KR101288502B1 - 식물 형질전환용 바이너리 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 및 분리 정제를 용이하게 하기 위하여 벡터의 크기를 축소시키고, 항생제 선발마커와 같은 식물용 마커유전자를 제거하여 국내에서 재조합 작물을 상용화하기 위한 재조합 바이너리 벡터 pRDA-748에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 형질전환 벡터에 의해 형질 전환 된 아그로박테리움 속 미생물과 이를 통하여 형질 전환 된 식물체에 관한 것이다. 기존의 식물 형질변환 벡터와는 달리 본 발명의 벡터는 크기가 작아 형질 전환이 용이하고 식물 마커 유전자를 가지고 있지 않으므로 이를 제거하는 과정 없이 상용화가 가능한 이점을 가진다.

Description

식물 형질전환용 바이너리 벡터{Binary vector for plant gene transformation}

본 발명은 식물 형질전환용 바이너리 벡터에 관한 것으로 보다 상세하게는 아그로박테리움 속 미생물을 이용한 형질전환 시 종래의 형질전환 벡터의 골격을 축소 개량하여 형질전환을 용이하게 하고, 벡터 내에 선발 마커 유전자를 제거하여 종래 형질전환체에서 문제되는 안전성을 확보한 재조합된 식물 형질전환용 바이너리 벡터, 이를 포함하는 미생물 및 형질 전환된 식물에 관한 것이다.

‘형질전환’이란 다른 생물체의 유전물질을 받아들여 자신의 염색체에 삽입하는 과정을 말하며, 식물체에 외래 유전자를 도입하는 기술인 '식물체 형질전환법'에는 토양미생물(Agrobacterium tumefaciens 등)에 의한 방법과 직접 전달방법(미세입자 bombarding 방법, 화학물질에 의한 방법)이 있다. 특히, 아그로박테리움에 의한 식물의 형질전환 방법이 가장 널리 사용되고 있으며, 아그로박테리움에 의한 식물 형질전환 과정은 다음과 같다.

식물을 유전적으로 형질 전환시키기 위해서 아그로박테리움은 T-복합체라고 부르는 일종의 핵산-단백질 복합체 형태로 유전재료를 숙주 세포의 핵 속으로 수송한다. 핵 안으로 일단 들어가고 나면 그 T-복합체는 숙주 염색체에 도달해서 그 숙주 세포의 유전 재료 속으로 통합된다. 아그로박테리움은 다양한 생물학적 과정을 전개해서 숙주 세포를 유전적으로 변환시킨다. 이와 같이 아그로박테리움은 세균과 진핵 세포간의 유전재료 수송을 연구할 수 있는 특별한 모델 시스템으로의 역할을 갖는다. 또한 세포 핵 속으로 유전재료를 수송하는 모델로서도 역할을 감당한다.

그러나, 아그로박테리움을 통하여 형질전환을 일으키도록 하는 유전물질 운반체인 벡터의 경우, 국내 고유 식물 형질전환용 벡터가 없어 전적으로 외국에서 개발한 식물형질전환용 벡터를 사용하고 있는 실정이며, 상용화를 목적으로 할 때 국내 고유 운반체의 개발이 요구된다. 식물 형질전환용 벡터는 보통 10kb 정도의 골격을 가지며, 식물 형질전환 선발마커가 추가되면 11kb에 달한다. 형질전환 벡터를 재조합하고 분리 정제할 때 운반체의 크기가 작을수록 편리하고 다루기 쉽다. 따라서 종래 벡터보다 골격이 축소된 벡터의 개발이 필요하다.

또한, 상기 기술은 모두 항생제 내성 유전자나 제초제 저항성 유전자와 같은 선발표지 유전자(Selection Marker Gene)에 의존하고 있다. 즉, 식물체에 도입하고자 하는 유전자와 선발표지 유전자를 하나의 DNA 단편에 실어서 식물체에 전달함으로써, 이 DNA 단편이 전달된 식물세포만 이 항생제나 제초제에 대한 저항성을 갖게 되고, 연구자는 이들 형질 전환된 세포로부터 재분화된 형질전환 식물체를 획득할 수 있다. 하지만, 최근 형질전환 식물체의 제작과정에서 필수불가결한 항생제나 제초제 내성에 관한 잠재적인 해악에 사회적 관심이 집중되고 있다. 또한, 유럽연합은 2004년부터 형질전환작물에 임상적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자의 사용을 금지하고 있다. 이처럼, 유전자 변형 식물이 생태계에 미칠 수 있는 잠재적 영향과 리스크에 대하여 현재까지 제기되고 있는 사항들은 다음과 같다.

첫째, 자연생태계의 생물다양성을 교란할 수 있는 가능성이다. 유전자 변형 농작물이 잡초화되어 생태계를 교란 할 수 있는 가능성과, 유전자 변형 농작물의 제조체 저항성 유전자나 살충제 저항성 유전자가 인근 잡초들과 수평적으로 전이되어 슈퍼잡초(superweed)가 발생할 가능성이 있다. 이 경우 통제불능의 우려할 만한 사태가 발생할 수 있다.

둘째는 생태계 진화과정의 파괴이다. 유전자 재조합 기술은 생물종간의 유전형질을 인위적으로 삽입하여 발현시키는 것이므로 자연적으로 발생하는 진화과정을 엄청난 속도로 가속화시킬 수 있다. 이러한 생물종 진화의 가속화가 자연적으로 발생하는 생물종의 진화 과정을 파괴할 우려가 있다. 또한, 유전자 변형 농작물 및 유전자 변형 농작물로 만들어진 식품을 인간이 섭취했을 경우, 새로 도입된 유전자 산물이 식품으로 인체에 들어갔을 때 발생할 수 있는 독성과 알레르기 유발의 위험성이 존재한다. 즉, 인체의 항생제 저항성이 증가하여 보건의료학적인 측면에서 문제를 야기할 수 있다는 것이다.

또한, 여러 개의 외래유전자를 도입하여 식물체를 개량하고자 하는 경우 한번 사용된 선발 마커 유전자는 재사용이 불가하며, 한번 사용된 것들은 상기 문제를 발생시키기 때문에 제거되어야 한다.

따라서, 형질 전환 작물의 상용화를 위해서는 이러한 선발 마커 유전자를 포함하지 않는 형질전환체를 선별하는 과정을 추가적으로 거쳐야 한다. 이와 관련된 기술로서, Cre/loxP 등을 이용한 위치 특이 재조합 시스템(site specific recombination system) 및 목표 유전자와 음성 선발마커의 동시 형질전환(co-tramsformation system)을 이용하여 항생제 저항성 마커를 포함한 형질전환체를 제거하는 방법 등이 알려져 있다. 그러나 이들 방법은 아직까지 일부 식물체에만 적용될 수 있으며, 형질전환이 완료된 후 선발 마커 유전자를 포함하는 세포 또는 조직을 사멸시키는 방식으로 항생제 저항성 유전자가 삽입된 개체를 골라내는 과정을 필요로 한다. 따라서 항생제 저항성을 가지는 선발 마커 유전자를 처음부터 포함하지 않으면서, 형질전환 효율이 높은‘마커-프리’벡터의 연구가 필요한 실정이다.

이에 본 발명의 발명자들은 형질전환이 용이하고 마커 유전자에 대한 안전성을 해결할 수 있는 벡터에 대하여 연구하던 중, 종래 형질전환 벡터보다 크기가 축소되고 선발마커 유전자가 제거된 형질전환용 벡터에 관한 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은, 기존의 바이너리 벡터인 pHG644에서 tetA-tetR을 제거하고 tetC를 삽입한 도 2의 개열지도로 표시되는 식물 형질전환용 바이너리 벡터 pRDA-748을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 식물 형질전환용 바이너리 벡터 pRDA-748로 형질전환된 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.) 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 미생물로 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 기존의 바이너리 벡터인 pHG644를 바탕으로 축소된 도 2의 개열지도로 표시되는 식물 형질전환용 바이너리 벡터 pRDA-748을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 식물 형질전환용 바이너리 벡터 pRDA-748로 형질전환된 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.) 미생물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 미생물로 형질전환된 식물체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 pHG644로부터 tetA 유전자 및 tetR 유전자를 제거하고, tetC 유전자를 포함하도록 한 식물 형질전환용 바이너리 벡터 pRDA-748에 관한 것이다. 바이너리 벡터(binary vector)란 두 개의 벡터 시스템에 걸쳐 기능을 발휘하도록 고안된 벡터로, 아그로박테리움의 Ti 플라스미드에 의한 형질변환시, 그 크기 때문에 조작이 어려워 이를 2개의 리플리콘에 나누어 하는데 이때 이용되는 것이다. 본 발명의 식물 형질전환용 바이너리 벡터 pRDA-748은 벡터 pRDA-747에 EcoRⅠ단편을 추가적으로 가지는 것으로, 제조 과정은 아래와 같다.

먼저, pRDA-747벡터를 제조하였다. pRDA-747 벡터는 pHG644를 EcoRⅠ으로 처리하여 EcoRⅠ단편을 제거한 후, 제한효소를 처리하여 tetA-tetR부분을 제거하고 pBR322벡터에서 tetC 유전자를 분리하여 tetA-tetR이 제거된 부위에 삽입하여 제조한 것으로, 약 6.2 kb의 크기를 가지는 벡터이다. (실시예 1 참고)

상기 tetA 유전자는 대장균과 아그로박테리움의 선발 마커 유전자부위로, 테트라사이클린에 내성을 가지는 유전자 부위를 말한다. 이는 유전자 재조합 및 아그로박테리움 형질전환시 필수적인 유전자이다. tetR은 tetA와 마찬가지로 테트라사이클린 내성을 가지는 유전자이다. 본 발명에서 기존의 pHG644에 포함된 tetA-tetR은 3.8kb의 크기를 가지는데, 본 발명의 벡터는 3.8kb인 tetA-tetR을 1.3kb인 tetC로 교체하여 전체적인 벡터의 크기를 줄였다. 본 발명의 일실시예에서는 tetA-tetR 보유 벡터인 기존의 pHG644와 tetC 보유 벡터인 pRDA-748의 아그로박테리움 형질 전환 효율을 비교하는 실험을 실시하였다. 그 결과, 기존의 pHG644보다 크기가 2.5kb가량 축소된 본 발명의 pRDA-748이 1.4배 높은 아그로박테리움 형질전환율을 가진다는 것을 알 수 있었다. (실시예 2-1 참고)

또한, 본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 바이너리 벡터의 상용화를 시험하기 위하여 상기 벡터 pRDA-747에 cryIAcI유전자를 추가적으로 포함하는 혹명나방 저항성 바이너리 벡터 pRDA-RTB를 제조하였다. 혹명나방은 중국에서 날아오는 해충으로 보통 7월 하순부터 출수기에 걸쳐 벼 잎을 세로로 말아 그 속에서 벼 잎을 갉아 먹는데, 혹명나방이 발생한 논의 벼는 낟알이 여물지 않아 일단 발생하면 큰 피해를 준다. 2003년 혹명나방 피해 면적은 29만8천㏊로 전체 벼 재배 면적의 30%를 차지했으며, 특히 혹명나방 애벌레는 벼 잎을 말고 그 안에서 잎을 갉아 먹어 초기에 방제하지 않을 경우 농약 방제 효과가 현저히 떨어지는 해충이다. 따라서 이를 친환경적인 방법으로 퇴치할 수 있는 방법으로서, 혹명나방 저항성 유전자인 cryIAcI를 이용하는 방법에 대하여는 이미 알려진 바 있다. 상기 혹명나방 저항성 유전자는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis; Bt)로부터 분리되었으며, Bt9 유전자라고도 한다. 본 발명은 pRDA-747 벡터가 실제로 식물체를 형질 전환시킨 후 상용화가 가능한지 여부를 확인하기 위하여, 혹명나방 저항성을 가지는 cryIAcI 유전자 카세트를 pRDA-747 벡터에 클로닝하여 pRDA-RTB(9,490bp)벡터를 제작하였다. 이를 벼에 주입하여 형질전환한 결과, 혹명나방에 대하여 저항성을 가지는 벼를 생산할 수 있었다. 또한 이와 같이 생산된 벼는 기존의 형질전환체와 달리 별도의 항생제 저항성 마커를 제거하는 별도의 과정을 거칠 필요가 없기 때문에, 별도의 선발 과정 없이 상용화가 가능하다.

또한, 본 발명은 식물 형질전환용 벡터 pRDA-748 벡터를 포함하는 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.) 미생물에 관한 것이다. 위에서 언급한바와 같이 식물 형질전환에 가장 널리 사용되는 방법은 토양미생물인 아그로박테리움을 이용하는 것이다. 아그로박테리움은 흙 속에 사는 운동성을 가진 토양미생물의 하나로, 암을 유발하는 플라스미드(Ti(Tumer induced) plasmid)를 가지고 있어 식물체의 상처 따위를 통하여 감염하여 조직 세포의 이상 증식을 유발한다. 아그로박테리아 속에 속하는 미생물 중, 형질전환에 이용되는 것으로서 아그로박테리움 투머페시안스(Agrobacterium tumefaciens) 및 아그로박테리움 라이조제네스(Agrobacterium rhizogenes)가 있고, 바람직하게는 아그로박테리움 투머페시안스가 있다. 본 발명의 일실시예에서는 아그로박테리움 투머페시안스 LBA4404를 이용하였다. 이는 Ti 플라스미드를 가지고 있는데, 이 플라스미드에 포함된 T-DNA는 숙주 식물의 염색체 안으로 끼어 들어가 발현하는 성질을 가진다. 본 발명의 바이너리 벡터 pRDA-748은 아그로박테리움의 T-DNA내로 도입되며, 그 결과, 미생물의 형질전환을 일으키게 된다. 따라서 본 발명은 pRDA-748 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 포함한다.

또한 본 발명은 상기 미생물로 형질전환된 식물체에 관한 것이다. 본 발명의 일실시예에서 pRDA-748을 보유한 LBA4404를 이용하여 화영벼와 일미벼를 형질전환하였다. 그 결과, 기존 바이너리 벡터에서 항생제 유전자를 축소 치환하여도 형질 전환이 성공적으로 일어나는 것을 확인하였다. 또한, pRDA-747을 이용하여 재조합한 pRDA-RTB벡터를 이용하여 일미벼를 형질전환하여 이를 PCR 스크리닝으로 확인한 결과, cryIAcI유전자를 나타내는 밴드를 확인할 수 있었다. 또한, 면역검출지(immunostrip)를 통해 단백질의 발현 여부를 확인한 결과, 도입된 혹명나방 저항성 유전자가 발현되었음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 벡터를 이용하여 형질전환을 할 수 있는 식물체는 이에 제한되지 않으나, 화영벼, 일미벼를 포함하는 벼, 고추, 배추, 무, 참외, 오이, 수박, 유채 및 담배의 형질전환에 이용될 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 재조합 및 분리 정제를 용이하게 하기 위하여 벡터의 크기를 축소시키고, 항생제 선발마커와 같은 식물용 마커유전자를 제거하여 국내에서 재조합 작물을 상용화하기 위한 재조합 바이너리 벡터, 상기 형질전환 벡터에 의해 형질전환 된 아그로박테리움 속 미생물 및 이를 통하여 형질전환 된 식물체에 관한 것이다. 기존의 바이너리 벡터 식물 형질변환체와는 달리 본 발명의 바이너리 벡터를 이용한 형질변환체는 크기가 작아 형질 전환이 용이하고 마커 유전자를 가지고 있지 않으므로 이를 제거하는 과정 없이 상용화가 가능한 이점을 가진다.

도 1은 본 발명의 pRDA-748 벡터 및 이의 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 pRDA-748 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3은 pHG644 벡터로부터 제조된 본 발명의 pRDA-747 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 4는 pRDA-748 벡터를 이용하여 아그로박테리움 형질전환 후 플라스미드를 분리하여 전기영동으로 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 5는 pRDA-748 벡터로 일미벼 및 화영벼를 형질전환한 후 유전자의 삽입 여부를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Bt9 유전자(cryIAI)를 보유한 pRDA-RTB 바이너리 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 7은 Bt9 유전자를 보유한 pRDA-RTB 벡터로 벼를 형질전환한 후 형질전환체의 DNA를 PCR후 그 산물을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 pRDA-RTB 벡터로 형질전환된 벼의 각 개체별 도입유전자 발현 여부를 면역검출지(Immunostrip)로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 pRDA-RTB로 형질전환된 벼의 유전자 삽입 여부를 서던 혼성화 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. (1번, 8번 레인 : 마커, 2번 레인 : 음성 대조군, 3번 내지 7번 레인 : #5, #6, #7, #11, #18)

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

아그로박테리움 형질 전환체의 선발 마커를 교체한 바이너리 벡터의 제조

본 발명의 벡터는 기존의 바이너리 벡터 pHG644(도 3 참조)로부터 제작되었다. tetC 유전자는 pBR322(1977, Gene, 2, page 95~113)벡터를 주형으로 프라이머 (tet5-SnaBI 5'-TTCTACGTATCTCATGTTTGACAGCTTAT-3'(서열번호 1), tet3-BssH 5'-GTGCGCGCATTCACAGTTCTC-3'(서열번호 2))를 제작하여 PCR반응으로 유전자를 분리했다. 우선 유전자 재조합 과정에 필요한 제한효소 자리를 확보하기 위해서 BL과 BR 사이에 있는 BssHII 자리를 제거하기 위해 pHG644를 EcoRI 처리하여 2,626bp EcoRI 단편을 제거한 운반체 pHG-Del-RI을 제작하였다. pHG-Del-RI을 제한효소 BssHII 와 SnaBI을 처리하여 3815bp tetA-tetR 유전자 부위를 제거하고 그 위치에 PCR로 클로닝한 tetC 유전자(1,366bp)를 삽입시켜 pRDA-747(6197bp)을 작성하였다. 이를 도 3에 나타내었다.

또한, 기존 pHG644벡터와 비교하여 작성된 벡터의 아그로박테리움 형질전환과 식물 형질전환 여부를 확인하기 위해 pHG644의 EcoRI 단편 2,626bp를 pRDA-747 EcoRI 자리에 재조합시켜 pRDA-748(8,824bp)을 제작하였다.

그 결과, 도 1 및 도 2에서 보듯이, 기존 바이너리 벡터의 골격 부위에 있는 마커 유전자인 tetA-tetR을 tetC로 교체하여 기존 벡터보다 크기가 작으면서 아그로박테리움 형질 전환 기능을 가지는 벡터 pRDA-748(8.824bp)를 제조하였다.

< 실시예 2>

pRDA -748 바이너리 벡터의 형질전환 및 DNA 분리

<2-1> 세균 형질전환 및 DNA 분리

기존의 바이너리 벡터에서 골격을 일부 치환시킨 pRDA-748의 기능을 확인하기 위해 먼저 아그로박테리움을 이용한 세균 형질전환을 실시하였다. 아그로박테리움 형질전환 방법은 아그로박테리움 투머페시안스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404를 동결융해(freeze and thaw) 방법으로 형질전환 하였으며, 테트라사이클린 항생제 저항성 아그로박테리움으로 Ti-Plasmid 분리 방법(Kado's method, J.Bacteriology 145, 1365 (1981))을 이용하여 DNA를 분리하였다. 이와 같이 분리한 DNA를 아가로즈 전기영동으로 분석하였다.

그 결과, 도 4에서 보듯이, 형질전환 아그로박테리움에서는 pRDA-748 바이너리 벡터와 LBA4404 수용세균이 가지는 축소된 Ti-Plasmid(종양 유발 유전자 제거) DNA를 확인 할 수 있었다.

또한 pRDA-748의 미생물 형질전환 효율을 기존 벡터와 비교하기 위하여 tetA-tetR 보유 벡터인 기존의 pHG644와 tetC 보유 벡터인 pRDA-748의 아그로박테리움 형질 전환 효율을 비교하는 실험을 실시하였다.

그 결과, 표 1에서 보듯이, 기존의 pHG644보다 본 발명의 pRDA-748이 1.4배 높은 형질전환율을 가짐을 알 수 있었다.

운반체	형질전환 세균수/ug Vector	전환율
pHG644	96 colony	1
pRDA-748	136 colony	1.41

<2-2> 식물 형질전환

기존의 바이너리 벡터에서 골격을 일부 치환시킨 pRDA-748의 기능을 확인하기 위하여 아그로박테리움을 이용한 식물 형질전환을 실시하였다. pRDA-748 보유 LBA4404 아그로박테리움 투머파시엔스를 이용하여 벼(일미벼, 화영벼)에 식물 형질전환 하였다. 하이그로마이신 저항성을 가진 벼를 선발하고 PCR을 통해 유전자 삽입을 확인하였다.

그 결과, 도 5에서 보듯이, 기존 바이너리 벡터에서 골격의 항생제 유전자를 축소 치환한 벡터로 형질전환 하여도 식물 형질전환이 일어난 것을 알 수 있었다. 따라서 재조합 벡터는 아그로박테리움 형질전환 및 식물 형질전환에 벡터로서의 기능을 가지고있는 것을 확인하였다.

< 실시예 3>

상용화를 위한 혹명나방 저항성 pRDA - RTB 바이너리 벡터의 제작

혹명나방 저항성 유전자로 알려진 Bt9(cryIAcI)에 벼 rbcS 프로모터와 지향서열(transit peptide)을 Bt9 유전자의 5‘ 부위에, nos 터미네이터를 Bt9 유전자의 3‘ 부위에 재조합 시켜 cryIAcI 유전자 카세트를 제작하였다. 이를 보유한 pSB11-RTB(10,053bp) 중간단계(intermediator) 벡터를 PvuII 제한효소로 처리한 cryIAcI 유전자 카세트를 pRDA-747 골격 운반체의 PvuII 자리에 클로닝 하였다.

그 결과, 도 6과 같은 pRDA-RTB(9,490bp) 바이너리 운반체를 작성했다. 이는 기존의 형질전환 벡터보다 크기가 작으면서, 항생제 저항성 식물 형질전환 선발 마커를 가지지 않는 것임을 아래 실험을 통해 확인하였다.

< 실시예 4>

pRDA - RTB 바이너리 벡터를 이용한 벼 형질전환 및 유전자 발현

상기 실시예 3에서 제작된 pRDA-RTB 벡터를 이용하여 일미벼를 형질전환 하였다. 식물 세포 선발과정을 생략한 무선발 마커 벼 형질전환으로 재분화된 벼 개체들을 그룹으로 PCR 스크리닝 하였다. 프라이머로는 Bt9 유전자의 SBRTB-4F 5'-AGCGTGTCTGGGGTCCTGATTCTA-3'(서열번호 3)와 SBRTB-806R 5'-GGTCCTTGATAACGCTTCCATT-3'(서열번호 4)를 사용하였다. 그룹으로 확인한 개체들은 다시 서브그룹으로 분리하여 PCR 스크리닝 하고 마지막 그룹별 5개체 내외로 남았을 때 개체별 PCR로 최종 벼 형질전환체를 확인하였다.

그 결과, 도 7에서 보듯이, pRDA-RTB벡터를 이용하여 형질전환된 벼는 PCR 스크리닝 결과, 동일한 위치에서 밴드가 확인되어, 유전자가 삽입되었음을 보여주었다.

또한, 상기와 같이 PCR을 통하여 유전자 삽입이 확인된 형질전환 벼 개체들중 일부를 무작위로 선발하여 면역검출지(immunostrip (agdia Inc.))를 이용하여 cryIAcI 유전자 단백질이 실제로 발현되었는지 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 8에서 보듯이, cryIAcI가 도입되어 발현되었는지 여부를 개체별로 나타내었다. cryIAcI 유전자가 발현된 개체들은 면역 검출지에서 아래쪽에 밴드가 나타났고, 발현되지 않은 것들은 아래쪽 밴드가 나타나지 않았다. 따라서, 유전자가 삽입되어 형질전환된 벼는 단백질이 정상적으로 발현되었음을 확인하였다.

< 실시예 5>

형질전환 벼 온실 재배중 cryIAcI 유전자 서던 분석.

실시예 4에서 확인된 벼 형질전환개체들을 순화하여 온실 재배 단계를 진행하였다. 유묘 시기에 유전자 삽입이 PCR 스크리닝으로 확인된 형질전환체라도 온실 재배육성 중 도입유전자의 결실이 생길 수 있기 때문에, 형질전환 벼를 온실에서 재배 육성 중 일부 벼 형질전환체로부터 DNA를 분리하고 비 방사선 표지인 DIG로 프로브 DNA인 cryIAcI에 표지하여 서던 혼성화(southern hybridization)를 하였다.

그 결과, 도 9에서 보듯이, 목적유전자인 cryIAcI 유전자의 감광 밴드가 비 형질전환벼인 2번에서는 나타나지 않았고 형질전환 개체인 3, 4, 5, 6 및 7번 에서는 감광 밴드가 개체별로 확인되었다.

본 발명은 재조합 및 분리 정제를 용이하게 하기 위하여 벡터의 크기를 축소시키고, 항생제 선발마커와 같은 식물용 마커유전자를 제거하여 국내에서 재조합 작물을 상용화하기 위한 재조합 바이너리 벡터, 상기 형질전환 벡터에 의해 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물 및 이를 통하여 형질전환된 식물체에 관한 것이다. 기존의 식물 형질변환체와는 달리 본 발명의 벡터를 이용한 형질변환체는 크기가 작아 형질 전환이 용이하고 식물 마커 유전자를 가지고 있지 않으므로 이를 제거하는 과정 없이 상용화가 가능한 이점을 가진다.

농업생명공학연구원 KACC95105 20101001

Claims (5)

1. 도 2의 개열지도로 표시되는 식물 형질전환용 바이너리 벡터 pRDA-748. (기탁번호 KACC95105P)
   
2. 제1항의 벡터로 형질전환 된 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.) 미생물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 아그로박테리움 속 미생물은 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)인 것을 특징으로 하는 미생물.
   
4. 제2항의 미생물로 형질전환 된 식물체.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 고추, 배추, 무, 참외, 오이, 수박, 유채 및 담배로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 식물체.

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