KR101332243B1 - 생체리듬 조절용 조성물, 생체 리듬 장애 진단용 조성물 및 진단 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 척추동물에서 일주기적 조절 (Circadian regulation)에 관련되는 NQ 펩타이드, C12orf39 유전자, NQ 펩타이드 cDNA 등을 주요성분으로 포함하는 생체 리듬 조절용 조성물, 생체리듬 장애 진단용 조성물 및 진단 키트에 관한 것이다.

Description

생체리듬 조절용 조성물, 생체 리듬 장애 진단용 조성물 및 진단 키트{Composition for Controlling Ciradian Rhythm, and Composition and Kit for Diagnosing Ciradian Rhythm Disorders}

본 발명은 척추동물에서 일주기적 조절 (Circadian regulation)에 관련되는 NQ 펩타이드, C12orf39 유전자, NQ 펩타이드 cDNA 등을 주요성분으로 포함하는 생체 리듬 조절용 조성물, 생체리듬 장애 진단용 조성물 및 진단 키트에 관한 것이다.

태고 이래로 지구상에 존재하는 모든 생명체들은 24시간을 하루로 낮과 밤이 거듭되는 지구 자전의 영향을 받음으로써 지속적이고 반복적이며 주기적으로 반복적인 외부환경의 간섭을 받아왔다.

한편, 여러 외부 신호들 (external cue) 중 빛, 온도, 습도, 진동, 소리 등은 생체에 내재적으로 존재하는 시간장치인 생체시계 (Biological clock)를 외부환경과 동조화 (synchronize)시킬 수 있는 핵심 요소이기 때문에 이들의 인공적 혹은 자연적 발생과 같은 발생근원적 의미와는 관계없는 자이트게버 (Zeitgebers, zeit=time, gebers=giver)라는 개념이 성립되었다[Aschoff J, Handbook of Behavioral Neurobiology. New York, Plenum Press, 1981].

또한 실제로 자이트게버가 배제된 환경조건하에서도 생체시계는 대략 (circa) 하루 (dies)의 주기를 보이는 자유유형 (free-running)의 리듬성 (rhythmicity)을 보이는데[Sharma and Chandrashekaran, Current Science, 2005], 이는 내재적 생체시계 (endogenous biological clock)가 예측 가능한 미래에 대비하여 적절한 반응 (optimal responses)을 할 수 있도록 유도함으로써 숙주 자신에게 선택적 혹은 생존적 이점 (Selective or survival advantage)을 부여할 수 있기 때문이다[Plamen D. Penev et al, Am.J.Physiol. Heart. Circ. Physiol., 1998; Diego A Golombek and Ruth E. Rosenstein, Physiol. Rev., 2010].

한편 빛에 의한 생체시계의 동조화 기작 (synchronizing mechanism)은 해부학적, 분자적, 신호전달 모델로 설명된다.

빛 신호 (photic cue)의 경우 생명체의 눈이 그 수용기관이며 번역된 전기적 신호는 망막시상하부관 (retino-hypothalamic tract, RHT)을 통한 후 시각교차구역 (optic chiasm, OX)을 지나 시상하부 앞쪽구역 (anterior hypothalamic area)에 위치한 시각교차위핵 (suprachiasmatic nucleus, SCN)으로 전달된다[David M. Berson et al., Science, 2002].

SCN은 핵심부 (core)와 주변부 (shell)로 나뉘며, 핵심부에 있는 중심 길잡이 뉴런 (central pacemaker neuron)은 SCN에서 받아들여진 신호와의 상호작용을 통해 유기체내에 내재된 리듬 (internal rhythmicity)을 외부에 맞게 조절하는 기능을 한다[Ralph MR et al., Science, 1990].

이러한 시간조절계 (time-keeping system)에서 최초 개시자가 빛과 같은 외부정보라면 시각교차위핵 내에 존재하는 bmal1과 clock은 한 개체내의 생체시간을 외부 정보와 동조화 시키는 핵심 유전자이다. 상기 두 유전자는 발현 이후 이종이합화 (heterodimer)의 형태를 이루며 Per, Cry, Ppar, Ror, Rev - Erb와 같은 시간관련 유전자 (clock-related gene)들의 프로모터 (promoter)인 E-BOX에 결합함으로써 유전자 발현 (gene expression)을 유도한다.

한편 발현된 시간관련 유전자들은 역으로 bmal1의 전사를 억제하거나 CLOCK:BMAL1 이종이합화를 제지시킴으로써 스스로의 전사가 더 이상 이루어지지 않게 하는 음성되먹임고리 (negative-feedback loop)를 가진다[Wangjie Yu, Biochem. Biophys.Res.Commun., 2002].

시각교차위핵에는 다양한 펩타이드성 뉴런 (peptidergic neuron)을 비롯하여 아미노산/아민계 신경들뿐만 아니라 이를 지지하거나 자체적으로 독립적인 기능을 수행하는 별아교세포 (astrocyte)등과 같은 다양한 종류의 세포들로 복잡한 네트워크가 형성되어 있다. 혈관작용성장펩타이드 (Vasoactive intestinal polypeptide, VIP), 아르지닌바소프레신 (Arginine-vasopressin, AVP), 감마아미노부티르산 (γ-aminobutyric acid, GABA), Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP), 세로토닌 (5-HT, Serotonin), 글루탐산염 (Glutamate), Neuropeptide Y (NPY), 가스트린유리펩타이드 (Gastrinreleasing peptide, GRP)들이 시각교차위핵에서 분비되는 주요 신경펩타이드 (neuropeptide) 혹은 신경전달물질 (neurotransmitter)로 알려져 있다[Watts and Swanson, J.Comp.Neurol., 1987].

이들 생리활성 펩타이드는 일주기적 리듬에 중요한 섭식, 재조정 (reset), 항상성 유지에 필요한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있으며, 흥미롭게도 최근에는 LC-FTMS/MS 분석을 통해 SCN에 존재하는 내생적 뉴로펩타이드로서 cerebellin-1, neuroendocrine protein 7B2, proenkephalin B, secretogranin 1, secretogranin 3, tachykinin 3, acyl-CoA-binding protein, brain-specific polypeptide PEP-19, PEBP-1 등이 일주기적 조절과 관련되어 있을 새로운 물질들로 밝혀졌다[Lee et al ., Mol.Cell.Proteomics, 2010].

이와 같은 결과는 여전히 일주기적 조절과 관련된 기능을 알지 못하는 신규 뉴로펩타이드들이 생체 내에 존재 할 가능성을 강력히 시사하고 있다.

1990년에 시작된 인간 유전체 사업 (human genome project)은 인간에서 실제로 단백질을 암호화 하는 수많은 유전자를 발굴하는데 기여하였다[National human genome institute].

또한 2005년에는 단세포종 (Schizosaccharomycespombe , Saccharomycescerevisiae)에서부터 식물 (Arabidopsisthaliana, Oryzasativa), 곤충 (Drosophila melanogaster, Anophelesgambiae), 선형동물 (Caenorhabditis elegans , Caenorhabditisbriggsae), 척색동물 (Cionaintestinalis , Cionasavignyi), 경골어류 (Takifugurubripes , Danio rerio), 그리고 생쥐 (Mus musculus)에 이르기까지 막대한 양의 유전체-데이터베이스 (genome-database)가 대부분 확립되었다[Robert Fredriksson, Mol.Pharmacol., 2005].

그 결과 서로 다른 종들 사이에서 동일한 단백질을 암호화하는 상동 유전자를 찾을 수 있게 되었고, 이들의 단백질을 서열화하는 아미노산을 비교/분석할 수 있게 됨에 따라 진화적으로 보존된 특정 아미노산의 생물학적 중요성을 추측할 수 있게 되었다. 뿐만 아니라 이러한 종간 분석법을 통해, 현재까지 밝혀지지 않았던 신규 펩타이드의 생리활성부위를 비교적 정확하게 예측할 수 있게 되었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명의 목적은 생체리듬 조절용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 생체리듬 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 생체리듬 장애를 진단할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 생체리듬 조절 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 생체리듬 장애의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 생체리듬 장애를 동정하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, C-말단에 있는 글루타민 잔기의 말단이 아미노기인 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 C12orf39 유전자, 서열목록 제9서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NQ 펩타이드의 cDNA 또는 서열목록 제9서열의 NQ 펩타이드의 cDNA에서 서열 106번부터 147번 또는 150번까지의 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 생체리듬 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 생체리듬 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다:

(a) 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, C-말단에 있는 글루타민 잔기의 말단이 아미노기인 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 C12orf39 유전자, 서열목록 제9서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NQ 펩타이드의 cDNA 또는 서열목록 제9서열의 NQ 펩타이드의 cDNA에서 서열 106번부터 147번 또는 150번까지의 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열의 약제학적 유효량; 및

(b) 약제학적으로 허용되는 담체.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, C-말단에 있는 글루타민 잔기의 말단이 아미노기인 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, (ii) 서열목록 제6서열의 펩타이드 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, (iii) 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 C12orf39 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브 또는 (iv) 서열목록 제9서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NQ 펩타이드의 cDNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 생체리듬 장애 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, C-말단에 있는 글루타민 잔기의 말단이 아미노기인 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 C12orf39 유전자, 서열목록 제9서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NQ 펩타이드의 cDNA 또는 서열목록 제9서열의 NQ 펩타이드의 cDNA에서 서열 106번부터 147번 또는 150번까지의 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물을 대상(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 생체리듬 조절 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, C-말단에 있는 글루타민 잔기의 말단이 아미노기인 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 C12orf39 유전자, 서열목록 제9서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NQ 펩타이드의 cDNA 또는 서열목록 제9서열의 NQ 펩타이드의 cDNA에서 서열 106번부터 147번 또는 150번까지의 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 대상(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 생체리듬 장애의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 생체리듬 장애 동정 방법을 제공한다:

(a) (i) 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, C-말단에 있는 글루타민 잔기의 말단이 아미노기인 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, (ii) 서열목록 제6서열의 펩타이드 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, (iii) 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 C12orf39 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브 또는 (iv) 서열목록 제9서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NQ 펩타이드의 cDNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 생물학적 시료에 접촉(contacting)시키는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)의 결과물에서 항원-항체 반응 또는 혼성화 반응의 발생여부를 분석하는 단계.

본 발명에 따른 생체리듬 조절용 조성물은 생체주기를 조절할 수 있으므로, 피로와 무기력증 (jet lag syndrome), 계절정동장애 (seasonal affective disorder), 기분장애 (mood disorder) 뿐만 아니라 이와 유사한 생체주기 장애에 의해 발생될 수 있는 장애의 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 또한 생체주기와 관련된 장애 진단용 조성물로 사용 될 수 있으며, 이를 이용하여 다른 차원의 신약 개발의 재료로 사용될 수도 있다.

도 1은 다양한 척추동물에서 발견된 C12orf39 유전자의 전사 이후 번역된 구조로서 NQ 펩타이드의 전체 아미노산 구조뿐 아니라 번역 후 공정과정에서 실제의 성숙된 NQ 펩타이드의 구조가 종간 매우 보존적임을 나타내는 도이다.
도 2는 척추동물의 대표적인 동물들에서 NQ 펩타이드를 암호화하는 C12orf39 유전자의 유전체 내 위치를 나타내는 도이며, 특히 이들에서 C12orf39 유전자를 포함하는 유전자 군은 매우 잘 보존되어 있음을 보인다.
도 3은 비교적 하등한 척추동물군인 일부의 경골어류와 양서류에서 NQ 펩타이드의 상동체가 존재함을 밝힌 도로써, 본 펩타이드가 진화적으로 잘 보존되었을 뿐 아니라 기능적으로 본 기능 이외에 다른 기능으로 분화되었을 가능성을 보여준다.
도 4는 NQ 펩타이드의 세포 내 발현 후 성숙공정을 나타내는 도로써, NQ 펩타이드는 전사 발현 후 공정단계를 경험할 것으로 예측된다.
도 5는 생쥐 뇌 부위 중 시각교차위핵과 고삐핵, 그리고 눈의 부위 중 망막에서 C12orf39 유전자의 mRNA가 검출됨을 확인한 도로써, NQ 펩타이드가 특정구역에서 발현하며, 생체시계와 관련된 기능을 할 것임을 보여준다.
도 6는 생쥐의 뇌 부위 중 시각교차위핵과 고삐핵, 그리고 눈의 부위 중 망막과 망막시상하부관에서 NQ 펩타이드가 검출됨을 확인한 도로써, NQ 펩타이드가 특정구역에서 발현하며, 생체시계와 관련된 기능을 할 것임을 보여준다.
도 7a는 생쥐 뇌에 존재하는 시각교차위핵의 관상절단전략을 나타내는 도이다.
도 7b는 생쥐의 뇌 조직을 이용하여 시각교차위핵에서 NQ 펩타이드의 특정 발현 부위를 검증한 도로써, NQ 펩타이드는 배측부 (ventrolateral)와 앞-뒤축 (rostrocaudal axis)상에서 비교적 중간부 (medial part)에 강하게 검출됨을 보인다.
도 8은 NQ 펩타이드의 발현이 시각교차위핵의 별아교세포와 망막의 망막신경절세포에서 특이적으로 발현함을 나타낸 도이다.
도 9는 시각교차위핵에서 시간유전자 혹은 시간관련 유전자인 (clock, clock-related gene) bmal1 , per1 과 NQ 펩타이드의 일주기적 전령 RNA 발현 양상을 보여준다.
도 10은 시각교차위핵에서 NQ 펩타이드의 시간대별 발현 양을 나타낸 도이다.
도 11은 ¹²⁵I-NQ 펩타이드의 표준곡선과 이를 이용한 망막에서의 빛 의존적인 NQ 펩타이드 발현 양을 나타낸 도로써, 강력한 외부신호인 빛에 의해 그 발현이 직접 조절됨을 보여준다.
도 12는 Per2의 일주기적 발현이 NQ 펩타이드의 처리에 의해 변화됨을 검증한 도로써, NQ 펩타이드가 Per2의 발현 주기를 직접적으로 조절함을 보인다.
도 13은 Per2의 발현에 있어서 그의 일주기적 위상에 따라 NQ 펩타이드의 생리적 활성 효과가 다름을 나타내는 도로써, NQ 펩타이드의 최고 작용 시간대는 고점 이후 10시간째 처리할 때임을 보인다.
도 14는 농도 의존적인 NQ 펩타이드의 처리에 따라 변화되는 Per2의 발현주기를 나타낸 도로써, Per2 주기변화에 영향을 미치는 NQ 펩타이드의 최고 농도는 200 nM임을 보인다.
도 15는 자연적으로 존재하는 NQ 펩타이드의 형태와 인위적으로 변형시킨 NQ 펩타이드 변이체 (mutant)를 이용하여 이들의 생리적 활성을 관찰한 도이다. 서열번호 2와 3으로 표시되는 포유류의 두 가지 NQ 펩타이드 형태는 공히Per2의 주기를 변화시키지만, 두 번째 Trp와 열한 번째 Lys 각각의 아미노산을 D-type의 광학 이성질체로 치환하거나 서열번호 5로 표시되는 카르복실기 말단을 제거한 경우에 있어서 그들의 활성은 현저히 떨어짐을 보인다.

이하 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 생체리듬 조절용 조성물 및 생체리듬 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 조성물은 “생체리듬 위상-전이 효과(circadian rhythm phase-shifting effect)를 유도하기 위한 조성물” 또는 “생체리듬을 정상화(normalizing) 하기 위한 조성물”로 표현될 수도 있다.

본 발명에서 지칭하는 NQ 펩타이드에 대한 명명은 본 펩타이드가 신규 펩타이드이기 때문에 이 분야에서 통상의 지식을 가진 사람에 의해 다르게 명명 될 수도 있다. 따라서 본 발명은 "NQ 펩타이드"라는 명명법에 한정되지 않으며 서열목록 제1서열, 제2서열 및 제3서열의 펩타이드 서열 혹은 서열목록 제4서열의 유전자 또는 서열목록 제9서열로 표시된 cDNA를 이용한 일주기적 리듬과 관련된 용도의 사용을 모두 포함한다.

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지면서 상기 아미노산 서열 중 글루타민의 말단에 NH₂를 갖는 펩타이드, 서열번호 3으로 표시되는 C12orf39 유전자 및 서열번호 8로 표시되는 NQ 펩타이드 cDNA를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 물질을 포함하는 생체리듬 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 발명자들은 유전자 선별 작업을 통하여 발견한 본 발명에 따른 펩타이드의 아미노기 말단(N-terminus)이 아스파라진 (Asn)이고, 카르복실기 말단이 글루타민 (Gln)인 것을 확인하여, 본 발명에 따른 서열목록 제1서열, 제2서열 및 제3서열로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 "NQ 펩타이드" 라고 명명하였다.

서열목록 제1서열의 펩타이드에서, 카르복실기 말단 (C-terminus)의 글라이신 (Gly)은 일반적인 분비 펩타이드 (secreted peptide)의 특성과 같이 펩타이드글라이신-알파-히드록시화 모노 옥시제나제 (peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase, PHM)에 의한 촉매화 작용으로 알파-아미드화 (α-amidation)가 됨으로써 절단되어[Betty A. Eipper and Richard E. Mains, Ann.Rev.Physiol., 1988], 글루타민의 말단이 NH₂를 갖게 된다.

따라서 두번째 NQ 펩타이드는 아래와 같은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖게 되며, 카르복실기 말단의 글루타민이 말단에 NH₂를 갖는다.

그 결과, 생체 내 아미노펩티드분해효소(aminopeptidase)나 합성효소 (synthetase)등의 공격을 받지 않기 때문에 본 펩타이드의 활성이 증대되는데 크게 기여할 것으로 추정된다.

한편, 카르복실기 말단의 글루타민 다음에 오는 히스티딘 또한 NQ 펩타이드의 활성을 유도하므로 (도 15 참조) 서열목록 제3서열의 경우와 같이 서열목록 제1서열의 경우 뒤에 글라이신과 히스티딘이 연속하여 존재하는 경우도 NQ 펩타이드의 범주에 포함된다. 이는 흰쥐에서 발현될 것으로 예측되는 NQ 펩타이드의 형태에 해당된다.

본 발명에 따른 서열목록 제1서열 내지 제3서열로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 서열번호 4로 표시되는 C12orf39 유전자에서 유래한다.

본 발명의 발명자들은 생물정보학적 접근 모델을 통하여 생체리듬 조절용 조성물의 유전자 선별 작업을 실시하였다. 현재까지 알려진 인간 유전자 약 50,000여종의 open reading frame (ORF) 중에서 세포에서 분비될 가능성을 지닌 유전자 (secretome) 약 2,000여종을 선별하였으며, 이중 기능이 알려져 있지 않은 새로운 펩타이드를 암호화하는 유전자 40여종을 대상으로 연구한 결과, 생체리듬 조절용 조성물을 암호화하는 유전자로서 C12orf39를 발굴하였다.

C12orf39 유전자로부터 발현되는, 본 발명에 따른 생체리듬 조절용 조성물 전구체의 아미노산은 시그날펩타이드를 포함한 성숙한 NQ 펩타이드의 아미노산 서열을 포함하고 있으며, 상기 펩타이드를 암호화 하는 아미노산의 서열은 종간 매우 잘 보존되어 있다 (도 1 참조).

또한 NQ 펩타이드를 암호화하는 C12orf39 유전자는 대표적인 척추동물들에서 공히 동일한 유전체군을 형성하기 있기 때문에 본 펩타이드가 생체내 중요기능을 담당할 가능성이 매우 높다 (도 2 참조).

진화적으로 NQ펩타이드의 또 다른 분기형태인 유사체 (paralog)가 경골어류의 일부와 양서류와 같은 비교적 하등한 척추동물군에서 발굴되었다(도 3 참조). 이는 NQ 펩타이드의 진화적 보존성을 보여줌과 동시에 생체시계와 관련된 본 기능을 더욱 강력히 뒷받침하거나 새로운 기능을 할 가능성을 보여준다.

본 발명에 있어서 서열목록 제4서열의 유전자는 펩타이드로 번역되어 도 1의 아미노산 구조를 이루며 발현 후 세포내 공정과정에서 Asn으로부터 Gln 혹은 Asn으로부터 His까지의 성숙한 형태로 변환된다. 이때 Asn으로부터 Gln까지의 아미노산 서열을 갖는 서열목록 제2서열의 경우에는 카르복실기 말단에 NH₂기를 갖게 된다 (도 4 참조).

본 발명의 서열목록 제9서열로 표시되는 NQ 펩타이드 cDNA는 서열목록 제7서열 및 제8서열로 표시되는 올리고뉴클레오타이드 서열을 가진 프라이머 세트를 이용하여 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 쉽게 제조할 수 있으며, 그 구체적인 방법은 실시예 5에 기재되어 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한 구현예에서는, NQ 펩타이드가 생체리듬을 관장하는 혈관작용성장펩타이드 뉴런이 다량으로 존재하는 핵심부 또는 시각교차위핵의 앞-뒤 축 상에서 중간구역 (medial part) 및 배부위(ventral)에서 특히 강하게 존재하는 것을 증명하였고 (도 6 및 7b 참조), 본 발명의 다른 한 구현예에서는, NQ 펩타이드가 생쥐 뇌의 시각교차위핵에서 존재하는 별아교세포에 존재하는 것을 동정하였으며 나아가서는 시각교차위핵으로 직접적인 신경전달을 담당하는 기관인 망막에서 망막신경절세포 (retinal ganglion cell, RGC)에 존재하는 것을 증명하였다 (도 8 참조).

본 발명의 다른 한 구현예에서는, 시간유전자 혹은 시간관련유전자의 일주기적 mRNA의 양적 변화와 함께 NQ 펩타이드의 mRNA가 24시간을 주기로 진동하는 그의 양적 발현 변화를 증명하였다 (도 9 참조).

전술한 NQ 펩타이드의 mRNA의 발현 변화는 본 발명의 다른 한 구현예에서 보인 바와 같이 시각교차위핵내의 24시간 주기의 주기성을 갖는 단백질의 양적인 발현변화를 유도하는 것으로 나타났다 (도 10 참조).

시각교차위핵으로 직접적인 전기/화학적 신호를 보내는 것으로 잘 알려진 망막에서 분비되는 NQ 펩타이드의 양을 정량적으로 분석하였다. 이를 위해 일정기간 암흑속에서 훈련된 쥐에 빛의 조사시간을 달리하여 처리하였다. 그 결과 Circadian Time(CT) 23 시기에서는 CT14 시기보다 빛에 대한 NQ 펩타이드의 분비가 현저하게 증가됨을 보였다 (도 11 참조). 이는 NQ 펩타이드가 빛-의존적으로 망막에서 시각교차위핵으로 분비됨을 증명하는 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명의 또 다른 한 구현예에서는, 생쥐의 뇌조직절편에 시간대에 따라 인공적으로 합성한 NQ 펩타이드를 Per2 주기에 있어서 고점과 저점시기에 처리한 결과 고점시기에 처리한 경우는 그 주기 변화가 미미하거나 거의 없었지만, 저점시기에 처리했을 때에는 자유-유형주기 (free-running period)가 24.27시간에서 22.87시간으로 약 2.80시간 가량 전진 (advanced)됨을 보였다 (도 12 참조). 따라서 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자 및 cDNA 등을 이용하여 생체주기를 조절 할 수 있음을 알 수 있다.

Per2의 주기적 발현시기에 있어서 NQ 펩타이드에 의한 일주기전진(phase-advance) 효과를 검증하기 위해, Per2 주기의 각 단계에서 NQ 펩타이드를 처리하였다 (도 13 참조). 그 결과 Per2의 고점시기 이후부터 저점시기에 이르는 단계, 즉 저점에 이르기 전단계인 고점 이후 2시간과 고점 이후 6시간째 처리된 NQ 펩타이드는 다음에 오는 고점시기를 전진(advance) 혹은 후퇴(delay)시키는 일주기변화를 보이지 아니하였으나, 저점근방으로부터 다음의 고점에 이르는 단계 즉, 고점 이후 10시간, 고점 이후 14시간, 고점 이후 20시간째 처리된 NQ 펩타이드는 다음의 고점시기를 유의하게 전진시키는 것으로 관찰되었다. 이들 중 고점 이후 10시간째 처리된 NQ 펩타이드의 효과가 가장 큰 것으로 나타났다. 한편 고점 이후 22시간째 처리된 NQ 펩타이드는다음의 고점을 약간 후퇴시켰으나 그 효과는 미미한 것으로 관찰되었다. 이는 NQ 펩타이드가 시간관련 단백질인 Per2의 일주기적 발현에 있어서 기능적으로 밀접히 관여되어 있음을 보여주는 명확한 증거이다.

본 발명의 다른 한 구현예에서는 다양한 농도로 처리되는 NQ 펩타이드에 의해 변화되는 Per2의 일주기적 전진효과를 검증하였다 (도 14 참조). Per2 일주기의 저점시기에 처리된 NQ 펩타이드는농도의존적으로 일주기적 전진효과를 보였고, 이 때 가장 큰 효과를 보이는 NQ 펩타이드의 적정 농도는 200 nM로 나타났다.

서열목록 제1서열과 제2서열로 표시되는 성숙한 NQ 펩타이드의 형태로부터 특정 아미노산이 기여하는 NQ 펩타이드의 기능적 역할을 검증하기 위해, 이를 대상으로 한 몇 가지 돌연변이 형태를 인공적으로 합성하여 각각의 경우에서 이들의 일주기적 주기변화효과를 검증하였다 (도 15 참조). 서열목록 제2서열로 표시되는 NQ 펩타이드의아미노산 구조 뒤에 아미드화가 된 형태와 서열목록 제3서열로 표시되는 흰쥐(rat) 종에서 발견되는 NQ 펩타이드의 아미노산 구조는 기능적으로 공히 Per2의 일주기적 전진효과를 보인 반면, 하기의 실시예에 기재된 NQ 펩타이드의 변이체를 처리한 경우는 Per2 단백질의 일주기적 변화에 어떠한 영향도 미치지 아니하였다. 이는 적어도 전술한 두 가지의 아미노산 즉, 서열목록 제1서열로 표시되는 NQ 펩타이드의 서열에서 두 번째 Trp과 열한 번째 Lys이 NQ 펩타이드의 기능적 역할 수행에 있어서 중요하며, 서열목록 제3서열로 표시되는 흰쥐 종의 NQ 펩타이드 형태는 서열목록 제2서열로 표시되는 아미노산 서열에서 카르복실기 말단에 존재하는 Gln 다음의 Gly 아미드화가 NQ 펩타이드의 기능적 수행에 있어서 크게 중요하지 않을 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-1000 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 생체리듬 조절용 조성물은 생체리듬 장애의 예방 및 치료에 사용할 수 있다.

상기 생체리듬 장애란, 예컨대, 시차증후군 (jet lag syndrome), 교대 근무 수면장애 (Shift Work Sleep Disorder)의 외인성 (extrinsic) 일주기수면장애, 수면위상지연증후군 (Delayed sleep phase syndrome, DSPS), 수면위상전진증후군 (Advanced sleep phase syndrome, ASPS), 비 24시간 수면-각성 증후군 (non-24-hour sleep-wake syndrome, non-24), 불규칙 수면-각성 양상 (Irregular sleep-wake pattern)의 내인성 (intrinsic) 일주기 수면장애 및 계절정동장애 (Seasonal Affective Disorder, SAD), 우울증 (depression), 조울증 (bipolar disorder)의 기분장애 (mood disorder), 및 위상 지연(phase delay) 또는 위상 전진(phase advance)에 의한 불면증을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 따른 생체리듬 조절용 조성물은 시각교차위핵 (SCN) 또는 고삐핵 (Habenula, Hb), 나아가서는 망막에서 작용할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

Ralph MR 등에 따르면, 시각교차위핵은 핵심부 (core)와 주변부 (shell)로 나뉘며, 망막으로부터 들어오는 직접적인 전기, 화학적 신호를 받아들여 유기체 내에 내재된 리듬 (internal rhythmicity)과 상호 작용을 일으킨다. 따라서 시각교차위핵은 한 개체에 있어서는 급변하는 외부환경과 생체내의 시간적 동조화를 가능케 하므로 생명체의 "생존을 위한 적응"에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 핵심부에 있는 중심 길잡이 뉴런 (central pacemaker neuron)은 이러한 외부신호가 없는 상황하에서도 유기체들 스스로 고유의 리듬성을 갖게 함으로써 일주기성을 유지한다 [Ralph MR et al., Science, 1990].

또한, 시각교차위핵뿐 아니라 고삐핵 또한 하등동물에서 포유동물까지 일주기적 리듬에 관여하는 것으로 알려져 있다 [H.Zhao and B.Rusak, Neurosci., 2005].

본 발명의 한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 생체리듬 조절용 조성물을 발현하도록 하는 C12orf39의 mRNA가 시각교차위핵과 고삐핵 그리고, 망막에서 강하게 발현되며 (도 5 참조), 면역조직화학법을 통하여 발명에 따른 생체리듬 조절용 조성물이 해당 위치에 존재한다는 것이 입증되었다 (도 6 참조). 이는 본 발명에 따른 생체리듬 조절용 조성물이 시각교차위핵과 고삐핵 및 망막에서 작용할 수 있음을 의미한다.

본 발명에 따른 생체리듬 조절용 조성물은 신경아교세포 (astrocyte)를 포함하는 신경교세포 (neuroglia)나 신경세포 (neuron)에서 작용할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명은 (i) 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, C-말단에 있는 글루타민 잔기의 말단이 아미노기인 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, (ii) 서열목록 제6서열의 펩타이드 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, (iii) 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 C12orf39 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브 또는 (iv) 서열목록 제9서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NQ 펩타이드의 cDNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 생체리듬 장애 진단용 조성물 또는 키트를 제공한다.

상기 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제7서열 및 제8서열로 표시된 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.

본 발명의 생체리듬 장애 진단용 조성물 및 진단 키트에는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 진단용 조성물 및 진단키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단 마커 검출용 키트에 관한 것이다. RT-PCR 키트는, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사 표소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 및 적합한 담체 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 대한 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또한, 바람직하게, 상기 진단키트는 마이크로어레이법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 DNA칩 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA나 올리고 염기가 부착되어 있는 기판을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 단백질 수준을 측정하는 제재가 바람직하게 항체인 경우, 상기 진단키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단키트일 수 있다. 이러한 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지 된 2차 항체, 발색단(chromopores), 적합한 담체, 효소 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어PBS; 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 (agarose) 및 이들의 조합일 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 생물정보학을 이용한 생체리듬 조절용 펩타이드의 발견

NQ 펩타이드의 유전자 선별 작업은 생물정보학적 접근 모델을 통하여 이루어졌다.

본 연구진은 Ensemble (http://www.ensembl.org/index.html) 및 UniprotKB (http://www.uniprot.org/uniprot)로부터 인간유전체 유전자 약 50,000여종의 open reading frame (ORF)을 내려 받았다. 이들 중에서 생리활성펩타이드로서의 가능성을 가진 분자를 식별하기 위해 SignalP3.0 프로그램을 사용하여 세포에서 분비될 가능성을 지닌 유전자 (secretome) 약 2,000여종을 선별하였다.

UniprotKB에 있는 정보를 바탕으로 선별된 ORF를 분석한 결과 약 600여종의 ORF가 펩타이드를 암호화하고 있는 유전자 (peptidome)로 밝혀졌고, 이중에서 560여종은 이미 그 기능을 알고 있는 유전자이나 나머지 40 여종은 아직 기능이 알려져 있지 않은 새로운 펩타이드를 암호화하는 유전자로 평가되었다.

이들 중 NQ 펩타이드를 암호화하는 유전자로서 C12orf39를 발굴하였다.

C12orf39 유전자는 인간을 포함한 다양한 척추동물에서 발견되었다. C12orf39 유전자로부터 발현되는 NQ 펩타이드의 전구체의 아미노산은 시그날펩타이드를 포함한 성숙한 NQ 펩타이드의 아미노산 서열을 포함하고 있다. 특히 NQ 펩타이드를 암호화 하는 아미노산의 서열은 종간 매우 잘 보존 되어있는 것으로 분석되었다 (도 1 참조). 예를 들어 경골어류의 한 종인 제브라피시의 경우, 카르복실기 말단 구역에서 알라닌 (Ala) 대신 트레오닌 (Thr)이 위치해 있는 것을 제외하면 NQ 펩타이드의 아미노산 서열은 조류의 한 종인 닭과 생쥐, 흰쥐 (rat), 인간을 포함하는 포유류까지 명백하게 잘 보존되어 있다. 한편 설치류의 한 종인 흰쥐의 경우는 다른 포유류와는 다르게 글라이신 바깥쪽, 카르복실기 말단 구역의 아르지닌 (Arg)이 히스티딘 (His)으로 치환되어 있는 형태의 아미노산 구조를 취하고 있다. 그러나 이러한 이염기 절단부위의 아미노산이 단일염기 절단부위 (monobasic cleavage site)로 변화된 경우에도 세포 내 전사, 번역 이후 공정과정에서 전단백질 분해효소의 효과를 충분히 겪는다는 점을 감안했을 때[Rouille Y, Front Neuroendocrinol., 1995], NQ 펩타이드의 기능적 변화에는 영향을 주지 않을 것으로 예측된다.

상기와 같은 비교유전체학적 분석법은 새롭게 밝혀진 신규 유전자가 실질적인 기능을 갖는지를 검증할 수 있는 신뢰성 있는 실험적 모델로 인정되고 있다[Robbins, R.J., MIT Press, 1996].

실시예 2: NQ펩타이드의 유전체 위치 및 서열분석

Ensemble 및 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)에서 C12orf39의 위치를 확인해 본 결과 척추동물 종에서 STRAP (Serine-threonine kinase receptor-associated protein), GOLT1B (Vesicle transport protein GOT1B), GYS2 (Glycogen [starch] synthase, liver), KISS2 (Kisspeptin isoform 2), LDHB (L-lactate dehydrogenase B chain), KCNJ8 (Potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member 8), ABCC9 (ATP-binding cassette sub-family C member 9), CMAS (N-acylneuraminate cytidylyltransferase), 그리고 TMPO (Lamina-associated polypeptide 2, isoforms beta/gamma)들의 유전자군과 함께 위치함에 따라 진화적으로 본 유전자가 보존되어 있음을 보인다. 특히 본 발명의 핵심 유전자인 C12orf39 유전자는 GOLT1B와 GYS2의 유전체 위치 사이에 존재하였으나, 제브라피시 와는 다른 경골어류의 한 종인 메다카 (medaka)의 경우는 본 유전자가 관찰되지 않았다. 이는 오랜 기간에 걸친 메다카 종의 진화과정에서 본 유전자를 잃었기 때문으로 추측된다.

실시예 3: NQ펩타이드의 유사체 분석

본 연구진은 Ensemble 데이터 베이스를 통해 또 다른 NQ 펩타이드의 유사체를 발견하였다. 상동체 (ortholog)의 비교 (도 1 참조)의 관점에서 벗어나 본 발명에서 NQ 펩타이드가 생리 활성펩타이드이고, 진화적으로 보존된 기능을 갖는 펩타이드일 가능성이 큰 것은, 그의 유사체가 존재하기 때문이다 (도 3 참조). 특정 유전자가 오랜 기간의 진화과정을 경험하게 되면 특정 DAN서열의 변형이 야기되거나 동일한 유전자의 중복화 (duplication)현상, 또는 그의 상실이 일어나기도 한다. 특히 동일 유전자 중복화 현상을 통해 동일 기능을 갖는 두 개의 유전자가 존재할 수도 있지만 진화가 가능한 충분히 긴 시간 속에서 본 기능의 유전자 외의 다른 유전자는 본 기능의 하위 기능을 담당(subfunctionalized) 하거나, 새로운 기능(neo-functionalized)을 수행 할 경우도 있으며, 본 기능을 잃게 (dis-functionalized)되기도 한다. 그러므로 한 유전자에 대한 유사체가 존재한다는 것은 본 유전자가 진화적으로 매우 이른 시기에 존재하여 왔음을 증명한다. 따라서 이러한 NQ 펩타이드 유사체의 발견으로 인해 소위 본 연구진이 명명한, NQ 펩타이드와 그의 유사체는 비단 일주기적 조절에만 관여하는 제한적 기능을 수행할 것으로는 예측되지 않는다.

실시예 4: NQ 펩타이드의 성숙공정과정

NQ 펩타이드는 총 118개의 아미노산으로 구성된 전단백질 (propeptide)이 전사, 번역 후 전단백질 분해효소 (prohormone convertase)에 의해 앞쪽과 뒤쪽에 존재하는 이염기 절단부위 (dibasic cleavage site)가 잘리는 번역 이후의 세포 내 공정과정 (post-translational modification)을 거쳐 실제 생체 내에서 역할을 할 것으로 예측되는 총 14개의 아미노산으로 이루어져 있을 것으로 추정되었다 (도 4 참조).

따라서 C12orf39 유전자로부터 발현된 성숙한 NQ 펩타이드의 아미노산 서열은 "NWTPQAMLYLKGAQ-NH2" 형태가 될 것으로 추정되었으며, 아미노기 말단 (N-terminus)에 아스파라진 (Asn)을, 카르복실기 말단에 글루타민 (Gln)을 갖기 때문에 본 연구진은 상기의 생리활성 펩타이드를 "NQ 펩타이드" 라고 명명하였다.

뿐만 아니라 NQ 펩타이드의 전단백질 구조에서는 세포 외부로 분비될 수 있는 신호로서 아미노기 말단에 전형적인 신호 펩타이드 (signal peptide)를 암호화하는 유전자 서열이 존재하였다. 이로써 세포 밖으로 분비될 준비 즉, 유전자 발현 후 성숙공정중의 NQ 펩타이드는 카르복실기 말단에 위치한 글라이신이 제거되는 과정에서 아미드기 (-NH₂)를 제공할 것으로 기대됨으로써 실제 생리활성 펩타이드로서의 기능을 가질 것으로 예측되었다. 그러나 흰쥐 종에서 NQ 펩타이드의 성숙공정은 카르복실기 말단에 아미드기를 취하지 않는 대신 서열번호 3으로 표시되는 His가 위치한다.

실시예 5: in situ 하이브리드조직화학법을 통한 C12orf39 유전자의 발현 검증

6 주령의 검은 수컷 생쥐(C57BL/6)는 대한바이오링크 (http://www.dhbiolink.com) 로부터 구입하였다. 구입한 생쥐는 사료와 물이 적절히 주어지고 20-24℃로 온도가 유지되며, 40-70%의 습도가 있는 쥐 우리(cage)에서 사육되었다. 상기 야생형 생쥐는 빛 개시가 8:00 am이고 빛 꺼짐이 8:00 pm인12/12 Light/Dark cycle에서 훈련되었다. 모든 실험은 가장 적은 수의 생쥐를 사용하도록 설계되었으며 실험동물윤리에 따라 마취법을 실시하여 실험에 사용된 생쥐의 고통을 최소화하였고, 이는 고려대학교의 동물 관리 및 이용 위원회에 의해 증명되었다 (Animal Care and Use Committee of the Korea University, KUIACUC-08).

상기의 방법으로 관리된 8 주령의 수컷 생쥐는 urethane 0.5 cc/100 g으로 복강 마취가 실시된 후, 희생시켜 (decapitation) 두개골로부터 뇌와 눈을 얻었다. 적출한 뇌와 눈을 드라이 아이스 (dry ice)위에서 차갑게 유지시킨 이소프로판 용액에 옮겨 급격히 냉각시켰다. 얼린 뇌와 눈 조직을 12 μm로 얇게 절편화 (section)하여 TESPA (sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)가 코팅된 글라스 슬라이드에 붙이고 (Thaw-mounted), 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)가 포함된 PBS (Phosphate buffered saline)용액에 고정하였다. 그 후 0.25% 아세트산 무수물 (acetic anhydride)이 포함된 0.1 M 트리에탄올아민 (triethanolamine)/0.9% NaCl (pH 8.0) 용액으로 아세틸화 (acetylated) 반응을 시키고, 이후 에탄올 (Ethanol)과 클로로포름 (chloroform) 용액을 이용해 탈수화 (dehydrated)와 탈지화 (defatted) 과정을 거쳐 공기 중에서 건조시켰다. 한편 절편화된 조직들은 ³⁵S가 표지된 탐침자 (probe)를 이용하여 55℃에서 이종화 (hybridized)반응을 시켰고, 상온에서 2X SSC용액으로 씻어내었다. RNA 분해효소 (RNase)를 처리한 후, 슬라이드를 1 mM 디티오트레이톨 (dithiothreitol)이 함유된 2X SSC, 1X SSC, 0.5X SSC, 0.1X SSC 용액으로 상온에서 각각 10분씩 순차적으로 씻어내었다. 마지막으로 조직절편들을 탈수화 시킨 후 공기건조를 수행한 후, 뇌 조직과 눈 조직 절편을 포함하고 있는 슬라이드 글라스를 엑스레이 필름 (X-ray film) (Biomax MR, Kodak, Rochester, NY, USA)에 감광시켰다.

한편, 탐침자의 생성을 위해 성체 생쥐의 대뇌피질 (cerebral cortex)로 부터 모든 RNA를 추출한 다음 역전사효소 (Reverse transcriptase)와 프라이머 (primer)로서 Random hexamer를 사용하여 상보성 DNA (complementary DNA, cDNA)를 만든 후, T-vector (Promega, Madison, WI, USA)로의 클로닝 (cloning)을 실시하였다. 중합연쇄반응법 (PCR)에 사용된 프라이머 (primer)의 정보는 하기 [표 1]에 열거되어 있다. 클로닝된 T-vector를 주형으로 하여, α-[³⁵S] UTP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)가 포함된 상태에서 in vitro transcription system (Promega, Madison, WI, USA)을 수행하였고, 생성된 방사선 표지의 안티센스 (anti-sense) 리보탐침자 (riboprobes)를 정제 (purify)하여 본 이종화 반응에 사용하였다.

타겟 유전자 (Target gene)	프라이머 시퀀스 (Primer sequences)	PCR 결과물 크기 (product Size) (bps)	위치 Positions	Accession number
C12orf39	up: CGA CTC TCT GAG AAG AGG AAC down: TCT CAG CCT TGA CAC GT	499	88-586	XM_620381

상기 전술한 이종이합화 기법을 통해 확인된 NQ 펩타이드의 mRNA는 시각교차위핵과 고삐핵, 그리고 망막에서 특이적으로 강하게 발현하였다. (도 5 참조).

시각교차위핵뿐 아니라 고삐핵 또한 하등동물에서 포유동물까지 일주기적 리듬과 관련이 있는 것으로 알려져 있다 [H.Zhao and B.Rusak, Neurosci., 2005]. 그 이유는 구조적으로 시각교차위핵에서 나온 바소프레신의 (vasopressinergic) 수출성 신경 (efferent nerve)이 일주기적 리듬과 관련하여 멜라토닌 (melatonin)을 분비하는 송과체 (pineal gland)와 연결되어 있을 뿐 아니라, 고삐핵, 특히 외측고삐핵 (lateral habenular nucleus, LHb)에서도 직접적으로 연결된 신경분포 (nerve innervation)를 보이기 때문이다 [Buijs, Cell Tissue Res., 1978; Ronnekleiv and Moller, Exp.Brain.Res., 1979]. 눈의 망막은 시상하부의 시각교차위핵에 직접적인 신호를 전달하는 신경들이 분포하고 있기 때문에 망막시상하부관을 통해 외부의 빛 자극을 빠르게 뇌로 전달할 수 있다 [Jens Hannibal, Cell Tissue Res., 2002].

또한 멜라토닌의 수용체가 외측고삐핵에 존재하므로 시각교차위핵, 고삐핵, 송과체는 모두 일주기적 리듬과 관련된 축 (axis)으로 추정된다 [Sato T et al., Cell Tissue Res., 1991; Weaver DR et al., J.Neurosci., 1989; Zamorskii II and Pishak VP, Bull.Exp.Biol.Med., 2000].

한편, 이러한 결과들은 최근에 말초조직에서 주로 관찰된 NQ 펩타이드의 존재 부위[Olivier Mirabeau, Genome.Res., 2007; Bingbing Wan, Biosci.Rep., 2010; Marcin Rucinski, Peptides, 2010]와는 전혀 다른 중추신경계에서의 새로운 발현양상이며, 궁극적으로는 NQ 펩타이드가 일주기적 리듬과 관련된 물질일 가능성을 최초로 시사하는 것이다.

실시예 6: 면역조직화학법을 통한 NQ펩타이드의 발현 검증

상기의 방법으로 관리된 8주령의 수컷 생쥐는 우레탄 (urethane) 0.5 cc/100 g으로 복강 마취가 실시되었고, 뇌를 얻기 위해 흉부 가죽을 절개하여 좌심방 (left cardiac ventricle)에 링거 바늘을 꽂아 0.9% 생리식염수 200 ml로 혈액을 빼낸 후, 200 ml의 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)가 함유된 0.9% 생리식염수로 관류하여 고정하였다. 한편 망막과 망막시상하부관의 조직을 얻기 위해 마취된 생쥐의 눈을 적출하고, 26G 주사바늘을 이용해 동공에 구멍을 낸 후 4 % 파라포름 알데하이드가 함유된 0.9% 생리식염수 용액에 2시간 동안 두어 고정하였다.

고정된 쥐의 뇌를 적출한 후, 4% 파라포름알데하이드가 함유된 0.9% 생리식염수로 24시간에서 48시간 동안 후 고정(post-fixation)하였고, 30%의 설탕 (sucrose)이 함유된 0.9% 생리식염수로 24시간 가량 처리하였다. 망막과 망막시상하부관의 경우, 고정이 끝난 조직을 30 % 설탕용액에 넣고 3시간 동안 두어 얼릴 조직이 손상되지 않도록 하였다. 보관이 끝난 망막조직을 구멍 난 동공으로부터 십자형으로 절개하여 렌즈를 제거하고 제거된 렌즈의 부피만큼을 30% 설탕용액과 OCT 합성물이 3:2의 비율로 혼합된 용액을 주입하여 메움으로써 조직의 붕괴를 방지하였다. 이후 생쥐의 뇌와 망막은 드라이 아이스 위에서 OCT 합성물이 포함된 몰드 (mold)를 이용하여 급격히 얼려졌으며 실험에 이용되기 전까지 -80 ℃에서 보관되었다.

생쥐의 뇌와 망막에서 면역조직화학법을 통한 NQ 펩타이드의 특이적 발현 부위와 강도를 확인하기 위하여 NQ 펩타이드와 반응할 수 있는 rabbit-polyclonal 항체인α-NQ-S와 α-NQ-L을 당업계의 일반적인 방법으로 제조하였다.

보관된 생쥐의 뇌와 망막 조직을 냉동미세절단기 (cryostat microtome)을 이용하여 30 μm로 얇게 절단한 후 슬라이드 글라스에 접합시켜 상온에서 하루 동안 말렸다.각각을 PBS용액으로 30분간 씻어내고 10% 염소혈청 (goat-serum)이 포함된 PBST용액 (TritonX-100이 PBS에 0.1 %의 비율로 포함된 용액)으로 1시간 가량 블로킹 (blocking) 하였다. 결과적으로 보여질 형광 이미지에서, 주변의 비특이적 항원-항체 반응을 지양하고, NQ 특이적 발현부위를 좀 더 정확히 구분하기 위하여 NQ항체와 용액의 비율이 1:500이 되도록 하였다.

NQ 항체 및 다른 이중 항체와 조직은 상온에서 밤새도록 반응시켰다. 1차 항체-항원반응이 끝난 후 PBS용액으로 10분간 세 차례씩 뇌 조직절편을 씻어낸 후 NQ 펩타이드에 대한 2차 항체로서 FITC가 결합된 Goat-anti rabbit secondary antibody (Molecular Probes, Eugene, OR)이나 Cy3.5가 결합된 Goat-anti mouse secondary antibody (abcam)를 각각 1:1,000과 1:500의 비율로 사용하였고, 이와 동시에 핵의 염색을 위해 Hoechest33342 (Molecular Probes, Eugene, OR)를 1:20,000의 비율로 사용하였다.

2차 항체-항원반응이 끝난 후 PBS용액으로 10분간 세 차례에 걸쳐 뇌 조직절편을 씻어낸 후 암흑속에서 약 30분간 건조시킨 후, crystal/mount 용액 (Biomeda, USA)을 조직 위에 도포하여 커버 글라스를 덮음으로써 표본을 준비하였다. 표본의 형광관찰을 위해 공초점 현미경 (Zeiss LSM 510 confocal microscopy)을 이용하였다.

흥미롭게도 이종화조직화학법을 이용한 실험결과와 같이 단백질 수준에서도 시각교차위핵과 고삐핵, 그리고 망막 및 망막시상하부관에서 NQ 펩타이드가 발현하는 것으로 나타났다 (도 6 참조).

어떤 유전자의 경우, 전사 후 혹은 번역 후 공정과정 등으로 인해 단백질 발현과 mRNA의 발현 위치가 다를 수 있으나[Cheryl L. Wellington et al., Lab. Invest., 2002], 본 실험에서는 상호 같은 위치에서 동일한 발현양상을 나타냄으로써 본 물질이 생체 내에서 비교적 안정적으로 발현되는 펩타이드임을 보인다.

실시예 5 및 실시예 6의 실험 결과는 생쥐의 뇌와 눈 조직에서 NQ 펩타이드의 존재여부, 발현위치, 그리고 발현강도를 제시하는 것이며, 발현 위치상 본 물질이 생체 내에서 일주기적 리듬과 관련 있다는 본 연구진의 초기 가설을 뒷받침한다.

실시예 7: 생쥐 뇌의 관상절단전략 및 면역조직화학법을 통한 시각교차위핵 내 NQ 펩타이드의 발현위치 검증

생체 전반에 걸쳐 일주기적 리듬을 관장하는 시각교차위핵은 뇌의 시각교차핵 위쪽, 제3 뇌실 및 시상하부 아래쪽에 존재하며, 생쥐의 경우 그 부피는 앞뒤 (rostrocaudal) 약 600 μm, 좌우 (left-right)로 300 μm, 위아래 (dorsoventral)로는 350 μm의 매우 협소한 구역을 차지하고 있는 것으로 알려져 있다 [Eric E. Abrahamson and Robert Y. Moore, Brain Res., 2001; Expedito S. Nascimento Jr., Brain Res., 2010].

이러한 시각교차위핵 내에서 NQ 펩타이드가 발현되는 위치를 검증하는 것은 NQ 펩타이드와 이 구역에 존재하는 특정 뉴런간의 상호 관련성을 예측할 수 있기 때문에 매우 중요하다.

시각교차위핵에는 배안쪽 (ventromedial) 부위에 해당하는 핵심부에는 혈관 작용성장펩타이드성 뉴런 (VIPergic neuron)이, 뒤가쪽 (dorsolaterl) 부위에 해당하는 주변부에는 아르지닌바소프레신성 뉴런 (AVPergic neuron)이 구분되어 다량으로 존재하므로 일주기적 리듬과의 관계성을 분석할 수 있기 때문이다[Yuriko Ban, J.Neurosci., 1997; Martin smith, J.Chem.Neuroanat., 1996].

뿐만 아니라 시각교차위핵의 앞쪽 영역 (anterior part)과 뒤쪽 영역 (posterior part)에서 이러한 신경성펩타이드들은 다른 발현 양상을 보이는 것으로 알려져 있다[Yuriko Ban, J.Neurosci., 1997]. 스티븐과 홀트만의 문헌에 따르면 이러한 신경성 펩타이드들을 발현하는 뉴런의 구조는 일주기적 변화에 따라 실시간으로 변화된다 [Beth Stevens, Neuro signal, 2008; Anthony J.G.D. Holtmaat et al., Neuron, 2005].

따라서 이러한 일주기적 상황에서 뉴런-뉴런 혹은 뉴런-글리아 (glia) 간의 상호 구조적인 관련성 및 변화의 요인이 NQ 펩타이드에 의한 것일 가능성이 있으므로 시각교차위핵 안에서의 NQ 펩타이드 발현 위치를 검증하는 것은 매우 중요하다.

이에 본 연구진은 시각교차위핵의 앞쪽부터 뒤쪽까지 40 μm의 두께로 상기의 방법으로 준비된 생쥐의 뇌를 절편화하는 실험계획을 수립하고 (도 7a 참조), 형광 표지된 이차항체를 이용하여 NQ 펩타이드의 발현 양상을 확인하였다 (도 7b 참조).

본 물질은 전구물질 (premature form) 혹은 성숙된 형태 (mature form)의 두 가지 구조로 존재하므로 각각 다른 항원결정인자 (Epitope)를 인지하고 면역반응을 할 수 있는 하기 [표 2]에 열거된 항체들을 사용하였다.

항체명	에피토프	관찰 형태
α-NQ-S	NWTPQAMLYLYGAQ-NH2	Mature, Premature
α-NQ-L	SLEKSQKGADEGGNFDKSELLEDR	Premature

전구물질의 NQ 펩타이드와 성숙된 형태의 NQ 펩타이드는 전반적으로 강하게 발현하였으나, 앞-뒤쪽의 위치상에서는 동일하게 4, 5번 구역 (medial part)에서 특히 강하였으며 구역상 시각교차위핵의 핵심부에서 강하게 발현하는 형태를 보였다. 또한 위-아래 축 상에서는 배(ventral region)쪽, 좌-우 축 상에서는 측면(lateral region)쪽에서 비교적 많이 발현됨을 알 수 있다.

이는 NQ 펩타이드가 혈관작용성장펩타이드를 다량 분비하는 신경세포가 있는 위치와 가스트린유리펩타이드성 신경세포들이 다량으로 분포하는 위치인 시각교차위핵의 핵심부에서 특히 강한 발현을 나타낸 것이므로 이 구역에 존재하는 신경세포나 신경아교세포간의 관계에서 일주기적 역할과 관련하여 본 물질이 중요한 기능을 할 수 있는 가능성을 보여준다.

실시예 8: 생쥐의 시각교차위핵과 망막 및 망막시상하부관에서의 NQ펩타이드의 발현양상 및 발현세포의 동정

본 실시예에서는 시각교차위핵의 핵심부와 망막에서 발현된 NQ 펩타이드가 어떤 종류의 세포로부터 발현되는지를 검증하였다. NQ 펩타이드를 합성하는 세포의 동정을 위해, 시각교차위핵에서는 별아교세포의 표지자인 Glial fibrillary acidic protein, GFAP에 대한 1차 항체로서 mouse GFAP (Cell Signaling Technology, UK)를, 망막에서는 망막신경절세포의 표지자인 Neuron-specific class III beta-tubulin, TuJ1 또는Neuronal nuclei, NeuN에 대한 1차 항체로서 mouse TuJ1 (Covance) 또는mouse NeuN (Milipore)을 각각 NQ 펩타이드에 대한 1차 항체와 함께 상기의 방법으로 준비된 생쥐의 뇌 조직절편에 이중 처리하여 면역조직화학법을 수행하였다.

항체를 처리하기 전에 10% 염소혈청이 함유된 PBS 용액으로 상온에서 1시간 동안blocking 한 후, NQ 펩타이드에 대한 1차 항체를 포함한 모든 1차항체를 1:500의 비율로 하여 각각 뇌 조직 및 망막조직에 처리하였으며 상온에서 밤새도록 항원-항체간 면역반응을 유도하였다.

1차 항체 반응이 끝난 후, 뇌와 망막 및 망막시상하부관의 조직절편을 PBS 용액으로 상온에서 10분씩 세 차례에 걸쳐 씻어내었다. NQ 펩타이드의 1차 항체에 대한 2차 항체는 FITC 혹은 Cy3가 결합된 goat anti-rabbit을 1:1,000의 비율로 처리하였고, 나머지 항체들에 대해서는 FITC 혹은 Cy3가 결합된 goat anti-mouse를 1:500의 비율로 처리하였다. 또한 핵의 염색을 위해 Hoechest33342를 1:20,000의 비율로 처리하였다. 상온에서 1시간 동안 면역반응을 유도한 후, 10분씩 세 차례에 걸쳐 PBS 용액으로 씻어내고 상온에서 완전히 건조시킨 후 crystal/mount 용액을 조직에 도포하고 커버 글라스를 덮어 표본을 준비하였다. 준비된 표본은 공초점 현미경을 통해 관찰하였다.

그 결과, 시각교차위핵에서 확인된 NQ 펩타이드는 정확하게 별아교세포와 일치하였다. 한편, NQ 펩타이드의 합성 및 발현은 모든 별아교세포가 아닌 몇몇의 별아교세포 에서만 한정적으로 일어남을 보였는데, 이는 NQ 펩타이드가 일주기적 변화에 따라 여러 별아교세포들 사이에서도 양적으로 다르게 발현하고 있음을 의미한다. 또한 망막에서는 시각교차위핵과는 다르게 신경세포의 일종인 망막신경절의 일부 세포에서 발현하였고 이들의 축삭 (axon)이 지나가는 자리인 망막시상하부관에도 NQ 펩타이드를 발현하였다 (도 8 참조).

이와 같은 결과는 다음의 문헌들에 의해 NQ 펩타이드가 일주기적 조절과 관련 있음을 더욱 뒷받침한다.

예를 들어, 뉴런뿐만 아니라 별아교세포에서도 빛의 자극에 의해 전사인자인 c-Fos가 발현되었으며, 더욱이 별아교세포의 표지단백질인 GFAP 역시 일주기적 리듬에 따라 그 발현이 양적으로 조절된다는 것이 보고되어 있다 (Bennett et al., NeuroRep., 1994). 또한 빛의 자극으로 눈에서 발생한 글루타메이트 (Glu)의 흥분성 신호는 망막시상하부관을 통해 시각교차구역으로 들어오는데, 발생학적 측면에서 망막시상하부관의 발생과 별아교세포의 양적인 증가는 상호 관련성이 있음이 증명되었다 (Lavialle and Serviere, Dev Brain Res., 1995). 이버는 척추동물에서 잘 알려진 별아교세포의 per 유전자가 초파리의 별아교세포에서도 관찰되며, 그 발현이 일주기적 리듬성을 보임을 증명하였다 (Ewer et al., J. Neurosci., 1992).

또한 뉴런과 별아교세포는 모두 글루타메이트에 의해 흥분되어 세포 내 소포체 (Endoplasmic Reticulum)에 있는 칼슘의 양을 증가시키는 것이 밝혀졌다 (van den Pol and Dudek, Neurosci., 1993). 뿐만 아니라 일주기적 리듬성을 보이는 별아교세포의 질서 있는 변화(systematic change)는 생체시계활성의 지표가 될 수 있음이 확인되었고 (Lavialle and Servier, Neurorep., 1993), 글리아 세포의 대사가 억제 되었을 때 뉴런의 생체시계가 붕괴됨이 증명되었다 (Prosser et al., Brain Res., 1994).

한편, 별아교세포는 세포막 수용체로서 G 단백질 연결 수용체 (G protein-coupled receptor, GPCR)의 일종인 A1형 아데노신 수용체 (Adenosine receptor type A1, A1 receptor)를 가지고 있는데 동물실험모델에서 본 수용체와 이에 대한 리간드 (ligand)로서 아데노신 (adenosine) 간의 결합은 세포적 수준에서 아교전이 (gliotransmission)를 증가시키는 기전을 통해 수면을 유도하지만 상호간 기능적 결핍은 수면기능의 상실을 초래하여 기억 및 인지력 결함을 유발하는 것으로 나타났다 (Halassa et al., Neuron, 2009).

별아교세포에서 뿐만 아니라 망막의 망막신경절세포에서 유래하는 NQ 펩타이드는 본 세포가 외부의 빛 자극을 감지하였을 때 글루타메이트와 같은 화학적 신호로써 시각교차위핵에 전달될 가능성을 보여주며 이 때문에 전술한 바와 같이 c-fos와 같은 빛에 의해 유도되는 전사인자의 빠른 발현을 촉진할 가능성을 보여준다.

위치해부학적으로 분리된 망막신경절세포에서와 시각교차위핵에서 독립적으로 발현하는 NQ 펩타이드는 전술한 두 기관이 상호 연결된 구조를 이루고 있다는 점과 신경세포의 일종인 망막신경절세포에서 발생된다는 점으로 인해 외부의 신호 및 빛의 정보를 망막-망막시상하부관을 통해 결과적으로 시각교차위핵으로 직접 전달하는 매개체일 가능성을 보여준다. 그 결과 NQ 펩타이드는 시각교차위핵에 존재하는 중심길잡이 뉴런의 내제적 시간장치를 외부 시간과 정밀하게 동조화시킴으로써 개체의 적응과 생존에 크게 기여할 것으로 예측된다.

위의 문헌들을 종합해 볼 때, 중추신경계에 존재하는 별아교세포는 단순히 뉴런의 지지기능만 담당하는 것이 아닌 독립적, 직접적으로 일주기적 기능과 중요하게 연결되어 있음을 알 수 있고, 뇌의 별아교세포와 망막의 망막신경절세포의 네트워크는 NQ 펩타이드의 일주기적 역할 수행에 있어 시너지 효과를 나타낼 것으로 기대된다.

실시예 9: 생체시계관련 표지 유전자 per1 , bmal1 과 NQ펩타이드를 암호화하는 유전자인 C12orf39 의 시간대별 mRNA 발현양상

별아교세포로부터 발현된 NQ 펩타이드가 일주기적 영향에 따라 그 발현양상이 어떻게 변화되는지를 확인하기 위해 상기의 방법으로 준비된 역전사 반응이 끝난 표본을 1 mM Tris를 이용하여 5배 희석하고 피합 (pooling)하여 real-time PCR의 standard로 사용하고, 다시 15배를 더 희석하여 정량을 위한 real-time PCR의 주형 (template)으로 사용하였다.

Real-time PCR은 LightCycler Version 1.5 (Roche, Salt Lake City, USA)를 사용하였으며 2X SYBR Premix EX Taq은 Takara (RR041A)를 사용하여 증폭하였다.

2.2 μl의 멸균 증류수, 정방향 (sense) 프라이머 0.4 μl, 중합연쇄반응 역전사 프라이머 (PCR Reverse Primer) 0.4 μl, 2X SYBR 5 μl비율로 혼합된 중합연쇄반응 마스터 혼합물 (PCR Master Mix) 8 μl에 2차로 희석된 각 표본 혹은 2 μl의 Standard를 사용하였다. 각 유전자의 발현 정도는 tata 결합단백질 (tata binding protein, tbp)의 mRNA의 양으로 보정하여 수치화하였으며, 측정에 사용된 프라이머의 염기서열은 아래에 정리된 하기 [표 3]과 같다.

타겟 유전자 (Target gene)	프라이머 시퀀스 (Primer sequence)	결과물 크기 (Product size) (bps)	위치 (Position)	Accession number
C12orf39	Up: AGA GCC GTA GGA AGG AGC TT Down: TTT TCC AAG GAA GCC AGA AA	112	170-281	XM_620381
Per1	Up: GTG TCG TGA TTA AAT TAG TCA G Down: ACC ACT CAT GTC TGG GCC	142	39-180	NM_001159367
Bmal1	Up: GGC CAT CAG TAA AGG TGG AA Down: GGT GGC CAG CTT TTC AAA TA	115	1284-1398	NM_007489
TBP	Up: GGG AGA ATC ATG GAC CAG AA Down: CCG TAA GGC ATC ATT GGA CT	113	239-351	NM_013684

실험결과에서 NQ mRNA는 CT18시에 최고의 양적 발현을 보였으며 (도 9 참조), 기존에 알려진 Per1과 Bmal1의 발현양상과는 차이가 있다. 시각교차위핵의 핵심부에서 많이 발현하는 NQ 펩타이드는 (도 6 참조) 이와 위치해부학적으로 유사한 구역에서 발현하는 혈관작용성장펩타이드의 mRNA 최고 발현 시간대 [Hugues Dardent et al., Molecular brain res., 2004]와 흡사하다.

실시예 10: NQ 펩타이드의 일주기적 발현양상

면역조직화학법을 통해 시각교차위핵 내부에 존재하는 별아교세포의 NQ 펩타이드 발현양 변화를 일주기적으로 관찰하였다. 빛의 개시가 09:00이고 빛의 꺼짐이 21:00인12:12 LD 조건하에서 2주동안 사육된 생쥐는 실험계획에 따라 상기의 방법으로 뇌 조직을 준비하였다. 빛의 개시는 ZT00시이고 빛의 꺼짐은 ZT12시이므로 여기에서 09:00은 ZT00시에 해당하며 21:00은 ZT12시에 해당한다. 하루 24시간을 6시간 간격으로 나누어 ZT00, ZT06, ZT12, ZT18시의 총 4가지의 시간대를 NQ 펩타이드의 발현량을 관찰하는 시간대로 선택하였다. 실험당일 각 시기에 맞게 훈련된 생쥐를 상기의 방법으로 복강 마취하였다. 단 ZT12와 ZT18의 경우는 어둠 속에서 실시되었다. 마취된 생쥐를 상기의 방법으로 관류시키고 뇌조직을 적출하였다. 파라포름알데하이드 용액으로 약 하루 동안 고정시킨 후 OCT 혼합물에 적셔 드라이아이스가 있는 상황하에서 급속히 얼렸다. 시각교차위핵이 포함된 뇌 조직을 40 mm 간격으로 절단하여 샘플을 준비하였다.

준비된 샘플을 30분간 PBS 용액으로 씻어내고 10 % 염소혈청이 포함된 PBST 용액을 이용해 1시간 가량 블로킹 하였다. 성숙 혹은 성숙 전 단계의 NQ 펩타이드에 대한 1차 항체는 상온에서 3시간가량 조직에 처리하였고, 이후 비특이적 항원-항체 면역반응을 제거하기 위해 PBS로 세 차례에 걸쳐 씻어내었다. 2차 항체로서 Cy3.5가 결합된 goat anti-rabbit을 1:500의 비율로 상온에서 1시간 가량 처리한 후 PBS 용액을 이용해 세 차례에 걸쳐 씻어내었다. 이 후 슬라이드 글라스 위로 접합시키고 음지에서 완전히 건조한 후 crystal/mount 용액을 조직에 도포하고 커버 글라스를 덮어 표본을 준비하였다. 준비된 표본은 형광 현미경을 통해 관찰하였다.

NQ 펩타이드의 성숙된 형태 혹은 성숙 전 형태는 모두 시각교차위핵에서 강하게 발현하였다. ZT00, ZT06, ZT12, ZT18에 이르는 일주기적 위상에 따라 NQ 펩타이드의 발현양은 변화되었다. 특히 NQ 펩타이드를 합성하는 것으로 본 발명에 의해 밝혀진 시각교차위핵의 별아교세포는 ZT06 시기에 가장 높은 형광강도를 나타내었고, 이와는 12시간 반대인 시간 즉, ZT18시기에는 상대적으로 가장 낮은 형광강도를 나타내었다. ZT00 시기와 ZT12 시기에는 NQ 펩타이드의 발현 양이 비슷하게 관찰되었지만, ZT18 시기 보다는 높고, ZT06 시기 보다는 낮은 중간 단계 정도의 상대적 강도를 나타내었다. 전술한 일주기적 위상에 따른 형광강도의 변화는 성숙된 형태나 미성숙 형태의 NQ 펩타이드 모두에서 동일하게 관찰되었으며, 이는 두 가지 펩타이드가 같은 유전자로부터 전사되어 번역된 후 번역 이후 공정과정을 겪는다는 것을 간접적으로 증명한다.

이는 시각교차위핵에 존재하는 NQ 펩타이드를 합성하는 세포인 별아교세포가 NQ 펩타이드를 발현하는데 있어 일주기적 변화에 역동적으로 반응함을 보여주는 것으로써 결국 NQ 펩타이드가 일주기적 펩타이드임 (circadian peptide)을 의미한다.

실시예 11: 망막에서 NQ 펩타이드의 빛 의존적 분비

본 발명의 몇 가지 구현예에 따르면 NQ 펩타이드는 대뇌의 영역 중 간뇌의 시상하부 내에 존재하는 매우 협소한 구역인 시각교차위핵에서도 발현되지만, 눈의 망막에서도 많은 양이 발현한다 (도 5, 6, 8 참조). 그러므로 망막 내 NQ 펩타이드의 발현은 빛 의존적으로 시각교차위핵의 일주기적 조절에 관여할 가능성이 있다.

따라서 본 연구진은 방사선면역측정법(RIA, radioimmunoassay)을 수행하기 위해 서열번호 2로 표시되고 카르복실기 말단에 아미드화가 된 NQ 펩타이드의 아미노산 서열에서 아홉 번째의 Tyr 잔기에 125-Iodine을 표지 할 수 있도록Chloramine-T 기법을 수행하였다.

상기 기법으로 준비된 ¹²⁵I-NQ 펩타이드를 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열을 갖는 합성 NQ 펩타이드와 경쟁시켜 표 2에 열거된 항체들 중 서열번호 1로 표시되는 에피토프를 인지할 수 있는 α-NQ-S 항체로 결합하도록 하였다. 방사선 표지가 되지 않은 NQ 펩타이드의 농도가 높아질수록(X 축), α-NQ-S 항체로 결합하는 ¹²⁵I-NQ 펩타이드가 줄어 드는 것(Y축)을 알 수 있다 (도 11 참조). 이를 통해 NQ 펩타이드의 기준 곡선(standard curve)을 만들 수 있으므로 본 그래프를 이용하여 준비한 생쥐의 망막에 존재하는 NQ 펩타이드의 절대량을 알아낼 수 있다. 이를 좀 더 자세히 설명한다.

빛 개시가 09:00이고 빛 꺼짐이 21:00인 12:12 LD 조건에 완전히 적응된 8 주령의 야생형 생쥐를 24시간 동안 충분히 암흑 속에 적응시켰다. CT14 시와 CT23 시와 같이 일주기적 위상을 달리하여 생쥐를 빛에 노출시킴으로써 일주기적 위상 차에 따른 빛 의존적 NQ 펩타이드의 분비를 확인하고자 하였다. 생쥐의 망막을 적출하는 장소 및 시간은 암흑 속에서, 빛 조사 후 0시간, 1시간, 2시간, 4시 이후이었으며, 각 위상마다 사용된 사용 된 생쥐는 3 마리였다. 각각의 일주기적 위상과 빛 노출시간이 계획대로 충분히 이루어진 생쥐에 경추탈골법을 실시하여 희생시킨 후 눈을 포셉으로 적출하였다. 26G 주사바늘을 이용해 적출한 눈의 동공에 구멍을 낸 후, 이를 기준으로 십자형으로 절개하여 렌즈를 제거하였다. 눈의 내측 벽에 존재하는 망막만을 선택적으로 얻기 위해, 광학현미경을 통하여 멜라닌 색소층을 제거하고 주사바늘로 망막 조직을 긁어 모아 총 3 마리 생쥐의 눈을 모두 취합하였다. 그 후 실험에 사용되기 전까지 -80℃에서 보관되었다.

서열번호 2로 표시 된 NQ 펩타이드와 Chloramine-T 기법으로 제조된 ¹²⁵I-NQ 가 α-NQ-S 항체로의 경쟁적 결합여부를 확인하고, 직선회기(linear regression)를 통해 샘플 속에 포함된 NQ 펩타이드의 양을 판별하기 위하여, 일정량의 ¹²⁵I-NQ (20,000cpm)에서 서열번호 2로 표시 된 NQ 펩타이드의 양을 증가시키면서 α-NQ-S 항체로의 경쟁적 결합을 확인하였다. 본 실험에서는 정상염소혈청 (normal rabbit serum)을 모든 반응에 첨가하여 α-NQ-S 항체의 비특이적 결합에 의해 나타나는 CPM 값을 판별하고 실제 계산되는 식에서 본 값이 제거될 수 있게 하였다. 그 결과 일정량의 ¹²⁵I-NQ 에서 서열번호 2로 표시되는 합성 NQ 펩타이드의 양이 증가될수록 α-NQ-S 항체에 결합되는 ¹²⁵I-NQ가 감소됨을 보였다. 이를 통해 동일한 항체에 대한 처리된 두 가지 유형의 펩타이드가 경쟁적으로 결합함을 알 수 있으며, 직선회기 곡선을 만듦으로써 향후에 있을 통계적 유의성과 NQ 펩타이드의 절대값을 계산할 수 있었다 (도 11 참조).

준비된 샘플에서 존재하는 NQ 펩타이드의 양을 확인하기 위해 일정량의 ¹²⁵I-NQ와 샘플 (망막 단백질)을 함께 첨가하여 α-NQ-S 항체에 대한 경쟁적 결합 여부를 확인하였다. 전술한 직선회기 곡선을 통해 만들어진 기준곡선으로 본 실험을 통해 얻게 된 CPM 값을 비교하여 망막조직속에 포함되어있는 NQ 펩타이드의 절대량을 계산하였다. 그 결과, 각 일주기적 위상에서 빛에 노출된 시간에 의존하여 존재 또는 소모된 NQ 펩타이드의 양을 확인 할 수 있었다. 이와 같이 망막에서 합성된 NQ 펩타이드가 소모된 것은 빛에 반응하여 시각교차위핵으로 분비되었기 때문으로 해석될 수 있다.

그러므로 NQ 펩타이드는 망막에서 시각교차위핵으로 전달되는 빛 의존적인 분비 물질이나, 분비량의 양적 차이는 일주기적 위상에 따라 차이가 날 수 있다. 이는 CT22시와는 다르게 CT14시에서는 NQ 펩타이드의 양이 빛에 의해 크게 변화되지 않음에 근거한다.

실시예 12: NQ펩타이드 처리에 따른 생체시계관련 표지 유전자인 per2 의 일주기적 발현양상 변화

시신경교차위핵에서 NQ 펩타이드가 실제로 per2의 주기성에 어떠한 영향을 미치는지를 검증하였다.

여기에 이용된 동물은 per2 프로모터 (promoter) 뒤 부분에 Luciferase 유전자가 삽입된 construct를 Knock-in한 유전자변형생쥐 (transgenic mouse)이다. 본 생쥐를 희생시킨 후 신속하게 뇌를 적출하여 시각교차위핵이 포함된 400 μm 두께로 절단하였다. 절단된 생쥐의 뇌 조직 절편을 1% penicillin/streptomycin 항생제, 25% Horse Serum, 25% Hank's Buffered Salt Solution (HBSS), 50% Minimum Essential Medium (MEM) 그리고 0.3 mM Luciferin이 혼합된 배지에서 배양하였다. 최초 뇌조직절편의 배지배양일로부터 5일째 되었을 때 시간대에 따라 인공적으로 합성한 NQ 펩타이드를 최종농도, 5 μM로 처리한 후, 크로노스 (Kronos, wheeled-luminometer)를 이용하여 변화되는 per2 프로모터의 활성으로부터 유도된 Luciferase activity를 관찰하였다.

그 결과, per2 프로모터의 Luminescence 활성은 일주기적 상황하에서 NQ 펩타이드를 처리하는 시간대에 따라 다르게 나타났다. 예컨대, 뇌조직절편의 최초 배양일로부터 4일째이고 per2가 최고활성을 보이는 시점에 NQ 펩타이드를 처리하였을 때에는 per2 프로모터의 활성주기에 변화가 없었지만 (약 24시간), per2의 최저활성 시점에 처리했을 때에는 그것의 자유-유형주기 (free-running period)가 약 24시간에서 22.3시간으로 1시간 30분 가량 전진 (advanced)되는 것을 관찰할 수 있었다.

이는 시각교차위핵에서 NQ 펩타이드가 per2유전자의 발현을 조절함으로써 포유동물의 일주기적 리듬을 직접적으로 조절할 수 있다는 결정적인 증거이다 (도 12 참조).

실시예 13: Per2 의 일주기적 위상에 따른 NQ 펩타이드의 약물효과

실시예 12의 방법으로 배양된 시각교차위핵이 포함된 뇌 슬라이스에서 Per2의 일주기적 위상의 변화에 따른 NQ 펩타이드의 약물효과를 검증하였다. 본 실험에서의 약물효과란 NQ 펩타이드의 처리에 따른 Per2의 활성변화를 지칭하며, 이는 좀더 구체적으로 Per2의 주기전진을 의미한다.

약 24시간을 주기로 하여 진동하는 Per2의 활성에서 최고점 시기 이후 2시간, 6시간, 10시간, 14시간, 20시간, 그리고 22시간 이후에 NQ 펩타이드를 100 nM의 농도로 처리하였다. NQ 펩타이드를 처리는 4시간 동안 지속되었으며, 이후에는 배지를 갈아주었다.

결과에서 NQ 펩타이드 처리는 고점 이후 저점 근방의 시간대인 10시간, 14시간 이후부터 18시간에 이르기까지 적게는 약 2시간, 많게는 약 4시간 가량의 다음에 오는 Per2 고점활성 시간대를 앞쪽으로 전진시켰다. 한편, Per2 활성에 있어서 고점 이후 2시간째와, 6시간째, 그리고 22시간째에 NQ 펩타이드를 처리한 경우는 주기진동의 전진 혹은 후퇴에 있어서 그 효과가 미미하거나 거의 보이지 않았다. 이로써 NQ 펩타이드는 Per2의 일주기적 활성에 직접적으로 영향을 주는 물질이며, 그의 일주기적 위상에 따라 다른 약물효과를 보이지만, 대체로 Per2 활성의 저점 시간대에 가장 큰 효과를 보이는 물질임을 알 수 있다 (도 13 참조).

실시예 14: NQ 펩타이드의 농도 의존적인 Per2 의 일주기적 변화

Per2의 활성을 조절하는 NQ 펩타이드의 좀 더 구체적이고 정확한 약물효과를 검증하기 위하여 실시예 12에서와 같이Per2-luc KI 생쥐의 시각교차위핵이 포함된 뇌 슬라이스를 실험실외에서 배양하였다.

NQ 펩타이드가 Per2의 활성에 가장 많이 영향을 주는 시점인 고점 이후 10시간째에 2 nM, 20 nM, 200 nM, 2000 nM의 농도로 4 시간 동안 NQ 펩타이드를 뇌 슬라이스에 처리하였다. 그 이후에는 배지를 원 배지 (50% minimum essential medium, 25% gey’s balanced salt solution, 25% horse serum, 36 mM glucose, and 100 units/ml aerosolized antibiotics) containing 0.3 mM luciferin)로 갈아 주어 NQ 펩타이드의 약물 지속시간을 제한하였다.

Vehicle은 NQ 펩타이드를 용액화 시킨 물질인 DMSO를 0.1 % 로 처리하였다. NQ 펩타이드를 처리한 경우, 처리되는 NQ 펩타이드의 농도가 올라갈수록 Per2의 발현주기가 비례하여 전진되었는데, 특히 20~200 nM의 농도로 처리한 경우에 최고효과를 보였다 (도 14 참조). 이는 Per2 활성이 처리되는 NQ 펩타이드의 농도에 의존하여 Per2의 활성을 변화시킨다는 것과 Per2 활성에 있어서 특히 주기후퇴보다는 주기전진에 중대한 영향을 주는 것으로 해석된다.

실시예 15: NQ 펩타이드 변이체를 이용한 생리적 활성 검증

도 1과 도 4에서 밝힌 것과 같이 NQ 펩타이드의 성숙된 형태는 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열을 가짐과 동시에 Gly이 있는 카르복실기 말단이 아미드화 되어 있다. 또한 몇몇의 경골어류와 양서류에서는 NQ 펩타이드의 유사체가 존재한다. 그러므로 NQ 펩타이드의 활성에 있어서 중요한 아미노산을 검증하는 작업은 매우 중요하다.

이를 위해, 본 연구진은 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열들 중에서 첫 번째 Asn부터 열 번째 Leu까지 만을 서열화하는 결손 변이체와 두 번째의 Trp, 열한 번째의 Lys 각각이 D-form의 Trp 및 Lys 광학이성질체로 변형된 형태의 광학이성질체 변이체1 및 광학이성질체 변이체2를 합성하였다.

시각교차위핵이 포함된 뇌 슬라이스를 배양하면서 서열번호 2나 3으로 표시되는 NQ 펩타이드 또는 상기 3가지 NQ 펩타이드 변이체를 각각 처리하였다. 특히 인간과 생쥐 종에서 발견되는 서열 2로 표시되는 NQ 펩타이드의 처리는 이들의 특이적인 효과를 좀 더 명확히 검증하고자 중성화 (neutralization) 물질로서 a-NQ-S 항체를 동시에 처리하였다.

인간과 생쥐 종에서 발견되는 서열번호 2의 NQ 펩타이드와 흰쥐 종에서 발견되는 서열번호 3의 NQ 펩타이드 형태는 모두 Per2의 일주기적 활성에 있어서 전진 효과를 야기하였다. 그러나 이를 중성화 하기 위해 a-NQ-S 항체를 동시에 처리한 경우는 그 효과가 억제 되었다. 한편, 여러 가지 NQ 펩타이드의 변이체들의 처리에서는 모두 일주기적 전진 효과를 나타내지 못하였다. 이로써 서열번호 2로 표시되는 NQ 펩타이드의 아미노산 서열에서, 두 번째의 Trp과 열한 번째의 Lys 뿐만 아니라, 열한 번째의 Lys부터 Gln까지를 서열화하는 카르복실기 말단이 NQ 펩타이드의 생리적 활성에 매우 중요함을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

1. 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, C-말단에 있는 글루타민 잔기의 말단이 아미노기인 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 C12orf39 유전자, 서열목록 제9서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NQ 펩타이드의 cDNA 또는 서열목록 제9서열의 NQ 펩타이드의 cDNA에서 서열 106번부터 147번 또는 150번까지의 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 생체리듬 조절용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 생체리듬 장애의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 생체리듬 조절용 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 생체리듬 장애는 시차증후군 (jet lag syndrome), 교대 근무 수면장애 (Shift Work Sleep Disorder)의 외인성 (extrinsic) 일주기수면장애, 수면위상지연증후군 (Delayed sleep phase syndrome, DSPS), 수면위상전진증후군 (Advanced sleep phase syndrome, ASPS), 비 24시간 수면-각성 증후군 (non-24-hour sleep-wake syndrome, non-24), 불규칙 수면-각성 양상 (Irregular sleep-wake pattern)의 내인성 (intrinsic) 일주기 수면장애 및 계절정동장애 (Seasonal Affective Disorder, SAD), 우울증 (depression), 조울증 (bipolar disorder)의 기분장애 (mood disorder), 및 위상 지연(phase delay) 또는 위상 전진(phase advance)에 의한 불면증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생체리듬 조절용 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 시각교차위핵 또는 고삐핵에 작용하는 것을 특징으로 하는 생체리듬 조절용 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 별아교세포 (astrocyte)에 작용하는 것을 특징으로 하는 생체리듬 조절용 조성물.
   
6. 다음을 포함하는 생체리듬 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
   (a) 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, C-말단에 있는 글루타민 잔기의 말단이 아미노기인 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 C12orf39 유전자, 서열목록 제9서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NQ 펩타이드의 cDNA 또는 서열목록 제9서열의 NQ 펩타이드의 cDNA에서 서열 106번부터 147번 또는 150번까지의 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열의 약제학적 유효량; 및
   (b) 약제학적으로 허용되는 담체.
   
7. (i) 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, C-말단에 있는 글루타민 잔기의 말단이 아미노기인 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, (ii) 서열목록 제6서열의 펩타이드 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, (iii) 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 C12orf39 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브 또는 (iv) 서열목록 제9서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NQ 펩타이드의 cDNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 생체리듬 장애 진단용 조성물.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 생체리듬 장애는 시차증후군 (jet lag syndrome), 교대 근무 수면장애 (Shift Work Sleep Disorder)의 외인성 (extrinsic) 일주기수면장애, 수면위상지연증후군 (Delayed sleep phase syndrome, DSPS), 수면위상전진증후군 (Advanced sleep phase syndrome, ASPS), 비 24시간 수면-각성 증후군 (non-24-hour sleep-wake syndrome, non-24), 불규칙 수면-각성 양상 (Irregular sleep-wake pattern)의 내인성 (intrinsic) 일주기 수면장애 및 계절정동장애 (Seasonal Affective Disorder, SAD), 우울증 (depression), 조울증 (bipolar disorder)의 기분장애 (mood disorder), 및 위상 지연(phase delay) 또는 위상 전진(phase advance)에 의한 불면증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.

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