KR101270710B1 - Monoclonal antibody specifically binding to deoxynivalenol and the kit for detecting deoxynivalenol comprising thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 난백알부민알부민(ovalbumin)과 데옥시니발레놀(deoxynivalenol)을 특정비율로 결합시킨 컨쥬게이트를 면역원으로 사용하여 생산되고, 데옥시니발레놀에 대한 결합 특이성 및 친화성이 향상된 단클론 항체 및 이를 포함하는 데옥시니발레놀 검출용 킷트에 관한 것이다.The present invention is produced using a conjugate that combines egg white albumin albumin (ovalbumin) and deoxynivalenol in a specific ratio as an immunogen, monoclonal antibody with improved binding specificity and affinity for deoxynivalenol And it relates to a deoxynivalenol detection kit comprising the same.
Description
본 발명은 난백알부민알부민(ovalbumin)과 결합된 데옥시니발레놀(deoxynivalenol)을 이용하여 제작된 단클론 항체 및 이를 포함하는 데옥시니발레놀 검출용 킷트에 관한 것이다.
The present invention relates to a monoclonal antibody prepared using deoxynivalenol coupled with egg white albumin albumin (ovalbumin) and a deoxynivalenol detection kit comprising the same.
콩, 옥수수 및 보리 등에서 오염된 푸사리움 속의 곰팡이에서 생성되는 곰팡이 독소인 데옥시니발레놀은 가축에 있어서 생식관련 호르몬을 교란시켜 불임, 유산 등을 일으키는 물질로서 이 밖에 면역억제, 성장장애, 피부자극성 등을 일으킨다. 특히 가축에서는 사료의 오염시 사료섭취의 거부에 의하여 가축의 생산성을 저하시킨다. 따라서 국내의 식품의약품안전청에서는 2009년부터 곡류 및 그 가공품에서 데옥시니발레놀의 허용기준을 정하여 관리하고 있다. 이와 함께 식품이나 사료 중에서 데옥시니발레놀을 검출하기 위해서 특이항체를 제작하기 위한 연구들이 수행되어왔으며 이를 이용한 효소면역 검출 및 정제킷트들이 개발되었다. Deoxynivalenol, a fungal toxin produced by fungi in the Fusarium contaminated with soybeans, corn, and barley, causes fertility-related hormones in animals and causes infertility and miscarriage. Causes irritation. Particularly in livestock, the productivity of livestock is reduced by refusing feed intake when soiling the feed. Therefore, since 2009, the Korea Food and Drug Administration has established and managed the deoxynivalenol acceptance criteria for grains and processed products. In addition, studies have been conducted to prepare specific antibodies to detect deoxynivalenol in food or feed, and enzyme immunoassay and purification kits have been developed using the same.
그러나 이들 항체는 이를 생산하는 클론에 따라서 특이성 및 친화성에 있어서 서로 다른 특성을 가지고 있다. 예를 들면 항체의 아이소타입(isotype)에 따라 IgG1, IgG2 및 IgG3 등의 형태를 띌 수 있으며, 항체가 인식하는 항원의 특정부위는 데옥시니발레놀과 결합된 링커의 결합형태, 정제정도와 담체단백질과 결합된 곰팡이독소의 물리화학적 구조에 따라 달라질 수 있다. 따라서 세포주를 생산하기 위한 유사한 방법을 사용할 지라도 다양한 친화성 및 특이성을 가지는 단클론 항체를 생산하는 세포주가 만들어진다.
However, these antibodies have different characteristics in specificity and affinity depending on the clones producing them. For example, depending on the isotype of an antibody, IgG1, IgG2 and IgG3 may be formed. Specific regions of the antigen recognized by the antibody may be determined by the binding form, degree of purification of the linker bound to deoxynivalenol, and the like. It may vary depending on the physicochemical structure of the fungal toxin bound to the carrier protein. Thus, even using similar methods for producing cell lines, cell lines are produced that produce monoclonal antibodies with varying affinity and specificity.
이에 본 발명자들은 데옥시니발레놀에 대해 특이성이 높은 특이항체를 생산하기 위해 링커물질로서 데옥시니발레놀의 3번 또는 15번 탄소와 결합하는 1,1’-카르보닐디이미다졸(1,1’-carbonyldiimidazole, CDI)을 이용하며 담체단백질로서 난백알부민을 이용하고 이들을 결합시켜 제조한 컨쥬게이트로 마우스를 면역시킬 경우 기존의 항체와 차별적으로 데옥시니발레놀에 대하여 높은 특이성을 가지는 항체를 생산할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have described 1,1'-carbonyldiimidazole (1) which binds to
따라서, 본 발명의 목적은 데옥시니발레놀에 대한 결합 특이성 및 친화성이 높은 단클론 항체 및 상기 단클론 항체를 포함하는 데옥시니발레놀 검출용 킷트를 제공하는 것이다.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a monoclonal antibody having high binding specificity and affinity for deoxynivalenol and a kit for detecting deoxynivalenol comprising the monoclonal antibody.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 데옥시니발레놀, 링커 및 난백알부민으로 구성되고, 상기 링커는 데옥시니발레놀의 3번 또는 15번 탄소와 결합하는 컨쥬게이트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention comprises a deoxynivalenol, a linker and egg white albumin, the linker provides a conjugate that binds to the 3 or 15 carbon of deoxynivalenol.
또한, 본 발명은 상기 컨쥬게이트를 면역원으로 마우스에 주입한 후 마우스로부터 상기 면역원에 대하여 생산된 기탁번호 KCLRF-BP-00236의 단클론 항체 및 이를 포함하는 데옥시니발레놀 검출용 킷트를 제공한다.
In addition, the present invention provides a monoclonal antibody of Accession No. KCLRF-BP-00236 and a deoxynivalenol detection kit comprising the same, wherein the conjugate is injected into a mouse as an immunogen and then produced for the immunogen from the mouse.
본 발명에 따른 데옥시니발레놀과 특이적으로 결합하는 단클론 항체는 데옥시니발레놀에 대한 친화성이 높아 이를 면역학적 진단 킷트 및 정제용 키트, 또는 식품이나 사료 중에 미량으로 존재하는 곰팡이 독소인 데옥시니발레놀의 제거 목적으로 사용시 진단 및 정제효율과 검출 감도를 증진시킬 수 있다.
Monoclonal antibodies that specifically bind to deoxynivalenol according to the present invention have high affinity for deoxynivalenol and thus have a small amount of fungal toxins present in immunological diagnostic kits and purification kits or in foods or feeds. When used for the purpose of eliminating phosphorus deoxynivalenol, diagnostic and purification efficiency and detection sensitivity can be enhanced.
도 1은 데옥시니발레놀과 링커인 1,1’-카르보닐디이미다졸을 반응시킨 후 담체단백질과 결합시키는 과정을 나타낸 것이다. 이는 데옥시니발레놀의 3번 또는 15번 위치의 OH기와 1,1’-카르보닐디이미다졸이 결합하여 카르바메이트 결합이 생성되고 이후 담체단백질의 아민기와 반응하는 과정을 나타내고 있다.
도 2는 데옥시니발레놀과 1,1’-카르보닐디이미다졸의 반응 전후의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3은 DON-CDI-OVA 컨쥬게이트를 이용한 면역원 항원의 특이성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 데옥시니발레놀을 마우스에 면역시켜 단클론 항체를 생산하는 세포주를 선발하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 마우스의 개체별 혈청 중에 존재하는 데옥시니발레놀에 대한 특이항체 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 마우스 혈청 테스트에서 데옥시니발레놀에 의한 혈청 중 항체의 억제정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 각 클론이 생산하는 항체의 데옥시니발레놀과의 반응성 및 특이성을 나타낸 것이다.
도 8은 데옥시니발레놀을 마우스에 면역시켜 단클론 항체를 생산하는 세포주를 선발한 후 그것이 생산하는 항체의 특성을 확인한 모식도이다.
도 9는 선발한 클론이 생산하는 항체의 아이소타입을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 Balb/C 마우스에서 생산된 복수에서 정제된 데옥시니발레놀 특이 항체의 반응성을 나탄낸 것이다.
도 11은 항원 코팅된 데옥시니발레놀 검출 킷트의 정량곡선을 나타낸 것이다.
도 12는 항체 코팅된 데옥시니발레놀 검출 킷트의 정량곡선을 나타낸 것이다.1 shows a process of reacting deoxynivalenol with a linker 1,1′-carbonyldiimidazole and then binding it to a carrier protein. This shows a process in which OH groups at
2 shows chromatograms before and after the reaction of deoxynivalenol with 1,1'-carbonyldiimidazole.
Figure 3 shows the results confirming the specificity of the immunogen antigen using the DON-CDI-OVA conjugate.
Figure 4 is a schematic diagram showing the process of selecting a cell line producing a monoclonal antibody by immunizing deoxynivalenol to the mouse.
Figure 5 shows the results confirming the specific antibody to the deoxynivalenol present in the individual serum of the mouse.
Figure 6 shows the result of measuring the degree of inhibition of the antibody in the serum by deoxynivalenol in the mouse serum test.
Figure 7 shows the reactivity and specificity of the antibody produced by each clone with deoxynivalenol.
Figure 8 is a schematic diagram confirming the characteristics of the antibody produced after selecting a cell line producing a monoclonal antibody by immunizing deoxynivalenol to the mouse.
Figure 9 shows the results confirming the isotype of the antibody produced by the selected clone.
10 shows the reactivity of purified deoxynivalenol specific antibodies in ascites produced in Balb / C mice.
Figure 11 shows the quantitation curve of the antigen coated deoxynivalenol detection kit.
12 shows the quantitation curves of antibody coated deoxynivalenol detection kits.
본 발명은 데옥시니발레놀, 링커 및 담체단백질로 구성되고, 상기 링커는 데옥시니발레놀의 3번 또는 15번 탄소와 결합하며 데옥시니발레놀과 담체단백질은 약 1:160~1:170의 몰비율로 결합하는 컨쥬게이트에 관한 것이다. The present invention consists of deoxynivalenol, a linker and a carrier protein, the linker is bound to
본 발명에서 링커는 당업계에서 통상적으로 사용하는 것을 임의로 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 1,1’-카르보닐디이미다졸(1,1’-carbonyldiimidazole, CDI)을 사용할 수 있다. 상기 링커는 데옥시니발레놀의 3번 또는 15번 탄소와 결합함으로써 데옥시니발레놀이 담체단백질과 결합할 수 있도록 만들어 준다.In the present invention, the linker may be arbitrarily selected and used commonly used in the art, and preferably 1,1′-carbonyldiimidazole (1,1′-carbonyldiimidazole, CDI) may be used. The linker binds to
본 발명에서 담체단백질은 당업계에서 통상적으로 사용하는 것을 임의로 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 난백알부민(ovalbumin)을 사용할 수 있다. 본 발명에서 데옥시니발레놀과 담체단백질은 약 1:160~1:170의 몰비율로 결합하며, 바람직하게는 약 1:166의 몰비율로 결합한다. 이때 상기 데옥시니발레놀과 난백알부민의 결합 비율이 상기 범위를 벗어날 경우 항원에 대한 친화성과 반응성이 떨어진다.Carrier protein in the present invention may be used to arbitrarily select those commonly used in the art, preferably egg white albumin (ovalbumin) can be used. In the present invention, the deoxynivalenol and the carrier protein are bonded at a molar ratio of about 1: 160 to 1: 170, preferably at a molar ratio of about 1: 166. At this time, if the deoxynivalenol and egg white albumin binding ratio is out of the above range, the affinity and reactivity for the antigen is inferior.
본 발명의 컨쥬게이트는 데옥시니발레놀과 링커를 먼저 결합시킨 후 이를 담체단백질과 결합시켜 제조할 수 있으며, 이러한 컨쥬게이트의 제조방법은 당업계에서 통상적으로 사용하는 방법을 이용할 수 있다.The conjugate of the present invention may be prepared by first combining deoxynivalenol and a linker and then combining it with a carrier protein, and the method for preparing such a conjugate may use a method commonly used in the art.
또한 본 발명은 상기 컨쥬게이트를 면역원으로 마우스에 주입한 후 마우스로부터 상기 면역원에 대하여 생산되고 데옥시니발레놀에 대한 결합 특이성 및 친화성이 높은 단클론 항체에 관한 것이다. 본 발명에서는 상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마세포를 한국세포주은행에 기탁하여 2010년 6월 30일자로 기탁번호 KCLRF-BP-00236을 부여받았다. 본 발명에서 제작한 단클론 항체는 Ig G2b의 아이소타입에 속하며, 기존의 항체에 비하여 데옥시니발레놀에 대한 결합 특이성 및 친화성이 높다.The present invention also relates to monoclonal antibodies which have been injected against the immunogen from mice after injecting the conjugate into an immunogen and have high binding specificity and affinity for deoxynivalenol. In the present invention, the hybridoma cells producing the monoclonal antibody were deposited with the Korea Cell Line Bank and received the accession number KCLRF-BP-00236 as of June 30, 2010. The monoclonal antibodies produced in the present invention belong to the isotype of Ig G2b, and have high binding specificity and affinity for deoxynivalenol as compared to the existing antibodies.
또한 본 발명은 데옥시니발레놀에 대한 결합 특이성 및 친화성이 높은 상기 단클론 항체를 포함하고, 식품이나 사료 중에 미량으로 존재하는 곰팡이 독소인 데옥시니발레놀을 검출할 수 있는 데옥시니발레놀 검출용 킷트에 관한 것이다. 본 발명에 의한 단클론 항체는 기존의 항체들보다 데옥시니발레놀에 대한 결합 특이성 및 친화성이 강화되어 고체상 또는 액체상에서 데옥시니발레놀을 검출할 수 있는 방법으로 활용할 수 있다. 이외에도 본 발명에 의한 단클론 항체는 식품이나 사료 중에 존재하는 데옥시니발레놀의 양을 측정하는 기구나 데옥시니발레놀을 제거하기 위한 기구의 일부분으로 사용될 수 있다.
In addition, the present invention includes the above monoclonal antibody having high binding specificity and affinity for deoxynivalenol, and is capable of detecting deoxynivalenol, which is a fungal toxin present in trace amounts in food or feed. The present invention relates to a knoll detection kit. The monoclonal antibody according to the present invention can be used as a method for detecting deoxynivalenol in a solid or liquid phase by enhancing binding specificity and affinity for deoxynivalenol than conventional antibodies. In addition, the monoclonal antibody according to the present invention can be used as part of a device for measuring the amount of deoxynivalenol present in food or feed, or as a part of a device for removing deoxynivalenol.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위하여 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에 통상적으로 주지된 변형이 가해질 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples and test examples. These examples are presented only for understanding the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to these examples, and modifications commonly known in the art may be applied thereto. It is included in a range.
[실시예 1] 데옥시니발레놀, 링커 및 난백알부민의 컨쥬게이트의 제조Example 1 Preparation of Conjugate of Deoxynivalenol, Linker and Egg White Albumin
본 발명에 따른 컨쥬게이트는 데옥시니발레놀과 링커를 결합시킨 결합체에 담체단백질을 결합시키는 방법으로 제조하였다. 구체적인 제조방법은 하기와 같다.The conjugate according to the present invention was prepared by a method of binding a carrier protein to a conjugate of deoxynivalenol and a linker. A concrete production method is as follows.
데옥시니발레놀(DON) 5mg을 800㎕의 무수 아세톤(dry acetone)에 녹인 다음 40mg의 링커물질인 1,1’-카르보닐디이미다졸(CDI)이 들어있는 갈색병에 천천히 넣어서 녹이고 상온에서 1시간동안 교반하면서 반응시켰다. 이 반응에 의해 데옥시니발레놀의 3번이나 15번 위치의 OH기에 1,1’-카르보닐디이미다졸이 반응하여 카르바메이트 결합이 생성되었다. 이의 구체적인 과정은 도 1에 나타내었다. 이때 상층액을 20㎕를 취해 데옥시니발레놀의 반응여부를 확인하였으며, 이의 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2를 보면 반응전의 데옥시니발레놀은 약 7.9분대에서 피크를 확인할 수 있으나, 1,1’-카르보닐디이미다졸과 반응한 후에는 13.2분대에서 피크가 확인되어 대부분의 데옥시니발레놀이 반응하였음을 알 수 있다. Dissolve 5 mg of deoxynivalenol (DON) in 800 μl of dry acetone, and slowly dissolve in a brown bottle containing 40 mg of
상기한 반응으로 생성한 반응용액을 핫 플레이트에서에서 100㎕ 이하의 용량이 되게 농축시켰다. 5.8mg의 난백알부민(OVA)이 녹아있는 385㎕의 0.1M 탄산 완충액(carbonate buffer)(pH 8.5)에 먼저 제조하여 농축한 용액을 천천히 첨가하였다. 4℃에서 24시간동안(밤새) 교반시킨 다음 세파덱스 G-25 컬럼을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 0.01M PBS(pH 7.2)로 정제 및 탈염하여 링커와 결합된 데옥시니발레놀에 난백알부민이 결합한 컨쥬게이트를 제조하였다. 정제한 컨쥬게이트는 정량한 후 동결 건조하여 -20℃에 보관하였다. The reaction solution produced by the above reaction was concentrated to a volume of 100 μl or less in a hot plate. 5.8 mg of egg white albumin (OVA) was dissolved in 385 μl of 0.1 M carbonate buffer (pH 8.5), and the concentrated solution was slowly added. Stirred at 4 ° C. for 24 hours (overnight) and then purified and desalted with 0.01 M PBS pH 7.2 using Sephadex G-25 column to deoxynivalenol bound to linker with egg white albumin. This conjugated conjugate was prepared. Purified conjugates were quantified and lyophilized and stored at -20 ° C.
상기의 방법으로 링커와 결합된 데옥시니발레놀과 담체단백질인 난백알부민의 커플링 밀도(Coupling density)는 처음 사용한 데옥시니발레놀과 반응 후 상층액에서의 데옥시발레놀의 차이에 의해 반응한 데옥시니발레놀의 양을 BCA 방법으로 측정하여 반응 몰수를 구하였으며 이후 담체단백질인 난백알부민은 정제된 양을 측정하여 몰수를 ‘농도/MW’로 계산하였다. 이때 데옥시니발레놀의 분자량(MW)은 296.32이고, 난백알부민의 분자량(MW)은 44,287이었다. 이렇게 구한 커플링 밀도는 하기 표 1과 같다.
Coupling density of deoxynivalenol, a carrier protein, and egg white albumin bound to the linker by the above method, was determined by the difference of deoxyvalenol in the supernatant after reaction with deoxynivalenol used for the first time. The amount of reacted deoxynivalenol was measured by the BCA method, and the number of moles of the reaction was calculated. Then, the number of moles of egg white albumin, which was a carrier protein, was measured and the number of moles was calculated as 'concentration / MW'. At this time, the molecular weight (MW) of deoxynivalenol was 296.32, and the molecular weight (MW) of egg white albumin was 44,287. The coupling density thus obtained is shown in Table 1 below.
(데옥시니발레놀의 몰수
/난백알부민의 몰수)Coupling density
(Moles of deoxynivalenol
Confiscation of egg white albumin)
(3.15mg)1.45 * 10 -5 M
(3.15mg)
(2.36mg)8.72 * 10 -8 M
(2.36mg)
상기 표 1의 결과를 통하여, 데옥시니발레놀과 난백알부민이 약 1:166 몰비율로 결합하는 것을 확인할 수 있다.
Through the results in Table 1, it can be seen that deoxynivalenol and egg white albumin bind at a ratio of about 1: 166.
담체단백질과 결합한 데옥시니발레놀의 항체와 반응여부를 확인하기 위해 상품화된 다클론항체(담체단백질로 소혈청알부민(BSA)을 이용)를 이용하여 효소면역학적 방법으로 항체와의 반응성과 억제정도를 확인하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었으며, 도 3에서 위의 그림은 본 실험에서 융합세포 스크린용으로 제조한 DON-CDI-BSA를 마이크로 플레이트에 코팅한 모식도이다.Reactivity and inhibition of the antibody by enzymatic immunoassay using a commercialized polyclonal antibody (using bovine serum albumin (BSA) as a carrier protein) to confirm the reaction of deoxynivalenol with the carrier protein. The degree was confirmed. The results are shown in Figure 3, Figure 3 above is a schematic diagram of a microplate coated DON-CDI-BSA prepared for fusion cell screen in this experiment.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 난백알부민과 결합한 DON-CDI-OVA가 소혈청알부민을 이용한 기존의 다클론항체와 비교하여 더 높은 특이성을 나타냄을 알 수 있다.
As can be seen in Figure 3, it can be seen that DON-CDI-OVA bound to egg white albumin of the present invention shows a higher specificity compared to the existing polyclonal antibody using bovine serum albumin.
[실시예 2] DON-CDI-OVA 면역 및 클론의 선발Example 2 Selection of DON-CDI-OVA Immunity and Clones
상기 실시예 1에서 제조한 DON-CDI-OVA 컨쥬게이트를 도 4의 면역일정에 따라 5마리의 6주령 Balb/c 마우스로 개체 당 컨쥬게이트 100㎍/100㎕를 복강으로 투여하였다. 완전 보조제로는 “Freund’s adjuvant complete(1차 주입시 사용)”를, 불완전 보조제로는 “Freund’s adjuvant imcomplete(2, 3 및 4차 주입시 사용)”를 각각 100㎕씩 사용하였다.The DON-CDI-OVA conjugate prepared in Example 1 was administered intraperitoneally with 100 μg / 100 μl of the conjugate per individual with five 6-week-old Balb / c mice according to the immunization schedule of FIG. 4. 100 μl of “Freund's adjuvant complete” was used as a complete supplement and “Freund's adjuvant imcomplete” (used at 2, 3 and 4) was used as an incomplete adjuvant.
처음에 완전 보조제와 함께 DON-CDI-OVA 컨쥬게이트를 투여(1차 주입)하고, 6주 후 불완전 보조제와 함께 DON-CDI-OVA 컨쥬게이트를 투여(2차 주입)하였다. 2주 후 불완전 보조제와 함께 DON-CDI-OVA 컨쥬게이트를 다시 투여(3차 주입)하고 2주 후 불완전 보조제와 함께 DON-CDI-OVA 컨쥬게이트를 다시 투여(4차 주입)하였으며, 4주 후 보조제 없이 DON-CDI-OVA 컨쥬게이트를 투여(5차 주입)하였다. 한편, 4차 주입하고 1주일 후에 혈청 친화성 테스트(serum affinity test)를 실시하였으며, 5차 주입하고 4일 후에 마우스 해부를 실시하였다. 혈청 친화성 테스트 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다. 도 5는 마우스 혈청 중 데옥시니발레놀 항체를 측정한 결과이고 도 6은 데옥시니발레놀에 의한 혈청 중 항체의 억제정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 이를 통해 M3 마우스가 혈청 중에 데옥시니발레놀에 의한 특이항체를 생산함을 알 수 있다.Initially, the DON-CDI-OVA conjugate with complete adjuvant was administered (first injection), and after 6 weeks, the DON-CDI-OVA conjugate with incomplete adjuvant was administered (second injection). Two weeks later, the DON-CDI-OVA conjugate was again administered with the incomplete adjuvant (third infusion) and two weeks later, the DON-CDI-OVA conjugate was again administered with the incomplete adjuvant (fourth infusion). DON-CDI-OVA conjugate was administered (5th infusion) without adjuvant. On the other hand, one week after the fourth injection, the serum affinity test was performed, and the mouse was dissected four days after the fifth injection. Serum affinity test results are shown in FIGS. 5 and 6. 5 is a result of measuring the deoxynivalenol antibody in the mouse serum, Figure 6 shows the result of measuring the degree of inhibition of the antibody in the serum by deoxynivalenol. This suggests that M3 mice produce specific antibodies by deoxynivalenol in serum.
그 다음, 데옥시니발레놀에 대해 특이적으로 반응한 마우스(도 5 및 도 6에 나타낸 M3)의 비장세포와 SP2/0를 퓨전시킨 후 클론화된 세포 중에서 데옥시니발레놀에 특이적인 클론을 선발하였다. 클론이 생산하는 상층액에서 생산되는 특이항체는 실험실에서 합성한 DON-CDI-OVA 컨쥬게이트를 이용하여 특이성을 확인하였으며, 그 결과 생산된 항체는 링커로 사용한 1,1’-카르보닐디이미다졸이나 담체단백질로 사용한 난백알부민과 반응하지 않는 데옥시니발레놀 특이항체임을 확인하였다. 클론에 따른 흡광도를 측정한 결과는 도 7에 나타내었다. 도 7에서 나타낸 2C15, 2C17, 2C19, 2C21, 2C22, 2C23, 2C24, 2C26, 2C28 및 2C29는 각각의 독립된 클론의 동정물질(clone identity)이며, 각각의 클론에서 배양하여 생산된 상층액을 취하여 0.5㎍/ml의 데옥시니발레놀 용액과 반응시켜 코팅된 데옥시니발레놀 항원과 반응이 억제되는 것을 확인한 결과 모두 억제되었음을 확인하였다.Next, after splicing sp2 / 0 with splenocytes of mice (M3 shown in FIGS. 5 and 6) that specifically reacted to deoxynivalenol, the cells specific for deoxynivalenol were cloned. Clones were selected. Specific antibodies produced from the supernatant produced by the clones were confirmed for specificity using a DON-CDI-OVA conjugate synthesized in a laboratory, and the resulting antibody was used as a linker as a 1,1'-carbonyldiimidazole. It was confirmed that it is a deoxynivalenol-specific antibody that does not react with egg white albumin used as a carrier protein. The result of measuring the absorbance according to the clone is shown in FIG. 2C15, 2C17, 2C19, 2C21, 2C22, 2C23, 2C24, 2C26, 2C28 and 2C29 shown in FIG. 7 are clone identity of each independent clone, and the supernatant produced by culturing in each clone was taken to take 0.5 Reaction with the deoxynivalenol solution of μg / ml was confirmed that the reaction with the coated deoxynivalenol antigen was inhibited.
도 7에서 보라색 막대는 생산하는 항체가 코팅된 항원과 반응정도를 나타내는 것이며 붉은색 막대는 데옥시니발레놀(0.5㎍/㎖)을 첨가시의 억제정도를 나타내는 것이다. 2C26의 경우 데옥시니발레놀이 없을 때의 흡광도가 높아서 항체생산력이 우수하며, 또한 데옥시니발레놀이 있을 때의 흡광도는 낮아서 데옥시니발레놀에 대한 억제력이 우수하여, 항체생산 및 억제력에서 모두 우수함을 확인할 수 있다. 따라서 2C26을 특이클론으로 선발하였다.In Fig. 7, the purple bar shows the degree of reaction with the antibody coated with the producing antibody, and the red bar shows the degree of inhibition upon addition of deoxynivalenol (0.5 µg / ml). In the case of 2C26, the absorbance in the absence of deoxynivalenol is high, and the antibody productivity is excellent. In addition, the absorbance in the presence of deoxynivalenol is low, which is superior to deoxynivalenol. It can be confirmed that excellent. Therefore, 2C26 was selected as a specific clone.
IsoStrip 마우스 단클론 항체 아이소타입핑 킷트(Isotrip mouse monoclonal antibody isotyping kit; Roche사)를 이용하여 제조사의 설명에 따라 아이소타입을 측정한 결과 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이 본 발명에서 제조된 클론의 아이소타입은 Ig G2b임을 확인하였다.
IsoStrip mouse monoclonal antibody isotyping kit (Isotrip mouse monoclonal antibody isotyping kit (Roche Co., Ltd.) using the measurement of the isotype according to the manufacturer's instructions according to the manufacturer's results as shown in Figure 8 and 9 of the clone prepared in the present invention It was confirmed that the type is Ig G2b.
[실시예 3] 선발된 클론이 생산하는 항체를 이용한 효소면역학적 데옥시니발레놀 검출 킷트 작성Example 3 Preparation of an Enzyme-Immunologic Deoxynivalenol Detection Kit Using Antibodies Produced by Selected Clones
상기 실시예 2에서 선발된 하이브리도마세포(기탁번호 KCLRF-BP-00236)를 Balb/c 마우스 복강에 투여하여 데옥시니발레놀 특이 단클론 항체를 생산 정제하였고, 이렇게 정제된 데옥시니발레놀 특이 항체의 희석에 따른 반응성을 확인하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이 protein G 정제킷트(Thermo scienfic 사, Melon Gel IgG purification resins and kit)를 이용해 정제하였을 경우 용출용액의 분획별로 희석함에 따라 항원이 코팅된 플레이트와 반응이 떨어짐을 알 수 있어 특이적임을 확인할 수 있어, 최종 정제된 항체를 면역학적 검출 킷트의 작성에 이용하였다. 그림에서 #19, #20은 정제컬럼에서 세척과 항체를 용출시키는 과정에서 19번째 및 20번째 분획을 의미한다.
The hybridoma cells selected from Example 2 (Accession No. KCLRF-BP-00236) were administered to the abdominal cavity of Balb / c mice to produce and purify deoxynivalenol specific monoclonal antibody, and thus purified deoxynivalenol The reactivity was confirmed by dilution of the specific antibody. As shown in Figure 10, when purified using a protein G purification kit (Thermo scienfic, Melon Gel IgG purification resins and kit) it can be seen that the reaction with the antigen-coated plate is diminished by dilution by fraction of the elution solution. Eligibility was confirmed and the final purified antibody was used for the preparation of immunological detection kits. In the figure, # 19 and # 20 represent the 19th and 20th fractions in the process of washing and eluting the antibody in the purified column.
상기 확인한 데옥시니발레놀에 대한 특이항체를 마이크로 플레이트에 코팅하고, 데옥시니발레놀-OVA(항원)을 코팅하여 경쟁적 원리에 의한 데옥시니발레놀을 간이 정량할 수 있는 효소면역학적 플레이트를 제작하였다. Enzyme-immunological plate capable of simply quantifying deoxynivalenol based on a competitive principle by coating the specific antibody against the deoxynivalenol identified above and coating deoxynivalenol-OVA (antigen) Was produced.
구체적으로 항원 코팅한 검출용 킷트는 데옥시니발레놀-OVA 접합체를 300ng/웰이 되도록 4℃에서 밤새 코팅 후 HRP를 붙인 항체(7.5㎍/ml)와 데옥시니발레놀을 50㎕씩 동량으로 섞어준 후 5분간 반응 후 기질을 넣어주고 5분간 다시 반응시킨 다음 반응을 정지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 도 11에 나타내었으며 이러한 방법으로 제작한 데옥시니발레놀 검출용 킷트의 정량범위는 25~500 ppb(r 2 =0.99)이었다.
Specifically, the antigen-coated detection kit was coated overnight at 4 ° C. to obtain 300 ng / well of the deoxynivalenol-OVA conjugate, followed by an equivalent amount of HRP-attached antibody (7.5 μg / ml) and 50 μl of deoxynivalenol. After mixing for 5 minutes, the substrate was added and reacted again for 5 minutes, and then the reaction was stopped and absorbance was measured at 450 nm. The measurement results are shown in FIG. 11 and the quantitative range of the deoxynivalenol detection kit prepared in this manner was 25-500 ppb ( r 2 = 0.99).
또한, 항체 코팅 검출용 킷트를 제작하였다. 이는 상기에서 정제한 데옥시니발레놀 단클론 항체를 2.5㎍/웰의 농도로 넣고 4℃에서 밤새 코팅시켰으며 데옥시니발레놀-HRP 접합체와 데옥시니발레놀을 50㎕씩 합쳐서 사용하였다. 5분간 반응 후 기질을 넣어주고 5분간 다시 반응시킨 다음 반응을 정지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 도 12에 나타내었으며 이러한 방법으로 제작한 킷트의 정량범위는 50~4000 ppb(r 2 =0.99)이었다. Moreover, the kit for antibody coating detection was produced. The deoxynivalenol monoclonal antibody purified above was added at a concentration of 2.5 μg / well and coated at 4 ° C. overnight, and 50 μl of deoxynivalenol-HRP conjugate and deoxynivalenol were used. After the reaction for 5 minutes, the substrate was added and reacted again for 5 minutes. Then, the reaction was stopped and the absorbance was measured at 450 nm. The measurement results are shown in FIG. 12 and the quantitative range of the kit prepared by this method was 50 to 4000 ppb ( r 2 = 0.99).
또한 개발한 검출 킷트를 이용하여 데옥시니발레놀 유사물질과 교차반응성을 확인하였으며, 이는 표 2에 나타내었다.In addition, the developed detection kit was used to confirm cross-reactivity with deoxynivalenol analogues, which are shown in Table 2.
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 검출 킷트는 데옥시니발레놀과 유사한 물질에 대하여 교차 반응성을 나타내지 않았으며, 데옥시니발레놀에 매우 특이적이었다.
As shown in Table 2 above, the detection kit according to the present invention did not show cross-reactivity with materials similar to deoxynivalenol and was very specific for deoxynivalenol.
또한, 상기와 같이 작성한 효소면역학적 킷트를 이용하여 데옥시니발레놀 변이계수를 측정하였다. 항원코팅한 데옥시니발레놀 효소면역학적 검사법의 실험실 변이계수 측정결과는 표 3에, 항체코팅한 데옥시니발레놀 효소면역학적 검사법의 실험실 변이계수 측정결과는 표 4에 나타내었다.In addition, the deoxynivalenol mutation coefficient was measured using the enzyme immunological kit prepared as described above. The results of laboratory coefficients of variation of antigen-coated deoxynivalenol enzyme immunoassay are shown in Table 3, and the results of laboratory coefficients of variation of antibody-coated deoxynivalenol enzyme immunoassay are shown in Table 4.
-ELISAAg-DC
ELISA
(ppb)density
(ppb)
-ELISAAb-DC
ELISA
(ppb)density
(ppb)
상기 표 3 및 표 4에서 알 수 있듯이, 본 발명의 킷트 이용시 실험간 변이계수는 10 이하로 나타났다.
As can be seen in Table 3 and Table 4, the variation coefficient between experiments was 10 or less when using the kit of the present invention.
또한, 상기의 방법으로 작성된 효소면역학적 킷트를 이용하여 사료 중에 데옥시니발레놀을 첨가한 후 추출하여 측정하였다. 결과는 하기 표 5에 나타내었다.In addition, using the enzyme immunoassay kit prepared by the above method was added by deoxynivalenol in the feed and then extracted. The results are shown in Table 5 below.
상기 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 킷트를 이용하여 데옥시니발레놀의 검출 결과 실험간의 변이계수는 10% 이하이었으며 회수율은 99.8%~149.9%이었다.
As can be seen in Table 5, the detection coefficient of the deoxynivalenol using the kit according to the present invention, the coefficient of variation was less than 10% between the experiments and recovery was 99.8% to 149.9%.
Claims (4)
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100087030A KR101270710B1 (en) | 2010-09-06 | 2010-09-06 | Monoclonal antibody specifically binding to deoxynivalenol and the kit for detecting deoxynivalenol comprising thereof |
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2010
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J. Agric. Food Chem., 1995, 43 (6), pp 1740-1744. * |
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