KR101300187B1 - Fusion proteins and bio-sensor comprising the same - Google Patents

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KR101300187B1
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Abstract

본 발명은 융합 단백질, 이를 포함하는 바이오센서, 바이오센서의 제조방법 및 바이오센서를 이용한 면역분석법에 관한 것으로, 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질 및 골드결합 단백질이 링커에 의해 연결된 융합 단백질을 제공한다. 본 발명에 따른 융합 단백질은 항체를 적절한 배향성을 가진 채 간단히 골드-함유 고체상에 고정 시킬 수 있을 뿐 아니라, 링커에 의해 유연성이 증가되어 항체와의 결합 빈도를 높여 줌으로써 고가의 항체 손실을 최소화시킬 수 있어 바이오센서의 대량생산을 유도할 수 있는 효과가 있다. The present invention relates to a fusion protein, a biosensor comprising the same, a method for manufacturing a biosensor, and an immunoassay using a biosensor, and provides a fusion protein in which a protein and a gold binding protein that bind to an Fc region of an antibody are linked by a linker. . The fusion protein according to the present invention can not only immobilize the antibody on the gold-containing solid phase with proper orientation, but also increase the flexibility by the linker to minimize the expensive antibody loss by increasing the frequency of binding to the antibody There is an effect that can induce the mass production of biosensors.

Description

융합 단백질 및 이를 포함하는 바이오센서{Fusion proteins and bio-sensor comprising the same}Fusion proteins and bio-sensor comprising the same

본 발명은 융합 단백질, 이를 포함하는 바이오센서, 바이오센서의 제작방법 및 바이오센서를 이용한 면역분석법에 관한 것이다.
The present invention relates to a fusion protein, a biosensor comprising the same, a method for manufacturing a biosensor, and an immunoassay using the biosensor.

항체를 기본으로 하는 면역분석법은 목표 항원에 대한 높은 선택성과 친화성 때문에 바이오물질들을 분석하는데 매우 중요한 기술 중의 하나이다(Fung et al., Curr. Opin. Biotechnol. 12:65, 2001). 이러한 면역분석법 분야에서, 골드 콜로이드 입자, 나노-골드 입자, 골드-코팅 입자, 혹은 골드가 도포된 기판과 같은 골드-함유 고체상(solid phase)에 항체를 효과적으로 고정화시키는 것은 바이오센서에 필수적으로 요구된다.Antibody-based immunoassays are one of the most important techniques for analyzing biomaterials because of their high selectivity and affinity for target antigens (Fung et al., Curr. Opin. Biotechnol. 12:65, 2001). In this field of immunoassay, effective immobilization of antibodies to gold-containing solid phases, such as gold colloidal particles, nano-gold particles, gold-coated particles, or gold coated substrates, is essential for biosensors. .

일반적으로, 항체나 다른 단백질들은 생물학적 활성을 유지한 채 골드에 쉽게 흡착되지 않는다. 항체를 골드에 물리적으로 흡착시키는 현재의 대부분의 방법은 실험 중 용액상태에서 떨어져 나갈 수 있어 지속적인 실험 결과를 얻지 못하는 문제가 있다. In general, antibodies and other proteins are not readily adsorbed to gold while retaining their biological activity. Most current methods of physically adsorbing antibodies to gold have the problem of being able to drop out of solution during the experiment, resulting in inconsistent results.

또한, 항체가 골드 표면에 임의로 흡착될 수 있어 항원과 결합하는 활성화 부위가 항원이 있는 용액의 방향으로 향하는 적절한 배향성(orientation)을 유지하지 못 할 수 있고 항체의 변성 역시 야기시 킬 수 있다. In addition, the antibody may be adsorbed arbitrarily on the gold surface such that the activation site that binds the antigen may not maintain proper orientation in the direction of the solution in which the antigen is present and may also cause denaturation of the antibody.

이러한 결과는, 항체-골드 반응을 응용하는 분야에서 민감성(sensitivity)과 재현성(reproducibility)을 떨어뜨려 이 방법의 유용성을 감소시키는 문제를 야기하였다. 이와 같은 이유로 좀 더 견고한 공유결합으로 골드 칩 위에 항체를 고정화하는 여러 방법이 시도되었다. 단백질-단백질, DNA-RNA, 탄수화물-단백질 상호작용에 관한 기술은 친화성 태그(Ni-NTA, Streptavidin, GST 등) 또는 골드 칩 표면에 화학적인 방법, 예를 들면 아민(amine), 리간드 티올(ligand thiol), 알데히드(aldehyde)를 수식화하거나, 기능기가 부착된 리간드로 자기조립 단일층(self-assembly monolayers)을 형성하여 목적 단백질을 고정화하는 방법들이 연구되어 왔다(Goodrich et al., J. Am. Chem. Soc., 126:4086, 2004). These results have led to the problem of decreasing the usefulness of the method by reducing sensitivity and reproducibility in the application of antibody-gold responses. For this reason, several methods have been attempted to immobilize antibodies on gold chips with more robust covalent bonds. Techniques for protein-protein, DNA-RNA, carbohydrate-protein interactions can be described by chemical methods on affinity tags (Ni-NTA, Streptavidin, GST, etc.) or on the surface of gold chips, such as amines, ligand thiols ( Methods of formulating ligand thiols, aldehydes, or immobilizing target proteins by forming self-assembly monolayers with ligands attached with functional groups have been studied (Goodrich et al., J. Am). Chem. Soc., 126: 4086, 2004).

그러나, 이 방법들 또한 항체의 적절한 배향성(orientation)을 부여하지는 못하여 생물학적 활성을 소실케 함과 동시에, 복잡하고 시간이 오래 걸릴 뿐만 아니라 알칸티올(Alkanethiol) 단일층이 시스테인(cysteine)을 가진 단백질을 포함한 황(sulfur)을 가진 혼합물을 처리했을 때 황-골드 결합 자체가 불안정하게 될 수 있는 화학적 처리 방법을 사용하고 있었다.However, these methods also do not confer proper orientation of the antibody, which leads to the loss of biological activity, complex and time-consuming, and that the alkanethiol monolayers contain proteins with cysteine. A chemical treatment method was used where the sulfur-gold bond itself could become unstable when the mixture containing sulfur was included.

따라서, 항체의 Fc 부위에 특이적으로 결합하는 단백질 A 혹은 단백질 G의 성질을 이용하여 항체의 배향성을 증가시키고자 하는 시도가 있어왔으나, 여전히 단백질 A 또는 단백질 G를 골드에 결합시킬 때 복잡하고 시간이 많이 걸리는 화학적 방법을 사용하고 있는 문제가 있었다.Thus, attempts have been made to increase the orientation of the antibody using the properties of Protein A or Protein G that specifically binds to the Fc region of the antibody, but are still complex and time consuming when binding Protein A or Protein G to gold. There was a problem using this much consuming chemical method.

이러한 문제를 해결하기 위하여 간단하고 경제적으로 골드-함유 고체상에 항원 결합 부위인 항체의 Fab 부위가 분석용액 방향으로 향하는 적절한 배향성을 유지하도록 하는 골드-함유 고체상과 항체를 연결하는 연결자가 요구된다. 이에, 본 발명자들은 골드결합 단백질 및 단백질 A 또는 단백질 G의 융합 재조합 단백질을 개발하여 국내등록특허를 받은바 있다(국내등록특허 제10-0965480호).In order to solve this problem, a linker is required to link the antibody with the gold-containing solid phase so that the Fab region of the antibody, which is the antigen-binding site on the gold-containing solid phase, can be simply and economically maintained in the direction of the assay solution. Accordingly, the present inventors have developed a fusion recombinant protein of gold binding protein and protein A or protein G and received a domestic patent (Domestic Patent Registration No. 10-0965480).

그러나, 여전히 상기 재조합 단백질을 연결자로 이용한 골드-함유 고체상을 포함하는 바이오센서 칩 제작 시 연결자와 사용된 항체의 결합 빈도를 높여 고가의 항체 손실을 최소화 할 필요가 있다.However, there is still a need to minimize the costly antibody loss by increasing the frequency of binding of the linker and the antibody used when fabricating a biosensor chip comprising a gold-containing solid phase using the recombinant protein as a linker.

이에, 본 발명자들은 항체를 골드-함유 고체상에 결합시키기 위한 연결자를 연구하던 중에, 펩티드 링커를 사용하여 골드결합 단백질 및 단백질 G를 연결한 융합 단백질이 골드-함유 고체상에 결합하는 능력이 우수할 뿐 아니라, 펩티드 링커의 유연성에 의해 항체와의 결합 빈도가 현저히 향상되었음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
Thus, while we are studying the linker for binding the antibody to the gold-containing solid phase, the inventors have only excellent ability to bind the gold-binding protein and the protein G-linked fusion protein to the gold-containing solid phase using a peptide linker. Rather, it was confirmed that the binding frequency with the antibody was significantly improved by the flexibility of the peptide linker, thus completing the present invention.

본 발명의 목적은 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질 및 골드결합 단백질이 펩티드 링커에 의해 연결된 융합 단백질을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a fusion protein in which a protein and a gold binding protein that bind to the Fc region of an antibody are linked by a peptide linker.

본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding a fusion protein.

본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide an expression vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein.

본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a transformant transformed with an expression vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein.

본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing a fusion protein.

본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질이 결합된 골드-함유 고체상을 포함하는 바이오센서를 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a biosensor comprising a gold-containing solid phase to which a fusion protein is bound.

본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질이 결합된 골드-함유 고체상을 포함하는 바이오센서의 제작방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method of manufacturing a biosensor comprising a gold-containing solid phase to which a fusion protein is bound.

본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질이 결합된 골드-함유 고체상을 포함하는 바이오센서를 이용한 면역분석법을 제공하는 것이다.
Still another object of the present invention is to provide an immunoassay using a biosensor comprising a gold-containing solid phase to which a fusion protein is bound.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질 및 골드결합 단백질이 펩티드 링커에 의해 연결된 융합 단백질을 제공한다.
As one aspect for achieving the above object, the present invention provides a fusion protein wherein the protein and gold binding protein that binds to the Fc region of the antibody is linked by a peptide linker.

본 발명의 융합 단백질은 바이오센서의 골드-함유 고체상과 항체를 연결시키는 연결자로서 역할을 한다. 본 발명의 "융합 단백질"은 단백질을 연결시킬 수 있는 펩티드 링커를 사용하여 기원이 다른 두 개 이상의 이종 단백질의 일부 또는 전부가 연결 또는 결합된 융합 단백질을 의미한다. 이와 같은 융합 단백질은 하나의 벡터 내에서 재조합 방법에 의해 링커가 포함된 형태로 제작되거나, 각기 서로 다른 벡터에서 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질 및 골드결합 단백질을 발현시킨 후, 효소나 화학적 방법에 의해 링커를 결합하여 제작될 수 있다. 본 발명의 목적상 바람직하게는 하나의 벡터에서 발현시킬 수 있다. The fusion protein of the invention serves as a linker connecting the antibody with the gold-containing solid phase of the biosensor. By "fusion protein" is meant a fusion protein in which some or all of two or more heterologous proteins of different origins are linked or bound using a peptide linker capable of linking proteins. Such a fusion protein may be produced in a form containing a linker by recombinant method in one vector or by expressing a protein and a gold binding protein which bind to the Fc region of the antibody in different vectors, and then, by enzyme or chemical method. It can be produced by combining the linker. For the purposes of the present invention, preferably in a single vector.

본 발명의 융합 단백질은 단백질 1-링커-단백질 2와 같이 표시할 수 있다. 예를 들면, 골드결합 단백질을 6개의 알라닌으로 이루어진 펩티드 링커를 통하여 단백질 G와 연결시킨 융합 단백질을 GBP-6Ala-protein G와 같이 나타낼 수 있다.The fusion protein of the invention can be expressed as protein 1-linker-protein 2. For example, a fusion protein in which a gold binding protein is linked to protein G through a peptide linker consisting of six alanines can be expressed as GBP-6Ala-protein G.

본 발명의 융합 단백질은 항체와의 특이적 결합 효율성을 향상시키기 위하여 펩티드 링커를 통해 골드결합 단백질 및 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질을 연결한 융합 단백질로서, 바람직하게는 도 1에 도시한 바와 같이, 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질(도 1의 protein A)의 N-말단 및 골드결합 단백질(GBP)의 C-말단에 펩티드 링커가 연결될 수 있다(도 1). 이와 같은 연결은 항체의 항원과 결합하는 활성화 부위가 항원이 있는 용액의 방향으로 향하도록 하는 적절한 배향성을 줄 수 있게 한다. The fusion protein of the present invention is a fusion protein connecting a gold binding protein and a protein binding to the Fc region of the antibody through a peptide linker in order to improve specific binding efficiency with the antibody, preferably as shown in FIG. Peptide linkers may be linked to the N-terminus of the protein (protein A in FIG. 1) and the C-terminus of the gold binding protein (GBP) that bind to the Fc region of the antibody (FIG. 1). Such linkage allows the active site that binds to the antigen of the antibody to have a proper orientation such that it is directed in the direction of the solution containing the antigen.

본 발명의 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질은 항체의 Fc 부위에 결합하는 활성을 가진 단백질로서, 이러한 활성을 가진 단백질, 펩티드는 제한 없이 사용할 수 있다. The protein that binds to the Fc region of the antibody of the present invention is a protein having activity that binds to the Fc region of the antibody, proteins and peptides having such activity can be used without limitation.

본 발명의 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질은 바람직하게는 단백질 G 또는 단백질 A일 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 1의 단백질 G 또는 서열번호 2의 단백질 A일 수 있다.
The protein that binds to the Fc region of the antibody of the invention may preferably be protein G or protein A, more preferably protein G of SEQ ID NO: 1 or protein A of SEQ ID NO: 2.

단백질 G : 서열번호1Protein G: SEQ ID NO: 1

L K G E T T T E A V D A A T A E K V F K Q Y A N D N G V D G E W T Y D D A T K T F T V T E K P E V I D A S E L T P A V T T Y K L V I N G K T L K G E T T T E A V D A A T A E K V F K Q Y A N D N G V D G E W T Y D D A T K T F T V T E K P E V I D A S E L T P A V T T Y K L V I N G K T L K G E T T T K A V D A E T A E K A F K Q Y A N D N G V D G V W T Y D D A T K T F T V T E L E H H H H H H
LKGETTTEAVDAATAEKVFKQ YANDNGVDGEWTYDDATKTFT VTEKPEVIDASELTPAVTTYK LVINGKTLKGETTTEAVDAAT AEKVFKQYANDNGVDGEWTYD DATKTFTVTEKPEVIDASELT PAVTTYKLVINGKTLKGETTT KAVDAETAEKAFKQYANDNGV DGVWTYDDATKTFTVTELEHH HHHH

단백질 A : 서열번호 2Protein A: SEQ ID NO: 2

A Q H D E A Q Q N A F Y Q V L N M P N L N A D Q R N G F I Q S L K D D P S Q S A N V L G E A Q K L N D S Q A P K A D A Q Q N N F N K D Q Q S A F Y E I L N M P N L N E A Q R N G F I Q S L K D D P S Q S T N V L G E A K K L N E S Q A P K A D N N F N K E Q Q N A F Y E I L N M P N L N E E Q R N G F I Q S L K D D P S Q S A N L L S E A K K L N E S Q A P K A D N K F N K E Q Q N A F Y E I L H L P N L N E E Q R N G F I Q S L K D D P S V S K E I L A E A K K L N D A Q A P K E E D N K K P G K E D G N K P G K E D G N K P G K E D N K K P G K E D G N K P G K E D N N K P G K E D G N K P G K E D N N K P G K E D G N K P G K E D G N K P G K E D G N G V H V V K P G D T V N D I A K A N G T T A D K I A A D N K L A D K N M I K P G Q E L V V D K K Q P A N H A D A N K A Q A L P E T G E E N P F I G T T V F G G L S L A L G A A L L A G R R R E L L E H H H H H H
AQHDEAQQNAFYQVLNMPNLN ADQRNGFIQSLKDDPSQSANV LGEAQKLNDSQAPKADAQQNN FNKDQQSAFYEILNMPNLNEA QRNGFIQSLKDDPSQSTNVLG EAKKLNESQAPKADNNFNKEQ QNAFYEILNMPNLNEEQRNGF IQSLKDDPSQSANLLSEAKKL NESQAPKADNKFNKEQQNAFY EILHLPNLNEEQRNGFIQSLK DDPSVSKEILAEAKKLNDAQA PKEEDNKKPGKEDGNKPGKED GNKPGKEDNKKPGKEDGNKPG KEDNNKPGKEDGNKPGKEDNN KPGKEDGNKPGKEDGNKPGKE DGNGVHVVKPGDTVNDIAKAN GTTADKIAADNKLADKNMIKP GQELVVDKKQPANHADANKAQ ALPETGEENPFIGTTVFGGLS LALGAALLAGRRRELLEHHHH HH

단백질 G는 그룹 G 스트렙토코카이(streptococci)에서 분리된 박테리아 세포막 단백질(cell wall protein)로서, 포유동물 항체의 Fc 부위 및 Fab 부위와 결합하는 것으로 알려져 있다(J. Immuunol. Methods 1988, 112,113-120). 그러나, 단백질 G는 항체의 Fc 부위에 대한 결합력이 Fab 부위에 대한 결합력보다 약 10배 정도 높다고 알려져 있다.Protein G is a bacterial cell wall protein isolated from the group G streptococci and is known to bind to the Fc and Fab sites of mammalian antibodies (J. Immunol. Methods 1988, 112, 113-120) . However, it is known that the binding power of the protein G to the Fc region of the antibody is about 10 times higher than that of the Fab region.

단백질 A 는 스타필로코쿠스 오레우스(Staphylococcus aureus)에서 발견되는 세포 표면 단백질이다. 이는 포유동물 항체, 특히 IgG 클래스(class) 항체의 Fc 부위에 결합하는 성질을 가진다. 제공된 클래스의 항체 내에서, 종 기원 및 항체 서브클래스(subclass) 또는 알로타입(allotype)에 관하여, 상기 친화성은 조금씩 변한다(Surolia, A. 등, 1982 Protein A: Nature's universal, antibody, TIBS 7, 74-76; Langone 등, 1982, Protein A of staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors, Advances in Immunology 32:157-252). 단백질 A 는 단백질 A를 분비하는 S. aureus의 배양으로부터 직접 분리될 수 있거나, 더욱 편리하게는 E. coli내에서 재조합적으로 발현시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, 단백질 A 및 단백질 G는 그 기원이 특별히 제한되지 아니하며, 항체의 Fc 부위와의 결합력을 보유하는 한 천연형의 단백질 A 및 단백질 G 에 아미노산이 결실, 부가, 치환 등이 일어난 단백질 A 및 단백질 G 유도체도 본 발명의 목적에 부합되게 사용될 수 있다.
Protein A is a cell surface protein found in Staphylococcus aureus. It has the property of binding to the Fc region of mammalian antibodies, in particular IgG class antibodies. Within antibodies of a given class, the affinity varies little with respect to species origin and antibody subclass or allotype (Surolia, A. et al., 1982 Protein A: Nature's universal, antibody, TIBS 7, 74). -76; Langone et al., 1982, Protein A of staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors, Advances in Immunology 32: 157-252). Protein A can be isolated directly from the culture of S. aureus secreting protein A, or more conveniently can be expressed recombinantly in E. coli. In the present invention, the protein A and the protein G are not particularly limited in origin, and a protein in which amino acids are deleted, added, or substituted in the native protein A and protein G, as long as they retain the binding force to the Fc region of the antibody. A and protein G derivatives may also be used for the purpose of the present invention.

본 발명의 펩티드 링커는 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질과 골드결합 단백질에 삽입되어 양 단백질을 연결함으로써 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질에 유연성을 부여하는 역할을 한다.The peptide linker of the present invention plays a role of providing flexibility to the protein binding to the Fc region of the antibody and the protein binding to the gold binding protein to be linked to both proteins.

상기 펩티드 링커는 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질과 골드결합 단백질에 삽입되는 임의의 아미노산 서열을 가진 펩티드로서, 기능기를 갖지 않으며 크기가 작은 아미노산이 적합하며, 바람직하게는 알라닌, 글라이신 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커일 수 있다. 즉, 알라닌으로 이루어진 링커, 글라이신으로 이루어진 링커 또는 알라닌 및 글라이신으로 이루어진 링커일 수 있다. 상기와 같은 아미노산은 기능기가 없어서 비특이적 결합이 일어나지 않으며, 접힘(folding)에 있어서 문제점도 없다는 것을 확인하였다. The peptide linker is a peptide having an amino acid sequence inserted into a protein and a gold binding protein that binds to the Fc region of the antibody, and is suitable for small amino acids having no functional groups, preferably alanine, glycine and combinations thereof. It may be a peptide linker consisting of one or more amino acids selected from the group consisting of. That is, it may be a linker composed of alanine, a linker composed of glycine or a linker composed of alanine and glycine. The amino acid as described above was confirmed that there is no functional group, non-specific binding does not occur, there is no problem in folding (folding).

또한, 본 발명의 펩티드 링커는 보다 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 링커일 수 있다. In addition, the peptide linker of the present invention may be more preferably a peptide linker consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.

또한, 본 발명의 펩티드 링커는 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질의 항체와의 결합능을 방해하지 않으며, 적절한 배향성을 유지할 수 있도록 하는 유연성을 줄 수 있는 개수까지의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 1개 내지 6개의 아미노산으로 이루어질 수 있고, 보다 바람직하게는 6개의 아미노산으로 이루어질 수 있다.
In addition, the peptide linker of the present invention may be composed of up to a number of amino acids that do not interfere with the binding ability of the protein binding to the Fc region of the antibody with the antibody, which can give flexibility to maintain proper orientation, but is not limited thereto. But preferably it may be composed of 1 to 6 amino acids, more preferably 6 amino acids.

본 발명의 실시예를 보면, 골드결합 단백질 및 단백질 G를 서열번호 4의 6개의 알라닌으로 이루어진 펩티드 링커를 통해 연결시킨 융합 단백질의 단백질 G와 hIgG와의 반응성(결합 빈도)이 링커로 연결되지 않은 골드결합 단백질 및 단백질 G의 융합 단백질에 비하여 약 20% 향상되었음을 알 수 있었다(실험예 2). 또한, 골드결합 단백질 및 단백질 G를 서열번호 5의 6개의 글라이신으로 이루어진 펩티드 링커를 통해 연결시킨 융합 단백질의 단백질 G와 hIgG와의 반응성(결합 빈도)이 링커로 연결되지 않은 골드결합 단백질 및 단백질 G의 융합 단백질에 비하여 약 9% 향상되었음을 알 수 있었다(실험예 2).According to an embodiment of the present invention, the gold of the fusion protein in which the gold binding protein and the protein G are linked through a peptide linker consisting of six alanines of SEQ ID NO: 4 and the reactivity (binding frequency) of the protein G and the hIgG are not linked with the linker. It was found that the fusion protein of the binding protein and protein G was improved by about 20% (Experimental Example 2). In addition, the reactivity (binding frequency) of the protein G and the hIgG of the fusion protein in which the gold binding protein and the protein G were linked through a peptide linker consisting of six glycines of SEQ ID NO: 5 was determined. It was found to be about 9% improvement over the fusion protein (Experimental Example 2).

이러한 결과는 도 2에 도시된 분자동역학 시뮬레이션에 의한 GBP-Linker-protein G 융합 단백질의 3차원 구조에 나타난 바와 같이, 골드결합 단백질과 단백질 G를 펩티드 링커를 사용하여 연결시킨 경우에 삽입된 펩티드 링커에 의하여 단백질 G의 유연성이 증가함으로써 항체와의 반응성(결합 빈도)이 현저히 향상되었기 때문이다(도 2).These results are shown in the three-dimensional structure of the GBP-Linker-protein G fusion protein by molecular dynamics simulation shown in Figure 2, the peptide linker inserted when the gold binding protein and protein G are linked using a peptide linker This is because the reactivity (binding frequency) with the antibody is remarkably improved by increasing the flexibility of the protein G (Fig. 2).

즉, 상기의 결과는 기존의 링커가 삽입되지 않은 융합 단백질에 비해 링커의 삽입으로 인해 항체와의 결합 빈도가 현저히 향상되는 것을 시사하는 것이며, 바이오센서에 적용시 고가인 항체의 손실을 최소화 할 수 있으며, 신호의 세기도 증폭될 수 있음을 시사하는 것이다. That is, the above results suggest that the binding frequency with the antibody is significantly improved due to the insertion of the linker compared to the fusion protein without the existing linker, and it is possible to minimize the loss of expensive antibodies when applied to the biosensor. It also suggests that the signal strength can be amplified.

본 발명의 골드결합 단백질(gold binding protein, GBP)은 골드-함유 고체상에 결합하는 활성을 가진 단백질로서, 본 발명의 융합 단백질의 분리를 편하게 하기 위하여 N-말단에 단백질 정제를 위한 태그를 포함할 수 있다.　 본 발명의 실시예에서는 핵사 히스티딘(6His)을 N-말단에 결합시켰으나, 본 발명의 목적상 단백질 정제를 위한 태그는 공지된 태그를 제한 없이 사용할 수 있다.　Gold binding protein (GBD) of the present invention is a protein having activity that binds to a gold-containing solid phase, and includes a tag for protein purification at the N-terminus to facilitate separation of the fusion protein of the present invention. Can be. In the embodiment of the present invention, nucleated histidine (6His) is bound to the N-terminus, but for the purposes of the present invention, a tag for protein purification may use any known tag without limitation.

본 발명의 골드결합 단백질은 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 골드결합 단백질 일 수 있다.
Gold binding protein of the present invention may be preferably a gold binding protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

골드결합 단백질 : 서열번호 3Gold binding protein: SEQ ID NO: 3

M H G K T Q A T S G T I Q S M H G K T Q A T S G T I Q S M H G K T Q A T S G T I Q S
MHGKTQATSGTIQSMHGKTQA TSGTIQSMHGKTQATSGTIQS

본 발명의 실시예를 보면, 골드결합 단백질과 단백질 G를 펩티드 링커를 통해 연결시킨 융합 단백질의 경우에 골드결합 단백질 및 단백질 G 융합 단백질에 비해 골드-함유 고체상과의 결합능력에는 유의적인 차이를 보이지 않아 펩티드 링커의 삽입이 골드결합 단백질과 골드와의 결합능력에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다(실험예 1).
According to an embodiment of the present invention, in the case of the fusion protein in which the gold-binding protein and the protein G are linked through a peptide linker, there is a significant difference in the binding ability with the gold-containing solid phase compared to the gold-binding protein and the protein G fusion protein. Therefore, the insertion of the peptide linker did not affect the binding ability of the gold binding protein and gold (Experimental Example 1).

본 발명은 다른 하나의 양태로서, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 배양하여 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
In another aspect, the present invention provides a polynucleotide encoding a fusion protein of the present invention, an expression vector comprising the same, a transformant transformed with the expression vector, and a method for producing a fusion protein by culturing the transformant. To provide.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질 및 골드결합 단백질이 펩티드 링커에 의해 연결된 융합 단백질을 코딩하는 DNA, RNA 등의 폴리뉴클레오티드로서, 바람직하게는 서열번호 6 또는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
The polynucleotide of the present invention is a polynucleotide such as DNA, RNA, etc., which encodes a fusion protein in which a protein and a gold binding protein bind to an Fc region of an antibody are linked by a peptide linker, preferably a base of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: It may be a polynucleotide having a sequence.

GBP-6Gly-protein G : 서열번호 6GBP-6Gly-protein G: SEQ ID NO: 6

atgcaccatcaccatcaccaccacggcaaaacccaggcgaccagcggcaccatccagagcatgcatggtaaaacgcaagccacgtctggtacgattcaatctatgcacggtaaaacccaagcgacgagcggtaccattcagtctggtggcgggggaggtggattgaaaggcgaaacaactactgaagctgttgatgctgctactgcagaaaaagtcttcaaacaatacgctaacgacaacggtgttgacggtgaatggacttacgacgatgcgactaagacctttacagttactgaaaaaccagaagtgatcgatgcgtctgaattaacaccagccgtgacaacttacaaacttgttattaatggtaaaacattgaaaggcgaaacaactactgaagctgttgatgctgctactgcagaaaaagtcttcaaacaatacgctaacgacaacggtgttgacggtgaatggacttacgacgatgcgactaagacctttacagttactgaaaaaccagaagtgatcgatgcgtctgaattaacaccagccgtgacaacttacaaacttgttattaatggtaaaacattgaaaggcgaaacaactactaaagcagtagacgcagaaactgcagaaaaagccttcaaacaatacgctaacgacaacggtgttgatggtgtttggacttatgatgatgcgactaagacctttacggtaactgaactcgagcaccaccaccaccaccac
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GBP-6Ala-protein G : 서열번호 7GBP-6Ala-protein G: SEQ ID NO: 7

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발현벡터는 본 발명의 융합 단백질을 발현시키는 형질전환체를 만들기 위하여 숙주세포에 DNA를 도입하여 융합 단백질을 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명의 목적상 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인헨서 같은 발현조절 엘리먼트를 포함할 수 있다.The expression vector is a means for expressing the fusion protein by introducing DNA into the host cell to make a transformant expressing the fusion protein of the present invention, a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, etc. may be used. For example, a plasmid vector can be used. For purposes of the present invention, the expression vector may comprise an expression control element such as a promoter, an initiation codon, a stop codon, a polyadenylation signal, and an enhancer.

본 발명의 실시예에서는 6개의 알라닌 또는 6개의 글라이신으로 이루어진 펩티드 링커를 통하여 연결된 골드결합 단백질 및 단백질 G의 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현벡터 pET-22b-GBP-6Ala-protein G, pET-22b-GBP-6Gly-protein G를 제조하였다(실시예 3). In an embodiment of the present invention, the expression vector pET-22b-GBP-6Ala-protein G, comprising a nucleotide sequence encoding a fusion protein of protein G and a gold binding protein linked through a peptide linker consisting of six alanines or six glycines, pET-22b-GBP-6Gly-protein G was prepared (Example 3).

형질전환체는 본 발명의 융합 단백질을 발현할 수 있는 대장균(E.coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등의 임의의 숙주세포를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 대장균을 사용할 수 있다. As the transformant, any host cell such as E. coli, Bacillus subtilis and the like capable of expressing the fusion protein of the present invention can be used, and E. coli can be preferably used.

본 발명의 융합 단백질은 펩티드 합성법에 의해 제조할 수도 있으나, 유전공학적 방법에 의해 특히 효율적으로 제조할 수 있다. 유전공학적 방법은 유전자조작에 의해 원하는 단백질을 대장균(E.coli) 등의 숙주세포에서 다량으로 발현시키는 방법이다. The fusion protein of the present invention may be prepared by peptide synthesis, but may be particularly efficiently produced by genetic engineering methods. A genetic engineering method is a method of expressing a desired protein in a large amount in a host cell such as E. coli by gene manipulation.

본 발명의 융합 단백질의 제조는 바람직하게는 a) 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; b) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체로 형질전환하는 단계; 및 c) 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 통하여 제조할 수 있다.Preparation of the fusion protein of the invention preferably comprises the steps of a) preparing an expression vector comprising a polynucleotide encoding the fusion protein of the invention; b) introducing the expression vector into a host cell and transforming it with a transformant; And c) culturing the transformant.

상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 방법은 바람직하게 본 발명의 DNA를 포함하는 발현 벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세 주사, 형질 도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposem-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질 감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기 침공법(electroporation) 등의 공지 방법으로 숙주세포에 도입하여 형질전환 시킬 수 있다.The method of introducing the expression vector into a host cell and transforming the vector is preferably carried out by a method known in the art such as a transient transfection, But are not limited to, microinjection, transduction, cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE dextran-mediated transfection, polybrene- Transfection can be carried out by introducing the vector into a host cell by a known method such as transfection, polybrene-mediated transfection, and electroporation.

형질전환체를 배양하여 본 발명의 융합 단백질을 생산하기 위한 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있는데, 예를 들면, 대장균을 키우는 일반적인 조건인 37℃, 호기조건, LB 배지에서 수행할 수 있다.Any method known in the art can be used as a method for culturing the transformant for producing the fusion protein of the present invention by culturing the transformant. For example, a method of culturing a transformant, which is a general condition for raising E. coli, Conditions, LB medium.

본 발명의 실시예를 보면, 대장균 BL21(DE3)을 컴피턴트 세포로 제작한 후 발현벡터 pET-22b-GBP-6Ala-protein G 및 pET-22b-GBP-6Gly-protein G로 형질전환하여 본 발명의 링커가 삽입된 융합 단백질 GBP-6Ala-protein G 및 GBP-6Gly-protein G를 발현시켰다(실시예 4). 또한, 도 3을 보면, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 대장균으로부터 융합 단백질 GBP-6Ala-protein G(도 3의 GBP-A-pG) 및 GBP-6Gly-protein G(도 3의 GBP-G-pG)가 발현되었음을 알 수 있다(도 3).
According to an embodiment of the present invention, E. coli BL21 (DE3) was produced as competent cells and transformed with the expression vectors pET-22b-GBP-6Ala-protein G and pET-22b-GBP-6Gly-protein G. The fusion proteins GBP-6Ala-protein G and GBP-6Gly-protein G into which the linker was inserted were expressed (Example 4). 3, the fusion proteins GBP-6Ala-protein G (GBP-A-pG in FIG. 3) and GBP-6Gly-protein G (BGV-G- in FIG. 3) from the E. coli transformed with the expression vector. pG) can be seen (Fig. 3).

본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 융합 단백질이 결합된 골드 함유 고체상을 포함하는 바이오센서 및 바이오센서의 제조방법을 제공한다.
As another aspect, the present invention provides a biosensor and a method for manufacturing the biosensor comprising a gold-containing solid phase to which the fusion protein is bound.

본 발명에 따른 융합 단백질은 골드결합 단백질과 단백질 A 또는 단백질 G가 펩티드 링커를 통하여 연결된 형태로서, 여기서 본 발명에 따른 상기 골드결합 단백질은 42개의 아미노산으로 이루어져 있으며 골드에 선택적으로 결합할 수 있다. 상기 융합단백질의 단백질 A 또는 단백질 G는 다른 단백질과 달리 항체의 Fc 부위에 특이적으로 결합한다.The fusion protein according to the present invention is a form in which a gold binding protein and protein A or protein G are linked through a peptide linker, wherein the gold binding protein according to the present invention is composed of 42 amino acids and may selectively bind to gold. Protein A or protein G of the fusion protein specifically binds to the Fc region of the antibody, unlike other proteins.

따라서, 본 발명에 따른 융합 단백질에 골드결합 단백질 부분은 골드-함유 고체상에 선택적으로 결합하고, 단백질 A 또는 단백질 G 부분은 항체의 Fc 부위에 특이적으로 결합함으로, 이를 이용하는 경우, 골드-함유 고체상에 선택적으로 결합하면서, 항체의 Fc 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 바이오센서를 제공할 수 있게 된다.Thus, the gold-binding protein portion of the fusion protein according to the present invention selectively binds to the gold-containing solid phase, and the protein A or protein G portion specifically binds to the Fc region of the antibody, whereby the gold-containing solid phase While selectively binding to, it is possible to provide a biosensor capable of specifically binding to the Fc region of an antibody.

이로써 상기 바이오센서는, 상기 융합 단백질이 골드-함유 고체상에 결합되며, 또한 항체의 Fc 부위에 결합하여 항원이 결합하는 활성화 부분인 Fab 부분이 용액의 방향으로 향하는 적절한 배향성을 유지할 수 있게 됨으로써, 항체-골드 반응을 응용하는 면역분석 분야에서 유용하게 사용될 수 있다. 이러한 배향성으로 인해 항체의 항원과 결합하는 활성화 부위가 효율적으로 항원과 반응할 수 있다. 또한, 링커에 의한 유연성으로 항체와의 결합 빈도 증가와 함께 항원 검출능력이 증가할 수 있다.This allows the biosensor to bind the fusion protein to the gold-containing solid phase, and also to maintain the proper orientation of the Fab portion, which is the activating portion to which the antigen binds by binding to the Fc region of the antibody, in the direction of the solution. It can be usefully used in the field of immunoassay applying gold reaction. Because of this orientation, the active site that binds to the antigen of the antibody can efficiently react with the antigen. In addition, the flexibility by the linker may increase the antigen detection ability with increasing the frequency of binding to the antibody.

바이오센서(biosensor)는 생물이 가지고 있는 기능을 이용하여 물질의 성질 등을 조사하는 기계로서, 효소 분석법과 면역 분석법에 사용하는 바이오센서, 광학적 바이오센서와 전기화학적 바이오센서 등이 있으며, 본 발명의 바이오센서는 샘플 주입, 혼성화 반응과 검출 등 실험의 전 과정을 하나의 작은 칩으로 자동적으로 처리하는 랩온어칩(lab-on-a-chip)일 수 있다.A biosensor is a biosensor, an optical biosensor, and an electrochemical biosensor, which are used for enzyme analysis and immunoassay. The biosensor can be a lab-on-a-chip that automatically processes the whole process of the experiment such as sample injection, hybridization reaction and detection into one small chip.

또한, 본 발명의 바이오센서는 바람직하게는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)을 이용한 바이오센서일 수 있다. 표면 플라즈몬 공명을 이용하는 바이오센서는 정성적인 정보(두 분자들이 특이적으로 결합을 하는지)와 정량적인 정보(반응 속도, Kinetics와 평형상수, equilibrium constants)를 제공할 뿐만 아니라 형광으로 표지할 필요 없이 실시간으로 감지할 수 있어, 항원과 항체 결합을 측정하는데 특히 유용하다.In addition, the biosensor of the present invention is preferably a biosensor using surface plasmon resonance. Biosensors using surface plasmon resonance provide qualitative information (whether two molecules specifically bind) and quantitative information (reaction rate, kinetics, equilibrium constants), as well as real-time And is particularly useful for measuring antigen and antibody binding.

본 발명의 골드-함유 고체상은 바람직하게는 골드 콜로이드 입자, 나노-골드 입자, 골드-코팅 입자 및 골드가 도포된 기판으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.The gold-containing solid phase of the present invention may preferably be selected from the group consisting of gold colloidal particles, nano-gold particles, gold-coated particles and gold coated substrates.

본 발명의 바이오센서는 융합 단백질을 이용하여 다른 생물학적 활성에 영향을 주지 않으면서 강력하게 항체를 골드-함유 고체상에 고정시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 단백질은 링커의 삽입으로 인해 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질의 유연성이 증가하여, 항체와의 결합 빈도가 현저히 증가하기 때문에 고가인 항체의 낭비를 막을 수 있으며, 결합 능력도 증가시킬 수 있다. The biosensors of the present invention can use fusion proteins to immobilize antibodies strongly on gold-containing solid phases without affecting other biological activities. In addition, the fusion protein of the present invention can increase the flexibility of the protein binding to the Fc region of the antibody due to the insertion of a linker, significantly preventing the waste of expensive antibodies because the binding frequency with the antibody is significantly increased, the binding ability is also Can be increased.

본 발명의 바이오센서는 a) 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 삽입하여 형질전환체를 준비하는 단계; b) 상기 형질전환체를 배양하여 본 발명의 융합 단백질을 발현시키는 단계; c) 상기 융합 단백질이 발현된 형질전환체를 회수한 다음, 파쇄하여 상기 융합 단백질을 수득하는 단계; 및 d) 상기 수득한 융합 단백질을 골드-함유 고체상에 특이적으로 고정시키는 단계를 통하여 제조할 수 있다.The biosensor of the present invention comprises the steps of: a) preparing a transformant by inserting an expression vector comprising a polynucleotide encoding the fusion protein of the present invention into a host cell; b) culturing the transformant to express the fusion protein of the present invention; c) recovering the transformant expressing the fusion protein, and then crushing to obtain the fusion protein; And d) specifically fixing the obtained fusion protein to a gold-containing solid phase.

본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 바이오센서를 이용한 면역분석법을 제공한다.
As another aspect, the present invention provides an immunoassay using a biosensor.

본 발명의 바이오센서에는 항체가 결합되어 있으므로 상기 항체에 특이적으로 결합하는 항원을 검출할 수 있다.Since the antibody is bound to the biosensor of the present invention, an antigen specifically binding to the antibody can be detected.

항원-항체의 특이적 결합을 확인하는 것을 특징으로 하는 면역검출법은 가시적(visually), 광학적(optically), 전기화학적(electrochemically) 방법을 통해 수행할 수 있으며, 특히, 광학적 방법의 한 예로 표면플라즈몬공명(SPR) 기술을 들 수 있다.Immunodetection, which is characterized by confirming the specific binding of an antigen-antibody, can be carried out through a visually, optically, or electrochemically method. Particularly, as an example of an optical method, surface plasmon resonance (SPR) technology.

본 발명의 면역분석법은 바람직하게는 표면 플라즈몬 공명 방법을 사용할 수 있다. 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR)은 전반사(attenuated total reflectance)에 의한 표면 플라즈몬 공명 현상을 이용하는 것으로, 전류 또는 기계적 변화를 이용하는 검출 시스템과 비교하였을 때, 용매의 흐름이나 전기적 잡음에 의해 방해받지 않기 때문에 안정된 신호를 얻을 수 있다는 장점을 가지고 있다.The immunoassay of the present invention can preferably use a surface plasmon resonance method. Surface Plasmon Resonance (SPR) utilizes surface plasmon resonance by attenuated total reflectance and is not disturbed by solvent flow or electrical noise when compared to a detection system using current or mechanical changes. It has the advantage of obtaining a stable signal.

본 발명의 면역분석법은 a) 바이오센서의 링커가 삽입된 융합 단백질에 항체를 특이적으로 결합시키는 단계; 및 b) 상기 항체에 특이적인 항원을 처리하여 항원-항체의 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.The immunoassay of the present invention comprises the steps of: a) specifically binding an antibody to a fusion protein into which a linker of a biosensor is inserted; And b) treating the antibody-specific antigen to detect the specific binding of the antigen-antibody.

본 발명의 실시예에서는 링커가 삽입된 융합 단백질 GBP-6Ala-protein G 및 P-6Gly-protein G에 항체를 특이적으로 결합시키고, 그 결합 정도를 융합 단백질 GBP-protein G와 비교하였다. 비교 결과, 링커가 삽입된 융합 단백질 GBP-6Ala-protein G의 항체와의 결합정도가 융합 단백질 GBP-protein G에 비해 약 20% 향상되었고, 링커가 삽입된 융합 단백질 GBP-6Gly-protein G의 항체와의 결합정도는 융합 단백질 GBP-protein G에 비해 약 9% 향상되었음을 알 수 있었다(실험예 2).In an embodiment of the present invention, the antibody specifically binds to the fusion proteins GBP-6Ala-protein G and P-6Gly-protein G into which a linker is inserted, and compares the binding degree with the fusion protein GBP-protein G. As a result, the binding degree of the linker-inserted fusion protein GBP-6Ala-protein G was improved by about 20% compared to the fusion protein GBP-protein G, and the linker-inserted fusion protein GBP-6Gly-protein G was antibody. The degree of binding with the fusion protein GBP-protein G was found to be about 9% improved (Experimental Example 2).

따라서, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 바이오센서를 이용한 면역분석은 링커가 삽입된 융합 단백질이 항체와 결합하는 빈도가 현저히 향상되었기 때문에, 고가인 항체의 손실 없이 융합 단백질에 결합된 항체에 반응시키고자 하는 항원을 처리하고, 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 측정함으로써 항원-항체의 특이적 결합을 검출할 수 있는 이점이 있다.
Therefore, the immunoassay using the biosensor comprising the fusion protein of the present invention, since the frequency of linker-inserted fusion protein with the antibody is significantly improved, and reacts to the antibody bound to the fusion protein without the loss of expensive antibodies. There is an advantage that the specific binding of the antigen-antibody can be detected by treating the antigen to be measured and measuring the change in the surface plasmon resonance signal.

본 발명에 따른 융합 단백질은 항체를 적절한 배향성을 가진 채 간단히 골드-함유 고체상에 고정 시킬 수 있을 뿐 아니라, 링커에 의해 유연성이 증가되어 항체와의 결합 빈도를 높여 줌으로써 고가의 항체가 손실되는 것을 최소화 시킬 수 있어 바이오센서의 대량생산을 유도할 수 있는 효과가 있다.The fusion protein according to the present invention not only secures the antibody to the gold-containing solid phase with the proper orientation, but also increases the flexibility by the linker to increase the frequency of binding to the antibody, thereby minimizing the loss of expensive antibodies. It is possible to induce mass production of biosensors.

도 1은 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질 및 골드결합 단백질이 펩티드 링커에 의해 연결된 융합 단백질을 보인 도면이다.
도 2는 분자동역학 시뮬레이션에 의한 GBP-Linker-protein G 융합 단백질의 3차원 구조를 보인 도면이다.
도 3은 대장균에서 발현된 GBP-6Ala-protein G 및 GBP-6Gly-protein G 융합 단백질의 전기영동 사진이다. L은 라이소자임처리, S는 초음파 처리한 경우의 전기영동 결과이다.
도 4는 GBP와 protein G 사이에 알리닌 또는 글라이신 링커를 삽입하기 위한 프라이머 서열을 보인 도면이다.
도 5는 GBP-6Ala-protein G 및 GBP-6Gly-protein G의 합성 확인을 위한 전기영동 사진이다.
도 6은 pET-22b 벡터에 GBP-6Ala-protein G 및 GBP-6Gly-protein G DNA 단편들의 삽입여부 확인을 위한 전기영동 사진이다.
도 7은 GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질의 골드와의 결합 정도를 나타낸 SPR 센서그램을 보인 도면이다.
도 8은 GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질과 hIgG와의 결합 정도를 나타낸 SPR 센서그램을 보인 도면이다.1 shows a fusion protein in which a protein and a gold binding protein that bind to the Fc region of an antibody are linked by a peptide linker.
2 is a view showing a three-dimensional structure of the GBP-Linker-protein G fusion protein by molecular dynamics simulation.
Figure 3 is an electrophoresis picture of GBP-6Ala-protein G and GBP-6Gly-protein G fusion protein expressed in E. coli. L is the result of electrophoresis when lysozyme treatment, S is the ultrasonic treatment.
Figure 4 shows the primer sequence for inserting an alinine or glycine linker between GBP and protein G.
5 is an electrophoresis picture for confirming the synthesis of GBP-6Ala-protein G and GBP-6Gly-protein G.
Figure 6 is an electrophoresis picture for confirming the insertion of GBP-6Ala-protein G and GBP-6Gly-protein G DNA fragments in the pET-22b vector.
7 is a diagram showing an SPR sensorgram showing the degree of binding of the GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G fusion protein with gold.
FIG. 8 is a diagram showing an SPR sensorgram showing the degree of binding between GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G fusion protein and hIgG.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Experimental Examples. However, the following examples are illustrative of the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.

<실시예 1> 재조합 GBP-protein G 융합 단백질의 제조Example 1 Preparation of Recombinant GBP-protein G Fusion Proteins

Streptococcus G148의 Protein G 유전자(Goward et al., Biochem. J., 1990, 서열번호 8)를 인공적으로 합성(Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA, 미국)하였으며, 이를 주형 DNA로 사용하고, 서열번호 9(5'-ggaattcttgaaaggcgaaacaactactga agctgttgatgctgctactg-3'; 프라이머 1)와 서열번호 10(5'-gaggatccttattcagttaccgtaaag-3'; 프라이머 2)의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 최종적으로 6His-GBP와 protein G가 융합된 형태의 유전자 산물 6His-GBP-protein G를 수득하였다. PCR 조건으로 첫 번째 변성(denaturation)은 94℃에서 5분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성은 94℃에서 1분간, 교잡(annealing)은 56℃에서 1분 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 1분간 수행하였으며 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 한번 더 수행하였다.
Protein G gene (Goward et al., Biochem. J., 1990, SEQ ID NO: 8) of Streptococcus G148 was artificially synthesized (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA, USA) and used as template DNA, SEQ ID NO: 9 (5'-ggaattcttgaaaggcgaaacaactactga agctgttgatgctgctactg-3 '; primer 1) and PCR using primers of SEQ ID NO: 10 (5'-gaggatccttattcagttaccgtaaag-3'; primer 2) to finally form a fusion of 6His-GBP and protein G The gene product of 6His-GBP-protein G was obtained. The first denaturation was performed once at 94 ° C for 5 minutes under the PCR conditions, then the second denaturation was performed at 94 ° C for 1 minute, the annealing at 56 ° C for 1 minute and 30 seconds, and the extension at 72 ° C. One minute was performed and this was repeated 30 times. Then, the last extension was performed once more for 5 minutes at 72 ° C.

<실시예 2> 펩티드 링커가 삽입된 GBP-6Ala-protein G 및 GBP-6Gly-protein G 융합 단백질의 제조Example 2 Preparation of GBP-6Ala-protein G and GBP-6Gly-protein G Fusion Protein with Peptide Linker Inserted

링커로 20개의 아미노산 중에 기능기를 갖지 않으면서 크기가 작은 알라닌(alanine)과 글라이신(glycine)을 선택하여 각각 GBP와 protein G사이에 삽입하였다. 구체적으로, 알라닌 6개를 링커로 삽입하기 위해 서열번호 11의 프라이머(5'-ggtaccattcagtctgcggcagctgcggcc-3' ; 프라이머 3 ; 도 4의 ① 프라이머)와 서열번호 12의 프라이머(5'-gcagctgcggccgcattgaaaggcgaaaca-3' ; 프라이머 4 ; 도 4의 ② 프라이머) 및 글라이신 6개 삽입을 위해 서열번호 13의 프라이머(5'-ggtaccattc agtctggtggcgggggaggt-3' ; 프라이머 5 ; 도 4의 ③ 프라이머)와 서열번호 14의 프라이머(5'-ggcgggggaggtggattgaaaggcgaaaca-3' ; 프라이머 6 ; 도 4의 ④ 프라이머)를 제작하였고, 또한, 상기 ① 프라이머와 ③ 프라이머의 reverse(각각 서열번호 15, 서열번호 16 ; 5'-ggccgcagctgccgcagactgaatggtacc-3' ; 5'-acctcccccgccaccagact gaatggtacc-3')도 PCR을 하기 위해 제작하였다(도 4). Small alanine and glycine were selected between the GBP and the protein G without having functional groups among the 20 amino acids as linkers. Specifically, to insert six alanines into the linker, a primer of SEQ ID NO: 11 (5'-ggtaccattcagtctgcggcagctgcggcc-3 '; primer 3; ① primer of FIG. 4) and a primer of SEQ ID NO: 12 (5'-gcagctgcggccgcattgaaaggcgaaaca-3'; Primer 4; ② primer of FIG. 4) and primer of SEQ ID NO: 13 (5'-ggtaccattc agtctggtggcgggggaggt-3 '; primer 5; primer of FIG. 4) and primer of SEQ ID NO: 14 for insertion of 6 glycine ggcgggggaggtggattgaaaggcgaaaca-3 '; primer 6; primer ④ of FIG. 4) was prepared, and the reverse of the primers ① and ③ primers (SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16; gaatggtacc-3 ') was also prepared for PCR (FIG. 4).

상기 실시예 1에서 제작한 6His-GBP-protein G의 염기서열을 주형으로 하여 표 1과 같은 조건으로 1차 PCR을 수행하였다. PCR은 주형 1㎕, 10mM dNTPs 0.4㎕, 프라이머 10 pmol 1㎕씩, 10X 버퍼 2㎕, taq polymerase(Takara LA taq) 0.2㎕에 나머지를 D.W.로 채워 전체 볼륨을 20㎕으로 넣어 준 PCR mixture를 사용하였다. 이후, 1차 PCR 산물을 주형으로 하여 T7 프로모터 프라이머(서열번호 17 ; 프라이머 7 ; 5'-taatacgactcactataggg-3') 및 T7 종결(terminator) 프라이머(서열번호 18 ; 프라이머 8 ; 5'-gctagttattgctcagcgg-3')를 사용하여 2차 PCR을 수행하였다.
Primary PCR was performed under the conditions shown in Table 1 using the nucleotide sequence of 6His-GBP-protein G prepared in Example 1 as a template. For PCR, PCR mixture was used to fill 1 μl of template, 0.4 μl of 10mM dNTPs, 1 μl of 10 pmol of primer, 2 μl of 10X buffer, 0.2 μl of taq polymerase (Takara LA taq) and add the total volume to 20 μl with DW. It was. Then, the T7 promoter primer (SEQ ID NO: 17; primer 7; 5'-taatacgactcactataggg-3 ') and the T7 terminator primer (SEQ ID NO: 18; primer 8; 5'-gctagttattgctcagcgg-3) using the primary PCR product as a template. Secondary PCR was performed using ').

Figure 112010084644168-pat00001
Figure 112010084644168-pat00001

PCR에 의해 Ala과 Gly 링커가 올바르게 증폭되었는지 확인하고자 아가로스 겔에 로딩하여 전기영동 하였다. 그 결과, lane 1, lane 2에서 약 1kb의 밴드가 형성되어 PCR에 의해 Ala과 Gly 링커가 올바르게 증폭되었음을 확인할 수 있었다(도 5).
In order to confirm that Ala and Gly linkers were correctly amplified by PCR, they were loaded on agarose gel and electrophoresed. As a result, a band of about 1 kb was formed in lanes 1 and 2, and it was confirmed that Ala and Gly linkers were correctly amplified by PCR (FIG. 5).

<실시예 3> 재조합 플라스미드 제작Example 3 Recombinant Plasmid

GBP-6Ala-protein G와 GBP-6Gly-protein G DNA 단편을 각각 Not1/xho1 enzyme(NEB)과 Ndel/xho1 제한효소들을 사용하여 pET-22b 벡터에 삽입한 후 라이게이션(ligation) 시키고, 증폭하였다. GBP-6Ala-protein G and GBP-6Gly-protein G DNA fragments were inserted into pET-22b vector using Not1 / xho1 enzyme (NEB) and Ndel / xho1 restriction enzymes, and then ligation and amplification were performed. .

DNA 단편들이 벡터에 각각 성공적으로 삽입되었음을 확인하기 위하여 DNA 10㎕, 효소 0.5㎕, 10X 버퍼 2㎕에 D.W를 전체 볼륨이 20μl가 되도록 채운 enzyme cutting mixture를 사용하여 37℃의 온도에서 1시간 동안 배양한 뒤, 바로 얼음에 넣어 아가로오즈 겔(agarose gel)에 로딩하여 전기영동 하였다. To confirm successful insertion of DNA fragments into the vector, incubate for 1 hour at 37 ° C using an enzyme cutting mixture filled with 10 μl of DNA, 0.5 μl of enzyme and 2 μl of 10X buffer so that the total volume is 20 μl. Immediately afterwards, they were placed on ice and loaded onto agarose gel, followed by electrophoresis.

도 6을 보면, 전기영동 결과 약 1kb 정도에서 밴드가 형성됨을 확인함으로써 이 DNA 단편들이 벡터에 각각 성공적으로 삽입되었음이 확인되었다(도 6).
Referring to FIG. 6, it was confirmed that these DNA fragments were successfully inserted into the vector by confirming that bands were formed at about 1 kb as a result of electrophoresis (FIG. 6).

<실시예 4> 재조합 플라스미드를 도입한 재조합 대장균의 제조 및 융합 단백질의 정제Example 4 Preparation of Recombinant Escherichia Coli with Recombinant Plasmid and Purification of Fusion Protein

융합 단백질을 발현시키기 위해 대장균 BL21(DE3)을 컴피턴트 세포(competent cell, cp cell)로 제작하여 형질전환시켰다. 컴피턴트 세포 제작을 위해 1M CaCl, D.W, LB 액체 배지를 고압멸균(autoclave)하여 4℃의 온도에서 보관하였다. BL21(DE3) 세포를 서브 클로닝(sub cloning)하여 LB 플레이트에서 37℃의 온도로 밤새 배양하여 키우고, 이 중 하나의 콜로니를 취하여 50㎖의 LB 액체 배지에 분주하여 200rpm, 37℃의 온도 조건으로 진탕(shaking) 배양하여 광학밀도(O.D)값이 0.6~0.8로 나올 때까지 배양하였다. E. coli BL21 (DE3) was produced as competent cells (cp cells) and transformed to express the fusion protein. 1M CaCl, D.W, LB liquid medium was autoclaved and stored at a temperature of 4 ° C for producing competent cells. BL21 (DE3) cells were subcloned and incubated overnight at 37 ° C. in LB plates. One colony was taken and aliquoted into 50 ml of LB liquid medium at 200 rpm and 37 ° C. conditions. Shaking culture was performed until the optical density (OD) value was 0.6-0.8.

그 후, BL21(DE3) 세포를 5000rpm, 10분의 조건으로 원심분리하여 상등액을 버리고 얼음에 보관하였다. 0.1M CaCl 25㎖을 BL21(DE3) 세포가 있는 팔콘 튜브(falcon tube)에 넣고 재현탁(resuspention)한 뒤 0.1M CaCl 25㎖을 다시 한 번 넣고, 얼음에 10분 동안 배양 한 뒤 3000rpm으로 4℃의 온도에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛(pellet)을 취하였다. 0.1M CaCl을 25㎖ 넣어 재현탁한 뒤 얼음에 5분 동안 배양함과 동시에 일정시간마다 inverting 하였다. 이후, 원심분리(3000rpm, 5분, 4℃)하여 상등액을 제거하고 원심분리를 동일 조건으로 돌린 뒤 0.1M CaCl 1㎖을 넣고 재현탁하여 얼음에 넣고 보관하였다. 농도가 1㎍/㎕인 플라스미드(TE buffer 내)를 100㎕ 컨피턴트 세포에 넣고 재현탁한 뒤 얼음에 30분간 배양하고, 42℃ 온도의 진탕기에서 30초간 배양하여 형질전환 시킨 후, 즉시 얼음에 2~3분간 놓아두었다. Thereafter, BL21 (DE3) cells were centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes to discard the supernatant and stored on ice. 25 ml of 0.1 M CaCl was placed in a falcon tube containing BL21 (DE3) cells and resuspended. 25 ml of 0.1 M CaCl was added again, incubated for 10 minutes on ice, Pellets were taken by centrifugation for 5 minutes at a temperature of &lt; RTI ID = 0.0 &gt; 25 ml of 0.1 M CaCl was resuspended and inverted every predetermined time while incubating for 5 minutes on ice. Thereafter, the supernatant was removed by centrifugation (3000 rpm, 5 minutes, 4 ° C.), the centrifugation was performed under the same conditions, 1 ml of 0.1 M CaCl was added, resuspended, and stored in ice. Plasmids (within TE buffer) of 1 µg / µl concentration were resuspended in 100 µl competent cells, incubated for 30 minutes on ice, incubated for 30 seconds on a shaker at 42 ° C, and transformed immediately on ice. Leave for 2-3 minutes.

액체 LB 배지 900㎕을 넣고 200rpm 37℃의 온도 조건으로 1시간 동안 진탕 배양을 한 뒤 앰피실린(ampicillin) 100mg/L을 포함한 LB 플레이트에 깔아주고, 37℃ 온도의 배양기에서 밤새 배양하였다. 형성된 콜로니를 LA 배지(앰피실린을 포함하고 있는 LB 배지) 10ml에서 37℃의 온도로 밤새 배양한 후, 1ml를 취해 DNA를 추출하여 플라스미드가 세포내에 성공적으로 삽입되었는지를 확인하고, 나머지는 70% 글리세롤에 보관하였다. 900 μl of liquid LB medium was added thereto, followed by shaking culture for 1 hour at a temperature of 200 rpm and 37 ° C., followed by spreading on an LB plate containing 100 mg / L of ampicillin, followed by incubation in an incubator at 37 ° C. overnight. The colonies formed were incubated overnight at a temperature of 37 ° C. in 10 ml of LA medium (LB medium containing ampicillin), and then 1 ml was taken to extract DNA to confirm that the plasmid was successfully inserted into the cells. Stored in glycerol.

이후, 보관된 세포 200㎕를 LA 배지 5㎖에 첨가한 후 37℃에서 밤새 170rpm으로 진탕 배양한 후, 1㎖를 신선한 60㎖ LA 배지에 분주하였다. 이를 분광광도계 600nm에서 O.D값 0.6이 나올때까지 배양한 후 1mM IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 진탕 배양을(170rpm, 37℃, 3시간)하면서 융합 단백질을 발현시키고, 원심분리(4000g, 4℃, 30분)하여 상등액을 제거하고, TE 버퍼(Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, 10mM iminazole, pH8.0) 1.4㎖를 넣어 피페팅(pipetting) 하였다. 세포를 튜브(epitube)에 옮겨 2초간 초음파처리, 5초간 얼음에서 배양하는 방법으로 총 10분간 초음파처리 하였다. 그 후, 원심분리(12000g, 4℃, 30분)를 실시하여 상등액을 취하였다. 또한, 라이소자임(lysozme) 처리(효소처리)도 병행하여 초음파처리의 융합 단백질 추출 정도와 비교하였다.Thereafter, 200 μl of stored cells were added to 5 mL of LA medium, followed by shaking culture at 170 rpm overnight at 37 ° C., and then 1 mL was dispensed into fresh 60 mL LA medium. This was incubated at 600 nm of the spectrophotometer until the OD value of 0.6 was reached, followed by addition of 1 mM IPTG (isopropyl-β-thiogalactoside) to express the fusion protein while shaking culture (170 rpm, 37 ° C., 3 hours) and centrifugation (4000 g, 4 ° C., 30 minutes), the supernatant was removed, and 1.4 ml of TE buffer (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, 10 mM iminazole, pH8.0) was added and pipetting was performed. Cells were transferred to a tube (epitube), sonicated for 2 seconds, and sonicated for 5 seconds in ice for 5 seconds. Thereafter, centrifugation (12000 g, 4 ° C, 30 minutes) was performed to obtain a supernatant. In addition, lysozyme (lysozme) treatment (enzyme treatment) was also compared with the degree of fusion protein extraction of the ultrasonic treatment.

융합 단백질의 정제는 Ni-NTA 컬럼(Qiagen)을 이용하였다. 컬럼에 반응버퍼(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM imidazole, pH 8.0) 600㎕ 넣고 원심분리(890g, 4℃, 2분)한 후, 컬럼에 동량의 단백질을 넣어 또 한 번 원심분리(270g, 4℃, 5분)하여 컬럼의 Ni와 융합 단백질의 His-tag가 결합하도록 했다. 세척 버퍼(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazole, pH 8.0) 600㎕를 넣고 890g로 4℃의 온도에서 2분 동안 원심분리를 2회 반복한 뒤, 300㎕ 용리 버퍼(elution buffer, 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 500mM imidazole, pH 8.0)를 넣어 융합 단백질을 얻었다. 각 융합 단백질들은 센트리콘(centricon, >10KDa)으로 PBS 버퍼에 농축하여 4℃에서 냉장보관 하였다. Purification of the fusion protein was performed using a Ni-NTA column (Qiagen). 600 μl of reaction buffer (50mM NaH 2 PO 4 , 300mM NaCl, 10mM imidazole, pH 8.0) was added to the column and centrifuged (890g, 4 ° C, 2 minutes), and the same amount of protein was added to the column. 270 g, 4 ° C., 5 minutes) to allow Ni of the column to bind His-tag of the fusion protein. Add 600 μl of wash buffer (50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0), repeat centrifugation twice at 890 g for 2 minutes at 4 ° C., and then 300 μl elution buffer (50 mM). NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 8.0) was added to obtain a fusion protein. Each fusion protein was concentrated in PBS buffer with centricon (> 10KDa) and refrigerated at 4 ° C.

도 3은 대장균에서 발현된 융합 단백질의 전기영동 사진을 나타낸다. 도 3 의 L은 효소처리, S는 초음파처리를 나타낸다. 도 3을 보면, GBP-protein G, GBP-Ala-protein G(도 3의 GBP-A-protein G), GBP-Gly-protein G(도 3의 GBP-G-protein G) 융합 단백질 모두에서 효소처리보다 초음파처리에서 좀 더 많은 융합 단백질을 얻을 수 있음을 알 수 있었다(도 3).
Figure 3 shows an electrophoresis picture of the fusion protein expressed in E. coli. 3, L denotes enzyme treatment, S denotes sonication. 3, enzymes from both the GBP-protein G, the GBP-Ala-protein G (GB-A-protein G in FIG. 3), and the GBP-Gly-protein G (GB-G-protein G in FIG. 3) fusion proteins It can be seen that more fusion proteins can be obtained by sonication than by treatment (FIG. 3).

<실시예 5> 링커가 삽입된 융합 단백질을 고정한 바이오센서의 제작Example 5 Fabrication of Biosensor Fixing Fusion Protein Inserted with Linker

실시예 4에서 수득한 GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질을 함유하는 수용성 단백질 분획을 PBS 버퍼(pH 7.4)로 1 mg/ml 농도로 희석하였다. 골드 칩(Biacore Internation AB, Uppsala, 스웨덴)을 normalization 용액(70% glycerol, v/v)으로 6분 동안 처리하여 표면의 유기물을 완전히 제거하고 골드 칩 사이의 미세 채널을 이용하여 SPR 장치내 시린지펌프(Syringe pump)로 5 μl/min 유속으로 PBS 버퍼를 흘리면서 골드 칩의 표면을 안정화시켜서 상기 융합 단백질을 고정화시킬 수 있는 바이오센서를 제작하였다.
The aqueous protein fractions containing GBP-6Ala-protein G and GBP-6Gly-protein G fusion proteins obtained in Example 4 were diluted to a concentration of 1 mg / ml in PBS buffer (pH 7.4). Gold chip (Biacore Internation AB, Uppsala, Sweden) was treated with normalization solution (70% glycerol, v / v) for 6 minutes to completely remove surface organic matter and syringe pump in SPR device using microchannel between gold chips. A biosensor capable of immobilizing the fusion protein was prepared by stabilizing the surface of the gold chip while flowing PBS buffer at a flow rate of 5 μl / min with a syringe pump.

<실험예 1> 분자동역학 시뮬레이션 분석Experimental Example 1 Molecular Dynamics Simulation Analysis

펩티드 링커로 연결된 골드결합 단백질-펩티드 링커-단백질 G에 대한 분자동역학(molecular dynamics)을 분석하였다. Amber 10 분자동역학 툴을 사용하였으며, 단백질 구조는 Swiss-prot에서 제공하는 homology modeling sever에서 예측된 것을 사용하였다. Molecular dynamics of the gold-binding protein-peptide linker-protein G linked with the peptide linker were analyzed. The Amber 10 molecular dynamics tool was used, and the protein structure was predicted from the homology modeling sever provided by Swiss-prot.

도 2를 보면, 시뮬레이션 결과, 골드결합 단백질과 단백질 G 사이에 삽입된 펩티드 링커에 의해 단백질 G의 유연성이 향상되었음을 확인할 수 있었다(도 2).
Referring to Figure 2, the simulation results, it was confirmed that the flexibility of the protein G by the peptide linker inserted between the gold binding protein and protein G (Fig. 2).

<실험예 2> GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질의 골드-함유 고체상과의 결합능력 측정Experimental Example 2 Measurement of Binding Ability of GBP-6Ala-protein G and GBP-6Gly-protein G Fusion Proteins with Gold-Containing Solid Phase

유전자 재조합 방법으로 합성된 GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질의 특성을 분석하기 위해 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 신호의 변화를 측정하였다. 구체적으로, 각각의 융합 단백질(300μg/ml)을 20분 동안 SPR 골드 칩 표면에 미세 채널을 통해서 흘려준 후 버퍼로 세척하여 골드와의 특이적 결합 정도를 분석하였다. 또한, 대조군으로 BSA와 골드와의 결합 정도를 분석하였다.Changes in surface plasmon resonance (SPR) signals were measured to characterize the GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, and GBP-6Gly-protein G fusion proteins synthesized by genetic recombination. Specifically, each fusion protein (300μg / ml) was flowed through the microchannel on the surface of the SPR gold chip for 20 minutes and washed with a buffer to analyze the degree of specific binding with gold. In addition, the degree of binding of BSA and gold was analyzed as a control.

도 7은 GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질의 골드와의 결합 정도를 나타낸 SPR 센서그램을 보인 도면이다. 도 7을 보면, 대조군으로 반응시킨 BSA는 골드와 거의 반응하지 않았으며, GBP-6Ala-protein G의 RU값 2198 및 GBP-6Gly-protein G의 RU값 2004가 GBP-protein G의 RU값 2286보다 아주 약간 작은 값을 보이나 유의적인 차이는 보이지 않았음을 알 수 있었다(도 7). 7 is a diagram showing an SPR sensorgram showing the degree of binding of the GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G fusion protein with gold. 7, the BSA reacted with the control showed little reaction with gold, and the RU value 2198 of GBP-6Ala-protein G and the RU value 2004 of GBP-6Gly-protein G were higher than the RU value 2286 of GBP-protein G. Very small values were found but no significant difference was observed (FIG. 7).

이러한 결과는 6개의 Ala 또는 Gly을 각각 링커로 삽입하여 GBP와 protein G를 연결하는 경우에도 융합 단백질(골드결합 단백질-링커-단백질 G)의 골드와의 특이적 결합능력에는 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
These results indicate that insertion of 6 Ala or Gly into the linker, respectively, to link GBP and protein G does not affect the specific binding ability of the fusion protein (gold-binding protein-linker-protein G) with gold. .

<실험예 3> GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질의 항체와의 반응성 측정Experimental Example 3 Measurement of Reactivity with Antibodies of GBP-6Ala-protein G and GBP-6Gly-protein G Fusion Proteins

GBP-protein G 융합 단백질의 링커(6Ala, 6Gly) 삽입으로 인한 항체 Fc 부위와의 반응성이 증가하는지 여부를 실험하였다. 이를 위해, 골드-함유 고체상에 결합된 GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질에 인간 면역글로블린(hIgG, 100μg/ml)을 10분 동안 반응시키고, 대조군으로 BSA를 10분 동안 반응시킨 후 PBS 버퍼로 세척하였다. Whether the reactivity with the antibody Fc region due to the insertion of linker (6Ala, 6Gly) of GBP-protein G fusion protein was examined. To this end, human immunoglobulin (hIgG, 100 μg / ml) was reacted with GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, and GBP-6Gly-protein G fusion proteins bound to the gold-containing solid phase for 10 minutes, and as a control. The BSA was reacted for 10 minutes and then washed with PBS buffer.

도 8은 GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질과 hIgG와의 결합 정도를 나타낸 SPR 센서그램을 보인 도면이다. 도 8을 보면, 융합 단백질의 protein G와 hIgG와의 결합 정도는 GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G에서 각각 4005 RU, 4899 RU, 4363 RU 값을 보였고, 대조군인 BSA와는 아주 약간의 반응 정도를 보였다. 구체적으로, 6Ala 링커가 삽입되어 있는 융합 단백질(GBP-6Ala-protein G)의 protein G와 hIgG의 결합 정도는 링커가 없는 융합 단백질(GBP-protein G)보다 약 20% 증가했고, 6Gly 링커가 삽입되어 있는 융합 단백질(GBP-6Gly-protein G)은 GBP-protein G 융합 단백질보다 약 9% 증가하였음을 확인되었다. FIG. 8 is a diagram showing an SPR sensorgram showing the degree of binding between GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G fusion protein and hIgG. 8, the binding degree of protein G and hIgG of the fusion protein showed values of 4005 RU, 4899 RU, and 4363 RU in GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, and GBP-6Gly-protein G, respectively. Very little reaction with BSA. Specifically, the binding degree of protein G and hIgG of the 6Ala linker-inserted fusion protein (GBP-6Ala-protein G) was increased by about 20% than that of the linker-free fusion protein (GBP-protein G), and the 6Gly linker was inserted. The fusion protein (GBP-6Gly-protein G) was found to be about 9% higher than the GBP-protein G fusion protein.

GBP-6Ala-protein G 융합 단백질 분자 1개당 hIgG와의 결합 정도는 GBP-protein G 융합 단백질보다 약 27% 증가했으며, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질의 경우에는 약 24% 증가하였다. 이러한 결과는 링커를 통하여 연결된 GBP와 protein G 융합 단백질은 골드-함유 고체상과의 결합능력은 유지하면서 항체의 Fc 부위와의 결합 정도(결합 빈도)가 상당히 향상되었음을 나타낸다.The binding degree of hIgG per molecule of GBP-6Ala-protein G fusion protein was increased by 27% compared to GBP-protein G fusion protein, and increased by 24% for GBP-6Gly-protein G fusion protein. These results indicate that the GBP and protein G fusion proteins linked through the linker significantly improved the degree of binding to the Fc region of the antibody (binding frequency) while maintaining the binding ability with the gold-containing solid phase.

도 2는 분자동역학 시뮬레이션에 의한 골드결합 단백질-링커-단백질 G 융합 단백질의 3차원 구조를 보인 도면이다. 도 2를 보면, 골드결합 단백질과 단백질 G를 링커를 통하여 연결한 융합 단백질은 삽입된 링커로 인하여 단백질 G 부분의 유연성(flexibility)이 증가하였음을 알 수 있으며, 따라서, 링커를 통하여 골드결합 단백질과 단백질 G를 연결한 융합 단백질에 있어서 항체와의 반응성(결합 빈도)이 향상되는 것은 링커의 삽입으로 인한 단백질 G의 유연성이 증가하였기 때문임을 알 수 있다.Figure 2 is a diagram showing the three-dimensional structure of the gold-binding protein-linker-protein G fusion protein by molecular dynamics simulation. 2, it can be seen that the fusion protein connecting the gold binding protein and the protein G through the linker has increased the flexibility of the protein G portion due to the inserted linker. It can be seen that the reactivity (binding frequency) with the antibody in the protein G-linked fusion protein is due to the increased flexibility of the protein G due to the insertion of the linker.

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Claims (17)

항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질인 단백질 G(protein G) 또는 단백질 A(protein A), 및 골드결합 단백질이 펩티드 링커에 의해 연결된 융합 단백질로서, 상기 펩티드 링커는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 것인 융합 단백질.
Protein G or protein A, which is a protein that binds to the Fc region of an antibody, and a fusion protein in which a gold binding protein is linked by a peptide linker, wherein the peptide linker is an amino acid of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 A fusion protein consisting of sequences.
제 1항에 있어서, 상기 펩티드 링커는 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질의 N-말단 및 골드결합 단백질의 C-말단에 연결된 것인 융합 단백질.
The fusion protein of claim 1, wherein the peptide linker is linked to the N-terminus of the protein that binds to the Fc region of the antibody and the C-terminus of the gold binding protein.
삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 1항에 있어서, 상기 항체의 Fc 영역에 결합하는 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것인 융합 단백질.
The fusion protein of claim 1, wherein the protein binding to the Fc region of the antibody is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
제 1항에 있어서, 상기 골드결합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 것인 융합 단백질.
According to claim 1, wherein the gold binding protein is a fusion protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
삭제delete 제 1항, 제 2항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
8. A polynucleotide encoding the fusion protein of any one of claims 1, 2, 6 and 7.
제 9항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6의 염기서열 또는 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 것인 폴리뉴클레오티드.
10. The polynucleotide of claim 9, wherein the polynucleotide comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 or a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
제 9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
An expression vector comprising the polynucleotide of claim 9.
제 11항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
A transformant transformed with the expression vector of claim 11.
a) 제 1항, 제 2항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; b) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체로 형질전환하는 단계; 및 c) 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 제 1항, 제 2항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 제조하는 방법.
a) preparing an expression vector comprising a polynucleotide encoding the fusion protein of any one of claims 1, 2, 6 and 7; b) introducing the expression vector into a host cell and transforming it with a transformant; And c) culturing the transformant, wherein the fusion protein of any one of claims 1, 2, 6 and 7 is prepared.
제 1항, 제 2항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질이 결합된 골드-함유 고체상을 포함하는 바이오센서.
8. A biosensor comprising a gold-containing solid phase to which the fusion protein of any one of claims 1, 2, 6 and 7 is bound.
a) 제 1항, 제 2항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 삽입하여 형질전환체를 준비하는 단계; b) 상기 형질전환체를 배양하여 제 1항, 제 2항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 발현시키는 단계; c) 상기 융합 단백질이 발현된 형질전환체를 회수한 다음, 파쇄하여 상기 융합 단백질을 수득하는 단계; 및 d) 상기 수득한 융합 단백질을 골드-함유 고체상에 특이적으로 고정시키는 단계를 포함하는, 제 1항, 제 2항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질이 결합된 골드-함유 고체상을 포함하는 바이오센서의 제작 방법.
a) preparing a transformant by inserting an expression vector comprising a polynucleotide encoding the fusion protein of any one of claims 1, 2, 6 and 7 into a host cell; b) culturing the transformant to express the fusion protein of any one of claims 1, 2, 6 and 7; c) recovering the transformant expressing the fusion protein, and then crushing to obtain the fusion protein; And d) the gold to which the fusion protein of any one of claims 1, 2, 6 and 7 is bound, comprising the step of specifically immobilizing the obtained fusion protein on a gold-containing solid phase. Method for producing a biosensor comprising a solid phase containing.
제 14항의 바이오센서를 이용한 면역검출법.
The immunodetection method using the biosensor of claim 14.
제 16항에 있어서, 상기 바이오센서의 융합 단백질에 항체를 특이적으로 결합시키는 단계; 및 상기 항체에 특이적인 항원을 처리하여 항원-항체의 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함하는 면역검출법.The method of claim 16, further comprising: specifically binding the antibody to a fusion protein of the biosensor; And treating the antigen specific for the antibody to detect specific binding of the antigen-antibody.
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