2(-delta Delta C(T)) 정량법(Livak and Schmittgen, Methods 25:402-408, 2001)으로 TRPV1 mRNA 발현량을 측정하는데 사용하였다. TRPV1에 대한 프라이머(primer)는 GeneBank에 등록된 염기서열에 준하여 Bioneer사에 주문, 제작하였다(표 1).

하기 표 1은 실시간 역전사 PCR 및 역전사 PCR에 사용된 프라이머(primer)의 염기서열이다.

[표 1]

캡사이신 투여군과 대조군의 비교는 t-test 검정법을 이용하여 시행하였으며, 모든 실험 결과는 평균±표준오차로 나타내었고 유의적인 차이는 5% 수준에서 검정하였다.

실험결과, 출생 직후 캡사이신을 투여한 동물군의 제1 천수후근신경절에서 TRPV1 항체에 면역반응을 보이는 세포의 수는 대조군의 15.8%에 불과한 것으로 조사되었다(도 1의 a 및 b). 제5 요수후근신경절에서 측정한 TRPV1 mRNA 양도 대조군에 비해 약 40%가 적게 측정되었다(도 1의 c). 후근신경절에서의 TRPV1 면역반응 신경세포 수의 감소와 일치하게 피부에서 PGP9.5에 면역반응을 보이는 신경섬유의 분포가 대조군에 비해 캡사이신을 투여한 동물군에서 현저히 감소되었다(도 2). 상기 실험결과로부터 출생 직후 투여한 캡사이신에 의해 TRPV1 발현 신경세포가 감소되었음을 알 수 있었으며, 이는 피부 신경섬유의 감소의 직접적 원인임을 짐작케 하였다.

실시예 3: 캡사이신의 투여군의 통증 민감도 평가

상기 실시예 1에서와 같이 출생 직후 캡사이신을 투여한 6주령의 동물군에서 캡사이신과 통증자극에 대한 민감도를 측정하였다. 캡사이신에 대한 반응 민감도는 캡사이신 용액과 대조 용액의 섭취선호도(intake preference) 조사를 통해 실시하였다(Simons et al, 2001). 간단히 설명하여, 1.65 μM 캡사이신 용액과 대조용액인 0.05% 에탄올 용액을 각각 용기에 담아 동물우리의 철망을 통해 나란히 제공하고 각 용액의 1일 섭취량을 측정하였다. 통증자극에 대한 민감도는 동물의 꼬리를 48 ℃의 물에 넣어 회피 잠복기(withdrawal latency)를 측정하는 방법과, 동물의 뒷발바닥에 적외선 열자극 장치(390 plantar test, IITC Inc, CA, USA)로 자극강도50(IR50)의 열자극을 가해 회피 잠복기를 측정하는 방법(Hargreaves et al, Pain 32:77-88, 1998)으로 평가하였다. 캡사이신 투여군과 대조군의 비교는 t-test 검정법을 이용하여 시행하였으며, 모든 실험 결과는 평균±표준오차로 나타내었고 유의적인 차이는 5% 수준에서 검정하였다.

실험결과, 대조 동물군의 경우 캡사이신 용액보다는 대조용액을 선호한 반면, 출생 직후 캡사이신을 투여한 동물군에서는 이러한 선호도가 관찰되지 않았다(도 1의 d 및 e). 유해한 열 자극에 대한 뒷다리 및 꼬리 회피반응 시간은 대조군에 비하여 캡사이신 투여군에서 현저히 길었다(도 1의 f 및 g). 상기 결과로부터, 출생 직후 캡사이신이 투여된 동물은 캡사이신 자극 및 통증자극에 둔감함을 알 수 있었다. 또한, 이런 통증둔감화는 상기 실시예 2에서와 같이 이들 자극을 전달하는 TRPV1 발현 구심신경(TRPV1-expressing primary afferent)이 감소되었기 때문임을 알 수 있었다.

실시예 4: 만성 가려움증의 평가

만성 가려움증의 시간추이는 매주 한 시간에 걸쳐 긁는 행동을 디지털 비디오로 촬영한 후 재생하는 과정에 그 횟수를 정량하여 조사하였다. 뒷발을 바닥에서 떼어 다시 바닥에 내려 놓을 때까지 피부를 긁는 연속된 행동을 일회 긁기로 판정하여 1 시간 동안 관찰되는 횟수를 가려움증 정도의 척도로 사용하였다. 동물을 거울이 설치된 투명한 플라스틱 통에 넣어 30분 가량 환경에 적응시킨 후 디지털 비디오 카메라(DCR-SR300, Sony, Japan)로 1시간 동안 행동을 녹화하였다. 비디오 파일을 컴퓨터에서 2배속으로 재생하면서 긁는 횟수를 기록하였다. 동물의 행동은 사람의 간섭이 없는 공간에서 촬영되었으며, 분석은 동물군의 정보를 모르는 실험자에 의해 맹검법(blind test)으로 실시되었다. 캡사이신 투여군과 대조군의 비교는 t-test 검정법을 이용하여 시행하였으며, 모든 실험 결과는 평균±표준오차로 나타내었고 유의적인 차이는 5% 수준에서 검정하였다.

실험결과, 대조군에서도 산발적인 긁기가 관찰되기도 하였으나, 그 횟수는 시간당 10 회 미만으로 조사되었다. 반면, 캡사이신이 투여된 모든 동물은 출생 후 3주부터 대조군에 비해 매우 심하게 얼굴, 귀 및 등의 피부를 긁기 시작하였으며, 이러한 현상은 10주까지 지속되는 것으로 조사되었다(도 3의 a).

상기 결과로부터, 출생 직후 다량의 캡사이신을 쥐의 피하에 투여하면 초기 잠복기를 가지는 심각한 만성 가려움증이 발생한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 5: 만성 피부염의 평가

상기 실시예 4에서와 같이 매주 동물의 가려움증 평가를 의한 촬영 직전에 동물의 피부상태를 조사하여 피부염의 정도를 수치화하여 분석하였다. 아래와 같이 얼굴(face), 귀(ears) 및 등(back)에서 피부의 상태에 따라 점수를 부여하고, 세 부위의 총합을 피부염 정도의 척도로 사용하였다(Mihara et al, Br J Dermatol 15:335-345, 2004): 얼굴: 0, normal; 1, wispy fur; 2, alopecia and flare; 3, bleeding or ulcerative lesion; 귀: 0, normal; 1, flare; 2, bleeding; 3, loss of part of the ear; 등: 0, normal; 1, wispy fur; 2, alopecia; 3, sever alopecia, bleeding or ulcerative lesion. 출생 후 15주까지 피부상태를 수치화하여 평가한 후, 무작위로 5마리의 캡사이신 투여 동물을 선택하여 1년간 대략적인 피부상태를 검사하였다. 캡사이신 투여군과 대조군의 비교는 t-test 검정법을 이용하여 시행하였으며, 모든 실험 결과는 평균±표준오차로 나타내었고 유의적인 차이는 5% 수준에서 검정하였다.

실험결과, 대조군은 전체 실험기간 동안 피부염의 증상을 전혀 보이지 않았다. 그러나, 캡사이신이 투여된 동물군에서는 출생 후 4주부터 얼굴, 귀주변, 등 및 앞다리의 상박 등, 자주 긁던 부위에 심각한 피부손상이 관찰되었다(도 3의 b 및 c). 피부손상은 탈모(alopecia), 피부건조(dryness), 표면침식(superficial erosion), 찰과상(deep excoriation), 출혈(hemorrhage) 및 흉터(scar)의 형태로 관찰되었다. 출생 후 12부터는 대부분의 상처가 탈모 또는 흉터의 형태로 관찰됨으로써 피부염의 호전 단계임을 알 수 있었다. 그러나, 1년간에 걸친 조사 결과, 일부 동물에서 출혈을 동반한 심한 찰과상이 반복적으로 관찰되었다(도 3의 d).

상기 결과로부터 출생 직후 다량의 캡사이신 투여는 호전과 악화를 반복하는 만성 피부염을 유발한다는 것을 알 수 있었으며, 그 만성 경과가 소아에서 관찰되는 아토피성 피부염 증상과 매우 유사함을 알 수 있었다.

실시예 6: 출생 직후 캡사이신 투여에 의한 피부염의 특성 평가: 아토피성 피부염 증상

<6-1> 피부의 조직학적 특성

조직학적 검사를 위해 출생 후(TRPV1 효현제 투여 후 시간과 일치) 3주와 6주에 생체검사법(biopsy)을 통해 피부조직을 획득하여 헤마톡실린과 에오신(hematoxylin and eosin) 또는 톨루이딘블루(toluidine blue) 염색을 실시하였다. 캡사이신 투여 후 3주에는 육안적인 피부손상이 관찰되지 않았기 때문에 비손상(non-lesional) 조직을 취한 반면, 6주에는 손상(lesional) 조직을 선택하였다. 톨루이딘 블루 염색 후 400배 현미경(BX51, Olympus, Japan) 시야에서 관찰되는 비만세포(mast cell)의 개수를 측정하였다. 캡사이신 투여군과 대조군의 비교는 t-test 검정법을 이용하여 시행하였으며, 모든 실험 결과는 평균±표준오차로 나타내었고 유의적인 차이는 5% 수준에서 검정하였다.

실험결과, 캡사이신 투여 후 6주령 동물의 손상피부조직에서 현저한 표피비후(epidermal hyperplasia)와 각질세포의 비후(hyperkeratosis)가 관찰되었으며, 대조군에 비해 많은 비만세포가 진피층(dermis)에 분포하는 것으로 조사되었다(도 4의 b). 이러한 조직병리적 변화(histopathological changes)는 외형적 피부손상이 관찰되지 않은 3주령 동물의 비손상 피부에서도 관찰되었다(도 4의 a).

상기 결과로부터, 출생 직후 캡사이신을 투여한 쥐 피부의 조직병리적 특성이 아토피성 피부염 환자에서 관찰되는 특성과 매우 유사하다는 것을 알 수 있었다[Kawakami et al, Curr Opin Immunol, 21:666-678, 2009]. 또한, 피부의 조직병리적 변화가 외상에 앞서 나타난다는 것을 알 수 있었다.

<6-2> 혈중 면역글로불린E ( IgE ) 및 피부 NGF ( nerve growth factor ) 정량

혈중(blood) 또는 피부조직(skin tissue) 내에 함유된 IgE와 NGF의 양은 각각 Rat IgE ELISA Quantitation Kit(Bethyl Laboratories, Montgomery, USA)와 NGF sandwich ELISA kit (EMD Millipore, MA, USA)을 이용하여 각 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA(Enzyme linked immune sorbent assay) 방법으로 정량화하였다. 혈액 및 피부조직은 출생 직후 캡사이신을 투여한 후 1, 2, 3, 6, 8, 10의 동물로부터 획득하였다. 캡사이신 투여군과 대조군의 비교는 t-test 검정법을 이용하여 시행하였으며, 모든 실험 결과는 평균±표준오차로 나타내었고 유의적인 차이는 5% 수준에서 검정하였다.

실험결과, 혈중 IgE 양은 대조군에 비해 캡사이신 투여 2주 후부터 이후 전기간에 걸쳐 캡사이신을 투여한 군에서 매우 증가되어 있는 것으로 조사되었다(도 5의 a). 비록 캡사이신 투여 동물의 혈중 NGF 양은 전 실험기간 동안 대조군과 크게 다르지 않았지만, 피부조직 내 NGF 양은 모든 조사기간에 캡사이신 투여군에서 대조군에 비해 증가된 것으로 조사되었다(도 5의 b).

상기 결과로부터 캡사이신 투여 동물군에서 나타나는 만성 가려움증 또는 피부염이 혈중 IgE 및 피부조직 내 NGF 양의 증가와 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. 아토피성 피부염 환자의 혈액 또는 피부에서 IgE (van Bever, Eur J Pediatr, 151:870-873, 1992) 및 NGF (Toyoda et al, Br J Dermatol, 147:71-79, 2002; Dou et al, Arch Dermatol Res, 298:31-37, 2006; Yamaguchi et al, J Dermatol Sci, 53:48-54, 2009)가 특징적으로 증가한다는 사실은 캡사이신 투여에 의해 유발되는 쥐의 피부염이 사람의 아토피성 피부염과 유사한 병인학에 기초한다는 것을 의미한다.

<6-3> 피부 내 IL -4 및 IL -13 mRNA 발현량

아토피성 피부염 환자에서 IL-4 또는 IL-13의 증가가 IgE 합성을 촉진하는 것으로 알려져 있다[Renauld,J Clin Pathol , 54:577-589, 2001]. 따라서, 본 발명에서는 출생 직후 캡사이신을 투여하고 1, 2, 3, 6, 8, 10주 후, 쥐 피부 내 IL-4 및 IL-13 mRNA 발현량을 측정하여 사람의 아토피성 피부염과의 유사성을 검사하였다. TRI 시약(Sigma-Aldrich, MO, USA)와 RNeasy Fibrous Tissue mini kit(Qiagen, Texas, USA)을 이용하여 피부의 총 RNA를 추출, 정제하였다. 역전사 시스템(Reverse Transcription system, Promega, Wisconsin, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. IL-4 및 IL-13에 대한 프라이머(primer)는 GeneBank에 등록된 염기서열에 준하여 Bioneer사에 주문, 제작하였다(표 1). PCR 생성물들은 ethidium bromide가 들어있는 1.5% agarose 젤에서 전기영동하여 Kodak 1D Image Analysis System (Kodak, USA)으로 관찰하였다. 각 피부조직 샘플의 IL-4 및 IL-13 mRNA 양은 GAPDH 양으로 표준화하였다. 캡사이신 투여군과 대조군의 비교는 t-test 검정법을 이용하여 시행하였으며, 모든 실험 결과는 평균±표준오차로 나타내었고 유의적인 차이는 5% 수준에서 검정하였다.

실험결과, 대조군에 비해서 캡사이신을 투여한 동물에서 피부염의 발생과는 무관하게 전 실험기간에 걸쳐 IL-4 mRNA가 증가되었다(도 5의 c). 반면, IL-13 mRNA는 피부염이 발생한 6, 8, 10주의 피부조직에서 대조군에 비해 크게 증가된 것으로 조사되었다(도 5의 d).

상기 실험결과, 실시예 6-2에서와 같이 캡사이신이 투여된 동물에서 관찰된 IgE의 증가가 IL-4 및IL-13의 증가와 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었으며, 캡사이신 투여에 의해 유발되는 쥐의 피부염이 사람의 아토피성 피부염과 유사하다는 것을 알 수 있었다.

<6-4> 표피투과장벽( skin permeability barrier ) 기능의 평가

표피투과수분손실량(transepidermal water loss, TEWL) 측정은 사람뿐만 아니라 동물의 표피투과장벽 기능을 평가하는 유용한 생물리학적 지표(biophysical indicator)로 알려져 있다[Flurh et al, Exp Dermatol, 15:483-492, 2006; Rubio et al, Int J Dermatol, 50:881-889, 2011]. 정상인의 피부에 비해 아토피성 피부염 환자의 피부에서 TEWL이 유의하게 증가된다는 보고가 있다[Schmuth et al, J Invest Dermatol, 122:909-922, 2004; Tomita et al, Exp Dermatol, 14:619-624, 2005; Angelova-Fisher et al, Br J Dermatol, 153:767-773, 2005].

이에 본 발명에서는 캡사이신을 투여한 동물의 TEWL을 측정하여 대조동물과 비교함으로써 출생 직후 캡사이신을 투여한 동물의 표피투과장벽 기능을 평가하고자 하였다. 캡사이신 투여 후 3, 6, 8, 11 주에 온도(22 ~ 24 ℃)와 습도(40 ~ 50%)가 조절된 공간에서 Tewameter TM210(Courage & Khazaka GmbH, Cologne, Germany)을 이용하여 동물의 등에서 TEWL을 측정하여 단위면적시간당 수분증발량(g/m²/h)으로 표시하였다. 측정은 각 동물에서 3회 반복하고 평균값을 산출하였다. 캡사이신 투여군과 대조군의 비교는 t-test 검정법을 이용하여 시행하였으며, 모든 실험 결과는 평균±표준오차로 나타내었고 유의적인 차이는 5% 수준에서 검정하였다.

실험결과, 캡사이신 투여 후 6, 8 주의 손상된 피부조직에서 대조군에 비해 유의하게 증가된 TEWL이 관찰되었다(도 6). 또한, 캡사이신 투여 후 아직 피부손상이 유발되지 않은 3주의 비손상 피부에서도 대조군에 비하여 TEWL이 유의하게 증가되었음을 관찰하였다(도 6).

상기 결과로부터, 출생 직후 다량의 캡사이신 투여는 장기간에 걸쳐 표피투과장벽 기능이상(dysfunction)을 초래한다는 것을 알 수 있었으며, 이 기능이상이 비손상 피부조직에서도 관찰된다는 사실을 통해 피부염에 선행한다는 것을 알 수 있었다.

<6-5> 황색상구균의 피부감염( Skin colonization with Staphylococcus aureus )

표피투과장벽기능의 이상은 병원성 미생물 또는 알레르기 유발물질에 대한 피부노출 가능성을 증가시킨다. 실제로 아토피성 피부염 환자의 경우 박테리아 감염에 취약한 것으로 알려져 있다. 아토피성 피부염 환자의 90%에서 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus , S. aureus)이 관찰되며, 피부염의 정도가 피부 내 세균밀도와 비례하는 것으로 알려져 있다(Leyden et al, Br J Dermatol 90:525-53, 1974). 환자의 아토피성 피부염과의 유사성을 알아보기 위해 캡사이신을 투여한 3 주령 3마리에서 비손상 피부조직 표본 3개와 6 주령 3마리에서 손상 피부조직 표본 3개를 획득하여 이들 조직 내 황색상구균의 분포밀도를 표준실험기법(standard laboratory techniques)으로 조사하였다. 세균의 분포밀도는 Vitek2(BioMerieux, NC, USA)을 이용하여 자동으로 조사되었다. 분포밀도는 피부단위면적당 분포개수(colony-forming units/cm², CFU/cm²)로 표시하였다. 황색상구균의 메티실린(methicillin) 저항성(methicillin resistance)은 국제 표준화 기관인 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)의 항균제 감수성 검사(antimicrobial susceptibility method)방법으로 조사하였다.

하기 표 2는 캡사이신 투여 후 3주의 비손상(Non-lesional) 피부와 6주의 손상(Lesional) 피부에 분포하는 황색상구균(Staphylococcus aureus)의 밀도 및 메티실린(methicillin) 저항성을 나타낸 결과이다[Cap-treated, 출생 후 캡사이신을 투여한 동물군; Vehicle-treated, 출생 후 캡사이신이 생략된 대조약물을 투여한 동물군].

[표 2]

실험결과(표 2), 대조군의 피부에서는 황색상구균이 관찰되지 않은 반면, 캡사이신 투여 후 6주의 손상피부조직 표본 총 3개에서 평균 950 CFU/cm²의 황색상구균 감염이 관찰되었다. 캡사이신 투여 3주 후 비손상 피부조직 표본 총 3개 중 2개에서 각각 >2,000 CFU/cm², 1,500 CFU/cm²의 황색상구균 감염이 조사되었다. 관찰된 황색상구균 모두 메티실린(methicillin)에 민감(sensitive)한 것으로 조사되었다.

상기 실험결과는 상기 <6-4>와 함께 출생 직후 캡사이신 투여에 의해 만성 가려움증과 동반되는 피부염이 사람의 아토피성 피부염과 유사하다는 것을 알 수 있게 하였다.

실시예 7: 출생 직후 레시니페라톡신 ( resiniferatoxin ) 투여에 의한 피부염의 특성 평가

상기 실시예 1에서와 같이 캡사이신의 유사체인 레시니페라톡신을 출생 직후 흰쥐 새끼에 주사하여 상기 실시예 5에 준하여 발생하는 피부염의 정도를 평가하였다.

실험결과, 도 7에서와 같이 레시니페라톡신도 캡사이신과 유사하게 만성 피부염을 유발하는 것을 알게 되었다.

따라서, 다양한 TRPV1 효현제가 흰쥐에서 만성 가려움증 또는 피부염을 유발할 것으로 예측된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

출생 직후의 쥐(rat) 새끼에 TRPV1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 or vanilloid receptor 1) 채널의 효현제(agonist)로 캡사이신(capsaicin) 또는 레시니페라톡신(resiniferatoxin)을 쥐 체중 1 g당 5 내지 100 ㎍ 주사하여 TRPV1 발현 말초신경이 제거된 만성 가려움증 또는 아토피성 피부염 유발 쥐(rat).
제 1 항에 있어서,
상기 출생 직후는 출생 후부터 48시간 내인 쥐.
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출생 직후의 쥐(rat) 새끼에 TRPV1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1) 채널의 효현제(agonist)로 캡사이신(capsaicin) 또는 레시니페라톡신(resiniferatoxin)을 쥐 체중 1 g당 5 내지 100 ㎍ 주사하여 TRPV1 발현 말초신경을 제거하는 단계;
TRPV1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1) 효현제 주사 시 유발되는 무호흡(apnea)을 치료하는 단계; 및
쥐를 성장시키는 단계
를 포함하는 만성 가려움증 및 아토피성 피부염 유발 쥐(rat)의 제작방법.
정상 쥐와 청구항 1에 따른 만성 가려움증 유발 쥐의 가려움증 정도를 측정하는 단계;
상기 만성 가려움증 유발 쥐에 시험제제를 투여하고 가려움증 정도를 측정하는 단계; 및
상기 시험제제를 투여하기 전과 투여한 후의 가려움증 정도를 비교하여 만성 가려움증 유발 쥐에서 가려움증을 감소시키는 제제를 선별하는 단계
를 포함하는 가려움증 억제제의 스크리닝 방법.
정상 쥐와 청구항 1에 따른 아토피성 피부염 유발 쥐의 피부염 정도를 측정하는 단계;
상기 아토피성 피부염 유발 쥐에 시험제제를 투여하고 피부염 정도를 측정하는 단계; 및
상기 시험제제를 투여하기 전과 투여한 후의 피부염 정도를 비교하여 아토피성 피부염 유발 쥐에서 피부염 증상을 감소시키는 제제를 선별하는 단계
를 포함하는 아토피성 피부염 치료제의 스크리닝 방법.