KR101273489B1

KR101273489B1 - 심폐 동시 이식용 바이오스캐폴드의 제조방법

Info

Publication number: KR101273489B1
Application number: KR1020110032804A
Authority: KR
Inventors: 우흥명; 박경미
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2011-04-08
Filing date: 2011-04-08
Publication date: 2013-06-21
Also published as: KR20120114944A

Abstract

본 발명은 탈세포화를 통한 바이오스캐폴드의 제조방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 동물의 전신으로 계면활성제를 관류시켜 다장기 바이오스캐폴드를 제조하는 방법 및 이렇게 제조된 다장기 바이오스캐폴드에 관한 것이다.
장기별 바이오스캐폴드의 제조에 비해 다장기 바이오스캐폴드의 제조는 각 장기마다 혈류량과 탈세포화에 소요되는 시간 등이 각각 다르다는 어려움이 있으나, 본 발명에서는 동물의 해부학적 구조와 신체의 구성 장기들 간의 유기적인 혈류관계를 분석하고 적절한 시술 (예, 특정 혈관의 절개와 봉합, 카테터 및 연동식 펌프의 사용 등)을 통해 장기별 혈류량과 탈세포화에 소요되는 시간을 조절하여 상기 어려움을 극복하고, 다장기 스캐폴드를 제조하였다.

Description

심폐 동시 이식용 바이오스캐폴드의 제조방법{Method for preparation of combined liver-kidney translantation.}

본 발명은 탈세포화(decellularization)기법을 이용한 심폐 동시 이식용 바이오스캐폴드(bioscaffold)의 제조방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 동물의 전신에 계면활성제를 관류시킴으로써 다장기(multi-organ)를 탈세포화시켜 다장기 바이오스캐폴드를 제조하는 방법 및 이렇게 제조된 다장기 바이오스캐폴드에 관한 것이다.

최근 이식용 장기의 부족으로 이식 가능한 대체 장기에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그 중에서도 조직공학(tissue engineering)을 이용한 방법은, 현재 동종(사람-사람)간 장기 이식의 대체방법으로 제안되고 있는 이종(동물-사람)간 장기 이식에서 발생할 수 있는 부작용인 면역 거부 반응과 인수 공통 질병 등을 극복할 수 있을 것으로 기대되어, 최근 재생의학 분야에서 많은 관심을 받고 있다.

특히 조직 공학의 한 방법으로서, 탈세포화(decellularization) 기법을 이용한 바이오스캐폴드(bioscaffold) 방법이 각광받고 있는데, 이는 다음과 같은 장점들을 가지고 있기 때문이다: (1) 세포 구성물이 제거되어 이식시 면역 거부 반응을 최소화함; (2) 세포 성장과 분화에 관여하는 세포외기질(ECM)이 보존됨; (3) 혈관 구조가 보존되어 세포 주입 후 산소 및 영양 공급이 가능함; (4) 원래 장기 그대로의 형태와 구조가 유지됨.

현재까지 탈세포화 기법을 이용한 바이오스캐폴드의 제작방법에 있어서 다양한 시도들이 이루어져 왔다. 초기에는 판막이나 혈관, 성대와 같은 얇은 구조물들을 계면활성제(detergent)에 담구거나, 장이나 방광 등의 내강이 있는 장기의 경우 내강에 계면활성제를 채워서 탈세포화시키는 방법이 이용되었으나, 최근에는 각각의 장기의 큰 혈관을 통해 계면활성제를 관류시키는 방법으로 심장, 신장, 간 등의 주요 실질 장기를 통째로 탈세포화시키는 방법이 연구되고 있다.

본 발명자는 가능한 많은 종류의 장기를 동시에 탈세포화시킬 수 있는 방안을 연구하던 중 전신을 통해 계면활성제를 관류시킴으로써 종래의 기관별 탈세포화 방식에 비해 더 빠르게 많은 종류의 장기를 효율적으로 탈세포화시켜 다장기 스캐폴드를 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 폐는 장기의 구조 및 특성상 타장기와 동시에 탈세포화 시키기 힘든바, 심장과 폐를 동시에 탈세포화 시키는 방법 으로 나누어 또한 개발하였다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 동물의 전신으로 계면활성제를 관류시켜 다장기 바이오스캐폴드를 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 심폐 동시 이식용 바이오 스캐폴드인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 다장기 바이오 스캐폴드를 제공한다.

본 발명의 제조방법은 전체 장기를 한꺼번에 탈세포화하므로 종래의 장기별 탈세포화 방식에 비해 더 많은 종류의 장기를 효율적으로 탈세포화시켜 바이오스캐폴드를 생산할 수 있다.

장기별 바이오스캐폴드의 제조에 비해 다장기 바이오스캐폴드의 제조는 각 장기마다 혈류량과 탈세포화에 소요되는 시간 등이 각각 다르다는 어려움이 있다. 본 발명에서는 동물의 해부학적 구조와 신체의 구성 장기들 간의 유기적인 혈류관계를 분석하고 적절한 시술 (예, 특정 혈관의 절개와 봉합, 카테터 및 연동식 펌프의 사용 등)을 통해 장기별 혈류량과 탈세포화에 소요되는 시간을 조절하여 상기 어려움을 극복하고, 다장기 스캐폴드를 제조할 수 있다. 특히 심장과 폐의 경우, 심폐 이식용 연구에 필요한데도 불구하고, 두 장기의 구조 및 특성이 너무도 달라 다장기 스캐폴드 제조가 어려운 바, 최소한의 혈관 절개법을 이용하여 시술시, 그리고 추후 연구시 용이성이 좋도록 고안하였다.

본 발명의 바이오스캐폴드는 재생 의학 분야에서 장기형성 (organogenesis), 약물 스크리닝, 면역 관련 등의 많은 연구에 이용될 수 있고, 용이한 시술 방법으로 기초과학 종사자, 의학 계열 종사자들에게 기술이전이 가능하다. 특히 심폐 동시 이식용 바이오 스캐폴드의 경우 심폐 동시 이식이 필요한 심폐 부전증 환자들 치료 연구에 활용이 가능하며, 최소한의 절개방법으로 추후 이식 연구등을 시행할 때 방법이 용이하여 시간을 단축하였고 마취시간이 짧아지므로 안전성을 높일 수 있다.

도 1은 본 발명에 따라 전신으로 계면활성제를 관류하기 위한 시술 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 이용된 관류 시스템을 나타낸 것이다.
도 3은 전체 장기에 대해 관류 전의 정상 상태(좌) 및 관류 후 탈세포화된 상태(우)를 나타낸 것이다.
도 4는 각 장기에 대해 관류 전의 정상 상태(좌) 및 관류 후 탈세포화된 상태(우)를 나타낸 것이다.
도 5는 심폐 동시 이식용 바이오 스캐폴드 제작시에 카테터 설치와 절개 위치를 나타낸 것이다.

본 발명은 동물의 전신으로 계면활성제를 관류시켜 다장기 바이오스캐폴드를 제조하는 방법 및 이렇게 제조된 다장기 바이오스캐폴드에 관한 것이다.

조직 공학(issue engineering)이란 세포와 여러 가지 물질들의 조합을 이용한 어떤 구조물(주형물)에 세포를 안착시키는 방법으로, 이러한 이 구조물(주형물)을 스캐폴드라고 부르고, 이것을 만드는 목적은 손상받은 조직이나 기관을 대체할 수 있는 구조물을 만드는 것이다. 종류는 여러 가지가 있으나, 대표적인 인공 구조물로는 PLA, PGA, PLS, 하이드로겔, 세포시트 등이 있으며, 생체 구조물(즉, 장기)을 탈세포화(decellularization)시켜 세포를 제거한 후 미세구조 및 장기의 윤곽만을 남긴 구조물(주형물)을 바이오스캐폴드라고 한다.

본 발명에서, 다장기(multi-organ)는 심장, 신장, 위, 소장, 대장, 간, 비장 방광, 폐 중에서 적어도 둘 이상을 의미한다.

특히, 호흡기관인 심장과 폐의 경우, 실제 실험동물을 이용한 이식 연구 수술 중 수술에 의한 호흡 억제로 인해 실험동물의 상태가 악화될 수 있다. 또한 이식 수술을 위해 필수적인 전신 마취제 역시 수술 받는 실험동물의 호흡억제를 유발 하므로, 이식연구에서(특히 호흡기관인 심폐이식연구에서) 마취시간의 단축은 수술 후 실험동물의 회복 및 예후에 매우 중요하다. 상대적으로 폐는 다른 장기보다 취약한 조직이어서 같은 농도의 계면활성제를 관류시킬 경우 미세구조가 손상될 우려가 있다. 이에 의해 폐포가 터지면서 다른 장기의 혈관에 공기 전색을 일으킬 수 있고, 공기전색에 의해 다른 장기의 계면활성제 관류에 문제를 유발 하여 다장기 바이오 스캐폴드의 제조에 문제가 될 수 있다. 따라서, 폐는 관류 용액 농도를 다르게 하였으며, 이하 폐를 제외한 경우와 폐를 포함한 경우를 나누어 설명한다.

1. 폐를 제외한 복강 장기와 심장의 바이오 스캐폴드 시술

본 발명은 폐를 제외한 전체 장기를 한꺼번에 탈세포화하는 것으로, 간과 다른 복강장기(위, 소장, 대장 방광)를 함께 탈세포화할 경우, 상기 복강 장기들로부터 탈세포화된 찌꺼기들이 간의 탈세포화에 이용되는 주요 혈관인 간문맥으로 흘러들어와 간의 탈세포화가 곤란하다. 본 발명에서는 간문맥 순환을 제2의 카테터를 삽입하여 유지하고, 간문맥의 카테터 삽입 후방에 배출구를 만들어 복강장기로부터 배출되는 탈세포화 찌꺼기들이 간문맥을 통해 간으로 유입되지 않도록 고안함으로써 복강 장기와 간을 함께 탈세포화하는 경우 발생하는 기술적 곤란성을 극복할 수 있다(도 1 참조).

또한, 장기마다 탈세포화에 소요되는 시간이 상이하므로 전체 장기를 한꺼번에 탈세포화하는 경우, 일부 장기는 과다하게 탈세포화되어 구조적으로 유약한 바이오스캐폴드가 생성될 수 있다. 본 발명에서는 장기별 탈세포화 시간을 달리하여 상기와 같은 문제점을 극복할 수 있다. 즉, 신장을 제외한 간과 기타 복강 장기에 대해 장기별 탈세포화 소요 시간을 파악하여 장기마다 계면활성제 관류 시간을 달리하여 최적의 바이오스캐폴드를 만들 수 있다.

장기마다 탈세포화에 소요되는 시간이 다르므로 (표 1) 장기마다 계면활성제가 관류되는 시간을 조절할 필요가 있다. 신장과 심장 > 간 > 장 (위, 소장, 대장) 순으로 탈세포화에 소요되는 시간이 길어진다. 따라서, 먼저, 신장과 심장, 그리고 간, 그 다음으로 장으로 계면활성제가 관류되도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제조방법은 한 양태로서,

(1) 목동맥을 통하여 계면활성제를 관류시키는 단계;

(2) 목동맥을 통한 관류 후 일정 시간이 경과된 다음 문맥을 통하여 계면활성제를 관류시키는 단계; 및

(3) 목동맥을 통한 관류 후 일정 시간이 경과된 다음 앞쪽 장간막 동맥과 신정맥 후방의 대동맥과 대정맥을 통하여 계면활성제를 관류시키는 단계를 포함할 수 있다.

여기서, 각 단계별 관류 시간은 동물의 종, 체중 등 여러 가지 요인에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 한 양태에 따라, 래트의 경우에는 목동맥을 통한 관류 시작 3-5시간 후부터 문맥을 통한 관류(2 단계)를 실시하고, 목동맥을 통한 관류 시작 10-12시간 후부터 앞쪽 장간막 동맥과 신정맥 후방의 대동맥과 대정맥을 통한 관류(3 단계)를 실시하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제조방법에서는, 전신으로 계면활성제를 관류시키기 전에,

(1) 목동맥(carotid artery)에 꼬리(caudal) 방향으로 카테터를 삽입하는 단계;

(2) 복강 및 흉강을 절개하는 단계;

(3) 문맥(portal vein)에 머리(cranial) 방향으로 카테터를 삽입하는 단계;

(4) 복강내 대정맥(caudal vena cava, 후대정맥)의 신정맥(renal vein) 분지부 바로 뒷부분을 조금 절개하는 단계;

(5) 흉강내 대정맥의 심장 바로 앞, 뒷부분을 조금 절개하는 단계;

(6)상기 (4에서 형성된 복강내 대정맥 절개부 뒤쪽으로 대동맥과 대정맥을 한번에 봉합하는 단계;

(7 장에서 문맥으로 오는 작은 혈관 분지부는 문맥에 가까이 봉합 후 뒷부분은 절개하는 단계;

(8 문맥내 카테터 삽입 후방부를 조금 절개하는 단계;

(9) 상기 (3)에서 형성된 폐의 폐동맥 및 폐정맥 분지부를 절개하는 단계;

(10)앞쪽 장간막 동맥(cranial mesenteric artery)을 봉합하는 단계를 포함하는 시술을 실시하는 것이 바람직하다.

2. 심장 및 폐의 바이오스캐폴드 시술

폐는 호흡기관으로 12시간 동안 탈세포화를 하기 위한 SDS의 농도가 심장의 탈세포화에 필요한 용량보다 낮아서 (1/10 정도) 따로 주입하는 하는 것이 좋으며, 따라서 카테터를 따로 설치 하였다.

본 발명의 제조방법에서는, 계면활성제를 관류시키기 전에,

(1) 실험동물을 마취 후 전신 헤파린 처리한다.

(2) 목동맥에 꼬리 방향으로 카테터를 삽입하였다.

(3) 출혈에 주의하여 복강 및 흉강을 절개하였다.

(4) 폐의 폐정맥 (pulmonary vein)을 심장 가까운 곳에서 조금 절개한다.

(5) 복강내 대정맥(caudal vena cava)의 신정맥(renal vein) 분지부 바로 뒷부분을 조금 절개한다.

(6) 1번에서 설치한 카테터를 이용하여 heparinized PBS로 충분히 전신 Flushing 한다.

(7) 오름 대동맥과 폐동맥, 기관을 보존하며 폐와 심장을 한번에 적출한다.

(8) 대동맥에 심장 방향으로 카테터를 설치한 후 뒷 부분은 봉합 후 자른다.

(9) 폐동맥은 심장의 기저부에서 약 3mm 떨어진 지점에서 폐동맥 지름의1/2 정도 절개 방향으로 카테터 설치를 한다.

(10) 폐의 경우 이 방법만으로 전신 플러싱이 완벽히 이루어지지 않는 경우가 있어, 이런경우엔 8번의 폐동맥에 삽입된 카테터에 heparinized PBS 처리하여 추가 플러싱 한다.

이렇게 형성된 혈관의 절개 부분을 통해서 관류 과정 동안 장기내 세포 구성물들이 배출되게 된다. 따라서, 절개 부분은 세포 구성물들이 배출될 수 있도록 절개하는 것이 적절하다. 또한, 앞서 형성된 봉합 부분은 관류 시간을 조절하는데 이용될 수 있다. 즉, 해당 기관으로 관류가 필요한 경우 봉합을 풀어준다.

본 발명의 "계면활성제"는 통상의 계면활성제가 이용될 수 있으며, 예를 들면, SDS(sodium dodecyl sulfate), Triton-X, DNase, CHAPS(3-((3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propane sulfonate) 등이 있으나, SDS가 바람직하고, 이의 농도는 0.1 내지 10%가 바람직하다.

본 발명에서는, 생리 상태에서 각 장기에 혈액이 공급되는 것과 유사한 관류량을 유지함으로써 세포외기질과 혈관 구조를 최대한 보존하는 것이 바람직하다. 이를 위해, 연동식 펌프(peristaltic perfusion device)를 이용할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 재료 및 방법

1-1. 실험 동물

6-8주령의 수컷 250-350g SD 래트를 최소 12시간 절식 후 ketamine : xylazine = 4:1로 전신 마취하였고, 이후 꼬리 정맥을 통하여 헤파린을 투여하였다.

1-2. 관류를 위한 시술과 생체내 관류 (도 1, 도2)

(1) 심장 및 폐를 제외한 복강 장기의 바이오 스캐폴드 시술

1) 관류를 위한 시술

1. 목동맥에 꼬리 방향으로 카테터를 삽입하였다.

2. 출혈에 주의하여 복강 및 흉강을 절개하였다.

3. 문맥에 머리 방향으로 카테터를 삽입하였다.

4. 복강내 대정맥(cvc)의 신정맥 분지부 바로 뒷부분(infra renal cvc)을 조금 절개하였다.

5. 흉강내 대정맥(supra hepatic cvc)의 심장 바로 앞, 뒷부분을 조금 절개하였다.

6. 헤파린이 첨가된(heparinized) PBS로 충분히 전신 Flushing 하였다.

7. 복강내 대정맥 절개부 뒤쪽으로 대동맥과 대정맥을 한번에 봉합하였다.

8. 장에서 문맥으로 오는 작은 혈관 분지부는 문맥에 가까이 봉합 후 뒷부분은 절개하였다.

9. 문맥내 카테터 삽입 후방부를 조금 절개하였다.

10. 폐의 폐동맥 및 폐정맥 분지부는 모두 절개하였다.

11. 앞쪽 장간막 동맥을 봉합하였다.

2) 생체내 관류

관류 시스템(Perfusion system)은 래트(rat)의 정상 심장 방출 속도(cardiac out flow)인 50ml/분으로 유지하였고, 공기 유입을 최소화하도록 고안되었다. 연동식 펌프(peristaltic perfusion system)는 Y관을 이용하여 각 2개의 분지로 나누어 각각 목동맥, 문맥에 설치된 카테터로 연결하였다. 먼저 목동맥에 삽입된 카테터를 통하여 PBS에 녹인 1% SDS 용액을 50ml/분으로 관류하였다. 목동맥 관류 시작 약 4시간 후부터 문맥을 통해서도 1% SDS 용액을 관류하였고, 속도는 각 호스마다 설치된 밸브를 통하여 조절이 가능하도록 하였다. 목동맥 관류 시작 약 10시간 후부터 앞쪽 장간막 동맥과 신정맥 후방 대동맥, 정맥의 봉합 부위를 풀어 주어 소장 및 대장, 방광 등 하지로의 SDS 관류가 가능하도록 하였다. 육안적으로 모든 장기들이 흰색을 나타낼 때까지 목동맥을 통한 총 관류 시간은 약 14시간이었고, 이 시간동안 중간 중간 헤파린이 첨가된 PBS로 세척을 해주었다. 장기내 세포 구성물들은 관류 과정동안 정맥의 절개부를 통하여 흘러 나왔고, 이 액체들은 아래쪽에 설치된 받침대를 통해 모아서 주기적으로 제거하였다. 1% SDS 관류가 끝난 후 세포 독성 유발 가능성이 있는 물질들을 제거하기 위하여 PBS로 여러번 세척하였다.

(2) 심장 및 폐의 바이오스캐폴드 시술

1) 관류를 위한 시술

1. 실험동물을 마취 후 전신 헤파린 처리한다.

2. 목동맥에 꼬리 방향으로 카테터를 삽입하였다.

3. 출혈에 주의하여 복강 및 흉강을 절개하였다.

4. 폐의 폐정맥 (pulmonary vein)을 심장 가까운 곳에서 조금 절개한다.

5. 복강내 대정맥(caudal vena cava)의 신정맥(renal vein) 분지부 바로 뒷부분을 조금 절개한다.

6. 1번에서 설치한 카테터를 이용하여 heparinized PBS로 충분히 전신 Flushing 한다.

7. 오름 대동맥과 폐동맥, 기관을 보존하며 폐와 심장을 한번에 적출한다.

8. 대동맥에 심장 방향으로 카테터를 설치한 후(도5 A) 뒷 부분은 봉합 후 자른다.(도5 B)

9. 폐동맥은 심장의 기저부에서 약 3mm 떨어진 지점에서 폐동맥 지름의1/2 정도 절개 (도5 C)방향으로 카테터 설치를 한다.(도5 D)

10. 폐의 경우 이 방법만으로 전신 플러싱이 완벽히 이루어지지 않는 경우가 있어, 이런경우엔 8번의 폐동맥에 삽입된 카테터에 heparinized PBS 처리하여 추가 플러싱 한다.

2) 생체내 관류

8번에 설치한 카테터로 PBS 또는 DW에 녹인 1%SDS용액을 약 12시간 관류하였다. 이것은 폐동맥을 통하여 폐가 탈세포화 됨을 유도하기 때문이다.

9번에 설치한 카테터로 0.1% SDS용액을 약 12시간 관류하였다. 이것은 폐동맥을 통하여 폐가 탈세포화 됨을 유도하기 때문이다. 9번에서 폐동맥 지름의 약 1/2정도를 절개한 이유는 (실제 카테터 지름보다 큼) 1) 심장의 관상동맥을 관류한 1%SDS 용액이 우심방->우심실->폐동맥 절개부를 통해 빠져나오게 하기 위함 (용이한 배출로 심장에 과도한 압력이 걸리지 않도록 함) 2) 폐는 12시간 동안 탈세포화를 하기 위한 SDS의 농도가 심장의 탈세포화에 필요한 용량보다 낮아서 (1/10 정도) 따로 주입하는 것이 좋다. (만약 심장의 관상동맥을 통하여 관류된 SDS가 우심방을 통해 우심실-폐동맥으로 이동하여 폐로 들어갈 경우 과도한 농도의 SDS가 들어가게 되므로 탈세포화 과정 중 폐의 변형 등이 일어남) 3) 폐동맥의 1/2만 절개한 이유는 추후 다시 혈관 봉합을 할 경우 뒤틀림 등에 의한 변형을 최소화 하고 방법을 용이하게 하고 시간 절약을 하기 위해서 이다.

그리고, 8,9번에 설치한 카테터로 물(증류수 또는 PBS)을 약 12시간 관류한다.

육안적으로 모든 심장과 폐가 흰색을 나타낼 때까지 필요한 평균 총 관류 시간은 약 12시간 이었고, 이 시간동안 중간 중간 Heparinized PBS로 세척을 해 주었다. 관류되고 난 용액은 방법의 4번과 9번의 절개부를 통하여 흘러 나왔고 이 액체들은 아래쪽에 설치된 받침대를 통해 모아서 주기적으로 제거 하였다. SDS관류가 끝난 후 세포 독성 유발 가능성이 있는 물질들을 제거하기 위하여 DW 또는 PBS로 약 12시간 가량 세척 하였다.

1-3. 조직학적 분석

탈세포화된 바이오스캐폴드의 조직학적 평가를 위하여 각 장기는 포르말린으로 고정하였고, 절편은 H & E(Hematoxylin and eosin)로 염색하여 세포의 제거 정도를 관찰하였다. 제작한 스캐폴드는 정상 래트의 조직과 비교하였다. 또한 SDS 관류 동안 약 3시간 간격으로 주요 장기의 형태 변화를 관찰하여 탈세포화가 어느 정도 진행되었는지를 평가하였다.

실시예 2. 결과

2-1. 다장기 탈세포화

상기 실시예에 의해 래트의 대부분의 장기를 동시에 탈세포화시킬 수 있었다. 대부분의 장기들은 투명한 흰색을 띄었고, 기저막 구조의 구물망 같은 모양을 나타내었다. 이러한 장기들은 스폰지처럼 쉽게 눌러졌다가 다시 팽창되었다(도 3). 모두 탈 세포화 후에 육안적으로 구조 및 모양의 변화를 일으키지 않았다.

2-2. 탈세포화 정도

탈세포화에 걸리는 시간은 각 장기마다 조금씩 차이를 보였다. 가장 시간이 오래 걸린 장기는 신장과 심장으로 약 14시간 정도가 소요되었고, 간은 10시간, 반면 얇은 조직인 장은 4시간 정도만에 탈세포화가 되었다. 간은 각 Y 관에 연결된 호스마다 장착된 밸브를 이용하여 계면활성제 관류의 양, 속도 및 시간 조절이 가능하였고, 소장, 대장은 앞쪽 장간막 동맥, 대정맥, 대동맥의 일시적인 혈관 봉합을 이용하여 관류 시간을 조절할 수 있었다.

	3h	7h	10h	14h
심장	+	+	++	+++
신장	+	+	++	+++
장(위,소장,대장)	+++
간	+	++	+++
비장	++	+++
방광	+++

+: 30%, ++:70%, +++:100%

2-3. 조직학적 분석

주요 장기 내 세포 구성물들이 제거되었는지를 평가하기 위하여 H&E 염색법을 이용하였다. SDS 용액을 이용한 연동식 펌프를 이용하여 제작한 여러 장기의 바이오스캐폴드 조직에서는 거의 모든 세포 구성물들이 제거된 반면, 장기 전반에 걸쳐 그물 구조의 결합 조직들이 보존됨을 확인할 수 있었다(도 4). 설치된 카터를 통한 조영제 주입후 X-ray 검사로 주요 혈관들이 온전히 보존됨을 확인하였다. 콜라젠 등과 같은 세포 외 기질이 보존되었다.

Claims

(1)카테터를 이용하여 인간을 제외한 동물의 목동맥을 통하여 계면활성제를 관류시키는 단계;
(2)상기 제 (1)단계의 목동맥을 통한 관류 후 3 내지 5시간이 경과된 다음, 카테터를 이용하여 문맥을 통하여 계면활성제를 관류시키는 단계; 및
(3)상기 제 (2)단계의 문맥을 통한 관류 후 5 내지 9시간이 경과된 다음, 카테터를 이용하여 앞쪽 장간막 동맥과 신정맥 후방의 대동맥과 대정맥을 통하여 계면활성제를 관류시키는 단계;를 포함하는, 계면활성제를 인간을 제외한 동물의 전신으로 관류시켜 탈세포화된 다장기 바이오스캐폴드의 제조 방법.
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제 1항에 있어서, 상기 제(1)단계 전에,
(a) 목동맥(carotid artery)에 꼬리(caudal) 방향으로 카테터를 삽입하는 단계;
(b) 복강 및 흉강을 절개하는 단계;
(c) 문맥(portal vein)에 머리(cranial) 방향으로 카테터를 삽입하는 단계;
(d) 복강내 대정맥(caudal vena cava)의 신정맥(renal vein) 분지부 뒷부분을 절개하는 단계;
(e) 흉강내 대정맥의 심장 앞, 뒷부분을 절개하는 단계;
(f)상기 (d)에서 형성된 복강내 대정맥 절개부 뒤쪽으로 대동맥과 대정맥을 한번에 봉합하는 단계;
(g)장에서 문맥으로 오는 작은 혈관 분지부는 문맥에 가까이 봉합 후 뒷부분은 절개하는 단계;
(h) 문맥내 카테터 삽입 후방부를 절개하는 단계;
(i) 상기 (c)에서 형성된 폐의 폐동맥 및 폐정맥 분지부를 절개하는 단계;
(j) 앞쪽 장간막 동맥(cranial mesenteric artery)을 봉합하는 단계를 포함하는, 시술을 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
(1)카테터를 이용하여 인간을 제외한 동물의 목동맥을 통하여 계면활성제를 관류시키는 단계;
(2)상기 제 (1)단계의 목동맥을 통한 관류 후 일정 시간이 경과된 다음, 카테터를 이용하여 문맥을 통하여 계면활성제를 관류시키는 단계; 및
(3)상기 제 (2)단계의 문맥을 통한 관류 후 일정 시간이 경과된 다음, 카테터를 이용하여 앞쪽 장간막 동맥과 신정맥 후방의 대동맥과 대정맥을 통하여 계면활성제를 관류시키는 단계;를 포함하는 계면활성제를 인간을 제외한 동물의 전신으로 관류시켜 심폐 동시 이식용 바이오스캐폴드를 제조하는 방법.
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제 5항에 있어서, 상기 제(1)단계 전에,
(a) 인간을 제외한 동물을 마취 후 전신에 헤파린 처리하는 단계;
(b) 목동맥(carotid artery)에 꼬리(caudal) 방향으로 카테터를 삽입하는 단계;
(c) 복강 및 흉강을 절개하는 단계;
(d) 심장쪽의 폐의 폐정맥 (pulmonary vein)부분을 절개하는 단계;
(e) 복강내 대정맥(caudal vena cava)의 신정맥(renal vein) 분지부 뒷부분을 절개하는 단계;
(f) 오름 대동맥과 폐동맥, 기관을 보존하며 폐와 심장을 한번에 적출하는 단계;
(g) 대동맥에 심장 방향으로 카테터를 설치 한 후, 뒷부분은 봉합 후 절개하는 단계;
(h) 심장의 기저부에서 2 내지 4mm 떨어진 지점의 폐동맥을 폐동맥 지름의 1/2 길이로 절개 후, 절개방향으로 카테터 설치하는 단계 ;
(i) 문맥내 카테터 삽입 후방부를 절개하는 단계;를 포함하는 시술을 실시하는 것을 특징으로 하는, 심폐 동시 이식용 바이오스캐폴드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 계면활성제는 SDS(sodium dodecyl sulfate)인 것을 특징으로 하는 탈세포화된 다장기 바이오스캐폴드의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 관류는 연동식 펌프(peristaltic perfusion device)를 이용하는 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 다장기 바이오스캐폴드의 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 다장기는 심장, 신장, 위, 소장, 대장, 간, 비장 방광, 폐 중에서 적어도 둘 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 계면활성제는 SDS(sodium dodecyl sulfate)인 것을 특징으로 하는 심폐 동시 이식용 바이오스캐폴드의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 관류는 연동식 펌프(peristaltic perfusion device)를 이용하는 것을 특징으로 하는, 심폐 동시 이식용 바이오스캐폴드의 제조방법.