KR101302440B1

KR101302440B1 - 전기유체역학 플로팅 장치, 방법 및 이에 의하여 제조되는 3차원 적층 구조체

Info

Publication number: KR101302440B1
Application number: KR1020110131592A
Authority: KR
Inventors: 김근형; 안승현; 이형진
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2011-12-09
Filing date: 2011-12-09
Publication date: 2013-09-02
Also published as: KR20130064952A

Abstract

본 발명은 전기유체역학 플로팅 장치, 방법 및 이에 의하여 제조되는 3차원 적층 구조체에 관한 것으로서, 전기장 형성에 의해 발생하는 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 구조체가 형성되는 스테이지를 점성 용액 내에 위치시킴으로써 표면이 거칠고, 흡수능이 우수하고, 세포의 부착과 증식 효과가 우수한 3차원 적층 구조체를 제조하였다.

Description

전기유체역학 플로팅 장치, 방법 및 이에 의하여 제조되는 3차원 적층 구조체 {Electrohydrodynamic plotting device, method and 3 dimensional layered scaffold prepared from the method}

조직재생에 있어서, 생체재료 (biomaterials)의 물리적 구조는 신호 표현 및 이어지는 시딩 세포의 분화에 영향을 미칠 수 있다 (Freed, L. E. et al., Biotechnology 1994, 12, 689, Griffith, L. G.; Naughton, G. Science 2002, 295, 1009.). 특히, 공극률과 공극 크기는 중간엽 줄기세포의 골모세포로의 분화 및 세포외 기질의 생성에 영향을 줄 수 있다 (Karageorgiou, V.; Kaplan, D. Biomaterials 2005, 26, 5474, Betz, M. W. et al., Biomacromolecules 2010, 11, 1160.). 그리하여, 다양한 생체 적합 물질 (콜라겐, 키토산, 합성 폴리머 및 바이오세라믹)의 물리적 구조는 생체의학적 구조체를 제조함에 있어서 중요한 디자인의 매개변수이다. 생체의학적 구조체를 제조하는 데는 상 분리 (Bang, S.-H. et al., J. Mater . Chem. 2011, 21, 4523), 기체 형성 (Barbetta, A. et al., Soft Matter 2010, 6, 5213), 공극형성물질을 이용한 용탈 (porogen-leaching) (Oh, S. et al., Biomaterials 2003, 24, 4011) 및 전기방사 (Cipitria, A. et al., J. Mater . Chem. 2011, 21, 9419. Zhang, H. B. et al. Key Eng . Mater . 2007, 330-332, 139)를 포함하는 몇 가지 제조방법이 이용되고 있다. 이 방법들은 다공성 구조체를 만들어내지만, 미세공극 구조의 제어는 현재까지 풀어야 할 과제가 되고 있다. 최근 용융 플로팅 (melt-plotting), 선택적 레이저 소결 (selective laser sintering), 스테레오리소그래피 (stereolithography), 3D 프린팅 및 FDM (fuse deposition modeling)과 같은 임의형상제작 (solidfreeform fabrication; SFF) 방법이 관심을 끌고 있는데, 그 이유는 이들 방법으로 공극률, 공극 크기, 상호 연결성 및 기계적 성질이 제어된 구조체를 제조할 수 있고, 조직 재생 및 분화에서 다양한 세포 신호에 영향을 줄 수 있기 때문이다 (Landers, R. et al., J. Mater . Sci . 2002, 37, 3107, Sachlos, E.; Czernuszka, J. T. Eur . Cells Mater . 2003, 5, 29, Hutmacher, D. W. et al., Trends Biotechnol . 2004, 22, 354, Kim, K. et al., Tissue Eng ., Part B 2010, 16, 523, Yeo, M. G. et al., Biomacromolecules 2011, 12, 502, Mulhaupt, R. et al., Eur . Cells Mater . 2003, 6, 12, Dalton, P. D. et al., Biomaterials 2009, 30, 701). 이러한 방법들이 현저한 가능성을 내포하고 있긴 하지만, 고비용, 저해상도 지주 (low-resolution struts), 원료의 제한, 장시간의 공정 및 최초 세포 부착 및 증식을 악화시키는 매끄러운 구조체 표면과 같은 단점이 있다 (Yeo, M. G. et al., Biomacromolecules 2011, 12, 502, Mulhaupt, R. et al., Eur . Cells Mater . 2003, 6, 12, Dalton, P. D. et al ., Biomaterials 2009, 30, 701). 직접전사방법인 전기유체역학적 젯트 프린팅 (Electrohydrodynamic (EHD) jet printing)은 기질 상에 마이크로 또는 나노 크기의 구조를 제작하는데 이용되어 왔다 (Rasekh, M. et al., Adv . Eng . Mater . 2011, 13, B296). 다양한 전기유체역학 프린팅은 전자 분야 (Sirringhaus, H. et al., Science 2000, 290, 2123, Shimoda, T. et al., Nature 2006, 440, 783), 정보통신 디스플레이 (Chang, S.-C. et al. Adv . Mater . 1999, 11, 734, Hebner, T. R.; Sturm, J. C. Appl . Phys . Lett . 1998, 73, 1775), 광학 필름 (Ahn, S. H.; Kim, G. H. Appl . Phys . A: Mater . Sci . Process . 2009, 97, 125.), 신약 개발 (drug discovery) (Heller, M. J. Annu . Rev . Biomed . Eng . 2002, 4, 129), 미세기계장치 (micromechanical devices) (Bietsch, A. et al., Nanotechnology 2004, 15, 873) 및 다른 분야들에서 이용되어 왔다 (Hiller, J. et al., Nat . Mater . 2002, 1, 59). 전기유체역학 프린팅은 전기장 하에서 액체 원뿔의 정점에서 생성되는 가는 분류물을 이용한 패터닝 방법이다 (Jayasinghe, S. N.; Edirisinghe, M. J.; De Wilde, T. A. Mater . Res . Innovations 2002, 6, 92). 분류물이 기질 상에 놓일 때 용매 증발 후 기질 상에는 마이크로/나노입자의 미세한 패턴이 남게 된다. 그리하여 전기유체역학 프린팅은 고체상의 마이크로/나노입자 또는 폴리머 방울로 이루어지는 미세 패턴 제조에 이용되어 왔다. 최근 Edirsinghe 등은 전기유체역학 직접전사 방법을 생체의학 구조체 제조에 이용하여 미리 디자인된 설계도에 따라 생분해성 코폴리머 재질의 미세 섬유 (<50 ㎛)를 제조하였다 (Gupta, A. et al., J. Bioact . Compat. Polym . 2007, 22, 265). 이들은 이 기술을 응용하여 골유도성 세라믹 및 폴리우레탄의 혼합물로 생체의학 구조체를 제조하는 기술로 확장하였다 (Ahmad, Z.; Rasekh, M.; Edirisinghe, M. Macromol . Mater . Eng . 2010, 295, 315). 이 기술은 그 공정이 간단하고, 저비용이며, 마이크로에서 나노 스케일에 이르는 넓이를 가진 미세 구조물을 손쉽게 형성할 수 있기 때문에 혁신적이었다. 그러나, 저자들이 밝힌 바와 같이, 3차원 구조체 (>2mm 두께)를 제조하기 위해서는 공정이 개선되어야할 필요가 제기되었다. 왜냐하면 이 공정에 의해 제조된 구조체는 얇고 부드러워서 층층이 쌓는 구조를 제어하기가 어렵기 때문이다 (Gupta, A. et al., J. Bioact . Compat . Polym . 2007, 22, 265, Ahmad, Z.; Rasekh, M.; Edirisinghe, M. Macromol . Mater . Eng . 2010, 295, 315).

본 발명은 종래 전기유체역학 프린팅 방법을 응용하여 전기유체역학 플로팅으로 적층 구조의 3차원 생체적합성 구조체를 형성하는 방법을 제공하려는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 표면이 거친 적층 구조의 3차원 생체적합성 구조체를 제공하려는 것을 목적으로 한다.

종래의 전기유체역학적 프린팅으로 생체의학적 구조체를 제조하는 방법의 한계를 극복하고, 다공성이 우수하고 표면이 거칠며 두께 2~3 ㎜까지 층층이 쌓아올리는 3차원 적층 구조체 제조를 위해 본 발명자들은 변형된 전기유체역학 공정을 제안하였다. 폴리카프로락톤이 골 손상 치료에서 골내 성장 (bone in-growth) 및 재생을 강화하는데 효과적으로 이용되고 있기 때문에 본 발명자들은 전기유체역학 플로팅의 일 실시예에서 폴리카프로락톤(이하 "PCL"과 혼용함)을 재료로 사용하였다. Boyan et al.에 따르면, 골아세포 (osteoblast)의 접착과 증식은 표면 지형과 기계적 자극에 매우 민감하므로 (Boyan, B. D. et al., Biomaterials 1996, 17, 137, Burg, K. J. L. et al., Biomaterials 2000, 21, 2347) 본 발명자들은 골 조직 재생에 표면이 매우 거친 PCL을 적용하였다. 통공 구조가 제어된 3차원 구조체를 형성하기 위해 변형 전기유체역학 플로팅 공정을 점성 폴리에틸렌옥사이드 용액을 이용한 지상 타겟 시스템(grounded target system)으로 보완하였다. 공정 윈도우를 결정하기 위해 PCL 중량 비율과 마지막 지주 상에 적용하는 전기장에 대해 연구하였다. 이 방법을 이용하여 본 발명자들은 지주 크기가 제어되고 높은 공극률 (>70%)을 나타내는 구조적으로 안정한 3차원 PCL 구조 (>2 mm 두께)를 제조하였다. 세포 생존율, ALP (alkaline phosphatase) 활성 및 제조된 구조체의 미네랄화는 골아세포-유사 세포 (MG63)를 배양하여 측정하였다.

구조체를 제조하기 위해 본 발명자들은 구조체가 부스러지는 것을 방지하고 플로팅되는 지주가 탄성을 갖도록 하기 위해 폴리에틸렌 용액 배쓰를 이용하여 통상적인 전기유체역학 직접 전사 방법을 변형하였다.

제조된 구조체는 표면 거칠기, 물 흡수력과 같은 물리적 성질뿐만 아니라 전기유체역학 공정으로 플로팅한 폴리카프로락톤 구조체에 대해 골아세포-유사 세포 (MG63)를 배양하여 생물학적 기능도 평가하였다. 본 발명의 변형된 전기유체역학 방법에 의하여 제조된 구조체는 일반 쾌속 조형 (rapid prototyping) 방법으로 제조된 PCL 구조체와 비교할 때 표면 거칠기가 현저히 우수하였으며, 흡수율이 400% 증대되었다. 일반 쾌속 조형 방법으로 제조된 구조체와 비교할 때 본 발명에 의하여 제조된 구조체의 세포 생존율, 알칼라인 포스파테이즈 활성 및 미네랄화 분석은 본 발명의 구조체에서 생물학적 특성들이 현저히 개선되었음을 보여주었다 (세포 생존율은 20배, 미네랄화는 6배 개선됨). 이러한 결과를 볼 때 본 발명의 변형된 전기유체역학 직접 전사 방법은 조직공학에서 3차원 생물의학적 구조체를 제조하는 유용한 도구가 될 수 있을 것이다.

본 발명은 3차원 구조체를 형성하기 위한 전기유체역학 플로팅 장치(Electrohydrodynamic plotting, EHD plotting)에 있어서,

전도성 액체를 일정한 전기유체역학적 압력으로 분류(jet)하는 노즐을 구비하는 액체 공급부;

상기 노즐로부터 이격된 거리에 위치하고 노즐에서 분류되는 전도성 액체가 적층되는 스테이지;

상기 스테이지가 잠기도록 점성 용액이 들어 있는 타겟 용액 배쓰;

상기 노즐과 상기 스테이지 사이에 전기장을 형성하는 상부전극과 하부전극;

상기 노즐과 상기 상부전극, 상기 하부전극에 전압을 인가하는 전원공급장치; 및

상기 상부전극, 상기 하부전극에 인가하는 전압을 제어하기 위한 제어부;를 포함하는 것을 특징으로 하는 전기유체역학 플로팅 장치를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 노즐의 움직임을 제어하는 3차원 플로터;가 더 포함됨을 특징으로 하는 장치를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 3차원 플로터가 3축 로봇임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 전도성 액체를 일정한 전기유체역학적 압력으로 분류(jet)하는 노즐을 구비하는 액체 공급부; 상기 노즐로부터 이격된 거리에 위치하고 노즐에서 분류되는 전도성 액체가 적층되는 스테이지; 상기 스테이지가 잠기도록 점성 용액이 들어 있는 타겟 용액 배쓰; 상기 노즐과 상기 스테이지 사이에 전기장을 형성하는 상부전극과 하부전극; 상기 노즐과 상기 상부전극, 상기 하부전극에 전압을 인가하는 전원공급장치; 및 상기 상부전극, 상기 하부전극에 인가하는 전압을 제어하기 위한 제어부;를 포함하는 전기유체역학 플로팅 장치를 이용한 전기유체역학 플로팅 방법에 있어서,

(a) 액체 공급부 내부에 전도성 유체를 수용하는 단계;

(b) 타겟 용액 배쓰 내에 점성 용액을 가하는 단계;

(c) 상부 전극과 하부 전극 사이에 전압을 인가하고 전기장을 형성하는 단계;

(d) 상기 액체 공급부 내부의 전도성 유체를 노즐을 통해 점성 용액 내에 잠긴 스테이지로 분류하여 구조체를 형성하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 전기유체역학 플로팅 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 전도성 유체가 생체적합성 재료 (biocompatible materials)임을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 생체적합성 재료가 푸코이단, 콜라겐, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 점성 용액이 폴리에틸렌옥사이드, 알지네이트, 콜라겐, 히알루론산, 키토산 등을 비롯하여 점성을 갖는 생체적합성 물질임을 특징으로 한다. 상기 점성 용액은 본 발명의 전기유체역학 플로팅 장치가 구동할 때 진동 및 움직임에 의한 구조체의 유동이 발생하지 않을 정도의 점성이면 특별한 제한은 없다. 점성이 너무 낮은 경우에는 3차원 구조체 제작은 가능하나, 낮은 점성으로 인해 구조체가 여러 방향으로 움직이기 때문에 원하는 3차원 구조체 제작이 어려워지며, 전기장으로 인해 구조체의 유동이 발생하여 원하는 구조의 구조체 제작이 어려워진다. 또한, 점성이 지나치게 높아도 3차원 구조체 제작에 어려움이 있고, 점성 용액의 잔여 용매가 구조체 표면을 매끄럽게 만들어 거친 표면을 형성하지 못하는 문제점이 있다. 점성 용액의 구체적인 예로 콜라겐 4wt%, PEO 4~5 wt% (Mw 900,000), PEO 10 wt% (Mw 300,000), 알지네이트 10 wt% 등 다양한 점성 생체적합성 물질을 이용할 수 있다. 상기 점성 용액은 20 ℃ 기준으로 물이 1 cP의 점도를 나타낼 때 640 내지 45,000 cP의 점도 범위인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 (c) 단계에서 인가되는 전압이 분산전압 (breakup voltage)보다 낮음을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 생체적합성 재료에 하이드록시아파타이트 및 베타-트리칼슘인산 중 1종 이상이 부가되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조되며, 표면이 거칠고, 공극률이 60% 이상인 3차원 적층 구조체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 구조체가 골 구조 재생용임을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 구조체는 표면이 거칠어 세포가 부착하여 증식하기에 매우 적합하다.

또한, 본 발명에 의한 구조체는 잘 부스러지지 않고 2 ㎜ 이상의 두께로 안정된 적층구조를 형성할 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 구조체는 공극률이 60% 이상으로 매우 우수하여 영양성분의 이동, 세포의 이동 등이 원활하다.

또한, 본 발명에 의한 구조체는 미네랄화가 우수하여 골 세포 재생용으로 이용하기에 적합하다.

도 1은 본 발명의 표면 거칠기가 우수한 3차원 구조체 제조공정을 나타낸다. (a) 폴리에틸렌옥사이드 용액 배쓰에서 진행하는 전기유체역학 플로팅 공정을 나타낸다. (b) 노즐 팁과 바닥의 폴리에틸렌옥사이드 용액 사이 (40 mm)에 전압 (10 kV)을 걸어주어 안정된 원뿔-분류 모드에서 분류되는 용액 라인을 보여준다. (c)는 바닥에 폴리에틸렌옥사이드 용액 배쓰를 놓고 제조된 지주 (struts)의 SEM 이미지이고, (d)는 폴리에틸렌옥사이드 용액 배쓰 없이 제조된 지주의 SEM 이미지이다. 바닥에 폴리에틸렌옥사이드 용액 배쓰를 놓고 제조하였을 때 제조된 지주의 표면이 매우 거칠었다. (e) 위쪽은 본 발명의 일 실시예에 의해 제조된 구조체 (80 × 80 × 2 ㎣)의 광학 현미경 사진이고, 아래쪽은 구조체의 측면 사진이다.
도 2의 (a) 내지 (c)는 PCL 용액의 동일한 흐름 속도 (1 ㎖/h), 동일한 중량 비율 (15 wt%) 조건에서 전압을 달리하였을 때 (8, 10, 15 kV)의 노즐 팁의 용액 메니스커스를 나타내며, (d)는 적용된 전압 (Va)에 대한 변형 속도 (strain rate) 프로파일이다. 우측 상단의 그래프는 테일러 원뿔의 정점에서 분류하는 액상 분류물의 평균 직경 (dl)을 나타낸다. (e)는 전압 (Va)과 PCL의 중량 비율 (10, 15, and 20 wt %)이 구조체의 지주 직경 (ds)에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의해 제조된 PCL 구조체의 SEM 이미지이다. (a)는 통상의 전기유체역학 전사방법으로 제조된 구조체의 SEM 사진이다. 통공 크기 (347 ± 86 ㎛), 지주 크기 (205 ± 61 ㎛). (b)는 높은 전기장을 주어 지주와 파이버가 혼합된 상태를 보여주는 SEM 이미지이다. (c)는 본 발명의 방법에 따라 PEO 용액 배쓰 상에서 전기유체역학 방법으로 제조한 3차원 구조체의 거친 표면을 보여주는 SEM 사진이다. (d)와 (e)는 본 발명의 방법에 따라 제조된 구조체 (60 × 60 × 3 ㎣)의 표면 및 단면 사진이다.
도 4는 (a) 종래 방법으로 제조된 구조체 (RP-PCL)와 본 발명 방법으로 제조된 구조체 (EHD-PCL)의 상대적 흡수율을 나타낸 그래프이다 (n = 5). 시간 경과에 따라 물 한 방울 (5 ㎕)이 흡수되는 것을 찍은 사진이다. 물에 빨간 염료를 넣었다. (b-d)는 종래 방법에 의한 구조체, (e-g)는 본 발명에 의한 구조체. (h) 인장속도 상수 (0.2 ㎜/s)(n = 5)인 종래 방법에 의한 구조체 (RP-PCL)(공극률, φ: 56%) 및 본 발명 구조체 (EHD-PCL) (공극률, φ: 78%)의 응력 (σ)-변형률 (ε) 커브. * p<0.05는 유의미한 차이를 나타낸다.
도 5 (a), (b)는 본 발명의 구조체 상에 MG63 세포를 배양한 후 3일째의 SEM 사진이고, (c)는 통상의 방법에 의한 구조체 상에 MG63 세포를 배양한 후 3일째의 SEM 사진이다. (d) 구조체 상에 시드한 MG63 세포에 MTT 분석하여 세포 생존율을 나타내었다 (n = 5). (e)는 통상의 방법에 의한 구조체와 본 발명의 구조체 상에 5~10일간 배양한 MG63 세포의 알칼라인 포스파테이즈 (ALP) 활성을 측정한 것이다 (n = 5). (f) 7~14일 동안 구조체의 칼슘 미네랄화를 시험한 결과를 나타낸 그래프이다 (n = 5). (g,h) 통상의 방법에 의한 구조체 (RP-PCL)와 본 발명 구조체 (EHD-PCL)에 7일 후의 미네랄화를 ARS-염색으로 확인한 광학 현미경 사진이다. *p < 0.05는 유의미한 차이를 나타낸다.

이하, 본 발명의 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재범위 내로 한정되는 것이 아님은 당업자에게 자명하다. 특히, 본 발명의 실시예에서는 전도성 유체로서 폴리카프로락톤을 이용하였고, 타겟 용액 배쓰에 가하는 점성 용액으로서 폴리에틸렌옥사이드 용액을 이용하였으나, 이는 대표적인 실시예로서 본 발명의 구성 및 효과를 자세히 설명하기 위한 예시일 뿐, 다른 생체적합성 재료와 다른 점성 용액을 이용하여 본 발명을 실시하였을 때 다공성의 거친 표면을 가진 3차원 구조체가 제조될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 보통의 지식을 가진 자에게 자명하며, 본 발명의 권리가 이에 미침은 자명하다.

재료와 방법

재료

폴리카프로락톤 (PCL) (밀도 = 1.135 g/㎤; Mw = 60 000; 녹는점 = 60 ℃) 및 폴리에틸렌옥사이드 (PEO) (Mw = 900,000)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다. 전기유체역학 플로팅으로 지주 (struts)를 제조하기 위해 메틸렌 클로라이드 (methylene chloride) (MC; Junsei Chem., Tokyo, Japan): 다이메틸포름아마이드 (dimethylformamide) (DMF; Junsei Chem.)가 20:80으로 혼합된 혼합용매에 12% 폴리카프로락톤 용액을 제조하여 사용하였다. 5% 폴리에틸렌옥사이드 용액을 제조하기 위해 증류수에 폴리에틸렌옥사이드를 용해시켰다.

구조체 제조

폴리카프로락톤 구조체를 제조하기 위해 3축 로봇과 연결된 전기유체역학 플로팅 시스템을 이용하였다. PCL 용액은 25 ℃에서 시린지 펌프를 이용하여 주사되며, 전기유체역학 플로팅 장치는 CAD 시스템에 의해 디자인된 구조에 따라 자동으로 움직인다. 적층된 PCL 지주를 얻기 위해 공정은 수 회 반복된다. 노즐 속도는 10.5 ㎜/s으로 고정하였고, 전기장은 2.5 kV/cm, PCL 용액 흐름 속도는 1 ㎖/h로 하였다 (KDS 230; KD Scientific, Holliston, MA). 전원 공급장치는 SHV300RD-50K (Convertech, Seoul, South Korea)를 사용하였다. 전기유체역학 플로팅으로 3차원 구조체를 제조하기 위해 타겟 용액 배쓰로서 5% PEO 용액을 사용하였고, 바닥의 구리판을 배쓰 내에 담갔다. 적층 구조를 제조한 후 PEO는 정제수로 용해시켰고, 구조체는 24시간 동안 건조시켜 3차원 구조를 유지하도록 하였다. 제조된 구조체의 모서리 부분의 흠을 제거하기 위해 모서리 부분을 약 1 내지 2 ㎜ 다듬어 잘라내었다. 최종적으로 본 발명의 방법에 의해 제조된 구조체(이하 "EHD-PCL"과 혼용함)는 60 × 60 × 2 ㎣이었다. 종래의 쾌속 조형 방법으로 제조되는 대조군 구조체(이하 "RP-PCL"과 혼용함)를 만들기 위해 가열 디스펜서가 있는 3축 로봇 시스템을 사용하였다. PCL 분말을 가열 실린더에서 120 ℃로 녹인 다음, 플로팅 속도 3.2 ㎜/s로 내경 200 ㎛ 노즐을 통해 압출시켰다. 구조체 압출 동안 적용된 공기압은 500 ± 20 kPa로 고정하였다. 자세한 공정 조건은 표 1과 같다.

구조체 특성 규명

구조체 표면 지형은 디지탈 카메라 및 주사전자현미경 (SEM; Sirion, Hillsboro, OR)과 연결된 광학 현미경 (BX FM-32; Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 수분 흡수는 두 시간 동안 증류수를 흡수시키기 전 및 후의 구조체 중량을 재어 계산하였다. 물 흡수 백분율 증가는 (W _2h - W _o)/W _o × 100으로 계산하였는데, 여기에서 W _2h는 두 시간 후의 구조체 중량이고, W _o는 흡수시키기 전 원래 구조체 중량이다. 구조체의 기계적 특성은 인장시험을 이용하여 건조 상태에서 측정하였다. 구조체는 작은 조각 (5 × 15 × 2 mm)으로 만들어서 각 구조체의 다른 부분에서 다섯 개의 시료를 얻었다. 디지탈 캘리퍼 마이크로미터 (Ultracal III; Sylvac, Bern, Switzerland)를 이용하여 직사각형 표본을 측정하였다. 평균 크기를 측정하기 위해 각 표본에서 세 군데의 다른 부분을 평균내었다. 인장 시험은 universal tensile machine (Top-tech 2000; Chemilab, Suwon, South Korea)으로 수행하였다. 구조체의 응력 변형률 곡선은 응력 속도 0.2 mm/s에서 기록되었다. 구조체의 겉보기 공극률은 다음의 식을 이용하여 얻었다.

공극률 (%) = (1 - 구조체의 겉보기 밀도/구조체의 벌크 밀도) × 100, 여기에서 겉보기 밀도는 (구조체 중량)/(직사각형 구조체의 부피)로 정의된다.

인 비트로 골아세포 -유사 세포 ( MG63 ) 배양

세포 배양에 사용된 구조체 (5 × 5 × 2 ㎣)는 70% 에탄올과 UV로 살균하여 배양배지에서 오버나잇 방치하였다. 대조군으로서 동일한 치수의 쾌속 조형 구조체를 사용하였다. 구조체 내에서 세포의 거동을 관찰하기 위해 골아세포-유사 세포 (MG63; ATCC, Manassas, VA)를 이용하였다. MG63 세포는 10% 우태혈청 (Hyclone) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium; Hyclone, Logan, UT)에서 배양하였다. 조직배양 플레이트는 24웰이고, 각 웰에 가하는 세포 배양배지의 부피는 400 ㎕였다. 세포는 7대까지 유지되었고, 트립신-EDTA로 처리하여 모았다. 5 × 10⁴ 개의 세포를 함유하는 약 50 ㎕의 배양배지를 24웰 배양 플레이트 내의 구조체 상에 시드하였다. 세포를 네 시간 동안 구조체에 부착시킨 다음 각 웰에 400 ㎕의 새로운 배양배지를 가하여 5% CO₂, 37 ℃ 조건으로 배양하였다. 배지는 매일 갈아주었다. 3일째 주사전자현미경으로 구조체 상의 세포 형태를 확인하였다. 세포/구조체 구조는 2.5% 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde)로 고정시키고 농도구배 에탄올로 탈수시켰다. 건조시킨 구조체는 금으로 코팅한 다음 주사전자현미경으로 관찰하였다. 생존 세포는 MTT 분석 (Cell Proliferation Kit I; Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)으로 시험하였는데, MTT 분석은 생존 세포 내의 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 황색 테트라졸리움염 MTT가 분열되어 자색 포마잔 결정 (formazan crystals)을 생성함에 기초한 것이다. 구조체 상의 세포는 0.5 ㎎/㎖의 MTT로 4시간 동안 37 ℃에서 배양하였고, 마이크로플레이트 판독기 (EL800; Bio-Tek Instruments, Winnooski, VT)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 배양기간마다 다섯 개의 시료를 시험하였고, 각 시험은 세 번 반복 수행하였다.

세포배양 3일 후 구조체 표면에 있는 세포의 핵을 확인하기 위해 구조체는 DAPI (diamidino-2-phenylindole)로 형광염색하였다. 형광 이미지는 ZEISS axiovision 1 (Germany)으로 촬영하였다.

알칼라인 포스파테이즈 활성

5 내지 10일간 구조체 상에 시드한 MG63 세포에 대해 p-나이트로페닐 포스페이트 (p-nitrophenyl phosphate; p-NPP)에서 p-나이트로페놀 (p-nitrophenol)의 방출을 측정함으로써 골아세포 활성의 마커인 알칼라인 포스파테이즈 (alkaline phosphatase; "ALP"와 혼용함) 활성을 평가하였다. MG63 세포를 시딩한 구조체는 PBS (phosphate-buffered saline)로 부드럽게 헹군 다음 0.1% Triton X-100을 함유한 트리스 완충액 (10 mM, pH 7.5)에서 10 분간 배양하였다. 그런 다음 ALP kit (procedure no. ALP-10; Sigma)를 이용하여 준비한 100 ㎕의 p-NPP 용액을 함유한 96웰 조직 배양 플레이트에 100 ㎕의 용균액을 가하였다. ALP가 있을 때 p-NPP는 p-나이트로페놀과 무기인산으로 변환되었다. ALP 활성은 마이크로플레이트 판독기 (Spectra III; SLT-Lab Instruments, Salzburg, Austria)를 이용하여 405 ㎚의 흡광도를 측정하여 판단하였다.

ARS 염색 및 칼슘 미네랄화 정성분석

6웰 플레이트를 이용하여 7일째와 14일째에 ARS (Alizarine Red-S)로 미네랄화 수준을 판단하였다. MG63 세포를 플로로탄닌 (phlorotannin) 존재 하에 1 주일간 50 ㎍/㎖의 비타민 C와 10 mM β-글리세로포스페이트 함유 DMEM 배지에서 배양하였다. 그런 다음 세포를 PBS로 세 번 세척하고 70% (v/v)의 찬 에탄올 (4 ℃)로 한 시간 고정한 후 건조시켰다. 에탄올로 고정된 표본을 40 mM ARS (pH 4.2)로 한 시간 동안 염색하고 정제수로 세 번 세척하였다. 표본들은 10% 세틸피리디움 클로라이드 (cetylpyridium chloride)를 포함하는 10 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.0)으로 15 분간 탈색하였다. Spectra Ⅲ UV 마이크로플레이트 판독기로 562 ㎚ 흡광도를 측정하였다.

통계 분석

모든 정량적 결과는 다섯 개의 시료에서 얻었다.제시된 모든 데이타는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계학적 분석은 ANOVA (single-factor analyses of variance)로 이루어진다. 유의성 수준은 p < 0.05로 정하였다.

결과

도 1a는 본 발명의 전기유체역학 플로팅 시스템의 개념도이다. 시린지 펌프 (흐름 속도: 1 ㎖/h)가 스테인레스 스틸 노즐 (내경, 510 ㎛; 외경, 800 ㎛)과 연결되어 노즐 팁으로 PCL 용액을 운반한다. 스테인레스 스틸 노즐은 전원 공급장치와 연결하여 양극 (anode)으로 이용되며, 바닥의 전극과 더불어 전기장을 형성한다. 3축 로봇 무빙 스테이지는 캐드 시스템으로 제어되었다. 노즐에 전압을 걸면 노즐 팁에서 폴리머 용액의 구형 메니스커스가 표면 전하의 축적에 의해 테일러 원뿔 (Taylor, G. Proc . R. Soc . London , Ser . A 1964, 280, 383)로 알려진 원뿔에 서서히 전이된다 (Park, J.-U. et al ., Nat . Mater . 2007, 6, 782). 원뿔 정점의 곡률반경은 맥스웰 응력이 최대 모세관 응력과 같아질 때까지 감소하여 대전된 유체 분류 (charged-fluid jet)가 분사된다 (Park, J.-U. et al ., Nat . Mater . 2007, 6, 782). 안정적인 원뿔 분류 (cone-jet) 모드를 얻기 위해 적용하는 전압은 대략 유체가 똑똑 떨어지는 모드 (dripping mode)와 다중분류 모드 (multijet mode) 사이에서 제어되도록 하였다 (Enayati, M. et al., Colloids Surf ., A 2011, 382, 154). 레일리 한계 (Rayleigh limit)를 넘는 전압은 마이크로/나노 사이즈의 방울/파이버를 생성하는 다중분류 모드를 유도하기 때문에, 적절한 전압을 선택해야 한다. 도 1b는 전압 (10 kV)을 고정 속도 (1㎖/h)로 흐르는 액체 (15w% PCL 용액)에 적용하여 전기유체역학 플로팅 동안 안정적인 단일 분류 (single jet)를 나타낸다. 안정적인 3차원 구조를 얻기 위해 바닥의 배쓰 내에 5w% PEO 용액을 사용하여 PEO 용액의 탄성 완충작용으로 침전된 지주가 붕괴되지 않도록 하였다 (도 1c). 침전된 지주는 노즐과 스테이지 간의 높은 정전기력 때문에 딱딱한 스테이지 상에서는 부스러질 수 있다 (도 1d). 전기유체역학 플로팅된 지주가 바닥의 배쓰에 담기면 지주 내의 잔여 DMF (dimethylformamide)와 MC (methylene chloride)는 지주 사이의 부착을 유도할 수 있다.

잔여 용매로 인해 촉진된 지주 간의 부착은 PEO 용액의 고점성으로 인해 개선되었다. 순수한 물을 넣은 배쓰에서는 지주가 빠르게 침강하여 부착이 감소하였다. 이러한 현상은 지주 내의 잔여 용매의 대량 손실은 시간 함수로서 지수함수적 감소 곡선 (exponential decay curve)임을 말하는 Fick의 제2법칙으로 설명될 수 있고, 이로부터 침적된 지주 간의 상호접착을 계산할 수 있다. 그러므로, 적량의 잔여 용매가 필요하다. 그러나, 워터 배쓰 내에서 침강이 빠르게 일어나면, 지주들은 서로 접착할 시간이 충분하지 않기 때문에 본 발명자들은 바닥의 타겟 용액 배쓰 내에 점성이 있는 용매를 선택하여 넣었다. 본 발명자들은 앞선 연구에서 타겟으로서 정전기력과 용액 배쓰를 이용한 유사한 공정으로 소수성 표면과 3차원 나노파이버 구조를 제조한 적이 있다 (Yoon, H.; Park, J. H.; Kim, G. H. Macromol . Rapid Commun . 2010, 31, 1435, Hong, S.; Kim, G. H. Appl . Phys . A: Mater . Sci . Process. 2011, 103, 1009). 타겟 용액으로서 PEO 용액을 사용한 다른 이유는 배쓰 내에서 PCL 지주를 플로팅함으로써 PCL 지주가 용액 내에서 흠뻑 적셔지기 때문에 전기적 방해가 발생한다는 것이다. 그러므로, 점도가 낮은 용액 내에서는 전기유체역학 플로팅된 지주는 쉽게 이동하였다. 배쓰 내에서 지주의 불안정한 움직임이 발생하면 안정적인 3차원 적층 구조를 제조하는 것은 매우 어려워진다. 그렇지만, 본 발명자들은 적절한 점도를 가진 PEO 용액을 사용하였기 때문에 지주의 움직임을 현저히 감소시킬 수 있었다. 도 1e는 최종 80 × 80 × 2 ㎜ 크기의 PCL 구조체를 보여준다.

도 2a 내지 2c는 전기장으로 수축된 노즐 팁의 메니스커스가 일정 유속 (1 ㎖/h)의 PCL 용액 하에서 증가함을 보여준다. 분류의 인장 변형 (elongational deformation)은 지수함수적 성장을 나타낸다 (Kim, G. H.; Yoon, H. Appl . Phys . Lett. 2008, 93, 023127); 따라서, 도 2c의 작은 그림과 같이, PCL 용액의 유속과 중량비 (15w%)가 동일할 때 분류의 직경 (d1)은 지수함수적으로 감소하며, 적용 전압 (Va)이 증가하면 감소율은 가속화된다. 도 2c와 같이, x 축의 인장변형률 (elongational strain rate), (1/vo)(dvx/dx)은 분류의 직경 변화를 이용하여 분석하였다. 변형률 곡선은 분류 라인을 따라 변형 부분에서 노즐 팁에 가까운 곳에 최대값을 갖는 특징적인 종 모양을 나타낸다. 적용 전압이 증가할수록 최대점은 증가하고 노즐 팁 쪽으로 이동하였다. 이러한 현상은 일반적인 용융방사 공정과 유사하다. 도 2d는 전기장 (Va) 및 폴리머 중량비가 전기유체역학 플로팅 시스템 내에서 최종 지주의 직경 (ds)에 미치는 영향을 나타낸 다이아그램이다. 전기스프레이 (electrospray) 또는 전기방사 (electrospinning)를 일으키는 분산 전압 (breakup voltages)이 다양한 PCL 중량비에 대해 동일 유속 하에서 측정되었다. 10, 15 및 20 wt% PCL 용액에 대해 분산 전압 (breakup voltages)은 각각 15.5, 16.7 및 18.5 kV였다. 비록 노즐까지의 유속이 같더라도 점성 용액에 대한 전압은 V≒η ^1/2로 표시할 수 있고, 여기에서 V 및 η은 각각 분산 전압과 점도이다 (Barrero, A.; Ganan-Calvo, A. M.; Fernandez-Feria, R. J. Aerosol Sci . 1996, 27, S175). 도 2d와 같이, 고점도 PCL 용액 (20 wt%) 내에서 지주의 직경은 저점도 (10 및 15 wt%) PCL 용액 내에서보다 작다. 왜냐하면 고점도 용액 내에서는 다중분류를 만드는 분산 전압이 높아지기 때문이다. 분산 전압보다 더 높은 전압에서는 전기스프레이된 방울이 방울 간 정전기적 척력에 의해 퍼져나가기 때문에 지주의 폭은 커졌다.

일반적으로, 전기유체역학 플로팅은 미세한 전자회로 및 생체의학 분야에 필요한 2차원 코팅 표면을 획득하기 위해 이용되어 왔다 (Thian, E. S. et al., Biomaterials 2008, 29, 1833, Li, X. et al., J. R. Soc . Interface 2010, 7, 189). 그러나, 조직공학에서 생체의학적 구조체는 표면부터 3차원 구조체 전체로 영양성분 및 생물학적 제제들을 물리적으로 이동시키기 위해 3차원의 거칠고 공극이 많은 구조여야 한다 (Hollister, S. J. Nat . Mater . 2005, 4, 518).

조직공학용의 전기유체역학 플로팅된 3차원 구조체를 제조하기 위해 본 발명자들은 일 실시예에서 12wt% PCL 용액과 2.5 kV/cm 전압을 사용하였다. 세세한 실험 조건은 상기와 같다. 도 3a는 종래 방법을 이용한 전기유체역학 플로팅된 지주의 SEM 이미지를 보여준다. 253 ± 27 ㎛ 크기의 지주는 층층이 쌓아올린 구조를 나타내지만, 플로팅된 지주 내에 잔류하는 용매로 인해 부스러져 있다. 수축된 모양의 지주는 공정 중 사용된 용매의 증발속도 (Peclet number)와 관련이 있다 (Yao, J. et al., J. Aerosol Sci . 2008, 39, 987, Luo, C. J. et al., Polymer 2010, 51, 1654). 양으로 대전된 용액과 고체 스테이지 간의 정전기력 증가로 인해 좀더 강해진 전기장 하에서 이 현상은 더욱 가속화된다. 또한, 분산 전압 하에서 전기장이 강해지면, 지주와 전기방사 파이버의 혼합물이 관찰된다 (도 3b). 그렇지만, 본 발명의 목표는 변형 전기유체역학 플로팅 공정을 이용하여 3차원 구조체를 얻는 것이다. 본 발명자들은 상기 공정을 이용하여 동일한 전기장 내에서 스테이지를 바닥의 점성 용액 배쓰에 위치시킴으로써 목표를 달성하였다. 도 3c는 이 공정을 이용하여 제조된 구조물의 SEM 이미지를 보여준다. 도면과 같이, 지주는 부스러지지 않았고, 표면은 거칠어서 처음에 세포들이 잘 부착되도록 해준다. 확대 사진은 본 발명에 의해 제조된 지주의 표면이 약간 용해된 물방울 덩어리 (평균 크기 = 11 ± 3 ㎛)와 비슷함을 보여준다. 표면 특성을 보면, 본 발명의 구조체는 종래의 방법에 의해 제조된 구조체와 비교할 때 세포 부착 및 증식 면에서 현저히 개선되었다. 도 3d, 3e는 최종 제조된 구조체 (60 × 60 × 3 ㎣)의 표면과 단면의 광학 이미지를 나타낸다.

구조체의 흡수능은 세포 분포, 세포 증식 및 재성장한 조직의 구조적 형태에 영향을 미치는 중요한 요소이다 (Roosa, S. M. et al., J. Biomed . Mater . Res ., Part A. 2009, 92, 359). 흡수능 (Water-absorption capacity)은 두 시간 동안 증류수를 흡수시키기 전과 후의 구조체 중량을 측정하여 계산하였다. 본 발명의 전기유체역학 플로팅된 PCL (EHD-PCL) 구조체와 비교하기 위해 공극 크기 205 ± 27 ㎛ 및 지주 직경 220 ± 25 ㎛의 종래 쾌속 조형방법으로 제조된 (rapid-prototyped) PCL (RP-PCL) 구조체를 대조군 시료로서 이용하였다. 대조군 시료 제조 방법은 본 발명자들의 종래 연구에 개시된 방법과 같고 (Yeo, M. G.; Lee, H.; Kim, G. H. Biomacromolecules 2011, 12, 502. Lee, H.; Kim, G. H. J. Mater . Chem . 2011, 21, 6305), 제조 매개변수는 표 1과 같다.

도 4a는 대조군 구조체 (RP-PCL)와 본 발명 구조체 (EHD-PCL)의 상대적 흡수능을 나타낸다. EHD-PCL 구조체는 구조체 제조에 사용된 재료는 같지만, 대조군 구조체에 비해 매우 높은 흡수능을 나타내었다. 이러한 현상은 두 구조체의 물리적 구조 사이의 차이점에 기인한 것이다. 즉, 본 발명 지주는 높은 공극률을 나타내고 약간의 오프셋 구조를 보이는 반면, 대조군 지주는 매끄러운 3차원 구조였다. 정제수와 적색 염료를 혼합한 물 한 방울 (5 ㎕)의 흡수 상황을 시간 경과에 따라 촬영한 이미지를 도 4b 내지 4g에 나타내었다.

골 구조 재생용 생체의학 구조체의 기계적 특성은 손상된 부분이 주위의 조직에 의해 압력이 가해질 수 있기 때문에 새로운 골 조직 재생을 견딜 만큼 강해야 한다 (Thian, E. S. et al., Biomaterials 2008, 29, 1833.). 그렇지만, 직접적인 골생성을 유도하기 위해서는 3차원 구조체에 공극률이 높아야 하기 때문에 (Karageorgiou, V.; Kaplan, D. Biomaterials 2005, 26, 5474) 기계적 강도는 낮아질 수밖에 없다. 따라서, 공극률과 기계적 성질 간에는 요구되는 기계적, 생물학적 기능에 따라 적절한 균형이 필요하다. 그러므로, 구조체를 디자인할 때는 공극과 기계적 성질의 조절이 중요하다 (Hollister, S. J. Nat . Mater . 2005, 4, 518). 일정한 인장 속도 0.2 ㎜/s에서 공극률이 다를 때 (56% 및 78%) 전형적인 응력 (σ)- 변형률 (ε) 곡선을 도 4h에 나타내었다. 종래 방법에 의한 대조군 RP-PCL 구조체에서, 인장시험 동안 서로 포개진 지주의 파괴로 인해 곡선이 오르내림을 볼 수 있다. 본 발명의 EHD-PCL 구조체에서는 단면 전체에 균일하게 응력이 분포하고 있기 때문에 곡선이 부드러운 선을 나타내었다. 이 곡선에 나타난 바와 같이 낮은 공극률 (56%) 구조체의 Young의 계수 (RP-PCL: 12.5 ± 2.3 MPa)는 높은 공극률 (78%)을 가진 구조체의 값 (EHD-PCL: 6.3 ± 1.8 MPa)보다 높았다. 공극률과 계수 간의 상관관계는 공극을 정육면체라고 가정하고 (Ishai, O.; Cohen, L. J. Int . J. Mech. Sci . 1967, 9, 539), E(φ) = E _o(1-φ ^2/3) 식으로 평가하였고, 여기에서 E _o 및 φ는 각각 공극이 없는 물질의 영 계수와 공극의 영 계수를 나타낸다. 공극이 없는 PCL 계수는 41 ± 2.1 MPa였다. 상기 등식을 이용하여 계산한 RP-PCL 및 EHD-PCL의 계수는 각각 13.1 및 6.3 MPa였다. 본 발명의 EHD-PCL 구조체의 계수가 대조군 RP-PCL 구조체의 계수에 비하여 비교적 낮은 것은 EHD-PCL 구조체의 상대적으로 높은 공극률에 기인하는 것으로 판단된다.

본 발명의 일 실시예에서 재생하고자 하는 목표는 지주골 (trabecular bone)이었고, 이것의 계수는 38 내지 130 MPa이다. 이 값은 가해지는 힘의 방향과 고유의 구조에 매우 의존적이다 (Williams, J. L.; Lewis, J. L. J. Biomech . Eng . 1982, 104, 50). 본 발명 EHD-PCL 구조체의 측정된 계수는 지주골 계수와 비교하여 약간 낮았다. 그러나, 기계적 특성은 하이드록시아파타이드 및 베타-트리칼슘인산과 같은 합성 폴리머 또는 세라믹을 포함하는 다양한 복합 시스템을 결합함으로써 개선될 수 있다.

전기유체역학 플로팅을 통해 제조된 구조체의 세포 반응을 평가하기 위해 골아세포 유사세포인 MG63을 이용하였다. 골 조직 재생용 구조체의 최적 공극 크기에 대해서는 논란이 있지만, 골 전도 (osteoconduction)를 위한 골 구조체의 최적 공극 크기는 100에서 400 ㎛ 사이라고 제시되고 있으므로 (Cyster, L. A. et al., Biomaterials 2005, 26, 697), 공극 크기 347 ± 86 ㎛인 본 발명 EHD-PCL 구조체를 제조하였다.

세포 MG63과 구조체 간의 상호작용을 관찰하기 위해 세포 배양 3일 후의 SEM 영상 및 형광 영상을 얻었다 (도 5a 내지 5c). 이 영상들은 증식된 골아세포 유사세포들이 지주 표면뿐만 아니라 지주를 이루는 작은 부분에도 부착되어 있음을 보여주었고, 대조군 구조체와 비교하여 본 발명의 구조체가 거친 적층구조로 인해 세포 친화성이 더 높음을 말해준다.

세포 생존율은 1, 3 및 7일 후 구조체에 접착하고 증식한 생존 세포수를 바탕으로 평가하였다. 도 5d는 대조군 구조체와 본 발명 구조체 상에서 세포 생존율에 현저한 차이가 있음을 보여준다. MTT {3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide} 분석은 전기유체역학 플로팅된 본 발명의 구조체가 대조군 구조체에 비하여 세포를 잘 부착시킬 수 있는 표면 구조로 인해 세포 생존율이 현저히 증가하였음을 나타낸다. 이러한 결과는 표면 거칠기와 세포 행동양식 간의 상관관계에 관한 앞선 연구결과들과 일치한다. 몇몇 연구팀들은 랫트 두개관 골아세포의 증식이 60 ㎚ 티타늄으로 에폭시 스퍼터-코팅되어 거칠어진 표면에서 현저히 증대되었고, (DIN EN ISO 4288-98)의 방법으로 계산된 거칠기 변수가 >2 ㎛일 때 세포 수가 증가하였음을 보고하였다.

본 발명 구조체의 효과를 관찰하기 위해 ALP 활성을 측정하였다. Lee 등에 따르면, 구조체 표면 형태와 세포 행동양식 간의 반응은 단백질 흡착, 수용체-리간드 결합 및 신호전달을 포함하는 복잡한 생물학적 시스템과 밀접한 관계가 있다 (Lee, S. J. et al., Biomaterials 2004, 25, 4699). 도 5e와 같이, ALP 활성은 시간이 경과함에 따라 증가하였다. 배양 5일 후, 본 발명에 의한 구조체의 ALP 활성은 대조군 구조체의 활성보다 현저히 높았다. 배양 10일 후, 본 발명 구조체의 ALP 활성은 대조군 구조체 활성의 3배였다. 이 결과는 동일한 재료를 사용하여 구조체를 만들더라도 본 발명의 전기유체역학적으로 디자인된 구조가 ALP 활성을 지지하는데 중요한 역할을 함을 말해준다.

본 발명자들은 칼슘 미네랄의 양을 결정하기 위해 ARS (Alizarine red-S)를 이용하였다. 염색된 배양액에서 추출된 ARS의 흡광도가 도 5f에 나타나 있다. 14일 후 흡광도는 7일 후의 흡광도보다 현저히 증가하였다. 또한, 본 발명의 전기유체역학 구조체는 대조군 구조체보다 높은 흡광도를 나타내었다. ALP 활성 및 ARS 염색 결과는 세포 생존율 데이타 (MTT 분석)와 비교할 수 있다. 결과를 비교할 때 ALP 활성 (도 5e) 및 미네랄화 (도 5f)는 세포 생존율과 밀접하게 관련되어 있었고, 도 5e의 ALP 활성 증가와 도 5f의 미네랄화가 증가한 이유는 세포 증식이 증가했기 때문이다. 도 5g, 5h는 세포 배양 7일 후 대조군 및 본 발명 구조체를 ARS 염색한 광학 이미지이다. 사진에서 붉은 색은 칼슘 미네랄을 나타낸다: 대조군과 비교할 때 본 발명 구조체는 지주와 통공까지 완전히 붉게 염색되었다. 따라서, 본 발명 구조체는 골조직 재생에 유용한 생체재료라고 할 수 있다.

요약하면, 본 발명의 전기유체역학 플로팅 방법은 마이크로/나노 크기의 전자제품 디자인 및 다양한 생물재료의 표면 코팅에 널리 이용되고 있지만, 전기유체역학 플로팅된 지주는 전하를 띠고 있어서 지주를 적층하는 동안 문제가 발생하고, 잔여 용매가 먼저 쌓인 지주 층을 용해할 수 있고, 3차원 구조가 부스러지기 때문에 생체의학적 구조체에 이용하는 데는 한계가 있었다.

조직 공학에서, 3차원 구조체는 영양성분과 주사된 세포의 이동 통로를 제공하기 위해 필수적이다. 본 발명 방법을 종래 전기유체역학 플로팅 방법과 비교할 때 첫 번째 강점은 거친 표면을 갖는 3차원 구조를 제조할 수 있다는 점이다. 비록 마이크로/나노 크기 지주의 안정된 크기 제어는 여전히 해결해야 할 과제이지만, 변수들을 제어하면 좀더 안정적인 3차원 구조 제조를 제어할 수 있을 것이다. 본 발명은 세포 생존율과 높은 미네랄화로 인해 바람직한 골 구조체를 제공할 수 있다.

Claims

3차원 구조체를 형성하기 위한 전기유체역학 플로팅 장치(Electrohydrodynamic plotting, EHD plotting)에 있어서,
전도성 유체를 일정한 전기유체역학적 압력으로 분류(jet)하는 노즐을 구비하는 액체 공급부;
상기 노즐로부터 이격된 거리에 위치하고 노즐에서 분류되는 전도성 유체가 적층되는 스테이지;
상기 스테이지가 잠기도록 20 ℃ 기준으로 물이 1 cP의 점도를 나타낼 때 640 내지 45,000 cP의 점도 범위를 갖는 생체 적합성 물질의 점성 용액이 들어 있는 타겟 용액 배쓰;
상기 노즐과 상기 스테이지 사이에 전기장을 형성하는 상부전극과 하부전극;
상기 노즐과 상기 상부전극과 상기 하부전극에 전압을 인가하는 전원공급장치; 및
상기 상부전극과 상기 하부전극에 인가하는 전압을 제어하기 위한 제어부;를 포함하는 것을 특징으로 하는 전기유체역학 플로팅 장치.
청구항 1에 있어서,
상기 노즐의 움직임을 제어하는 3차원 플로터;가 더 포함됨을 특징으로 하는 장치.
청구항 2에 있어서,
상기 3차원 플로터는 3축 로봇임을 특징으로 하는 장치.
전도성 유체를 일정한 전기유체역학적 압력으로 분류(jet)하는 노즐을 구비하는 액체 공급부; 상기 노즐로부터 이격된 거리에 위치하고 노즐에서 분류되는 전도성 유체가 적층되는 스테이지; 상기 스테이지가 잠기도록 점성 용액이 들어 있는 타겟 용액 배쓰; 상기 노즐과 상기 스테이지 사이에 전기장을 형성하는 상부전극과 하부전극; 상기 노즐과 상기 상부전극과 상기 하부전극에 전압을 인가하는 전원공급장치; 및 상기 상부전극과 상기 하부전극에 인가하는 전압을 제어하기 위한 제어부;를 포함하는 전기유체역학 플로팅 장치를 이용한 전기유체역학 플로팅 방법에 있어서,
(a) 액체 공급부 내부에 전도성 유체를 수용하는 단계;
(b) 타겟 용액 배쓰 내에 20 ℃ 기준으로 물이 1 cP의 점도를 나타낼 때 640 내지 45,000 cP의 점도 범위를 갖는 생체 적합성 물질의 점성 용액을 가하는 단계;
(c) 상부 전극과 하부 전극 사이에 전압을 인가하고 전기장을 형성하는 단계;
(d) 상기 액체 공급부 내부의 전도성 유체를 노즐을 통해 20 ℃ 기준으로 물이 1 cP의 점도를 나타낼 때 640 내지 45,000 cP의 점도 범위를 갖는 생체 적합성 물질의 점성 용액 내에 잠기도록 스테이지로 분류하여 구조체를 형성하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 전기유체역학 플로팅 방법.
청구항 4에 있어서,
상기 전도성 유체는 생체적합성 재료 (biocompatible materials)임을 특징으로 하는 방법.
청구항 5에 있어서,
상기 생체적합성 재료는 푸코이단, 콜라겐, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 방법.
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청구항 4에 있어서,
상기 생체 적합성 물질의 점성 용액은 폴리에틸렌옥사이드, 알지네이트, 콜라겐, 히알루론산 및 키토산 중 1종 이상의 용액임을 특징으로 하는 방법.
삭제
청구항 4에 있어서,
상기 (c) 단계에서 인가되는 전압은 분산전압 (breakup voltage)보다 낮음을 특징으로 하는 방법.
청구항 5에 있어서,
상기 전도성 유체에는 하이드록시아파타이트 및 베타-트리칼슘인산 중 1종 이상이 부가되는 것을 특징으로 하는 방법.
상기 청구항 4 내지 청구항 6, 청구항 8, 청구항 10 및 청구항 11 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조되며, 공극률이 60% 이상인 3차원 적층 구조체.
상기 청구항 12에 있어서,
상기 구조체는 골 구조 재생용임을 특징으로 하는 구조체.