KR101323580B1 - ｐｈｎＦ 단백질 등을 이용하여 항균 감수성 증강제를 스크리닝하는 방법 - Google Patents

ｐｈｎＦ 단백질 등을 이용하여 항균 감수성 증강제를 스크리닝하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 phnF 단백질 등을 이용하여 항균 감수성 증가제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 phnF 단백질 등을 이용하여 항균 감수성 증강제를 스크리닝하는 방법을 이용하면, 기존 항균제의 항균력을 회복시킬 수 있는 물질을 제공할 수 있다.

Description

ｐｈｎＦ 단백질 등을 이용하여 항균 감수성 증강제를 스크리닝하는 방법 {Method for screening enhancer of an antimicrobial agent using phnF protein and on the like}
본 발명은 phnF 단백질 등을 이용하여 항균 감수성 증가제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
암 등 중증 질환 환자 증가로 인한 면역기능 부전자 증가로 매년 입원환자 중 5-10%, 약 400만 명의 의료관련 감염이 발생하고 있고, 이로 인한 항균제 비용은 연 15억 달러로 추산되며 연 5.1%씩 성장하고 있다(Datamonitor, 2007).
1960년대와 1970년대 초반까지 항균제 개발에 괄목할 만한 성과가 있었고, 이를 통하여 많은 감염증이 치료되었다. 그러나 40 여년이 지난 요즈음에도 감염병은 세계적으로 2번째 흔한 사인이자 (WHO Report-2002) 미국 내에서는 3번째 사인으로 보고되어서 (Pinner RW. JAMA. 1996:275:189-93) 그 심각성이 줄어들지 않고 있다. 더군다나 최근 여러 항균제에 내성인 세균이 출현, 증가하고 있어서 약제 선택의 폭이 현저히 줄어들고 있다. 내성 세균의 출현은 항균제의 사용으로 촉진되며, 일단 출현한 내성 세균은 항균제의 사용이나 비위생적인 환경으로 확산된다. 우리나라의 KONSAR 자료에 의하면 주요 의료관련 감염균인 Klebsiella pneumoniae의 세프타지딤(ceftazidime) 내성율은 25-35%에 이르고 있고 플루오로퀴노론(fluoroquiolone) 내성은 2002년 10% 이하였으나 2004년 30%이상으로 증가하였다. 이는 extended-spectrum beta-lactamase 등의 광범위 항균제 분해 효소 생성균 증가가 중요한 원인으로 판단된다.
이와 같은 세계적인 그람음성 세균에서의 항균제 내성율 증가로 드디어 치료 가능한 항생제에 모두 내성인 pandrug-resistant gram-negative bacilli가 출현하게 되었다. 더군다나 Enterobacteriaceae, glucose-nonfermenting bacilli 모두에서 이들이 증가하고 있어서 더욱 심각한 문제라고 할 수 있다.
이에 본 발명자들은 항균제 내성 세균 문제를 궁극적으로 해결하기 위하여 기존 항균제의 항균력을 부활시키는 후보 물질을 찾기 위해 노력한 결과, phnF 유전자 등을 결실(knock out)시킴으로써 기존 항균제의 항균력을 회복시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 PhnF 단백질 등을 이용하여 항균 감수성 증강제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여,
(a) 서열번호 1로 표시되는 PhnF 단백질 또는 서열번호 3으로 표시되는 유전자가 발현된 단백질을 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단백질의 양 또는 활성이 감소조절(down regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항균 활성을 증가시키는 물질임을 판별하는 단계를 포함하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 다른 구체예에서,
(a) 서열번호 1로 표시되는 PhnF 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 3으로 표시되는 유전자를 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 유전자의 발현량이 감소조절(down regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항균 활성을 증가시키는 물질임을 판별하는 단계를 포함하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법을 제공하며, 이 때 상기 PhnF 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 구체예에서,
(a) 서열번호 4로 표시되는 단백질을 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단백질의 양 또는 활성이 증가조절(up regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항균 활성을 증가시키는 물질임을 판별하는 단계를 포함하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 또 다른 구체예에서,
(a) 서열번호 4로 표시되는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 유전자의 발현량이 증가조절(up regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항균 활성을 증가시키는 물질임을 판별하는 단계를 포함하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법을 제공하며, 이 때 상기 서열번호 4로 표시되는 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 5로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항균제는 페니실린계, 세팔로스포린계 또는 카바페넴계 항균제인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 항균제는 이미페넴 또는 메로페넴인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시료"는 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 양 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRCpress), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.
RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시료를 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 단일가닥 cDNA를 제조한다. 이어, 단일가닥 cDNA를 주형으로 이용하고, 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 유전자-특이적 프라이머 세트는 하기 표 2에서 열거 되어 있다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 유전자의 발현량 변화를 측정한다.
단백질의 양의 변화는 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 표지된 단백질-특이 항체가 이용될 수 있다. 본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 시료가 처리된 세포로부터 추출물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계 (ⅱ) 단백질-특이 항체와 상기 세포 추출물을 반응시키는 단계 (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. 상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 및 o-페닐렌디아민(OPD)과 같은 기질이 이용될 수 있다. 상기 ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 "항균제"는 세균 및/또는 곰팡이류의 번식을 억제하는 것으로, 무기계 항균제, 유기계 천연물 추출계 항균제, 유기계 지방족 화합물 항균제 및 유기계 방향족 화합물 항균제를 포함한다. 또한, 이에 한정되지 않지만, 무기계 항균제로서는, 차아염소 나트륨으로 대표되는 염소 화합물 과산화 수소로 대표되는 과산화물 붕산, 붕산 나트륨으로 대표되는 붕산 화합물 황산동으로 대표되는 동화합물 황산 아연, 염화 아연으로 대표되는 아연 화합물 유황, 다황산 석회, 수화 유황으로 대표되는 유황계물 산화 칼슘으로 대표되는 칼슘 화합물 티오술파이트 은착염, 질산은으로 대표되는 은화합물 그 밖에, 옥소(沃素), 실리코플루오리드 나트륨 등을 들 수 있고, 유기계 천연물 추출계 항균제로서는, 히노키티올, 맹종죽(孟宗竹) 추출액, 크레오소트유(油) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 항균제는 페니실린계(Penicillin), 세팔로스포린계(cephalosporin) 또는 카바페넴계(carbapenem) 등이 있다.
본 발명에 따른 PhnF 단백질 등을 이용하여 항균 감수성 증강제를 스크리닝하는 방법을 이용하면, 기존 항균제의 항균력을 회복시킬 수 있는 물질을 제공할 수 있다.
도 1은 pBTK30을 나타낸 것이다.
도 2은 특정 유전자를 넉아웃시킨 균주의 클론성을 확인하기 위하여 엔도뉴클레아제 SpeⅠ으로 PFGE 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다(1번 및 7번 레인:마커, 2번 레인:YMC7-M09-943034, 3번 레인:Y6 70317, 4번 레인:Y7 70318-2; 5번 레인:Y2 70320-18; 6번 레인:Y3 70320-40).
도 3는 특정 유전자를 넉아웃시킨 균주의 외막 단백질(outer membrane protein) 및 시토졸 단백질(cytosolic protein)을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타낸 것이다(1번 및 7번 레인:마커, 2번 내지 6번 레인:YMC7-M09-943034, Y6 70317, Y7 70318-2, Y2 70320-18, Y3 70320-40의 외막 단백질, 8번 내지 12번 레인:YMC7-M09-943034, Y6 70317, Y7 70318-2, Y2 70320-18, Y3 70320-40의 시토졸 단백질).
도 4은 Q-TOF를 이용한 단백질 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
병원성 세균 은행 및 항균제 감수성 자료의 준비
병원성 세균 은행을 확보하기 위하여 Enterobacteriaceae (Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Proteus mirabilis) 등, Pseudomonas spp/ Acinetobacter spp/ Stenotrophomonas maltophilia/ Burkholderia cepacia 등, Staphylococcus spp. Enterococcus spp. 등의 균주를 준비하였다.
또한, 다제 내성 병원균을 선별하기 위하여 페니실린계(Penicillin), 세팔로스포린계(cephalosporin), 카바페넴계(carbapenem), 아미노글리코시드계(Aminoglycoside) 항생제의 감수성 자료를 확보하였다. MIC(minimal inhibitory concentraion) 값은 액체배지희석법(microbroth dilution method) 또는 한천희석법(agar dilution method)이나 디스크 확산법(disk diffusion method)으로 측정하였다.
항균제의 항균력을 회복시키는 유전자의 검출
앰피실린(ampicillin)에 대한 MIC값 100 mg/ml, 젠타마이신(gentamicin)에 대한 MIC값 25 mg/ml을 가지고, DAP (Diainopimelic acid) 요구성 10 mg/ml을 가지는 Escherichia coli (pBTK30)를 이용하여, LB 플레이트(AMP100 mg/ml /GM 25 mg/ml)에 DAP 100 ml를 spread하여(최종 50 mg/ml) 배양하였다.
젠타마이신 감수성을 가지는 와일드타입 균주에 pBTK30를 전달하고(Agar with DAP only), 특정 시험 항균제에 대하여 감수성이 감소 혹은 증가된 transconjugant를 선별하였다(Agar with GM only). Flanking PCR을 이용하여 이들 균주에 트랜스포존이 삽입된 위치를 확인하고, MIC의 패턴 변화를 확인하였다(Agar or broth dilution).
트랜스포존 삽입 위치 확인을 위한 Flanking PCR
트랜스포존이 삽입된 위치를 확인하기 위하여 Flanking PCR을 이용하였으며, 이때 PCR 반응조건은 다음과 같다.
1차 PCR
Rnd1-BTK30: 5'-CACCGCTGCGTTCGGTCAAGGTTC-3'
Rnd1-PA01: 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNGATAT-3'
95℃ 5분
94℃ 30초, 30℃ 30초, 72℃ 1분 15초 X 6 회
94℃ 30초, 65℃ 30초, 72℃ 1분 15초 X 30 회
72℃ 5분
2차 PCR
Rnd2-BTK30: 5'-CGAACCGAACAGGCCTTATGTTCAATTC-3'
Rnd2-PA01: 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'
Rnd2- 2차 PCR
95℃ 5분
94℃ 30초, 68℃ 30초, 72℃ 1분 15초 X 30 회
72℃ 5분
트랜스포존 삽입위치 확인용 프라이머: BTK30-seq 5'-TGGTGCTGACCCCGGATGAAG-3'
막 단백질 분류 방법
오버나이트 배양액(overnight culture)을 준비한 다음, 13000rpm에서 10분 동안 오버나이트 배양액 1ml를 스핀다운시켰다. 10 mM Tris (pH6.8)의 300 ul으로 셀펠렛(cell pellet)을 재서스팬션하였다. Dry ice/EtOH 또는 영하 80℃로 현탁액을 동결시킨 후, 상온의 water bath를 이용하여 동결된 현탁액을 해동시켰다. 상기 과정을 두 번 더 수행한 후 15초 동안 초음파를 처리하고(sonication) 1분 동안 얼음에서 식혀주었다. 초음파 처리를 두 번 더 수행하고, 13000rpm에서 10분 동안 스핀다운시켰다. 용액 상태 세포 추출물로 상등액을 취하여 10 mM Tris (pH6.8)의 100 ul로 막을 포함하는 펠렛을 재서스팬션하였다.
SDS - PAGE , Q- TOF 를 이용한 단백질 동정
시험 세균을 50ml LB Broth에 오버나이트 배양하고, 5,000 g로 20 분간 원심분리하였다. 로딩 버퍼(Loading buffer) 5 ul(62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% glycerol, 1% β-mercaptoethanol, 0.02% bromophenol blue, 2% SDS)와 샘플 15 ul를 혼합한 후 5분간 끓인 다음, 이를 원침한 후 15% Tris-HCl SDS Gel (BIO-RAD)에 마커(Promega Broad range protein V 849)와 함께 로딩하였다. BIO-RAD EP machine으로 30 V에서 30 분간 전기영동한 후 1 시간동안 40% MeOH/ 브로모페놀블루(bromophenol blue(without acetic acid))로 염색하였다. 이를 50% MeOH로 overnight destaining 하였다.
SDS PAGE gel에서 단백 밴드를 채취하여 10 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)과 0.1 M NH4HCO3 용액으로 56℃에서 30분간 가온하여 부유시키고, 티올 그룹을 20 mM 요오드아세트아미드(iodoacetamide)로 암소에서 30분간 알킬화하였다. 채취한 단백 밴드를 4 ℃에서 45분간 digestion buffer (0.05 M NH4HCO3와 10 ng/㎕의 modified porcine trypsin (Promega, Madison, WI))으로 재수화하였다. 남은 상청액을 제거하고 gel 조각을 0.05 M NH4HCO3 버퍼로 덮은 후, 37℃에서 overnight하여 단백질을 처리하였다. 최종적으로 Oasis HLB cartridge (Waters, Milford, MA)로 탈염하고, 건조한 후 2% CH3CN (in water)에서 재부유하였다.
자가제조한 pulled tip capillary column (75-㎛ i.d., 360-㎛ o.d., 15 ㎝)을 장착한 Q-TOF Ultima mass spectrometer (Waters)을 이용한 CapLC로 Nanoflow LC-ESI-MS-MS 시험을 수행하였다. 펩타이드 이온(Peptide ion)은 3회의 data-dependent MS-MS scan 후에 MS precursor scan (300-170 amu) data-dependent 분석 mode에서 검출였다. Mascot Search program과 NCBI 데이터베이스를 이용하여 수집된 MS/MS spectra를 분석하였다. Mass tolerance는 precursor peptide와 peptide fragment ions의 molar masses는 100 ppm으로 하였고, 최소 Mascot score 49 이상이 되어야 extensive homology가 있는 것으로 인정하였다.
유전자 결실에 따른 MIC 값의 변화 확인
항균제 내성을 가지는 균주를 선택하기 위하여, 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem), 에르타페넴(ertapenem) Hodge 실험에서 양성을 보이는 카베페넴 분해효소를 생성하는 균주(YMC7-M09-943034 Enterobacter aerogenes)를 선택하였다. 균주는 EDTA-SMA와 clavulanic acid double-disk synergy 시험에서 음성을 나타내었다(표 1).
시험
　		 　
　
 YMC7-M09-943034
Enterobacter　
aerogenes
MICs (mg/ml)
　		 Imipenem 4
Meropenem 3
Hodge with:
　
　
　		 Imipenem +
Meropenem +
Ertapenem +
Cefoxitin +
Imipenem Double-disk synergy test with: EDTA-SMA -
APBA +
CLA -
Meropenem Double-disk synergy test with: EDTA-SMA -
APBA +
CLA -
Ertapenem Double-disk synergy test with:
　		 EDTA-SMA -
APBA +
CLA -
Cefoxitin Double-disk synergy test with:
 EDTA-SMA -
APBA -
CLA -
선별된 균주에 대하여 특정 유전자들을 결실(knock out)시킨 후 replica plate법으로 각각 1500개 콜로니들의 이미페넴 및 메로페넴 감수성 변화를 측정하여, 이미페넴 및 메로페넴에 대한 MIC 값이 와일드 타입에 비하여 감소 또는 증가한 3개의 균주를 선택하였다. 그 중에서, 이미페넴 및 메로페넴에 대한 MIC 값이 각각 0.094μg/ml와 0.125μg/ml로 현저히 감소한 두 개의 균주를 확인하였다:Y3 70320-40, Y6 70317. 이들 두 균주에서 트랜스포존에 의해 결실된 유전자는 각각 phosphonates metabolism transcriptional regulator(PhnF)와 가설 단백질의 유전자였다(표 2). 한편, 그 중에서 이미페넴 및 메로페넴에 대한 MIC값이 증가한 균주를 확인하였다: Y2 70320-18(표 2). 이 균주에서 트랜스포존에 의해 결실된 유전자는 transporter, major facilitator family 유전자였다(표 2).
또한, 와일드 타입 균주 및 변이 균주 각각에서의 항균제 감수성 변화를 디스크 확산법으로 확인한 결과, 페니실린(Penicillin), 세팔로스포린(cephalosporin), beta-lactamase 병합제제, 카바페넴(carbapenem), 트리메토프림-설파메톡사졸(trimethoprim-sulfamethoxazole), 플루오로퀴노론(fluoroquinolone), 미도싸이클린(midocycline), 아미노글리코시드(aminoglycoside) 까지 영향이 있음을 확인하였다(표 3).
균주 　
 MIC (mg/ml) 결실 유전자 Accession No. of Ref. sequence 삽입 부위
IPM MEM
와일드타입 YMC7-M09-943034 4 3 - - -
돌연변이

 Y2 70320-18 >32 >32 Transporter, major facilitator family CP000964 302,286　
Y3 70320-40 0.094 0.125 Phosphonates metabolism transcriptional regulator, PhnF CP000964 5,221,700　
Y6 70317

 0.125

 0.25

 Hypothetical protein KPN_01406 [Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578] NC_009648


 1,566,974　
항균제 디스크 확산법 시험의 억제대 지름, mm
와일드타입 결실 균주
YMC7-M09-943034 Y6-70317 Y3-703020-40 Y2-70320-18
Ampicillin 6 20 6 6
Cephalothin 6 6 6 6
Ampicillin-sulbactam 6 21 7 6
Imipenem 14 39 35 13
Piperacillin 16 34 18 13
Meropenem 12 35 28 13
Cefepime 20 38 31 18
Cefotaxime 6 36 29 6
Ceftazidime 10 36 28 6
Aztreonam 10 40 31 6
Cefoxitin 6 11 10 6
Trimethoprim-sulfamethoxazole 23 30 23 23
Levofloxacin 27 35 28 29
Piperacillin-tazobactam 15 34 28 12
Amikacin 24 28 24 20
Gentamicin 24 10 9 6
Minocycline 18 25 19 17
Tobramycin 30 28 23 20
AmpC β- lactamase 의 소실 확인
특정 유전자를 결실시킨 균주들의 외막 단백질과 시토졸 단백질을 SDS-PAGE 분석한 결과 외막 단백질은 와일드타입과 돌연변이 모두에서 동일하게 나타났다(도 3). 한편, 시토졸 단백질의 분석 결과, 와일드타입에 비하여 이미페넴 MIC가 현저히 감소한 두 개의 균주(Y3 70320-40, Y6 70317)에서 약 35 kDa 크기의 단백질 밴드가 소실되었음을 관찰하였다. 야생 균주의 해당 밴드의 단백질을 추출하여 Q-TOF로 동정한 결과 Enterobacter aerogenes의 AmpC b-lactamase인 것을 확인하였다(도 4).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (18)

  1. (a) 서열번호 1로 표시되는 PhnF 단백질 또는 서열번호 3으로 표시되는 유전자가 발현된 단백질을 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 단백질의 양 또는 활성이 감소조절(down regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항균 활성을 증가시키는 물질임을 판별하는 단계를 포함하는 페니실린계, 세팔로틴을 제외한 세팔로스포린계, 세파마이신계, 모노박탐계 또는 카바페넴계 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 페니실린계 항균제는 앰피실린, 앰피실린-설박탐, 피페라실린-타조박탐 또는 피페라실린인 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 세팔로스포린계 항균제는 세페핌, 세포탁심 또는 세프타지딤인 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 세파마이신계 항균제는 세폭시틴이거나, 모노박탐계 항균제는 아즈트레오남이거나, 카바페넴계 항균제는 이미페넴, 메로페넴 또는 미니사이클린인 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  5. (a) 서열번호 1로 표시되는 PhnF 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 3으로 표시되는 유전자를 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 유전자의 발현량이 감소조절(down regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항균 활성을 증가시키는 물질임을 판별하는 단계를 포함하는 페니실린계, 세팔로틴을 제외한 세팔로스포린계, 세파마이신계, 모노박탐계 또는 카바페넴계 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 PhnF 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 페니실린계 항균제는 앰피실린, 앰피실린-설박탐, 피페라실린-타조박탐 또는 피페라실린인 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  8. 제 5항에 있어서,
    상기 세팔로스포린계 항균제는 세페핌, 세포탁심 또는 세프타지딤인 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  9. 제 5항에 있어서,
    상기 세파마이신계 항균제는 세폭시틴이거나, 모노박탐계 항균제는 아즈트레오남이거나, 카바페넴계 항균제는 이미페넴, 메로페넴 또는 미니사이클린인 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  10. (a) 서열번호 4로 표시되는 운반체 단백질을 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 단백질의 양 또는 활성이 증가조절(up regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항균 활성을 증가시키는 물질임을 판별하는 단계를 포함하는 페니실린계, 세팔로틴을 제외한 세팔로스포린계, 세파마이신계, 모노박탐계 또는 카바페넴계 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 페니실린계 항균제는 앰피실린, 앰피실린-설박탐, 피페라실린-타조박탐 또는 피페라실린인 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 세팔로스포린계 항균제는 세페핌, 세포탁심 또는 세프타지딤인 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 세파마이신계 항균제는 세폭시틴이거나, 모노박탐계 항균제는 아즈트레오남이거나, 카바페넴계 항균제는 이미페넴, 메로페넴 또는 미니사이클린인 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  14. (a) 서열번호 4로 표시되는 운반체 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 유전자의 발현량이 증가조절(up regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항균 활성을 증가시키는 물질임을 판별하는 단계를 포함하는 페니실린계, 세팔로틴을 제외한 세팔로스포린계, 세파마이신계, 모노박탐계 또는 카바페넴계 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 서열번호 4로 표시되는 운반체 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 5로 표시되는 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 페니실린계 항균제는 앰피실린, 앰피실린-설박탐, 피페라실린-타조박탐 또는 피페라실린인 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  17. 제 14항에 있어서,
    상기 세팔로스포린계 항균제는 세페핌, 세포탁심 또는 세프타지딤인 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
  18. 제 14항에 있어서,
    상기 세파마이신계 항균제는 세폭시틴이거나, 모노박탐계 항균제는 아즈트레오남이거나, 카바페넴계 항균제는 이미페넴, 메로페넴 또는 미니사이클린인 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
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