KR101332830B1 - 페닐우레아 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항암감작제 - Google Patents

페닐우레아 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항암감작제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페닐우레아 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항암감작제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 페닐우레아 유도체와 항암제를 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다. 상기 페닐우레아 유도체는 TRAIL에 내성을 나타내는 암세포주에서 죽음 수용체(DRs)의 발현을 촉진하고, 항-세포사멸 단백질들의 발현을 효과적으로 억제함으로써, TRAIL에 내성을 가지고 있는 암세포의 세포사멸을 감작하는 효과를 가지므로, 항암감작제 또는 항암제와 함께 항암 조성물로 널리 활용될 수 있다.

Description

페닐우레아 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항암감작제{A cancer sensitizer comprising phenylurea derivatives or salts thereof}
본 발명은 페닐우레아 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항암감작제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 페닐우레아 유도체와 항암제를 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다.
암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 우리나라의 경우, 질병 사망원인 중 제 1위의 질병으로서 연간 약 10만 명 이상이 진단되고, 약 6만 명 이상이 사망하고 있다. 이러한 암의 유발 인자인 발암물질로는 흡연, 자외선, 화학물질, 음식물, 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다.
TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)은 TNF(tumor necrosis factor) family 단백질로서 선택적으로 암세포의 사멸을 유도할 수 있다고 알려져 있다(Wiley et al., Immunity, 3(6):673-682, 1995). 실제 TRAIL은 일반 세포에 대해서는 무해하면서, 다양한 암 세포주에 대해서만 독성을 유도한다는 특징들이 밝혀졌다(Ashkenazi et al., J. Clin. Invest.,104:155-162, 1999; Walczak et al., Nat. Med.,5:157-163, 1999). 이러한 일반 세포에 무해한 특성은 일반 세포의 표면에만 존재하는 유인 수용체 1, 2 (DcR1, DcR2)의 기능 때문이다(Sheridan et al., Science,277:81 8-821, 1997). DcR1, DcR2는 TRAIL과 결합이 가능하지만, 세포내 신호 전달 부분이 결여되어 있어서 일반 세포들은 TRAIL에 의한 세포 사멸 유도가 일어나지 않게 된다. 이러한 선택적인 암세포 사멸 유도 특징으로 TRAIL은 암치료의 획기적인 매개체로 주목을 받고 있다.
TRAIL이 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 개략적인 과정은 다음과 같다. TRAIL-R1(death receptor 4, DR4) 및 TRAIL-R2(death receptor 5, DR5)에 TRAIL이 결합하면, 세포사멸 신호 전달이 촉진된다. 수용체의 활성은 아답터 단백질, Fas-관련 죽음 도메인(FADD) 및 프로카스파제-8을 증가시켜 죽음-유도경로 복합체, DISC를 형성하도록 유도하고, DISC에서 카스파제-8의 자가 촉매 활성화는 카스파제-3와 같은 다운스트림의 카스파제의 활성화를 유도한다. 그러나, DISC는 세포성 FADD-유사 인터루킨-1β전환 효소(FLICE) 저해 단백질(FLIP)을 포함하는 기능적 저해제에 의해 음성적으로 조절될 수 있다. FLIP과 프로카스파제-8간의 구조적 유사성 때문에 FLIP은 FADD 또는 카스파제-8 에 결합하여 카스파제-8을 억제할 수 있다. 또한, 카스파제 활성화는 세포사멸 단백질 저해제 패밀리(IAPs)들에 의해서도 억제될 수 있다.
현재까지 알려진 많은 항암제 및 암 저해제들은 비특이성으로 인한 정상조직에의 심한 부작용, 높은 돌연변이율로 인한 암세포주의 내성 획득 등의 문제점을 가지고 있다. 1997년 TRAIL이 정상세포주에는 작용하지 않고 암세포주에만 작용하여 세포사멸을 유도한다는 사실이 발견된 이후, TRAIL은 암세포주 특이적 항암제일 뿐만 아니라 기존 항암 치료제에 대해 저항성을 획득한 암세포주의 치료제로서의 가능성이 대두되었다. 그러나 유방암, 전립선암, 자궁암, 폐암, 간암, 뇌종양 등의 다수의 암에서 TRAIL 내성이 나타나고 있으며, TRAIL을 암세포주에 지속적으로 처리하면 TRAIL에 감수성을 보이던 암세포주도 차차 TRAIL에 대해 내성을 가지는 것으로 밝혀졌다.
TRAIL 내성 기전은, DR4 또는 DR5의 불활성화, DISC 인자의 결손, IAP 패밀리와 같은 항-세포사멸 분자의 과발현 또는 Akt 경로와 같은 생존 경로의 상향 조절이 발생하는 경우로 알려져 있다. 이러한 측면에서 최근의 연구는 TRAIL-기반의 치료법과 표준 화학치료제 약물 또는 방사선 요법을 조합하여 암세포가 TRAIL-매개 세포사멸에 민감성을 가지도록 연구되고 있다. 즉, TRAIL의 내성을 극복하는 신규 치료제의 발굴에 의해 TRAIL 내성이 극복되어 암세포주 특이적 세포사멸을 증진시키는 TRAIL 센서타이저(sensitizer)의 개발이 절실한 실정이다.
이에 본 발명자는, TRAIL의 감수성을 증진시켜, TRAIL에 내성이 있는 암 세포주에 효과적으로 작용하는 암 치료제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 페닐우레아 유도체 화합물을 TRAIL 내성을 보이는 암세포주에 처리한 경우, TRAIL 매개 세포사멸을 효과적으로 유도하여 항암감작제로 유용하게 쓰일 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 화학식 1로 표시되는 페닐우레아 유도체를 포함하는 항암감작제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 페닐우레아 유도체 및 하나 이상의 항암제를 포함하는 항암 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 페닐우레아 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항암감작제를 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112012053978997-pat00001
상기 식에서,
X는 O 또는 S이고,
R1은 비치환 또는 R2로 n개 치환된, 옥사졸일, 피리미디닐, 피라졸일, 페닐, 티아디아졸일, 티아졸일 또는
Figure 112012053978997-pat00002
이고,
상기 n은 1 내지 3 중 어느 하나의 정수이고,
R2는 아미노, 니트로, 비치환 또는 할로겐으로 치환된 C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, 페닐 또는 티오페닐이고,
Y는 비치환 또는 R3로 m개 치환된 페닐,
Figure 112012053978997-pat00003
,
Figure 112012053978997-pat00004
또는
Figure 112012053978997-pat00005
이고,
상기 m은 1 내지 3 중 어느 하나의 정수이고,
R3는 할로겐, -OH, -NO2, 비치환 또는 할로겐으로 치환된 C1-C4 알킬, 비치환 또는 할로겐으로 치환된 C1-C4 알콕시 또는 할로겐으로 치환된 C1-C4 알킬티오이다.
본 발명에서 사용된 용어, "할로겐"은 F, Cl, Br, I 중 어느 하나를 의미하며, 본 발명에서 사용된 용어, "알킬"은 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄의 포화된 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알킬의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필 이소프로필 등이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 상기 알킬은 치환 또는 비치환 될 수 있으며, 치환되는 경우, 할로겐으로 치환되는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용된 용어, "알콕시"는 탄소수 1 내지 4의 저급 알킬기가 산소에 결합한 기(Group)을 의미한다. 알콕시의 예로는, 메톡시, 에톡시, 이소부틸옥시 등이 포함될 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 상기 알콕시는 치환 또는 비치환 될 수 있으며, 치환되는 경우, 할로겐으로 치환되는 것이 바람직하다.
바람직하게, 상기 식에서 R1은
Figure 112012053978997-pat00006
,
Figure 112012053978997-pat00007
,
Figure 112012053978997-pat00008
,
Figure 112012053978997-pat00009
,
Figure 112012053978997-pat00010
,
Figure 112012053978997-pat00011
,
Figure 112012053978997-pat00012
,
Figure 112012053978997-pat00013
,
Figure 112012053978997-pat00014
,
Figure 112012053978997-pat00015
,
Figure 112012053978997-pat00016
,
Figure 112012053978997-pat00017
또는
Figure 112012053978997-pat00018
이다.
또한, 바람직하게 상기 식에서 Y는 비치환 또는 OH, F, Cl, Br, I, CH3, CF3, OCF3, SCF3 및 NO2 중 어느 하나 이상으로 치환된 페닐이다.
보다 바람직하게 상기 식에서 R1은
Figure 112012053978997-pat00019
,
Figure 112012053978997-pat00020
또는
Figure 112012053978997-pat00021
이고, Y는 비치환 또는 OH, F, Cl, Br, I, CH3, CF3, OCF3, SCF3 및 NO2 중 어느 하나 이상으로 치환된 페닐이다.
상기 화학식 1로 표시되는 페닐우레아 유도체의 대표적인 예는 하기와 같다:
1) 1-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-3-(4-(5-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
2) 1-(5-클로로-2-메틸페닐)-3-(4-(5-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
3) 1-(4-(2-메틸-5-페닐옥사졸-4-일)페닐)-3-(3-(트리플루오로메틸)페닐)티오우레아;
4) 1-(4-(2-아미노피리딘-4-일)페닐)-3-페닐우레아;
5) 1-(4-(2-아미노피리딘-4-일)페닐)-3-(3-클로로페닐)우레아;
6) 1-(4-(2-아미노피리딘-4-일)페닐)-3-(3-(트리플루오로메톡시)페닐)우레아;
7) 1-(4-(3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)-3-(4-(트리플루오로메틸티오)페닐)우레아;
8) 1-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
9) 1-(3-클로로페닐)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
10) 1-(4-(3,5-비스(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)-3-(3,5-디클로로페닐)우레아;
11) 1-(4-(3,5-비스(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)-3-(2,4-디플루오로페닐)우레아;
12) 1-(2,4-디플루오로페닐)-3-(4-(4,6-디메톡시피리미딘-2-일)페닐)우레아;
13) 1-페닐-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
14) 1-(3,5-디메틸페닐)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
15) 1-(4-플루오로페닐)-3-(4-(5-(티오펜-2-일)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
16) 1-페닐-3-(4-(5-(티오펜-2-일)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
17) 1-(5-메틸-3-페닐이속사졸-4-일)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
18) 1-(3,5-디메틸페닐)-3-(4-(5-(티오펜-2-일)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
19) 1-(2-메톡시페닐)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
20) 1-(비페닐-4-일)-3-(4-(데크일옥시)페닐)우레아;
21) 1-(비페닐-4-일)-3-(2-클로로-4,5-디플루오로페닐)우레아;
22) 1-(9-옥소-9H-플로렌-2-일)-3-페닐우레아;
23) 1-(비페닐-4-일)-3-(3-브로모페닐)티오우레아;
24) 1-(4-아이오도페닐)-3-(4-니트로비페닐-4-일)우레아;
25) 1-(4-메틸-2-니트로페닐)-3-(4-니트로비페닐-4-일)우레아;
26) 1-(비페닐-4-일)-3-(3-클로로페닐)우레아;
27) 1-(비페닐-4-일)-3-(4-브로모-2,6-디메틸페닐)티오우레아;
28) 1-(4-니트로비페닐-4-일)-3-(4-(트리플루오로메틸)페닐)우레아;
29) 1-(2,3-디하이드로벤조퓨란-5-일)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
30) 1-(4-(1,2,3-티아디아졸-4-일)페닐)-3-(2-클로로페닐)티오우레아;
31) 1-(4-(1,2,3-티아디아졸-4-일)페닐)-3-(4-클로로페닐)티오우레아;
32) 1-(4-(1,2,3-티아디아졸-4-일)페닐)-3-(2-(트리플루오로메틸)페닐)티오우레아;
33) 1-(4-메톡시페닐)-3-(4-(2-페닐티아졸-4-일)페닐)우레아;
34) 1-페닐-3-(4-(2-페닐티아졸-4-일)페닐)우레아;
35) 1-(4-메톡시페닐)-3-(4-(2-메틸티아졸-4-일)페닐)우레아;
36) 1-(4-브로모-2-클로로페닐)-3-(2-니트로비페닐-4-일)티오우레아;
37) 1-(4-플루오로페닐)-3-(2-니트로비페닐-4-일)우레아;
38) 1-(4-(4,6-디옥소-1,3b,4,6,6a,6b-헥사하이드로사이클로부타[3,4]사이클로프로파[4,5]사이클로펜타[1,2-c]피롤-5(3aH)-일)페닐)-3-(2-하이드록시페닐)우레아
39) 1-(2-클로로페닐)-3-(4-니트로비페닐-4-일)우레아; 및
40) 1-(4-(2-메틸티아졸-4-일)페닐)-3-페닐티오우레아.
보다 바람직하게, 본 발명에 따른 상기 페닐우레아 유도체는
1-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-3-(4-(5-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아; 또는
1-(5-클로로-2-메틸페닐)-3-(4-(5-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아이다.
상기 화학식 1로 표시되는 페닐 우레아 유도체는 천연 공급원으로부터 분리되거나, 천연 공급원으로부터 수득하여 화학적인 개질에 의해 제조하거나, 또는 공지의 제조방법에 의해 당업자가 용이하게 화학적으로 합성하여 제조하거나, 상업적으로 제조된 상품일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "약학적으로 허용가능한 염"이란, 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 제조된 염을 의미하며, 이러한 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 구체적으로, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 하기 무기산과 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 포함할 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 알칼리 금속, 예를 들어, 나트륨, 또는 칼륨, 알칼리 토금속, 예를 들어, 마그네슘을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "항암감작"이란 "화학감작"과 동일한 의미로 사용되는 것으로, 항암감작제가 없을 때보다 있는 경우 항암제의 암세포에 대한 감수성이 더 강화되거나 증가되는 것을 의미하며, 구체적으로는 항암제에 대한 저항성이 줄어들고 항암제의 효과(암세포에 대한 독성)가 더 잘 발휘되는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서는 상기 페닐우레아 유도체가 항암제, 특히 TRAIL에 대한 암세포의 민감성을 증가시킴으로써, 항암제에 대한 암세포의 저항성을 줄이고, 항암제의 효과를 높이는 것을 특히 항암감작이라 한다.
상기 항암제 저항성은 항암제 투여시 약물이 암세포를 사멸시키지 못하거나 사멸시키는 정도가 미비한 상태를 말하는 것으로서, 항암제 내성이 가장 주요한 원인이다. 본 발명에서 사용된 용어, "항암제 내성"이란 항암제를 이용하여 환자를 치료할 때, 치료 초기부터 효과가 없거나 또는 초기에는 암 질환 치료 효과가 있었지만, 계속적인 항암제의 투여로 치료 효과가 미비 또는 상실되는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 상기 페닐우레아 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 항암감작제로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "암"이란 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 아팝토시스(apoptosis)의 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 되어 생기는 질병을 의미한다. 본 발명에서 상기 암은 바람직하게 TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)에 내성을 나타내는 암이며, 이의 대표적인 예로는 TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)에 내성을 나타내는, 폐암, 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암 중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand)"은 세포 사멸 과정을 유도하는 리간드로서의 기능을 하는 단백질의 하나를 의미한다. TRAIL은 일반적인 세포에는 영향을 주지 않으면서, 다양한 암종에서 세포사멸을 유도하기 때문에, 항암 치료제로서 유용하게 사용되어 왔다. 그러나, 많은 암세포주에서 TRAIL 저항성이 보고되면서, TRAIL 단독으로는 유의적인 치료 효과를 거둘 수 없는 문제가 있었다. 본 발명에 따른 페닐우레아 유도체는 TRAIL 매개 세포사멸의 감수성을 효과적으로 증진시킴으로써 TRAIL에 내성을 나타내는 암에 대한 항암감작제로 유용하게 사용될 수 있다.
바람직하게 상기 페닐우레아 유도체는 사멸 수용체의 발현을 촉진 또는 상향 조절하거나 및/또는 항-세포사멸 분자의 발현의 저해 또는 하향 조절한다.
구체적인 일실시예에서, 상기 페닐우레아 유도체들(1-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-3-(4-(5-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아; 또는 1-(5-클로로-2-메틸페닐)-3-(4-(5-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아)을 단독 또는 TRAIL과 조합하여 TRAIL에 내성을 가진다고 알려진 폐암세포주 H1299에 처리하였고, 상기 세포 중의 DRs 단백질들과 항-세포사멸 분자들의 발현 정도를 분석하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 페닐우레아 유도체들은 1) TRAIL의 감수성을 증가시키는 죽음 수용체(DR5)의 발현을 상향 조절하고 동시에 2) TRAIL의 감수성을 감소시키는 항-세포사멸 분자들의 발현을 효과적으로 억제하여 TRAIL 매개 세포사멸을 효과적으로 유도시키는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 구체적인 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 페닐우레아 유도체 화합물과 TRAIL을 조합하여 처리한 경우, TRAIL 만을 처리한 경우에 비하여 세포사멸 경로에 관련한 인자(죽음 수용체 및 인산화된 c-Jun과 ERK)의 발현은 증가시켰으며, 항-세포사멸 분자들의 발현은 효과적으로 억제시킴으로써 세포 생존력을 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다. 이로써, 본 발명에 따른 페닐우레아 화합물은 TRAIL에 내성을 나타내는 암의 감수성을 현저하게 증가시켜 항암감작제로 유용하게 사용될 수 있는 것을 확인하였다.
특히, 본 발명에 따른 페닐우레아 유도체 화합물은 단독으로 암 세포에 처리할 경우 뿐만아니라, 다른 항암제와 조합하여 병용 처리하는 경우, 암세포주를 감작시켜 보다 효과적으로 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 효과를 가진다.
따라서, 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 화학식 1의 페닐우레아 유도체와 하나 이상의 항암제를 포함하는 항암조성물을 제공한다.
바람직하게, 상기 항암제는 TRAIL이며, 바람직하게, 상기 암은 TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)에 내성을 나타내는 암이다. 상기 TRAIL에 내성을 나타내는 암은 예를 들어, TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)에 내성을 나타내는, 폐암, 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암 중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 페닐우레아 유도체 화합물은 TRAIL에 내성을 나타내는 암세포의 감수성을 증진시키기 때문에 TRAIL과 함께 사용되는 경우 TRAIL 내성암 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.
또한, 다른 하나의 양태로서 본 발명은 본 발명의 항암조성물을 약학적으로 유효한 양으로 TRAIL 내성 암 질환의 발병 또는 발병 가능성이 있는 인간을 포함하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 TRAIL 내성 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
구체적인 일실시예에 따르면, 본 발명의 페닐우레아 유도체 화합물은 TRAIL 매개 세포사멸 신호전달 경로에 관련된 다양한 단백질 및 분자들의 발현을 상승시키고, TRAIL 민감성을 저해하는 Akt 경로에 관련한 단백질 및 분자들의 발현은 억제시켰다. 또한, 상기 페닐우레아 유도체 화합물은 이러한 TRAIL 매개 세포사멸을 감작시킴으로써, TRAIL과 병용하여 사용되는 경우 TRAIL 내성 암세포주만을 선택적으로 사멸시켜 세포 생존력을 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다. 이는, 본 발명에 따른 페닐우레아 유도체 화합물이 TRAIL에 내성을 나타내는 암 질환에 유용하게 사용될 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 TRAIL 내성 암 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미경질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 페닐우레아 유도체 화합물은 TRAIL에 내성을 나타내는 암세포주에서 죽음 수용체(DRs)의 발현을 촉진하고, 항-세포사멸 단백질들의 발현을 효과적으로 억제함으로써, TRAIL에 내성을 나타내는 암세포의 세포사멸을 유도하는 효과를 가지므로, 항암감작제 또는 항암제와 함께 항암 조성물로 널리 활용될 수 있다.
도 1은, 본 발명의 일실시예에 따른 화합물 1을 처리한 유동세포 계측법 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는, 본 발명의 일실시예에 따른 화합물 2를 처리한 유동세포 계측법 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은, 본 발명의 일실시예에 따른, 화합물 1을 처리한 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4는, 본 발명의 일실시예에 따른, 화합물 1의 카스파제-8 활성 시험 및 카스파제 저해제를 처리한 세포 생존율 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는, 본 발명의 일실시예에 따른, 화합물 2의 카스파제-8 활성 시험 및 카스파제 저해제를 처리한 세포 생존율 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은, 본 발명의 일실시예에 따른, 화합물 1을 처리한 세포의 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은, 본 발명의 일실시예에 따른, 화합물 2를 처리한 세포의 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은, 본 발명의 일실시예에 따른, 화합물 1을 처리한 세포의 RT-PCR 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
도 9는, 본 발명의 일실시예에 따른, 화합물 1 또는 2와 JNK 또는 ERK 저해체를 처리한 후, DR5 발현을 분석한 그래프 및 이의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은, 본 발명의 일실시예에 따른, 화합물 1과 JNK 또는 ERK 저해제를 처리한 세포의 생존율 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은, 본 발명의 일실시예에 따른, 화합물 1을 처리한 세포의 ROS 발생률을 나타낸 그래프이다.
도 12는, 본 발명의 일실시예에 따른, 화합물 1과 항산화제 NAC를 처리한 세포의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 사진 및 세포 생존율 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험 재료
실험에 사용한 페닐우레아 유도체 화합물은 모두 Maybridge (Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA, USA)에서 구입하였다. 가용성 재조합 인간 TRAIL 및 항-DR5 항체는 Chemicon International Inc. (Temecula, AC, USA)에서 구입하였다. FLIP, survivin및 XIAP에 대한 1차 항체는 Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. 1차 항체(DR4, Bcl-2, Bcl-xL, cIAP-1, cIAP-2, p-c-Jun, c-Jun, p-ERK, ERK 및 액틴) 및 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 항-인간 DR5-PE는 BioLegend, Inc. (San Diego, CA, USA)에서 구입하였고, CM-H2DCFDA는 Molecular Probes, Inc (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. JNK 저해제 SP600125 및 MEK-ERK 저해제 PD98059는 Calbiochem (EMD Biosciences, Inc., La Jolla, CA, USA)로부터 구입하였다. 카스파제 저해제 Z-VAD-FMK는 Promega (Madison, WI, USA)로부터 구입하였고, N-아세틸 시스테인(NAC)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
실시예 2: 세포 배양
인간 폐암 H1299 세포 및 폐 WI38 세포((American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)는 37℃ 5% 이산화탄소 조건에서 RPMI 1640 또는 10% 우태아혈청, 100U/㎖의 페니실린 및 100㎍/㎖의 스트렙토마이신으로 보충된 MEM 배지에서 배양하였다. 배지는 3일 마다 교환하였다.
실시예 3: 항암감작 효과 분석
본 발명에 따른 페닐우레아 유도체 화합물들이 항암감작 효과가 있는지를 분석하기 위하여 H1299 세포주에 TRAIL 단독 처리한 경우와 페닐우레아 유도체 화합물 및 TRAIL을 조합 처리한 경우의 세포 생존율을 비교하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
No. 페닐우레아 화합물 세포 생존율%
화합물(μM)/TRAIL(100ng/㎖)
+/- +/+
1
Figure 112012053978997-pat00022
 94 13
2
Figure 112012053978997-pat00023
 78 12
3
Figure 112012053978997-pat00024
 68 58
4
Figure 112012053978997-pat00025
 95 71
5
Figure 112012053978997-pat00026
 95 63
6
Figure 112012053978997-pat00027
 91 72
7
Figure 112012053978997-pat00028
 17 11
8
Figure 112012053978997-pat00029
 56 20
9
Figure 112012053978997-pat00030
 50 11
10
Figure 112012053978997-pat00031
 26 8
11
Figure 112012053978997-pat00032
 32 20
12
Figure 112012053978997-pat00033
 100 62
13
Figure 112012053978997-pat00034
 94 64
14
Figure 112012053978997-pat00035
 94 55
15
Figure 112012053978997-pat00036
 71 31
16
Figure 112012053978997-pat00037
 55 21
17
Figure 112012053978997-pat00038
 87 38
18
Figure 112012053978997-pat00039
 36 11
19
Figure 112012053978997-pat00040
 91 71
20
Figure 112012053978997-pat00041
 91 43
21
Figure 112012053978997-pat00042
 91 59
22
Figure 112012053978997-pat00043
 97 71
23
Figure 112012053978997-pat00044
 94 75
24
Figure 112012053978997-pat00045
 99 70
25
Figure 112012053978997-pat00046
 95 75
26
Figure 112012053978997-pat00047
 68 41
27
Figure 112012053978997-pat00048
 84 41
28
Figure 112012053978997-pat00049
 19 11
29
Figure 112012053978997-pat00050
 91 63
30
Figure 112012053978997-pat00051
 92 59
31
Figure 112012053978997-pat00052
 95 71
32
Figure 112012053978997-pat00053
 93 58
33
Figure 112012053978997-pat00054
 97 75
34
Figure 112012053978997-pat00055
 98 84
35
Figure 112012053978997-pat00056
 96 74
36
Figure 112012053978997-pat00057
 104 80
37
Figure 112012053978997-pat00058
 93 76
38
Figure 112012053978997-pat00059
 99 78
39
Figure 112012053978997-pat00060
 101 73
40
Figure 112012053978997-pat00061
 95 68
TRAIL만을 H1299 세포에 처리한 경우, TRAIL에 대한 내성으로 세포 생존율은 95%을 나타내었다.
그러나, 상기 표 1에서 확인할 수 있듯이 본 발명에 따른 페닐우레아 유도체 화합물 1 내지 40 중 어느 하나와 TRAIL을 함께 처리한 경우, 세포 생존율이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이는, 본 발명에 따른 페닐우레아 유도체가 TRAIL을 감작(sensitizing)시켜 TRAIL 매개 세포사멸을 효과적으로 유도하는 것을 의미한다.
실시예 4: 세포사멸 분석( Apoptosis analysis )
세포사멸은 아넥신 V 및 프로피디움 아이오다이드(PI) 염색 기반의 ApoAlert 아넥신 V 세포사멸 검출 키트(Clontech, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 확인하였다. H1299 세포(2.8×105 세포/웰)를 6-웰 플레이트에 접종하였고, 24시간 후, 화합물 1(10μM) 단독 또는 화합물 1(10μM) 및 TRAIL(100ng/㎖)을 조합 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 수확하여 유동세포 계측법(CytomicsFC500; Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA)로 분석하였다. 얻어진 데이터는 Beckman Coulter Cytomic RXP software를 사용하여 분석하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
또한, 화합물 2(10μM)를 24시간 동안 처리한 것을 제외하고 상기 화합물 1과 동일한 방법으로 H1299 세포에 처리하여, 유동세포 계측법으로 분석하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
TRAIL을 단독으로 처리하였을 경우의 세포사멸 정도를 비교하기 위하여 대조군은 TRAIL만을 처리하였고, 모든 결과는 사멸한 세포 수는 총 세포 수에 대하여 각 판넬당 %로 표시하였다.
도 1 및 2에 나타나듯이 H1299 세포에 아무것도 처리하지 않은 경우와 TRAIL을 단독을 처리한 경우, 사멸한 세포수 %는 각각 1.35% 및 2.53% 로 유의한 차이를 나타내지 않는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 폐암 세포주 H1299가 TRAIL 처리에도 불구하고 거의 사멸되지 않았으며, H1299 세포가 TRAIL 내성 암세포주임을 확인하였다.
또한, H1299 세포에 화합물 1 또는 2를 10μM씩 처리한 경우, 사멸한 세포는 각각 3.65% 및 3.25%였으나, TRAIL(100ng/㎖)과 조합하여 함께 처리한 경우, 사멸한 세포는 각각 40.79% 및 39.40%로 현저하게 증가하였다. 이로써, 화합물 1 또는 2가 H1299 세포를 감작시켜 TRAIL-매개 세포사멸을 효과적으로 유도하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 세포 생존력 시험
TRAIL 감작제는 일반 세포에 대해서는 독성을 가지지 않아야 하기 때문에, 폐 세포주 WI38와 폐암 세포주 H1299를 이용하여 페닐우레아 유도체의 세포 생존력 시험을 수행하였다. WI138 세포와 H1299세포를 각각 96-웰 플레이트에 1.4×103세포/웰로 접종하고, 24시간 후, 세포들을 화합물 1(10μM) 단독 또는 화합물 1(10μM)과 TRAIL(100ng/ml)을 조합하여 48시간 동안 처리하였다. 그 후, 세포 카운팅 키트-8(CCK-8; Dojindo Molecultar Technology, Rockvill, MD, USA)로 세포 생존율을 측정하였다(*P<0.001). 흡광도는 Wallac Encision miroplate reader (PerkinElmer, Finland)를 사용하여 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
그 결과, 도 3에 나타나듯이 화합물 1 또는 TRAIL을 단독으로 처리하는 경우, WI38 및 H1299 세포 모두 생존률이 크게 감소하지 않았다. 그러나, 화합물 1과 TRAIL을 동시에 처리하는 경우, H1299의 생존율은 화합물 1의 농도 증가에 따라 현저하게 감소하였으며, WI38은 TRAIL 단독 처리시에 비하여 생존율이 거의 감소하지 않았다. 이로써, 본 발명에 따른 페닐우레아 유도체가 정상 세포에는 독성을 가지지 않고, TRAIL 내성 암세포에 대해서만 선택적으로 사멸 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 카스파제 -8 활성 시험
TRAIL 매개 외인성 세포죽음(cell death) 과정에 있어서 카스파제-8은 주요한 조절자로 알려져 있다. 이에, 페닐우레아 유도체 화합물이 상기 카스파제-8에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 카스파제-8의 활성을 시험하였다. 활성은 카스파제-8 Fluorometri Assay kit (R&D system, Inc, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 측정하였고, 시험은 사용자의 프로토콜에 따라 96-웰 플레이트에서 세 차례 수행하였다. 구체적으로, H1299 세포(1.4×103 세포/웰)를 96 웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후, 세포를 화합물 1 또는 2 단독 또는 TRAIL(100ng/ml)과 조합하여 4시간 동안 처리하고 카스파제-8의 활성을 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
또한, 본 발명에 따른 페닐우레아 유도체 화합물이 카스파제-8을 활성화 경로를 통하여 TRAIL 매개 외인성 세포죽음을 유도하는지 확인하기 위하여, 카스파제 저해제를 투여하여 세포 생존력을 측정하였다. 시험 과정은 상기 카스파제-8 활성 시험과 동일한 조건으로 시험하였고, 다만 화합물 1 또는 2와 TRAIL 처리 전에, 1시간 동안 카스파제 저해제인 Z-VAD-FMK(10μM)를 처리한 후, 화합물 1 또는 2 단독 또는 TRAIL(100ng/ml)과 조합하여 48시간 동안 처리하고 CCK-8 시험으로 세포 생존력을 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
그 결과, 도 4에 나타나듯이 화합물 1, 2 또는 TRAIL 단독은 카스파제-8의 활성에 거의 영향을 끼치지 않았다. 그러나, 화합물 1 또는 2와 TRAIL을 조합하여 처리할 경우, 카스파제-8의 활성이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 5에 나타나듯이, 화합물 1 또는 2와 TRAIL 및 카스파제 저해제를 모두 처리한 경우, 카스파제 저해제를 미처리한 경우에 비하여 세포 생존력이 유의한 정도로 상승하였다. 이로써, 본 발명에 따른 페닐우레아 유도체가 카스파제-8의 신호 전달을 촉진시키고, 이를 통하여 TRAIL-매개 세포사멸을 유도하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 웨스턴 블롯 시험
본 발명에 따른 페닐우레아 유도체 화합물이 DR5 (Death Receptor 5)와 MAP 카이네이즈 및 항-세포사멸 분자들의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 시험을 수행하였다. 구체적으로 H1299 세포(2.8×105세포/웰)를 6-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 후, 세포를 화합물 1 또는 2 단독, 또는 화합물 1 또는 2와 TRAIL(100ng/ml)을 조합 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 15분 동안 10,000×g에서 균질화 및 원심분리하였고, 상청액을 세포질 단백질 분획으로 사용하였다. 변성 단백질은 겔에서 분리하여 PVDF (Millipore, Temecula, CA, USA)로 이동시켰다. 항체와 배양한 후, 멤브레인은 LAS-3000 luminescent image analyzer(Fuji Photo Film Co., Ltd., Japan)을 사용하여 Pierce SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Fisher Scientific,Pittsburgh, PA, USA)에 전개하였다. 화합물 1을 처리한 결과를 도 6에, 화합물 2를 처리한 결과를 도 7에 각각 나타내었다.
그 결과, 도 6의 A에 나타나듯이 아무것도 처리하지 않은 경우 또는 TRAIL 만을 단독으로 처리한 경우에는 죽음 수용체(DR4 또는 DR5)의 발현이 거의 증가하지 않았다. 그러나, 화합물 1 단독 또는 TRAIL과 조합 처리시, DR5 단백질의 발현은 현저하게 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, 도 6의 B에 나타나듯이, 아무것도 처리하지 않은 경우 또는 TRAIL만을 처리한 경우에는 p-c-Jun 또는 p-ERK의 발현이 거의 증가하지 않았다. 그러나, 화합물 1 단독 또는 TRAIL과 조합 처리시, p-c-Jun 및 p-ERK의 발현이 증가하였으며 이로써 화합물 1이 c-Jun과 ERK의 인산화를 촉진시키는 것을 확인하였다. 또한, 도 6의 C에 나타나듯이 아무것도 처리하지 않은 경우 또는 TRAIL만을 처리한 경우에는 항-세포사멸 분자들의 발현이 유의적으로 감소하지 않았다. 그러나, 화합물 1 단독 또는 TRAIL과 조합 처리시, 항-세포사멸 분자들(FLIPS, Bcl-2, Bcl-xL, cIAP-1, cIAP-2, survivin 및 XIAP)의 발현을 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다.
이로써, 화합물 1은 1) 죽음 수용체(DR5)의 발현을 상향 조절하고, JNK 및 ERK의 인산화를 촉진하면서 동시에 2) 항-세포사멸 분자들의 발현을 효과적으로 억제하여 TRAIL 매개 세포사멸을 효과적으로 유도시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, TRAIL 만을 처리한 경우에 비하여 세포사멸 경로에 관련한 인자(죽음 수용체 및 인산화된 c-Jun과 ERK)의 발현은 증가시켰으며, 항-세포사멸 분자들의 발현은 효과적으로 억제하였으므로, TRAIL 내성암의 감수성을 증진시켜 항암감작제로서 유용하게 사용될 수 있는 것을 확인하였다.
또한, 도 7의 A에 나타나듯이 아무것도 처리하지 않은 경우 또는 TRAIL 만을 단독으로 처리한 경우에는 세포사멸 경로와 관계된 죽음 수용체(Death Receptor 5, DR5) 및 CHOP(C/EBP-homologous 단백질)의 발현이 거의 증가하지 않았으며, TRAIL 저항성을 증가시키는 항-세포자멸 분자들의 발현이 거의 억제되지 않았다. 그러나, 화합물 2는 단독 또는 TRAIL과 조합 처리시, DR5 및 CHOP(C/EBP-homologous 단백질)의 발현이 효과적으로 증가하였으며, 동시에 항-세포자멸 분자들(survivin 및 XIAP)의 발현은 현저하게 감소하였다. 또한, 도 7의 B에 나타나듯이, 화합물 2는 단독 또는 TRAIL과 조합 처리시 c-Jun의 인산화를 유도하였으며, Akt의 인산화는 현저하게 억제시켰다.
이로써, 화합물 2가 1) TRAIL의 감수성을 증가시키는 DR5와 CHOP을 상향 조절하는 동시에, 2) TRAIL의 감수성을 감소시키는 다양한 항-세포사멸 분자들(IAPs, cIAPs, survivin 및 XIAP)은 하향 조절시켜 TRAIL 매개 세포사멸을 효과적으로 유도시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, TRAIL 만을 처리한 경우에 비하여 세포사멸 경로에 관련한 인자(CHOP 및 인산화된 c-Jun과 Akt)의 발현은 증가시켰으며, 항-세포사멸 분자들의 발현은 효과적으로 억제하였으므로, TRAIL 내성암의 감수성을 증진시켜 항암감작제로서 유용하게 사용될 수 있는 것을 확인하였다.
실시예 8: 역전사 - PCR 분석
총 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 클로로포름 추출액으로 분리하였다. RNA 수율 및 순도는 A260/A280을 사용하여 측정하였다. 첫 스트랜드 cDNA는 Omniscript Reverse Transcriptase (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 총 RNA 1㎍과 올리고(dT18) 프라이머 1μM으로 합성하였다. Taq PCR Mster Mix kit (Qiagen)을 사용하고 이어서, PCR은 0.5㎕의 첫-스트랜드 cDNA 및 20pmol의 프라이머와 함께 수행하였다. PCR은 94℃에서 3분 초기 변성, 94℃에서 40초, 53℃에서 40초 및 72℃에서 1분으로 구성된 3-스텝 사이클링(30 사이클), 72℃에서 10분간 최종 extension으로 진행하였다. PCR 산물은 1.2% 아가로스겔에서 전개시켰고, 에티디움 브로마이드로 염색하고, 도트 프린트 이미징 시스템(Vilber Lourmat, Germany)로 사진 찍었다. GAPDH를 대조군으로 사용하였으며, 사용한 PCR 프라이머는 하기 표 2와 같다. 결과는 도 8에 나타내었다.
Forward Reverse
DR5 5'-AGA GGG ATT GTG TCC ACC TG-3' 5'-AAT CAC CGA CCT TGA CCA TC-3'
GADPH 5'-GTC AGT GGT GGA CCT GAC CT-3' 5'-AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG-3'
그 결과, 도 8에 나타나듯이 실시예 7의 웨스턴 블롯 시험 결과와 마찬가지로 DR5의 mRNA 수준 분석에서도 화합물 1 단독 또는 TRAIL과 조합 처리시 모두, 동일하게 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9: DR5 -발현 세포 분석
화합물 1이 DR5를 상향 조절하는 경로가 JNK-c-Jun 및/또는 MEK-ERK 활성화를 통한 것인지를 확인하기 위하여 JNK 저해제 및 ERK 저해제를 투여하여 약리적 저해 시험을 수행하였다.
H1299 세포(2.8×105 세포/웰)을 SP600125(10μM, JNK 저해제) 또는 PD98059(20μM, ERK 저해제)와 함께 1시간 동안 전-처리하였다. 그 후, 화합물 1 또는 2 단독, 또는 화합물 1 또는 2와 TRAIL을 조합 처리하고 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포들을 수확하고, 0.5% FBS를 함유한 PBS로 세척하고 피코에리드린(phycoerythrin, PE)-컨쥬게이티드 항-인간 DR5로 1시간 동안 4℃에서 염색하였다. 그리고 DR5 양성인 세포들을 유동세포 계수법으로 분석하였다. 또한, DR5의 단백질 수치는 웨스턴 블롯 분석으로 분석하여 도 9에 나타내었다. 대조군으로 PE-컨쥬게이티드 IgG를 사용하였다.
그 결과, 도 9의 A에 나타나듯이, SP600125(JNK 저해제, 35.1%) 또는 PD98059(ERK 저해제, 48.0%)를 처리한 경우, 화합물 1을 처리한 경우(52.7%)에 비하여 사멸한 세포 수가 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 도 9의 B에 나타나듯이, JNK 또는 ERK 저해제를 처리한 경우, c-Jun 및 ERK의 인산화가 감소하는 것을 확인하였다. 이로써, 화합물 1은 DR의 발현을 JNK 및 ERK 경로를 통하여 상향 조절하는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 9의 C에 나타나듯이, 화합물 2와 SP600125(JNK 저해제)를 동시에 투여한 경우에 비하여 화합물 2, SP600125 및 TRAIL을 모두 투여한 경우, c-Jun a및 CHOP의 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이로써, 화합물 2도 DR의 발현을 JNK 경로를 통하여 상향 조절하는 것을 확인하였다.
나아가, 상기 JNK 또는 ERK 신호 전달 경로를 통한 DRs의 발현 증가가 최종적으로 세포 사멸에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, SP600125 및 PD98059를 각각 투여하여 세포 생존율을 측정하였다. 구체적으로, H1299 세포(2.8×105 세포/웰)을 SP600125(10μM) 또는 PD98059(20μM)와 함께 1시간 동안 전-처리하고, 화합물 1 또는 화합물 1과 TRAIL을 조합하여 48시간 동안 처리하고 CCK-8 시험으로 세포 생존력을 측정하고 그 결과를 도 10에 나타내었다.
그 결과, 도 10에 나타나듯이 화합물 1은 SP600125를 이용하여 JNK-c-Jun 신호 전달을 저해하거나 또는 PD98059를 이용하여 MEK-ERK의 신호 전달을 저해하는 경우, 세포 생존력이 증가하는 것을 확인하였다. 이 때, SP600125의 JNK-c-Jun 신호 전달의 저해는 PD98059의 MEK-ERK 신호 전달의 저해보다 훨씬 강력하게 DR5의 발현 유도를 저해하였다.
실시예 10: ROS 발생 분석
반응성 산소종(ROS)의 발생은 DR5의 발현을 유도하는데 필요한 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명에 따른 화합물 1이 ROS의 생성을 촉진하는지 확인하고자, 과산화수소 처리에 따른 유동세포 분석을 수행하였다. 구체적으로 세포(2.8×105 세포/웰)를 6-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 후, 화합물 1과 3시간 동안 배양하였다. 그리고, 5μM의 CM-H2DCFDA로 15분 동안 염색하였고, 유동세포를 분석하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.
또한, ROS 제거제인 항산화제를 처리하여, 이에 따른 DR5 및 c-Jun의 발현을 분석하고, 세포 생존율을 측정하였다. 구체적으로 H1299 세포(2.8×105 세포/웰)를 항산화제인 NAC 10mM과 함께 1시간 동안 전-처리하고, 화합물 1 또는 화합물 1과 TRAIL을 조합하여 48시간 동안 처리한 후, 웨스턴 블롯 시험 및 CCK-8 시험을 수행하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
그 결과, 도 11에 나타나듯이 화합물 1의 농도 의존적으로 ROS의 생성이 증가하였다. 또한, 도 12의 A에 나타나듯이 화합물 1 및 TRAIL만을 처리한 경우보다 화합물 1, TRAIL 및 NAC를 처리한 경우, c-Jun의 인산화 및 DR5의 발현이 감소하였으며, 도 12의 B에 나타나듯이 세포 생존율이 증가하는 것을 확인하였다. 이로써, 페닐우레아 유도체가 DR5의 발현을 상향 조절하는 ROS의 생성을 촉진시키는 것을 확인하였다.
실시예 11: 통계학적 분석
유의성은 Student's t test로 확인하였고, 편차는 P<0.05 일 때, 유의성이 있음을 의미한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 페닐우레아 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항암감작제:
    [화학식 1]
    Figure 112012053978997-pat00062

    상기 식에서,
    X는 O 또는 S이고,
    R1은 비치환 또는 R2로 n개 치환된, 옥사졸일, 피리미디닐, 피라졸일, 페닐, 티아디아졸일, 티아졸일 또는
    Figure 112012053978997-pat00063
    이고,
    상기 n은 1 내지 3 중 어느 하나의 정수이고,
    R2는 아미노, 니트로, 비치환 또는 할로겐으로 치환된 C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, 페닐 또는 티오페닐이고
    Y는 비치환 또는 R3로 m개 치환된 페닐,
    Figure 112012053978997-pat00064
    ,
    Figure 112012053978997-pat00065
    또는
    Figure 112012053978997-pat00066
    이고,
    상기 m은 1 내지 3 중 어느 하나의 정수이고,
    R3는 할로겐, -OH, -NO2, 비치환 또는 할로겐으로 치환된 C1-C4 알킬, 비치환 또는 할로겐으로 치환된 C1-C4 알콕시 또는 할로겐으로 치환된 C1-C4 알킬티오이다.
  2. 제1항에 있어서, R1은
    Figure 112012053978997-pat00067
    ,
    Figure 112012053978997-pat00068
    ,
    Figure 112012053978997-pat00069
    ,
    Figure 112012053978997-pat00070
    ,
    Figure 112012053978997-pat00071
    ,
    Figure 112012053978997-pat00072
    ,
    Figure 112012053978997-pat00073
    ,
    Figure 112012053978997-pat00074
    ,
    Figure 112012053978997-pat00075
    ,
    Figure 112012053978997-pat00076
    ,
    Figure 112012053978997-pat00077
    ,
    Figure 112012053978997-pat00078
    또는
    Figure 112012053978997-pat00079
    인 항암감작제.
  3. 제1항에 있어서, Y는 비치환 또는 OH, F, Cl, Br, I, CH3, CF3, OCF3, SCF3 및 NO2 중 어느 하나 이상으로 치환된 페닐인 항암감작제.
  4. 제1항에 있어서, R1은
    Figure 112012053978997-pat00080
    ,
    Figure 112012053978997-pat00081
    또는
    Figure 112012053978997-pat00082
    이고, Y는 비치환 또는 OH, F, Cl, Br, I, CH3, CF3, OCF3, SCF3 및 NO2 중 어느 하나 이상으로 치환된 페닐인 항암감작제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 페닐우레아 유도체는
    1) 1-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-3-(4-(5-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
    2) 1-(5-클로로-2-메틸페닐)-3-(4-(5-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
    3) 1-(4-(2-메틸-5-페닐옥사졸-4-일)페닐)-3-(3-(트리플루오로메틸)페닐)티오우레아;
    4) 1-(4-(2-아미노피리딘-4-일)페닐)-3-페닐우레아;
    5) 1-(4-(2-아미노피리딘-4-일)페닐)-3-(3-클로로페닐)우레아;
    6) 1-(4-(2-아미노피리딘-4-일)페닐)-3-(3-(트리플루오로메톡시)페닐)우레아;
    7) 1-(4-(3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)-3-(4-(트리플루오로메틸티오)페닐)우레아;
    8) 1-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
    9) 1-(3-클로로페닐)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
    10) 1-(4-(3,5-비스(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)-3-(3,5-디클로로페닐)우레아;
    11) 1-(4-(3,5-비스(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)-3-(2,4-디플루오로페닐)우레아;
    12) 1-(2,4-디플루오로페닐)-3-(4-(4,6-디메톡시피리미딘-2-일)페닐)우레아;
    13) 1-페닐-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
    14) 1-(3,5-디메틸페닐)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
    15) 1-(4-플루오로페닐)-3-(4-(5-(티오펜-2-일)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
    16) 1-페닐-3-(4-(5-(티오펜-2-일)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
    17) 1-(5-메틸-3-페닐이속사졸-4-일)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
    18) 1-(3,5-디메틸페닐)-3-(4-(5-(티오펜-2-일)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
    19) 1-(2-메톡시페닐)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
    20) 1-(비페닐-4-일)-3-(4-(데크일옥시)페닐)우레아;
    21) 1-(비페닐-4-일)-3-(2-클로로-4,5-디플루오로페닐)우레아;
    22) 1-(9-옥소-9H-플로렌-2-일)-3-페닐우레아;
    23) 1-(비페닐-4-일)-3-(3-브로모페닐)티오우레아;
    24) 1-(4-아이오도페닐)-3-(4-니트로비페닐-4-일)우레아;
    25) 1-(4-메틸-2-니트로페닐)-3-(4-니트로비페닐-4-일)우레아;
    26) 1-(비페닐-4-일)-3-(3-클로로페닐)우레아;
    27) 1-(비페닐-4-일)-3-(4-브로모-2,6-디메틸페닐)티오우레아;
    28) 1-(4-니트로비페닐-4-일)-3-(4-(트리플루오로메틸)페닐)우레아;
    29) 1-(2,3-디하이드로벤조퓨란-5-일)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아;
    30) 1-(4-(1,2,3-티아디아졸-4-일)페닐)-3-(2-클로로페닐)티오우레아;
    31) 1-(4-(1,2,3-티아디아졸-4-일)페닐)-3-(4-클로로페닐)티오우레아;
    32) 1-(4-(1,2,3-티아디아졸-4-일)페닐)-3-(2-(트리플루오로메틸)페닐)티오우레아;
    33) 1-(4-메톡시페닐)-3-(4-(2-페닐티아졸-4-일)페닐)우레아;
    34) 1-페닐-3-(4-(2-페닐티아졸-4-일)페닐)우레아;
    35) 1-(4-메톡시페닐)-3-(4-(2-메틸티아졸-4-일)페닐)우레아;
    36) 1-(4-브로모-2-클로로페닐)-3-(2-니트로비페닐-4-일)티오우레아;
    37) 1-(4-플루오로페닐)-3-(2'-니트로비페닐-4-일)우레아;
    38) 1-(4-(4,6-디옥소-1,3b,4,6,6a,6b-헥사하이드로사이클로부타[3,4]사이클로프로파[4,5]사이클로펜타[1,2-c]피롤-5(3aH)-일)페닐)-3-(2-하이드록시페닐)우레아
    39) 1-(2-클로로페닐)-3-(4-니트로비페닐-4-일)우레아; 및
    40) 1-(4-(2-메틸티아졸-4-일)페닐)-3-페닐티오우레아 중 어느 하나인 항암감작제.
  6. 제1항에 있어서, 상기 페닐우레아 유도체는
    1-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-3-(4-(5-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아; 또는
    1-(5-클로로-2-메틸페닐)-3-(4-(5-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)페닐)우레아인 항암감작제.
  7. 제1항에 있어서, 상기 암은 TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)에 내성을 나타내는 암인 항암감작제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 암은 TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)에 내성을 나타내는, 폐암, 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 항암감작제.
  9. 제1항에 있어서, 상기 페닐우레아 유도체는 TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand) 매개 세포사멸을 감작하는 것인 항암감작제.
  10. 제1항에 있어서, 상기 페닐우레아 유도체는 사멸 수용체(Death Receptor, DR)의 발현을 촉진하거나, 또는 항-세포사멸 분자의 발현을 저해하는 것인 항암감작제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 항암감작제와 하나 이상의 항암제를 포함하는 항암조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항암제는 TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)인 항암조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 암은 TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)에 내성을 나타내는 암인 항암조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 암은 TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)에 내성을 나타내는, 폐암, 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 항암조성물.
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