KR101274835B1 - Biomarker composition for diagnosing acute exacerbations chronic obstructive pulmonary disease and the method for detecting using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표 2에 기재된 단백질 중 하나 이상을 포함하는 만성 폐쇄성 폐질환(이하 COPD)의 급성 악화 진단용 바이오마커 조성물 및 COPD 급성 악화 진단용 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 단백질 중 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 COPD의 급성 악화 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 COPD 급성 악화 진단용 바이오마커 검출 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면 급성 악화된 COPD의 발생 위험을 예측할 수 있으며 급성 악화 COPD의 예방, 초기 진단 및 치료 분야에 유용하게 이용될 수 있다. The present invention provides a biomarker composition for diagnosing acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease (hereinafter referred to as COPD) and a kit for diagnosing acute exacerbation of COPD comprising at least one of the proteins described in Table 2. In addition, the present invention comprises the steps of reacting a biological sample with an antibody that specifically binds to one or more of the proteins; And comparing the amount of the antigen-antibody complex formed by the reaction with a control group. The method provides a biomarker detection method for diagnosing COPD acute exacerbation for providing information necessary for diagnosing acute exacerbation of COPD. The present invention can predict the risk of developing acutely exacerbated COPD and can be usefully used in the field of prevention, early diagnosis and treatment of acutely exacerbated COPD.
Description
본 발명은 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)의 급성 악화 진단용 바이오마커에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker for diagnosing acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease (COPD).
만성 폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease : 이하 COPD)는 비정상적인 폐 염증 반응 때문에 느리게 진행하는 기도 제한의 특징을 가진다. 한국인 인구의 17.2%가 COPD의 임상적 증상을 가지는, 초당 노력성 호기량(forced expiratory volume: FEV1)/ 노력성 폐활량(forced vital capacity: FVC) 비율이 0.7 미만이다. 급성 악화(Acute Exacerbations Chronic Obstructive Pulmonary Disease: 이하 AECOPD)를 가지는 COPD 환자의 치사율이 2.5%로 보고된 바 있다. 또한, 급성 악화는 COPD를 가진 환자의 장기간 생존율을 감소시킬 수 있다. 급성 악화 COPD는 유해한 입자나 가스에 노출되어서 급작스럽게 기도 흐름이 제한되는 특징을 가진다. 이 과정은 환자에 따라 치명적인 결과로 반복적으로 악화됨으로써 빠르게 진행된다. 따라서, 급성 악화시에 기도과 폐 실질의 비정상적인 반응에 대한 이해가 COPD를 가지는 환자들의 생존을 연장시키기 위해 필요하다. 또한, 급성 악화의 예방과 초기 상태를 치료하기 위해 AECOPD의 마커를 탐색할 필요가 있다. COOPD에서 국부적인 폐 반응, CRP, IL-6 및 TNF-알파가 말초 혈액에서 증가하는 것이 보고된 바 있고 이 혈액 마커는 COPD의 생존과 매우 관련되어 있다. 그러나 COPD의 급성 악화를 예측하거나 진단하는 마커는 없다. 혈청SP-D 와 같은 몇몇 마커들은 AECOPD를 가지는 환자에게서 발견되지만 AECOPD를 예측할 수 있는 유일한 마커는 아니다. COPD 악화 과정에서 기도와 실질 폐 세포는 유해한 감염성의 제제에 환경적으로 노출되는 것과 관련된 단백질의 발현을 바꾸는 것을 보여주었다. 따라서, COPD 악화와 관련한 단백질의 역할을 이해하기 위하여 대규모의, 수율 좋은, 전체 단백질적 연구가 요구되었다. 기도와 폐포 내면액에서 호흡기 질환 특이적인 단백질을 탐색한다면, 그런 단백질은 질병의 초기 검색, 진단, 및 치료에 도움이 될 것이다. Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is characterized by slow airway restriction due to abnormal lung inflammatory responses. The ratio of forced expiratory volume (FEV 1 ) / forced vital capacity (FVC) per second, where 17.2% of the Korean population has clinical symptoms of COPD, is less than 0.7. A mortality rate of 2.5% has been reported in COPD patients with Acute Exacerbations Chronic Obstructive Pulmonary Disease (AECOPD). In addition, acute exacerbations can reduce long-term survival of patients with COPD. Acute Deterioration COPD is characterized by sudden airway flow restriction due to exposure to harmful particles or gases. This process progresses rapidly by repeatedly exacerbating with fatal consequences, depending on the patient. Thus, an understanding of the abnormal response of airways and lung parenchyma in acute exacerbation is necessary to prolong the survival of patients with COPD. In addition, there is a need to search for markers of AECOPD to prevent acute exacerbations and treat initial conditions. Local pulmonary responses, CRP, IL-6 and TNF-alpha have been reported in COOPD in peripheral blood and these blood markers are highly related to the survival of COPD. However, no marker predicts or diagnoses acute exacerbation of COPD. Some markers, such as serum SP-D, are found in patients with AECOPD but are not the only markers that can predict AECOPD. During COPD exacerbations, airway and parenchymal lung cells have been shown to alter the expression of proteins associated with environmental exposure to harmful infectious agents. Therefore, large-scale, high yield, whole protein studies were required to understand the role of proteins in COPD exacerbation. Searching for respiratory disease specific proteins in the airways and alveolar inner fluids will help in the early detection, diagnosis, and treatment of diseases.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 만성 폐쇄성 폐질환의 급성 악화를 진단할 수 있는 바이오마커 조성물, 상기 바이오마커를 이용하는 COPD의 급성 악화 진단용 키트, COPD 급성 악화 진단용 바이오마커 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. The present invention to solve the above problems, to provide a biomarker composition for diagnosing acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease, a kit for diagnosing acute exacerbation of COPD using the biomarker, a biomarker for detecting acute exacerbation of COPD The purpose.
본 발명은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 만성 폐쇄성 폐질환((Chronic Obstructive Pulmonary Disease:이하 COPD)의 급성 악화 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다. (1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴10(Keratin 10); (2) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 락토페린(lactoferrin); (3) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 칼파인-유사 프로테아제 CAPN10b(calpain-like protease CAPN10b); (4) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 피브리노겐 감마 체인(fibrinogen gamma chain); (5) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 피브린 베타(fibrin beta); (6) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 트랜스페린(transferrin); (7) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 Ig 알파-2 체인 C 리젼(Ig alpha-2 chain C region); (8) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 액틴(actin); (9) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 1(keratin 1); (11) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 사이클로필린 B 체인 A(Chain A, Cyclophilin B); (12) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 Ig 알파-2 체인 C 리젼(Ig alpha-2 chain C region); (13) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 미오신-9(myosin-9); (14) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 랩 GDP 분리 저해제 베타 이소폼 1(rab GDP dissociation inhibitor beta isoform 1); (15) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 열 쇼크 70kd 단백질 체인 A(Chain A, Heat-Shock 70kd Protein); (16) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 징크 핑거 단백질 570(zinc finger protein 570); (17) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 인간 타액 아밀라제 체인 A(Chain A, Human Salivary Amylase); (18) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 AMY1A 단백질(AMY1A protein); (19) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 미오신-9(myosin-9); (20) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 액틴 바인딩 단백질 ABP620(actin binding protein ABP620); (21) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 뉴런 네비게이터 2 이소폼 2(neuron navigator 2 isoform 2); (22) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 DIP2B 단백질(DIP2B protein); (23) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 이소폼 CRA hCG32657(hCG32657, isoform CRA); (24) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 프로아포리포프로테인(proapolipoprotein); (25) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 플렉틴 이소폼 1g(plectin isoform 1g); (26) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 3 옹스트롬에서 카나인 미엘로퍼옥시다제의 X-레이결정 구조 체인 A(Chain A, X-Ray Crystal Structure Of Canine Myeloperoxidase At 3 Angstroms); (27) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 락토페린(lactoferrin); (28) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 10(keratin 10); (29) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 9(Keratin 9); (30) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 1(keratin 1); (31) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 이종 핵 리보뉴크레오티드 단백질 A2/B1 이소폼 A2(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 isoform A2); (32) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 Mrp14의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal Structure Of The Mrp14); (33) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 시토크롬 P450 4X1(cytochrome P450 4X1); (34) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 도메인 개방된 뮤턴트의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal Structure Of A Domain-Opened Mutant); (35) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 징크 핑거 단백질 334(Zinc finger protein 334); 및 (36) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 징크 핑거 단백질 ZNF222(zinc finger protein ZNF222).The present invention provides a biomarker composition for diagnosing acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease ((Chronic Obstructive Pulmonary Disease: COPD)) comprising one or more proteins selected from the group consisting of: (1) amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Keratin 10 (Keratin 10) comprising; (2) lactoferrin comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (3) calpine-like protease CAPN10b (calpain-like protease) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 CAPN10b); (4) fibrinogen gamma chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (5) fibrin beta comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; (6) SEQ ID NO: 6 Transferrin comprising an amino acid sequence; (7) an Ig alpha-2 chain C region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; (8) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 Actin comprising: (9)
또한, 본 발명은 상기 단백질 중 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 COPD의 급성 악화 진단용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for diagnosing acute exacerbation of COPD, characterized in that it comprises an antibody that specifically binds to one or more of the proteins.
또한, 본 발명은 상기 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 COPD의 급성 악화 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 COPD 급성 악화 진단용 바이오마커 검출 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of reacting a biological sample with an antibody that specifically binds to at least one protein selected from the group; And comparing the amount of the antigen-antibody complex formed by the reaction with a control group. The method provides a biomarker detection method for diagnosing COPD acute exacerbation for providing information necessary for diagnosing acute exacerbation of COPD.
본 발명에 의하면 급성 악화된 COPD의 발생 위험을 예측할 수 있으며 급성 악화 COPD의 예방, 초기 진단 및 치료 분야에 유용하게 이용될 수 있다. The present invention can predict the risk of developing acutely exacerbated COPD and can be usefully used in the field of prevention, early diagnosis and treatment of acutely exacerbated COPD.
도 1은 COPD를 가진 6명의 환자로부터의 얻은 고인 객담의 단백질 프로파일을 안정 상태(COPD)와 악화 상태(AECOPD)에서 나타낸 것이다.
도 2는 환자 4명으로부터 얻은 객담으로 웨스턴 블롯을 수행한 결과로, 안정 상태의 COPD에 비해 급성 악화 상태의 AECOPD의 객담에서 시클로필린 B를 나타내는 21kDa 밴드를 얻어낸 것을 나타낸 것이다. 1 shows the protein profiles of deceased sputum obtained from six patients with COPD in steady state (COPD) and worsening state (AECOPD).
FIG. 2 shows Western blotting with four sputum from four patients, showing that 21kDa band representing cyclophylline B was obtained from sputum of AECOPD in acute exacerbation compared to steady-state COPD.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 일실시예는 다음으로 구성된 군에서 선택되는 단백질 중 하나 이상, 구체적으로는 1개 내지 35개의 단백질을 포함하는 만성 폐쇄성 폐질환(이하 COPD)의 급성 악화 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다. (1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴10(Keratin 10); (2) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 락토페린(lactoferrin); (3) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 칼파인-유사 프로테아제 CAPN10b(calpain-like protease CAPN10b); (4) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 피브리노겐 감마 체인(fibrinogen gamma chain); (5) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 피브린 베타(fibrin beta); (6) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 트랜스페린(transferrin); (7) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 Ig 알파-2 체인 C 리젼(Ig alpha-2 chain C region); (8) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 액틴(actin); (9) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 1(keratin 1); (11) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 사이클로필린 B 체인 A(Chain A, Cyclophilin B); (12) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 Ig 알파-2 체인 C 리젼(Ig alpha-2 chain C region); (13) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 미오신-9(myosin-9); (14) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 랩 GDP 분리 저해제 베타 이소폼 1(rab GDP dissociation inhibitor beta isoform 1); (15) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 열 쇼크 70kd 단백질 체인 A(Chain A, Heat-Shock 70kd Protein); (16) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 징크 핑거 단백질 570(zinc finger protein 570); (17) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 인간 타액 아밀라제 체인 A(Chain A, Human Salivary Amylase); (18) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 AMY1A 단백질(AMY1A protein); (19) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 미오신-9(myosin-9); (20) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 액틴 바인딩 단백질 ABP620(actin binding protein ABP620); (21) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 뉴런 네비게이터 2 이소폼 2(neuron navigator 2 isoform 2); (22) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 DIP2B 단백질(DIP2B protein); (23) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 이소폼 CRA hCG32657(hCG32657, isoform CRA); (24) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 프로아포리포프로테인(proapolipoprotein); (25) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 플렉틴 이소폼 1g(plectin isoform 1g); (26) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 3 옹스트롬에서 카나인 미엘로퍼옥시다제의 X-레이결정 구조 체인 A(Chain A, X-Ray Crystal Structure Of Canine Myeloperoxidase At 3 Angstroms); (27) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 락토페린(lactoferrin); (28) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 10(keratin 10); (29) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 9(Keratin 9); (30) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 1(keratin 1);(31) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 이종 핵 리보뉴크레오티드 단백질 A2/B1 이소폼 A2(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 isoform A2); (32) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 Mrp14의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal Structure Of The Mrp14); (33) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 시토크롬 P450 4X1(cytochrome P450 4X1); (34) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 도메인 개방된 뮤턴트의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal Structure Of A Domain-Opened Mutant); (35) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 징크 핑거 단백질 334(Zinc finger protein 334); 및 (36) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 징크 핑거 단백질 ZNF222(zinc finger protein ZNF222).One embodiment of the present invention provides a biomarker composition for diagnosing acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease (hereinafter referred to as COPD) comprising one or more proteins, specifically 1 to 35 proteins selected from the group consisting of: (1)
또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 군에서 선택되는 단백질 중 하나 이상, 구체적으로는 1개 내지 35개의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 COPD의 급성 악화 진단용 바이오마커 검출용 조성물을 제공한다. 상기 바이오마커 검출용 조성물은 상기 단백질 수준을 측정하는 제제, 구체적으로 항체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한, 완전한 형태의 항체뿐 아니라, 항체 분자의 기능적 단편도 포함한다. In addition, an embodiment of the present invention provides a composition for detecting a biomarker for diagnosing acute exacerbation of COPD comprising an antibody that specifically binds one or more proteins, specifically 1 to 35 proteins selected from the group. do. The biomarker detection composition may include an agent for measuring the protein level, specifically, an antibody. The antibody includes all polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies that specifically bind to the protein. Also included are functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms of antibodies.
또한 본 발명의 일실시예는 상기 군에서 선택되는 단백질 중 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 COPD의 급성 악화 진단용 키트를 제공한다. In addition, one embodiment of the present invention provides a kit for diagnosing acute exacerbation of COPD, characterized in that it comprises an antibody that specifically binds to one or more proteins of the protein selected from the group.
상기 진단용 키트는 상기 바이오마커 검출용 조성물에 당분야에서 널리 사용되는 다른 구성 성분 또는 장치를 추가적으로 포함하여 응용, 제작될 수 있다. 단백질에 대한 특이적인 항체 및, 추가적으로, 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소 및 그의 기질을 포함하는 ELISA용의 키트로 제작될 수 있다. 또 다른 예로서, 단백질 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 단백질 칩용 키트로 제작될 수 있다.The diagnostic kit may be applied and manufactured by additionally including other components or devices widely used in the art in the biomarker detection composition. And a kit for ELISA comprising antibodies specific for the protein and additionally a reagent capable of detecting the bound antibody, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes and substrates thereof. have. As another example, the kit may be manufactured as a kit for a protein chip containing essential elements necessary for carrying out the protein chip.
또한, 본 발명은 상기 군에서 선택되는 단백질 중 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 COPD의 급성 악화 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 COPD 급성 악화 진단용 바이오마커 검출 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of reacting a biological sample with an antibody that specifically binds to one or more proteins of the protein selected from the group; And comparing the amount of the antigen-antibody complex formed by the reaction with a control group. The method provides a biomarker detection method for diagnosing COPD acute exacerbation for providing information necessary for diagnosing acute exacerbation of COPD.
상기 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계의 구체적 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등의 다양한 ELISA 방법을 포함한다.Specific analysis method of the step of comparing the amount of the antigen-antibody complex with a control group, Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoproliferation method, Oukteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunosuppression Precipitation assays, complement fixation assays, FACS, protein chips, and the like, but are not limited thereto. ELISA is a direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in a complex of antibody and antigen attached to a solid support, followed by reaction with another antibody that recognizes the antigen in a complex of antibody and antigen attached to a solid support. Various ELISA methods, such as indirect sandwich ELISA using the labeled secondary antibody which recognizes this antibody, are included.
상기 생물학적 시료는 COPD 급성 악화 진단용 마커를 검출할 수 있는 세포, 조직 또는 체액 샘플을 의미하고, 구체적으로, 혈액, 뇨, 림프, 여성 체액, 생검, 땀, 대변, 눈물 또는 객담을 들 수 있고, 더욱 구체적으로 객담을 들 수 있다. The biological sample refers to a cell, tissue or bodily fluid sample capable of detecting a marker for diagnosing acute exacerbation of COPD, and specifically, may include blood, urine, lymph, female fluid, biopsy, sweat, feces, tears, or sputum, More specifically, sputum can be mentioned.
상기 대조군은 안정 상태 COPD 환자의 시료일 수 있다. The control may be a sample of a steady state COPD patient.
상기 바이오마커는 (1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴10(Keratin 10); (2) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 락토페린(lactoferrin); (3) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 칼파인-유사 프로테아제 CAPN10b(calpain-like protease CAPN10b); (4) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 피브리노겐 감마 체인(fibrinogen gamma chain); (5) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 피브린 베타(fibrin beta); (6) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 트랜스페린(transferrin); (7) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 Ig 알파-2 체인 C 리젼(Ig alpha-2 chain C region); (8) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 액틴(actin); (9) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 1(keratin 1); (11) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 사이클로필린 B 체인 A(Chain A, Cyclophilin B); (12) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 Ig 알파-2 체인 C 리젼(Ig alpha-2 chain C region); (13) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 미오신-9(myosin-9); (14) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 랩 GDP 분리 저해제 베타 이소폼 1(rab GDP dissociation inhibitor beta isoform 1); 및 (15) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 열 쇼크 70kd 단백질 체인 A(Chain A, Heat-Shock 70kd Protein) 으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상, 구체적으로는 1개 내지 14개의 단백질이며, 검출 대상의 생물학적 시료 내의 상기 단백질 발현량이 대조군에 비해 증가한 경우 급성 악화된 COPD로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다. The biomarker is (1) keratin 10 (Keratin 10) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (2) lactoferrin comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (3) calpain-like protease CAPN10b (calpain-like protease CAPN10b) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (4) a fibrinogen gamma chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (5) fibrin beta comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; (6) transferrin comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; (7) Ig alpha-2 chain C region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; (8) actin comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; (9)
상기 바이오마커는 (16) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 징크 핑거 단백질 570(zinc finger protein 570); (17) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 인간 타액 아밀라제 체인 A(Chain A, Human Salivary Amylase); (18) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 AMY1A 단백질(AMY1A protein); (19) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 미오신-9(myosin-9); (20) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 액틴 바인딩 단백질 ABP620(actin binding protein ABP620); (21) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 뉴런 네비게이터 2 이소폼 2(neuron navigator 2 isoform 2); (22) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 DIP2B 단백질(DIP2B protein); (23) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 이소폼 CRA hCG32657(hCG32657, isoform CRA); (24) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 프로아포리포프로테인(proapolipoprotein); (25) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 플렉틴 이소폼 1g(plectin isoform 1g); (26) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 3 옹스트롬에서 카나인 미엘로퍼옥시다제의 X-레이결정 구조 체인 A(Chain A, X-Ray Crystal Structure Of Canine Myeloperoxidase At 3 Angstroms); (27) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 락토페린(lactoferrin); (28) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 10(keratin 10); (29) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 9(Keratin 9); (30) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 1(keratin 1); (31) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 이종 핵 리보뉴크레오티드 단백질 A2/B1 이소폼 A2(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 isoform A2); (32) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 Mrp14의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal Structure Of The Mrp14); (33) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 시토크롬 P450 4X1(cytochrome P450 4X1); (34) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 도메인 개방된 뮤턴트의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal Structure Of A Domain-Opened Mutant); (35) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 징크 핑거 단백질 334(Zinc finger protein 334); 및 (36) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 징크 핑거 단백질 ZNF222(zinc finger protein ZNF222)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상, 구체적으로는 1개 내지 21개의 단백질이며, 검출 대상의 생물학적 시료 내의 상기 단백질 발현량이 대조군에 비해 감소한 경우 급성 악화된 COPD로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다. The biomarker comprises (16) zinc finger protein 570 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; (17) Human saliva amylase chain A comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 (Chain A, Human Salivary Amylase); (18) an AMY1A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; (19) myosin-9 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (20) actin binding protein ABP620 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (21) neuron navigator 2 isoform 2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; (22) a DIP2B protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; (23) isoform CRA hCG32657 (hCG32657, isoform CRA) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; (24) proapolipoprotein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; (25) 1 g of plectin isoform comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (26) X-Ray Crystal Structure Of Canine Myeloperoxidase At 3 Angstroms of Canine Myeloperoxidase in 3 Angstroms comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26; (27) lactoferrin comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; (28)
상기 검출 대상의 생물학적 시료와 대조군 간의 발현량의 차이는 절대적 또는 상대적 차이로 비교될 수 있다.Differences in the amount of expression between the biological sample of the detection subject and the control group may be compared with absolute or relative differences.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
실시예 1: 환자의 객담 수집과 분리Example 1: Sputum Collection and Separation of Patients
COPD를 가지는 6명의 환자를 본 연구에 포함시켰다.6명 환자의 임상적 특징은 아래 표 1과 같다.Six patients with COPD were included in this study. The clinical characteristics of the six patients are shown in Table 1 below.
Total Neu(%)Sputum Cell Count
Total Neu (%)
축약어 정의:Abbreviation definition:
FEV1 = 초당 노력성 호기량(Forced expiratory volume in 1 second). 이 값은 악화전의 가장 최근 데이터이다.FEV 1 = Forced expiratory volume in 1 second. This value is the most recent data before deterioration.
ND = 검출되지 않음(Not-detected)ND = Not-detected
Total = 총 세포 수, x 105/mLTotal = total cell count, x 10 5 / mL
Neu = 호중구(Neutrophil)
Neu = Neutrophil
COPD의 진단기준은 1)기관지 확장제 사용 후 FEV1/FVC 비율이 70% 미만이고, 2)흡연기간이 10년 이상이며, 3)가슴 X선에서 중증 비활성 결핵이나 심각한 기관지확장증과 같은 기도 폐쇄성 질환을 보여주는 비정상적인 결과가 없는 것이다. 급성 악화 전 또는 급성 악화 후 6주 때 기관지확장제 테스트를 수행하였다. 환자의 베이스라인 호흡곤란, 기침 및/또는 가래가 정상적인 매일의 변이를 넘는 변화가 급격하게 시작되는 변화의 특징을 가진 질환의 자연적인 과정에서의 사건으로 정의되는 AECOPD는, COPD를 가지는 환자에게서 정규적인 치료 중에서도 변화가 가능하였다. 급성 악화의 첫 날과 급성 악화 후 6-7주에 객담을 수집하였다 The diagnostic criteria for COPD are: 1) FEV1 / FVC ratio is less than 70% after bronchodilator use, 2) smoking duration is more than 10 years, and 3) airway obstructive disease such as severe inactive tuberculosis or severe bronchiectasis in chest X-ray. There are no abnormal results showing. Bronchodilator tests were performed before or after 6 weeks of acute exacerbation. AECOPD, defined as an event in the natural course of a disease characterized by a patient's baseline dyspnea, a change in which coughs and / or sputum changes rapidly beyond normal daily variation, is normal in patients with COPD. Changes were possible during routine treatment. Sputum was collected on the first day of acute exacerbation and 6-7 weeks after acute exacerbation.
객담의 더 고체성의 눈에 보이는 부분을 주의깊게 선택하였고, 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)를 미리 무게를 달아서 준비하였다. 샘플을 0.1% 디티오트레이톨(dithiothreitol)(Sputolysin, Calbiochem Corp., San Diego, Calif., USA)을 4배 부피를 추가하였다. 프로테아제 저해제(protease inhibitors)(0.1 M EDTA 와 2 mg/ml 페닐메틸설포틸플루오라이드)를 균질화한 객담의 100배 부피로 추가하였고, 총 세포 수를 혈구계산기(hemocytometer)로 결정하였다. 균질화된 객담을 세포원심분리로 돌렸고, 500 세포를 디프-퀵 솔루션(Diff-Quik solution (American Scientific Products, Chicago, Ill., USA)으로 염색한 각 객담 슬라이드에 놓았다. 균질화한 객담을 5분 동안 1000g 으로 원심분리 하고나서 상등액을 수집하여 다음 분석을 위해 -70℃에서 저장하였다. 세균 배양과 리노바이러스의 검출을 COPD 악화시에 수행하였다. 인두 면봉(pharyngeal swab)을 얻어서 인플루엔자 A와 B, 파라인플루엔자 1,2 와 3, 아데노바이러스 및 세포융합 바이러스를 분리하기 위해 셀 라인의 모노레이어에 접종하였다. 인간 리노바이러스를 리노바이러스 특이적인 프라이머로 역전사 PCR을 사용하여 검출하였다.
The more solid visible part of the sputum was carefully selected and the Eppendorf tube was prepared by weighing in advance. Samples were added four times the volume of 0.1% dithiothreitol (Sputolysin, Calbiochem Corp., San Diego, Calif., USA). Protease inhibitors (0.1 M EDTA and 2 mg / ml phenylmethylsulpotylfluoride) were added to 100-fold volume of homogenized sputum, and the total cell number was determined by a hemocytometer. The homogenized sputum was turned to cell centrifugation and 500 cells were placed on each sputum slide stained with Diff-Quik solution (American Scientific Products, Chicago, Ill., USA). Supernatants were collected after centrifugation at 1000 g and stored at −70 ° C. for subsequent analysis Bacterial culture and detection of rhinoviruses were performed at COPD exacerbation Pharyngeal swabs were obtained to obtain influenza A and B, para.
실시예 2: 샘플 준비와 2차원 전기영동 및 이미지 분석Example 2: Sample Preparation and Two-Dimensional Electrophoresis and Image Analysis
각각의 환자로부터 200㎍의 단백질을 포함하는 객담을 2차원 전기영동을 위해 모았다. 고여있는 객담을 아세톤에서 10%TCA로 침전시키고, 샘플 용액에서 재현탁시켰다. Immobiline Dry Strips(Amersham Biosciences) 을 등전점 전기영동을 위해 사용하였고 MultiPhor II™ (GE Healthcare)에서 단백질 1mg 을 추출하였다. IEF 분리 후에 단백질을 SDS-PAGE에 의해 2차원으로 분리하였다. 이미지 분석을 위해 겔을 제조자 지시에 따라 Immobiline Dry Strips (Amersham Biosciences)로 시각화하였다. 2-D 겔을 ImageScanner(BIO RAD) 로 transmission mode에서 스캔하였다. ImageMaster 2D 버젼 5.0(Amersham Biosciences)을 사용하여 스팟 검출과 매칭을 수행하였다. 디지탈화한 이미지를 광학 밀도를 스팟 지역(스팟 "부피")로 나눔으로써 2-D 스팟 강도를 계산하기 위해 ImageMaster 프로그램을 사용하여 분석하였고 정규화하였다.
Sputum containing 200 μg of protein from each patient was collected for two-dimensional electrophoresis. The standing sputum was precipitated with 10% TCA in acetone and resuspended in sample solution. Immobiline Dry Strips (Amersham Biosciences) were used for isoelectric point electrophoresis and 1 mg of protein was extracted from MultiPhor II ™ (GE Healthcare). After IEF separation, proteins were separated in two dimensions by SDS-PAGE. Gels were visualized with Immobiline Dry Strips (Amersham Biosciences) according to manufacturer's instructions for image analysis. 2-D gels were scanned in transmission mode with an ImageScanner (BIO RAD). Spot detection and matching was performed using ImageMaster 2D version 5.0 (Amersham Biosciences). Digitized images were analyzed and normalized using the ImageMaster program to calculate 2-D spot intensities by dividing the optical density by the spot area (spot “volume”).
실시예 3:나노LC-MS/MS와 데이타베이스 서칭(searching)에 의한 단백질 동정Example 3: Protein Identification by Nano LC-MS / MS and Database Search
다르게 발현하는 단백질 스팟을 2-D 겔에서 얻었고, 더 작은 사이즈로 자른 후 트립신(Promega)으로 소화시켰다. 모든 LC-MS/MS실험을 Agilent 1100 Series nano-LC system 특징을 가진 Agilent Nanoflow Proteomics Solution을 사용하여 수행하였다. Agilent 1100 Series LC/MSD Trap XCT 이온 트랩 질량 분광기에 직교성 나노스프레이 이온 소스와 MS/MS를 커플링하였다. 나노-LC 시스템은 ZORBAX 300SB-C18 enrichment column (0.3 X 50 mm, 5㎛)으로 sample enrichment/desalting Mode으로 작동하였다. 크로마토그래피를 ZORBAX 300SB-C18 (75-up X 150-mm) 나노칼럼을 사용하여 수행하였다. 칼럼을 5분 동안 3% 용매 B (아세토니트릴에 0.1% 포름산)과 97% 용매 A (물에 0.1% 포름산)의 등용매조성 적용하여 경사도 시작으로 용출하였다. 경사 혼합물을 5분 넘게(5-10분) 10% B로 바꾸었고, 40분 넘게(10-50분) 45% B로, 5분 동안(55-60분) 90% B(등장) 및 1분 넘게(60-61분) 3% B로, 그리고 마지막으로 칼럼을 10분 동안 3% B로 세척하였다. Differently expressed protein spots were obtained on 2-D gels, cut into smaller sizes and digested with trypsin (Promega). All LC-MS / MS experiments were performed using an Agilent Nanoflow Proteomics Solution featuring the Agilent 1100 Series nano-LC system. An orthogonal nanospray ion source and MS / MS were coupled to an Agilent 1100 Series LC / MSD Trap XCT ion trap mass spectrometer. The nano-LC system was operated in sample enrichment / desalting mode with a ZORBAX 300SB-C18 enrichment column (0.3 × 50 mm, 5 μm). Chromatography was performed using ZORBAX 300SB-C18 (75-up × 150-mm) nanocolumns. The column was eluted at the beginning of the gradient by applying isocratic composition of 3% solvent B (0.1% formic acid in acetonitrile) and 97% solvent A (0.1% formic acid in water) for 5 minutes. The gradient mixture was changed to 10% B for more than 5 minutes (5-10 minutes), 45% B for more than 40 minutes (10-50 minutes), 90% B for 5 minutes (55-60 minutes) and 1 Over 3 minutes (60-61 minutes) with 3% B, and finally the column was washed with 3% B for 10 minutes.
LC/MSD Trap XCT를 유니크 펩티드 스캔 Auto-MS/MS mode에서 작동하였다. 이온화 모드는 Agilent orthogonal source를 가지고 하는 포지티브 나노일렉트로스프레이였다. 건조 가스를 300 ℃ 온도에서 5 리터/분으로 처리하였다. Vcap는 30 V에서 스킴 1로 1800-1900 V였고, 모세관 출구는 75 V에서 옵셋이었다. 트랩 드라이브는 하나나 둘의 평균으로 85 V에서 시작하였고, 스마트 타겟은 125,000였고, MS 스캔 범위는 300-2200이었다. 자동 MS/MS를 parents 2, 1.15 V의 평균 2 프래그먼트 앰플리튜드, (30-200%)에서의 스마트프래그(SmartFrag), 활성 제거(1분 동안 2 스펙트라(spectra) 후에), +2에서, 100-1800의 MS/MS 스캔 범위, 및 울트라스캔의 ㅅ수치를 가지는 울트라스캔 모드에서 수행하였다.각각 요구되는 MS/MS 스펙트럼은 Spectrum Mill 소프트웨어를 사용해서 비중복 단백질 서열에 대항하여 서치하였다.LC / MSD Trap XCT was operated in unique peptide scan Auto-MS / MS mode. The ionization mode was a positive nanoelectrospray with an Agilent orthogonal source. The dry gas was treated at 5 liter / min at 300 ° C. Vcap was 1800-1900 V with
도 1은 COPD를 가진 6명의 환자로부터의 고인 객담의 단백질 프로파일을 안정 상태(COPD)와 악화 상태(AECOPD)에서 나타낸 것이다. 2DE에서 관찰된 총 스팟의 갯수는 안정상태에서 455개였고, 악화 상태에서 465개였다. 두 상태의 스팟의 상대적인 강도를 비교하였다. 35개의 단백질 스팟이 안정 상태와 악화 상태 상이에 상대적 강도에서 2.5 배 이상의 차이를 보였다. 아래 표 2을 보면 상대적인 강도가 14 개 스팟에서 증가한 반면, 21개 스팟은 안정 상태에 비해 악화 상태에서 감소하였다. 아래 표 2에서 등록 번호(Accession No)는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GI 를 의미한다. 1 shows the protein profile of deceased sputum from six patients with COPD in steady state (COPD) and worsening state (AECOPD). The total number of spots observed at 2DE was 455 at steady state and 465 at worsening state. The relative intensities of the spots in the two states were compared. 35 protein spots differed by more than 2.5 times in relative intensity between the steady and deteriorated states. In Table 2 below, the relative intensity increased at 14 spots, while 21 spots decreased in the worsening state compared to the steady state. In Table 2 below, the accession number (Accession No) means the GI of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
35개 단백질을 Nano LC-MS/MS를 사용하여 동정하였다(표 2). 급성 악화시의 상대적 강도를 안정 상태에 비교하였을 때, 케라틴 10(keratin 10)과 케라틴 1(keratin 1)은 각각 3배 증가하였다. 락토페린과 칼파인 유사 프로테아제 CAON10b 는 4배 이상 증가하였고, 피브리노겐 감마 체인, 피브린 트렌스퍼린, Ig 알파-2- 체인 C 리젼 및 시클로필린 B는 3배 이상 증가하였다. Ig 알파-2- 체인, 미오신-9 및 랩 GDP 분리 저해제 베타 이소폼 1, 열 쇼크 70kd 단백질은 2.5배에서 3배 증가하였다. 35 proteins were identified using Nano LC-MS / MS (Table 2). When the relative intensity of acute exacerbation was compared to the steady state,
안정 상태에 비해 급성 악화 상태에서 상대적 강도의 감소를 보여준 단백질 중에서, 징크 핑거 단백질 570은 38배 더 낮아졌다. 인간 타액 아밀라제와 AMY1A 단백질은 4배 이상 감소했다. 미오신, 액틴 바인딩 단백질 ABP620, DIP2B 단백질, 및 뉴런 네비게이터 2 이소폼 2, 프로아포리포프로테인, 플렉틴 hCG32657, 이소폼 미엘로퍼옥시다제도 급성 악화시에 매우 감소하였다.
Of the proteins that showed a decrease in relative intensity in the acute exacerbation compared to the steady state, zinc finger protein 570 was 38 times lower. Human saliva amylase and AMY1A protein were reduced by more than fourfold. Myosin, actin binding protein ABP620, DIP2B protein, and neuron navigator 2 isoform 2, proapolipoprotein, plectin hCG32657, isoform myeloperoxidase were also significantly reduced during acute exacerbations.
실시예 4:객담에서 웨스턴 블롯에 의한 시클로필린 B의 검출Example 4 Detection of Cyclophylline B by Western Blot in Sputum
단백질 200㎍을 로딩하였고, 15% 폴리아크릴아미드 겔로 구성되는 불연속적인 시스템으로 전기영동하였다. 단백질을 40분 동안 120V에서 니트로셀룰로스 멤브레인으로 트랜스퍼하였다. 멤브레인을 실내온도에서 2시간 동안 TBS에서 0.1% NP40에서 5% 스킴 밀크로 블로킹하였고, 오버나이트 동안 4℃에서 시클로필린 B 대한 래빗 다클론 항체의 1:500 희석으로 인큐베이트하였다. 멤브레인을 실내온도에서 1시간 동안 HRP-콘쥬게이트된 항-래빗 IgG (1:5,000 희석)으로 인큐베이트하였다. 타겟 단백질을 강화된 화학발광 용액(enhanced chemiluminescence solution) (Amersham pharmacia biotech, Little Chalfont Buckinghamshire, England)으로 검출하였다. 200 μg of protein was loaded and electrophoresed into a discontinuous system consisting of 15% polyacrylamide gel. Protein was transferred to nitrocellulose membrane at 120V for 40 minutes. The membranes were blocked with 5% scheme milk at 0.1% NP40 in TBS for 2 hours at room temperature and incubated at 1: 500 dilution of the rabbit polyclonal antibody against cyclopilin B at 4 ° C. for overnight. Membranes were incubated with HRP-conjugated anti-rabbit IgG (1: 5,000 dilution) for 1 hour at room temperature. Target proteins were detected with enhanced chemiluminescence solution (Amersham pharmacia biotech, Little Chalfont Buckinghamshire, England).
본 웨스턴 블롯은 시클로필린 B발현이 안정상태에 비해 급성 악화시에 변화하는지를 조사하기 위해, 동일한 환자(n=4)에게서 얻은 객담으로 수행하였다. 안정 상태의 COPD에 비해 급성 악화 상태의 AECOPD의 객담에서 시클로필린 B를 나타내는 21kDa 밴드를 얻어냈다(도 2). This western blot was performed with sputum from the same patient (n = 4) to investigate whether cyclophilin B expression changed at acute exacerbation compared to steady state. A 21 kDa band representing cyclophylline B was obtained in the sputum of AECOPD in acute exacerbation compared to steady COPD (FIG. 2).
시클로필린 B는 시클로스포린 수용체 단백질로서 알려져 있고 주로 엔도플라스믹 레티쿨럼 내에 위치한다. 시클로필린 B는 림프구에 바인딩하고 시클로스포린 중재 면역 억제반응을 조절할 수 있다. 객담에서의 시클로필린 B의 수준은 COPD 유사 c-반응 단백질의 악화를 지적하는 마커가 될 수 있다. Cyclophylline B is known as a cyclosporin receptor protein and is located primarily in endoplasmic reticulum. Cyclophilin B can bind to lymphocytes and modulate cyclosporin mediated immune suppression. The level of cyclophylline B in sputum may be a marker of deterioration of COPD-like c-reactive protein.
본 발명자는 최초로 단백질학적 접근을 적용하였다. 스크리닝 도구로서 2-D 전기영동을 이용하여, 객담에서 안정 상태에 비하여 악화 상태에서 다른 발현을 보이는 35개의 단백질을 동정하였다. 동정된 단백질은 그들의 세포적 기능과 생화학적 경로에서의 역할에 기초하여 항염증, 세포 골격, 응고, 면역과 대사, 수송, 효소의 6개의 다른 그룹으로 분류될 수 있었다. 그들 중에서, 세포 골격 단백질이 가장 흔히 관찰되었다(표 2). 이들은 케라틴, 액틴, 및 미오신을 포함하였다. 이는 급성 악화의 폐에서 조직이 손상되고 세포내 단백질이 방출되었다는 것을 가리킨다. 또한 락토페린, 열 충격 70kd 단백질, 프로아포리포프로테인 및 도메인 개방된 뮤턴트의 결정 구조 체인 A, 베타 피브린 및 피브리노겐 감마 체인을 포함하는 응집 단백질을 관찰하였다. 이 데이터는 악화된 COPD의 기도에서 염증이 커지고 응집반응이 활성화됨을 알려주었다. We first applied a proteomics approach. Using a 2-D electrophoresis as a screening tool, 35 proteins with different expressions in the worsening state compared to the stable state in sputum were identified. The identified proteins could be classified into six different groups: anti-inflammatory, cytoskeleton, coagulation, immunity and metabolism, transport, and enzymes based on their cellular function and role in biochemical pathways. Among them, cytoskeletal proteins were most commonly observed (Table 2). These included keratin, actin, and myosin. This indicates that tissue was damaged and intracellular proteins were released in the lungs of acute exacerbations. Also observed were aggregate proteins comprising crystal structure chains A, beta fibrin and fibrinogen gamma chains of lactoferrin,
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
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Claims (6)
(1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 10(Keratin 10);
(2) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 락토페린(lactoferrin);
(3) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 칼파인-유사 프로테아제 CAPN10b(calpain-like protease CAPN10b);
(4) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 피브리노겐 감마 체인(fibrinogen gamma chain);
(5) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 피브린 베타(fibrin beta);
(6) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 트랜스페린(transferrin);
(7) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 Ig 알파-2 체인 C 리젼(Ig alpha-2 chain C region);
(8) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 액틴(actin);
(9) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 1(keratin 1);
(11) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 사이클로필린 B 체인 A(Chain A, Cyclophilin B);
(12) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 Ig 알파-2 체인 C 리젼(Ig alpha-2 chain C region);
(13) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 미오신-9(myosin-9);
(14) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 랩 GDP 분리 저해제 베타 이소폼 1(rab GDP dissociation inhibitor beta isoform 1);
(15) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 열 쇼크 70kd 단백질 체인 A(Chain A, Heat-Shock 70kd Protein);
(16) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 징크 핑거 단백질 570(zinc finger protein 570);
(17) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 인간 타액 아밀라제 체인 A(Chain A, Human Salivary Amylase);
(18) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 AMY1A 단백질(AMY1A protein);
(19) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 미오신-9(myosin-9);
(20) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 액틴 바인딩 단백질 ABP620(actin binding protein ABP620);
(21) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 뉴런 네비게이터 2 이소폼 2(neuron navigator 2 isoform 2);
(22) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 DIP2B 단백질(DIP2B protein);
(23) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 이소폼 CRA hCG32657(hCG32657, isoform CRA);
(24) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 프로아포리포프로테인(proapolipoprotein);
(25) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 플렉틴 이소폼 1g(plectin isoform 1g);
(26) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 3 옹스트롬에서 카나인 미엘로퍼옥시다제의 X-레이결정 구조 체인 A(Chain A, X-Ray Crystal Structure Of Canine Myeloperoxidase At 3 Angstroms);
(27) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 락토페린(lactoferrin);
(28) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 10(keratin 10);
(29) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 9(Keratin 9);
(30) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 1(keratin 1);
(31) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 이종 핵 리보뉴크레오티드 단백질 A2/B1 이소폼 A2(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 isoform A2);
(32) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 Mrp14의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal Structure Of The Mrp14);
(33) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 시토크롬 P450 4X1(cytochrome P450 4X1);
(34) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 도메인 개방된 뮤턴트의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal Structure Of A Domain-Opened Mutant);
(35) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 징크 핑거 단백질 334(Zinc finger protein 334); 및
(36) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 징크 핑거 단백질 ZNF222(zinc finger protein ZNF222).
Biomarker composition for diagnosing acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) comprising 35 proteins consisting of:
(1) Keratin 10 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(2) lactoferrin comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(3) calpain-like protease CAPN10b (calpain-like protease CAPN10b) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
(4) a fibrinogen gamma chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
(5) fibrin beta comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;
(6) transferrin comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
(7) Ig alpha-2 chain C region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7;
(8) actin comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8;
(9) keratin 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;
(11) Cyclophilin B chain A comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 (Chain A, Cyclophilin B);
(12) an Ig alpha-2 chain C region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(13) myosin-9 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13;
(14) rab GDP dissociation inhibitor beta isoform 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14;
(15) Heat shock 70kd protein chain A (Chain A, Heat-Shock 70kd Protein) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15;
(16) zinc finger protein 570 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16;
(17) Human saliva amylase chain A comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 (Chain A, Human Salivary Amylase);
(18) an AMY1A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
(19) myosin-9 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19;
(20) actin binding protein ABP620 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;
(21) neuron navigator 2 isoform 2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21;
(22) a DIP2B protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;
(23) isoform CRA hCG32657 (hCG32657, isoform CRA) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23;
(24) proapolipoprotein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24;
(25) 1 g of plectin isoform comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25;
(26) X-Ray Crystal Structure Of Canine Myeloperoxidase At 3 Angstroms of Canine Myeloperoxidase in 3 Angstroms comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;
(27) lactoferrin comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27;
(28) keratin 10 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28;
(29) Keratin 9 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29;
(30) keratin 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30;
(31) heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2 / B1 isoform A2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31;
(32) Crystal structure chain A of Mrp14 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 (Chain A, Crystal Structure Of The Mrp14);
(33) cytochrome P450 4X1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33;
(34) Crystal Structure Of A Domain-Opened Mutant (A) of domain-opened mutants comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34;
(35) Zinc finger protein 334 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; And
(36) zinc finger protein ZNF222 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36.
(1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 10(Keratin 10)에 특이적으로 결합하는 항체;
(2) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 락토페린(lactoferrin)에 특이적으로 결합하는 항체;
(3) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 칼파인-유사 프로테아제 CAPN10b(calpain-like protease CAPN10b)에 특이적으로 결합하는 항체;
(4) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 피브리노겐 감마 체인(fibrinogen gamma chain)에 특이적으로 결합하는 항체;
(5) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 피브린 베타(fibrin beta)에 특이적으로 결합하는 항체;
(6) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 트랜스페린(transferrin)에 특이적으로 결합하는 항체;
(7) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 Ig 알파-2 체인 C 리젼(Ig alpha-2 chain C region)에 특이적으로 결합하는 항체;
(8) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 액틴(actin)에 특이적으로 결합하는 항체;
(9) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 1(keratin 1)에 특이적으로 결합하는 항체;
(11) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 사이클로필린 B 체인 A(Chain A, Cyclophilin B)에 특이적으로 결합하는 항체;
(12) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 Ig 알파-2 체인 C 리젼(Ig alpha-2 chain C region)에 특이적으로 결합하는 항체;
(13) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 미오신-9(myosin-9)에 특이적으로 결합하는 항체;
(14) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 랩 GDP 분리 저해제 베타 이소폼 1(rab GDP dissociation inhibitor beta isoform 1)에 특이적으로 결합하는 항체;
(15) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 열 쇼크 70kd 단백질 체인 A(Chain A, Heat-Shock 70kd Protein)에 특이적으로 결합하는 항체;
(16) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 징크 핑거 단백질 570(zinc finger protein 570)에 특이적으로 결합하는 항체;
(17) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 인간 타액 아밀라제 체인 A(Chain A, Human Salivary Amylase)에 특이적으로 결합하는 항체;
(18) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 AMY1A 단백질(AMY1A protein)에 특이적으로 결합하는 항체;
(19) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 미오신-9(myosin-9)에 특이적으로 결합하는 항체;
(20) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 액틴 바인딩 단백질 ABP620(actin binding protein ABP620)에 특이적으로 결합하는 항체;
(21) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 뉴런 네비게이터 2 이소폼 2(neuron navigator 2 isoform 2)에 특이적으로 결합하는 항체;
(22) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 DIP2B 단백질(DIP2B protein)에 특이적으로 결합하는 항체;
(23) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 이소폼 CRA hCG32657(hCG32657, isoform CRA)에 특이적으로 결합하는 항체;
(24) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 프로아포리포프로테인(proapolipoprotein)에 특이적으로 결합하는 항체;
(25) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 플렉틴 이소폼 1g(plectin isoform 1g)에 특이적으로 결합하는 항체;
(26) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 3 옹스트롬에서 카나인 미엘로퍼옥시다제의 X-레이결정 구조 체인 A(Chain A, X-Ray Crystal Structure Of Canine Myeloperoxidase At 3 Angstroms)에 특이적으로 결합하는 항체;
(27) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 락토페린(lactoferrin)에 특이적으로 결합하는 항체;
(28) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 10(keratin 10)에 특이적으로 결합하는 항체;
(29) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 9(Keratin 9)에 특이적으로 결합하는 항체;
(30) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 케라틴 1(keratin 1)에 특이적으로 결합하는 항체;
(31) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 이종 핵 리보뉴크레오티드 단백질 A2/B1 이소폼 A2(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 isoform A2)에 특이적으로 결합하는 항체;
(32) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 Mrp14의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal Structure Of The Mrp14)에 특이적으로 결합하는 항체;
(33) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 시토크롬 P450 4X1(cytochrome P450 4X1)에 특이적으로 결합하는 항체;
(34) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 도메인 개방된 뮤턴트의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal Structure Of A Domain-Opened Mutant)에 특이적으로 결합하는 항체;
(35) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 징크 핑거 단백질 334(Zinc finger protein 334)에 특이적으로 결합하는 항체;및
(36) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 징크 핑거 단백질 ZNF222(zinc finger protein ZNF222)에 특이적으로 결합하는 항체.
A kit for diagnosing acute exacerbation of COPD, comprising an antibody that specifically binds to 35 proteins consisting of:
(1) an antibody that specifically binds keratin 10 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(2) an antibody that specifically binds to lactoferrin comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(3) an antibody that specifically binds to a calpain-like protease CAPN10b (CAPN10b) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
(4) an antibody that specifically binds to a fibrinogen gamma chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
(5) an antibody that specifically binds to fibrin beta comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;
(6) an antibody that specifically binds to transferrin comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
(7) an antibody that specifically binds to an Ig alpha-2 chain C region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7;
(8) an antibody that specifically binds to actin comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8;
(9) an antibody that specifically binds keratin 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;
(11) an antibody that specifically binds to cyclophilin B chain A (Chain A, Cyclophilin B) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;
(12) an antibody that specifically binds to an Ig alpha-2 chain C region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(13) an antibody that specifically binds to myosin-9 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13;
(14) an antibody that specifically binds to rab GDP dissociation inhibitor beta isoform 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14;
(15) an antibody that specifically binds to Heat Shock 70kd Protein Chain A (Chain A, Heat-Shock 70kd Protein) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15;
(16) an antibody that specifically binds to zinc finger protein 570 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16;
(17) an antibody that specifically binds to human saliva amylase chain A (Chain A, Human Salivary Amylase) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17;
(18) an antibody that specifically binds to an AMY1A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
(19) an antibody that specifically binds to myosin-9 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19;
(20) an antibody that specifically binds to the actin binding protein ABP620 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;
(21) an antibody that specifically binds to a neuron navigator 2 isoform 2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21;
(22) an antibody that specifically binds to a DIP2B protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;
(23) an antibody that specifically binds to isoform CRA hCG32657 (hCG32657, isoform CRA) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23;
(24) an antibody that specifically binds to a proapolipoprotein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24;
(25) an antibody that specifically binds to 1 g of plectin isoform comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25;
(26) specifically binds to X-ray crystal structure of Canine Myeloperoxidase At 3 Angstroms of canine myeloperoxidase in 3 angstroms comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 Antibody;
(27) an antibody that specifically binds to lactoferrin comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27;
(28) an antibody that specifically binds keratin 10 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28;
(29) an antibody that specifically binds keratin 9 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29;
(30) an antibody that specifically binds keratin 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID 30;
(31) an antibody that specifically binds to heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2 / B1 isoform A2 (heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2 / B1 isoform A2) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31;
(32) an antibody that specifically binds to Crystal structure chain of Mrp14 (Chain A) comprising the amino acid sequence of SEQ ID 32;
(33) an antibody that specifically binds to cytochrome P450 4X1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33;
(34) an antibody that specifically binds to a crystal structure of a domain-opened mutant (Chain A) of a domain-opened mutant comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34;
(35) an antibody that specifically binds to zinc finger protein 334 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; and
(36) An antibody that specifically binds to zinc finger protein ZNF222 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36.
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| 논문 1 : THROMB HAEMOST. * |
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