KR101268478B1 - Composition comprising expression or activity inhibitors of DKK3 for the prevention and treatment of cancer - Google Patents
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Abstract
본 발명은 DKK3 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 H460 비소세포폐암주에서 DKK3 siRNA를 트랜스펙션한 후, 암세포의 사멸과 세포 내 활성산소 수준이 증가하는 효과를 가지므로, DKK3 단백질 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암의 예방 및 치료용 조성물 또는 항암 보조제로 유용하게 사용될 수 있다. The present invention relates to a composition for the prevention and treatment of cancer containing the expression or activity inhibitor of DKK3 protein, and more particularly, after transfection of DKK3 siRNA in H460 non-small cell lung cancer, cancer cell death and intracellular activity Since it has an effect of increasing the oxygen level, it can be usefully used as a composition for the prevention and treatment of cancer or an anticancer adjuvant containing a DKK3 protein expression or activity inhibitor.
Description
본 발명은 DKK3 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for the prevention and treatment of cancer containing a DKK3 expression or activity inhibitor.
암은 인류의 건강을 위협하는 최대의 질병 중의 하나로서, 세포가 일련의 돌연변이 과정을 거쳐, 무제한적이고 비조절적인 방식으로 증식하고 불사화 되어 발생하는 질병이다. 암 발생의 원인으로는 화학물질, 바이러스, 세균, 전리방사선 등의 환경적 또는 외적 요인과 선천성 유전자 변이 등의 내적 요인을 들 수 있다(Klaunig & Kamendulis, Annu Rev Pharmacol Toxicol., 44:239-267, 2004). Cancer is one of the greatest threats to human health, a disease that occurs when cells multiply through a series of mutations and proliferate and immortalize in an unlimited and unregulated manner. Cancer causes include environmental or external factors such as chemicals, viruses, bacteria, ionizing radiation, and internal factors such as congenital gene mutations (Klaunig & Kamendulis, Annu Rev Pharmacol Toxicol. , 44: 239-267). , 2004).
초기에 발견된 암일 경우 수술, 방사선 치료, 화학적 요법 등의 치료법이 있으나 그 부작용 또한 큰 문제로 대두하고 있으며, 말기 암이나 전이된 암의 경우 특별한 치료법 없이 시한부 인생으로 삶을 마감하는 상황이다. 또한, 암과 관련된 다양한 생화학적 기전이 규명되고 그에 따른 치료제가 개발되어 오고 있으나, 아직까지 암에 대한 근본적인 치료방법은 제시되지 않고 있다.
In the early stages of cancer, there are treatments such as surgery, radiation, and chemotherapy, but the side effects are also a big problem. In the case of terminal or metastatic cancers, life ends in a limited-time life without special treatment. In addition, various biochemical mechanisms related to cancer have been elucidated and treatments have been developed accordingly, but fundamental treatments for cancer have not been suggested.
활성 산소(reactive oxygen species, ROS)는 호흡을 하는 동안 미토콘드리아에서 생성되며, 특정 효소의 작용에 의해서 생성된다고 알려져 있다(Kamata and Hirata, Cell Signal, 1999). 낮은 수치의 ROS는 세포내의 신호를 조절하며, 정상 세포의 성장에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려졌다(Burdon, Free Radic. Biol. Med, 1995). 또한, ROS 산물이 암세포에서 증가된다는 보고가 있다Cancer Res., 1991); Burdon, 1995). 종양이 진행되는 동안 증가되는 ROS는 뉴클리어팩터 카파B(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB)와 활성 단백질 1(activator protein 1, AP-1) 전사인자의 발현을 유도시킨다고 알려져있다(Gupta et al., Carcinogenesis, 1999). 산화적 스트레스 역시 DNA의 손상을 일으켜 게놈(Genome)의 불안정을 유도하고, 이는 암이 진행되는데에 영향을 끼친다고 알려졌다(Jackson and Loeb, Mutat. Res., 2001). 따라서, ROS는 암의 발병과, 진행 그리고 유지와 관련된 여러 역할을 한다고 추정된다. 근래의 연구에 따르면, ROS는 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF)와 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF)와 같은 성장인자에 자극받은 세포에서 발생된다고 보고되었다(Bae et al., J. Biol. Chem., 1997, 2000). Reactive oxygen species (ROS) are produced in mitochondria during respiration and are known to be produced by the action of specific enzymes (Kamata and Hirata, Cell Signal , 1999). Low levels of ROS regulate intracellular signaling and are known to play an important role in normal cell growth (Burdon, Free Radic. Biol. Med , 1995). It is also reported that ROS products are increased in cancer cells Cancer Res ., 1991); Burdon, 1995). Increased ROS during tumor progression is the expression of nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) and activator protein 1 (AP-1) transcription factors. Induction (Gupta et al., Carcinogenesis, 1999). Oxidative stress also causes DNA damage, leading to genome instability, which is known to affect cancer progression (Jackson and Loeb, Mutat. Res. , 2001). Thus, ROS are believed to play several roles in the development, progression and maintenance of cancer. Recent studies have reported that ROS occur in cells stimulated by growth factors such as epidermal growth factor (EGF) and platelet-derived growth factor (PDGF) (Bae et al. , J. Biol. Chem. , 1997, 2000).
스트레스를 받지 않는 조건에서 ROS는 세포의 성장을 촉진시키는 역할을 수행하나, 세포가 스트레스를 받는 조건에서는 세포사멸을 활성화시키고, 조절한다고 알려져있다. ROS의 수치는 세포가 다양한 스트레스 물질(예를 들어, 항암제)에 노출되었을 때 증가된다(Jabs, Biochem. Pharmacol., 1999). 또한, 세포사멸 신호 조절 키나이제 1(Apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1), 씨-준-아미노말단 키나아제(c-Jun N-terminal kinase, JNK), p38과 같은 세포사멸 관련 유전자를 자극하여 세포사멸을 유도한다고 알려졌다.(Benhar et al., Mol. Cell. Biol., 2001). 그 외에도 p53을 통한 세포사멸을 유도하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져있다(Polyak et al., Nature, 1997).
ROS plays a role in promoting cell growth under stress, but it is known to activate and regulate apoptosis in conditions under stress. Levels of ROS increase when cells are exposed to various stressors (eg, anticancer agents) (Jabs, Biochem. Pharmacol. , 1999). In addition, apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1), C-Jun N-terminal kinase (JNK), and p38-related genes such as apoptosis-stimulating apoptosis-related genes It is known to induce death (Benhar et al., Mol. Cell. Biol., 2001). In addition, it is known to play an important role in inducing apoptosis through p53 (Polyak et al., Nature , 1997).
포유류에 존재하는 디코프(Dickkopf, DKK) 유전자는 배발생 및 조직발달 등을 조절하는 세포 외 신호전달 물질의 일종으로 알려져 있다. 현재 DKK1, DKK2, DKK3, DKK4의 4종류의 DKK 유전자가 알려져 있으며, 이들은 윈트/베타 카테닌(Wnt/β-catenin) 신호전달의 억제제로서 연구가 활발히 이루어졌다. Dickkopf (DKK) genes present in mammals are known as a kind of extracellular signaling substances that regulate embryonic development and tissue development. Currently, four types of DKK genes are known, DKK1, DKK2, DKK3, and DKK4, and they have been actively studied as inhibitors of Wnt / β-catenin signaling.
4종류의 DKK 유전자 중에서, DKK3는 잠재적인 Wnt 저해제로서 알려졌으며, 폐암 세포주와 같은 인간 암세포에서 일반적으로 저(低)발현되어 잠재적인 암억제유전자로 인식되고 있다. 여러 종류의 암에서, 이러한 DKK3의 저발현은 DKK3의 프로모터(promoter) 부위에 존재하는 CpG 섬의 메틸화(methylation)에 기인하는 것으로 알려져 있으며, DKK3에 관한 대부분의 연구는 이러한 메틸화에 집중되어 있다. 그러나 암세포라도 그 종류에 따라 DKK3가 완전히 억제되어 있지 않아 일부 발현되고 있으며, 특히 DKK3의 저발현을 완전히 억제시키는 연구 및 DKK3의 발현 억제로 발생하는 세포 내 독성의 원인 및 신호전달 과정에 대한 연구는 이루어지지 않고 있는 실정이다.
Of the four types of DKK genes, DKK3 is known as a potential Wnt inhibitor and is generally low expressed in human cancer cells such as lung cancer cell lines and is recognized as a potential cancer suppressor gene. In many cancers, this low expression of DKK3 is known to be due to the methylation of CpG islands present in the promoter site of DKK3, and much of the research on DKK3 is focused on this methylation. However, even cancer cells are partially expressed because DKK3 is not completely suppressed according to their type. Especially, studies on completely suppressing the low expression of DKK3 and on the cause and signal transduction process of intracellular toxicity caused by inhibition of DKK3 expression are It is not happening.
이에 본 발명자들은 DKK3가 여전히 발현되고 있는 H460 비소세포폐암주에서 DKK3 siRNA를 트랜스펙션한 후, DKK3의 발현을 완전히 억제하였으며, 이 트랜스펙션된 H460 비소세포폐암주에서 세포사멸과 세포 내 활성산소 수준이 증가하는 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors transfected DKK3 siRNA in H460 non-small cell lung cancer still expressing DKK3, and completely inhibited the expression of DKK3, and apoptosis and intracellular activity in the transfected H460 non-small cell lung cancer. By confirming the effect of increasing oxygen levels, the present invention has been completed.
본 발명의 목적은 DKK3 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
An object of the present invention is to provide a composition for the prevention and treatment of cancer containing inhibitors of the expression or activity of DKK3 protein.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DKK3 단백질 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for preventing and treating cancer containing DKK3 protein expression or activity inhibitor.
또한, 본 발명은 DKK3 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 항암 보조제를 제공한다. The present invention also provides an anticancer adjuvant containing an inhibitor of expression or activity of DKK3 protein.
아울러, 본 발명은 암의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
In addition, the present invention provides a method for screening a composition for preventing or treating cancer.
본 발명의 DKK3 단백질 발현 또는 활성 억제제는 DKK3의 발현을 억제시키며, 비소세포폐암 H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 세포사멸이 관찰되며, 세포사멸 관련 단백질의 발현 증가와 더불어 세포 내부의 ROS가 증가되는 효과를 가지므로, DKK3 단백질 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암의 예방 및 치료용 조성물 또는 항암 보조제로 유용하게 사용될 수 있다.
The DKK3 protein expression or activity inhibitor of the present invention inhibits the expression of DKK3, and after transfection of DKK3 siRNA into non-small cell lung cancer H460 cells, apoptosis is observed, and with increased expression of apoptosis-related proteins, Since ROS has an effect of increasing, it can be usefully used as a composition for preventing and treating cancer or anticancer adjuvant containing DKK3 protein expression or activity inhibitor.
도 1은 비소세포폐암 H460 세포의 메틸화 측정과 DKK3 siRNA를 트랜스펙션한 후, DKK3의 발현억제를 확인한 그림이다:
도 1의 A는 비소세포폐암 H460 세포에 존재하는 DKK3 유전자의 메틸화를 측정한 그림이다;
도 1의 B는 비소세포폐암 H460 세포에 음성 대조군인 (negative control, NC) NC siRNA와 DKK3의 발현을 억제시키는 DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, DKK3의 발현을 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 이용하여 확인한 그림이다;
H460: 비소세포폐암 H460 세포;
H460/NC: H460 세포에 대조군인 NC siRNA를 트랜스펙션한 군; 및
H460/SiDKK3: H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션한 군.
도 2는 DKK3 단백질 발현 억제 후, 세포의 성장 저해를 나타낸 그림이다:
도 2의 A는 H460 세포에 NC siRNA, DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 세포의 형태를 관찰한 그림이다;
H460: 비소세포폐암 H460 세포;
H460/NC: H460 세포에 대조군인 NC siRNA를 트랜스펙션한 군;
H460/SiDKK3: H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션한 군;
도 2의 B는 H460 세포에 NC siRNA, DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 생존세포의 분획에서 세포를 카운팅한 그래프이다;
●: 비소세포폐암 H460 세포;
○: H460 세포에 대조군인 NC siRNA를 트랜스펙션한 군;
■: H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션한 군;
도 2의 C는 H460 세포에 NC siRNA, DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 세포생존율을 확인한 그래프이다;
●: 비소세포폐암 H460 세포;
○: H460 세포에 대조군인 NC siRNA를 트랜스펙션한 군;
■: H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션한 군;
도 2의 D는 H460 세포에 NC siRNA, DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 콜로니 형성을 측정한 그림이다;
H460: 비소세포폐암 H460 세포;
H460/NC: H460 세포에 대조군인 NC siRNA를 트랜스펙션한 군;및
H460/SiDKK3: H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션한 군.
도 3은 H460 세포에 NC siRNA, DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 유세포 분석을 나타낸 그래프이다:
H460: 비소세포폐암 H460 세포;
H460/NC: H460 세포에 대조군인 NC siRNA를 트랜스펙션한 군;및
H460/SiDKK3: H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션한 군.
도 4는 H460 세포에 NC siRNA, DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 세포사멸 관련 단백질의 발현과 ROS 수치를 나타낸 그림이다:
도 4의 A는 H460 세포에 NC siRNA, DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 세포사멸 관련 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 이용하여 나타낸 그림이다;
H460: 비소세포폐암 H460 세포;
H460/NC: H460 세포에 대조군인 NC siRNA를 트랜스펙션한 군;
H460/SiDKK3: H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션한 군;
도 4의 B는 H460 세포에 NC siRNA, DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, H460 세포내의 ROS 수치의 변화를 확인한 그래프이다;
H460: 비소세포폐암 H460 세포;
H460/NC: H460 세포에 대조군인 NC siRNA를 트랜스펙션한 군;및
H460/SiDKK3: H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션한 군.Figure 1 shows the methylation measurement of non-small cell lung cancer H460 cells and the transfection of DKK3 siRNA, and confirm the expression inhibition of DKK3:
Figure 1 A is a measure of the methylation of the DKK3 gene present in non-small cell lung cancer H460 cells;
FIG. 1B shows a transtranscription polymerase chain reaction of DKK3 after transfection of a negative control (NC) NC siRNA and a DKK3 siRNA that inhibits DKK3 expression in non-small cell lung cancer H460 cells. Figures confirmed using Polymerase Chain Reaction (RT-PCR);
H460: non-small cell lung cancer H460 cells;
H460 / NC: group that transfected H460 cells with NC siRNA as a control; And
H460 / SiDKK3: group transfected with DKK3 siRNA to H460 cells.
Figure 2 shows the inhibition of cell growth after DKK3 protein expression inhibition:
FIG. 2A is a diagram illustrating the morphology of cells after transfection of NC siRNA and DKK3 siRNA to H460 cells; FIG.
H460: non-small cell lung cancer H460 cells;
H460 / NC: group that transfected H460 cells with NC siRNA as a control;
H460 / SiDKK3: group transfected with DKK3 siRNA to H460 cells;
2B is a graph counting cells in the fraction of viable cells after transfection of NC siRNA, DKK3 siRNA to H460 cells;
●: non-small cell lung cancer H460 cells;
○: group transfected with NC siRNA as a control group to H460 cells;
■: group transfected with DKK3 siRNA to H460 cells;
2C is a graph confirming cell viability after transfecting NC siRNA and DKK3 siRNA to H460 cells;
●: non-small cell lung cancer H460 cells;
○: group transfected with NC siRNA as a control group to H460 cells;
■: group transfected with DKK3 siRNA to H460 cells;
Figure 2 D is a picture of measuring colony formation after transfection of NC siRNA, DKK3 siRNA to H460 cells;
H460: non-small cell lung cancer H460 cells;
H460 / NC: group transfected with NC siRNA as a control to H460 cells; and
H460 / SiDKK3: group transfected with DKK3 siRNA to H460 cells.
3 is a graph showing flow cytometry after transfection of NC siRNA, DKK3 siRNA to H460 cells:
H460: non-small cell lung cancer H460 cells;
H460 / NC: group transfected with NC siRNA as a control to H460 cells; and
H460 / SiDKK3: group transfected with DKK3 siRNA to H460 cells.
4 is a diagram showing the expression of apoptosis-related proteins and ROS levels after transfection of NC siRNA and DKK3 siRNA into H460 cells:
4A is a diagram showing the expression of apoptosis-related proteins after transfection of NC siRNA and DKK3 siRNA to H460 cells using Western blot;
H460: non-small cell lung cancer H460 cells;
H460 / NC: group that transfected H460 cells with NC siRNA as a control;
H460 / SiDKK3: group transfected with DKK3 siRNA to H460 cells;
4B is a graph confirming changes in ROS levels in H460 cells after transfection of NC siRNA and DKK3 siRNA to H460 cells;
H460: non-small cell lung cancer H460 cells;
H460 / NC: group transfected with NC siRNA as a control to H460 cells; and
H460 / SiDKK3: group transfected with DKK3 siRNA to H460 cells.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 DKK3 단백질 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. The present invention provides compositions for the prevention and treatment of cancer containing DKK3 protein expression or activity inhibitors.
상기 DKK3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 특징인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The DKK3 protein is preferably characterized by an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
상기 DKK3 단백질의 발현 억제제는 DKK3 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. Preferably, the expression inhibitor of the DKK3 protein is any one selected from the group consisting of antisense nucleotides, small interfering RNAs, and short hairpin RNAs, which complementarily bind to mRNA of the DKK3 gene. However, the present invention is not limited thereto.
상기 DKK3 단백질의 활성 억제제는 DKK3 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지 않는다. The activity inhibitor of the DKK3 protein is any one selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, aptamers and antibodies that specifically bind to DKK3 protein, but is not limited thereto.
상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고 간암, 대장암, 폐암 또는 대장암인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
The cancer is preferably any one selected from the group consisting of liver cancer, colon cancer, cervical cancer, kidney cancer, gastric cancer, prostate cancer, breast cancer, brain tumor, lung cancer, uterine cancer, colon cancer, bladder cancer, blood cancer and pancreatic cancer. More preferably, but not limited to colorectal cancer, lung cancer or colorectal cancer.
안티센스Antisense 뉴클레오티드 Nucleotide
안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al ., J. Natl. Cancer Inst ., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
Antisense nucleotides, as defined in Watson-click base pairs, bind (hybridize) the complementary sequences of DNA, immature-mRNA or mature mRNA to disrupt the flow of genetic information as a protein in DNA. The nature of antisense nucleotides that are specific for the target sequence makes them exceptionally multifunctional. Since antisense nucleotides are long chains of monomeric units they can be easily synthesized for the target RNA sequence. Many recent studies have demonstrated the utility of antisense nucleotides as a biochemical means for studying target proteins (Rothenberg et al ., J. Natl. Cancer Inst . , ≪ / RTI > 81: 1539-1544, 1999). The use of antisense nucleotides can be considered as a novel type of inhibitor since there has been much progress in the field of oligonucleotide chemistry and in the field of nucleotide synthesis showing improved cell adsorption, target binding affinity and nuclease resistance.
펩티드 미메틱스(Peptide mimetics ( PeptidePeptide MineticsMinetics ))
상기 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)는 DKK3 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드로서 DKK3 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 비가수분해성 펩티드 유사체의 주요 잔기로는 β-턴 디펩티드 코어(Nagai et al . Tetrahedron Lett 26:647, 1985), 케토-메틸렌 슈도펩티드류(Ewenson et al . J Med Chem 29:295, 1986; 및 Ewenson et al . in Peptides: Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), 아제핀(Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 벤조디아제핀(Freidinger et al . in Peptides; Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), β-아미노알콜(Gordon et al . Biochem Biophys Res Commun 126:419 1985) 및 치환 감마 락탐환(Garvey et al . in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshell ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988)을 사용하여 생성할 수 있다.
Peptide Minetics are peptides or non-peptides that inhibit the binding domain of DKK3 protein and inhibit the activity of DKK3 protein. Major residues of non-hydrolyzable peptide analogs include β-turn dipeptide cores (Nagai et. al . Tetrahedron Lett 26: 647, 1985), keto-methylene pseudopeptides (Ewenson et al . J Med Chem 29: 295, 1986; And Ewenson et al . in Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), Azepine (Huffman et al . in Peptides: Chemistry and Biology, GR Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), benzodiazepines (Freidinger et al . in Peptides; Chemistry and Biology, GR Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), β-aminoalcohol (Gordon et al . Biochem Biophys Res Commun 126: 419 1985) and substituted gamma lactam ring (Garvey et al . in Peptides: Chemistry and Biology, GR Marshell ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988).
siRNAsiRNA 분자 molecule
센스 RNA와 안티센스 RNA가 이중가닥 RNA 분자를 형성하고, 이때 센스 RNA가 DKK3 mRNA 중 일부의 연속 뉴클레오티드의 표적 서열과 동일한 핵산 서열을 포함하는 siRNA 분자인 것이 바람직하다. 상기 siRNA 분자는 DKK3 유전자의 염기서열 내에서 선택되는 10개 내지 30개의 염기로 구성되는 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정된 것은 아니며, DKK3 유전자의 염기서열을 대상으로 상보적으로 결합할 수 있는 센스 서열을 가진 이중가닥 RNA 분자라면 모두 사용 가능하다. 상기 안티센스 서열은 센스 서열과 상보적인 서열을 가지는 것이 가장 바람직하다.
The sense RNA and the antisense RNA form a double stranded RNA molecule, wherein the sense RNA is preferably an siRNA molecule comprising a nucleic acid sequence identical to the target sequence of a continuous nucleotide of some of the DKK3 mRNA. The siRNA molecule is preferably composed of a sense sequence consisting of 10 to 30 bases selected from the base sequence of the DKK3 gene and an antisense sequence complementarily binding to the sense sequence, but is not limited thereto. Any double-stranded RNA molecule having a sense sequence capable of complementarily binding to a nucleotide sequence can be used. Most preferably, the antisense sequence has a sequence complementary to the sense sequence.
항체Antibody
상기 항 DKK3 항체는 항 DKK3의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다.The anti-DKK3 antibody can be prepared by the injection of anti-DKK3 or commercially available. In addition, the antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, fragments capable of binding epitopes, and the like.
다클론 항체는 상기 DKK3를 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다.Polyclonal antibodies can be produced by conventional methods of injecting the DKK3 into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum containing the antibody. Such polyclonal antibodies can be purified by any method known in the art and can be made from any animal species host, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, cattle, dogs and the like.
단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al ., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984).Monoclonal antibodies can be prepared using any technique that provides for the generation of antibody molecules through the cultivation of continuous cell lines. Such techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human B-cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (Kohler G et. al ., Nature 256: 495-497, 1975; Kozbor D et al . , J Immunol Methods 81: 31-42, 1985; Cote RJ et al. Proc Natl Acad Sci 80: 2026-2030, 1983; And Cole SP et al ., Mol Cell Biol 62: 109-120, 1984).
또한, 상기 DKK3에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작게 하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al ., Science 254: 1275-1281, 1989). In addition, antibody fragments containing specific binding sites for the DKK3 can be prepared. For example, F (ab ') 2 fragments can be prepared by digesting antibody molecules into pepsin, and Fab fragments can be prepared by reducing disulfide bridges of F (ab') 2 fragments, although not limited thereto. Alternatively, the Fab expression library can be made smaller to quickly and easily identify monoclonal Fab fragments with the desired specificity (Huse WD et. al . , Science 254: 1275-1281, 1989).
상기 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.
The antibody may be bound to a solid substrate to facilitate subsequent steps such as washing or separation of the complex. Solid substrates include, for example, synthetic resins, nitrocellulose, glass substrates, metal substrates, glass fibers, microspheres and micro beads. The synthetic resin includes polyester, polyvinyl chloride, polystyrene, polypropylene, PVDF, and nylon.
앱타머Aptamer ( ( AptamerAptamer ))
앱타머 (Aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 압타머는 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 압타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후(Ellington, AD and Szostak, JW., Nature 346:818-822, 1990), 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 앱타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 앱타머는 고유의 높은 친화성 (보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특히 “화학 항체”라고 할 만큼 대체항체로서의 높은 가능성이 있다.
Aptamers are single-stranded nucleic acids (DNA, RNA or modified nucleic acids) which, by themselves, have a stable tertiary structure and are capable of binding to target molecules with high affinity and specificity. Aptamers have been developed since the first development of the aptamer excavation technology called SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) (Ellington, AD and Szostak, JW., Nature 346: 818-822, 1990). Many aptamers have been unearthed that can bind to various target molecules. Aptamers are often compared with monoclonal antibodies due to their inherent high affinity (usually pM levels) and their ability to bind to target molecules with specificity, and there is a high likelihood of being an alternative antibody, particularly as a "chemical antibody".
본 발명의 한가지 실험예에서 H460 세포에 존재하는 DKK3 유전자의 메틸화 정도를 조사하였을 때, 평균 44%의 메틸화(methylation)가 관찰되었으며, DKK3 siRNA를 H460 세포에 트랜스펙션시킨 후, DKK3의 발현이 완전히 억제되었다(도 1 참조).In one experimental example of the present invention, when examining the degree of methylation of the DKK3 gene present in H460 cells, an average of 44% methylation was observed. After transfecting the DKK3 siRNA to H460 cells, the expression of DKK3 was decreased. Completely inhibited (see FIG. 1).
본 발명의 한가지 실험예에서 H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 세포 사멸을 관찰한 결과, 세포가 정상적으로 컬쳐 플레이트(culture plate)에 붙어서 자라지 못하고, 대조군 NC siRNA를 트랜스펙션했을 때보다 배지의 상층액에 부유하고 있는 세포 수가 증가하였다(도 2의 A 및 B 참조). 또한, 세포 생존율을 MTT assay를 이용하여 측정한 결과, DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 군에서 세포의 생존율이 많이 감소됨을 확인할 수 있었다(도 2의 C 참조). 아울러, H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 콜로니 형성(colony forming assay)을 확인한 결과 세포의 형성이 정상적으로 이루어지지 않고 있음을 확인할 수 있었다(도 2의 D 참조).In one experimental example of the present invention, after transfecting DKK3 siRNA to H460 cells, the cell death was observed. As a result, the cells did not normally attach to the culture plate and did not grow, compared with the control NC siRNA. The number of cells suspended in the supernatant of the medium increased (see A and B in FIG. 2). In addition, as a result of measuring the cell viability using the MTT assay, it was confirmed that the survival rate of cells in the group transfected with DKK3 siRNA is significantly reduced (see FIG. 2C). In addition, after transfecting the DKK3 siRNA to H460 cells, colony forming assay confirmed that the cells were not formed normally (see FIG. 2D).
본 발명의 한가지 실험예에서 H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 유세포 분석을 한 결과, H460 세포군과, H460 세포에 NC siRNA를 트랜스펙션시킨 군보다 DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 군에서 세포사멸이 일어나며, 트랜스펙션 3일 후에 각 군의 차이가 가장 크게 나타남을 확인할 수 있었다(도 3 참조).In one experimental example of the present invention, after transfecting DKK3 siRNA to H460 cells and performing flow cytometry, the H460 cell group and the group transfected with DKK3 siRNA than the group transfected with NC siRNA to H460 cells. Apoptosis occurred, and after 3 days of transfection, it was confirmed that the difference between each group was greatest (see FIG. 3).
본 발명의 한가지 실험예에서 H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 세포사멸 관련 단백질의 발현을 비교한 결과, 싸이클린 D(Cyclin D), 싸이클린 E(Cycliln E), p53, p21 및 백스(Bax)의 발현이 H460 세포군과 H460 세포에 NC siRNA를 트랜스펙션시킨 군에 비해서 확연히 증가됨을 관찰할 수 있었다(도 4의 A 참조). 또한, H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 세포내의 ROS를 측정한 결과, ROS 수준이 H460 세포군과 H460 세포에 NC siRNA를 트랜스펙션시킨 군에 비해서 증가함을 확인할 수 있었다(도 4의 B 참조).In one experimental example of the present invention, after transfecting DKK3 siRNA to H460 cells and comparing the expression of apoptosis related proteins, Cyclin D, Cycliln E, p53, p21 and Bax ( It was observed that Bax) expression was significantly increased as compared with the H460 cell group and the NC siRNA transfected group to H460 cells (see FIG. 4A). In addition, after transfecting the DKK3 siRNA to H460 cells, the intracellular ROS was measured, and it was confirmed that the ROS level was increased compared to the H460 cell group and the NC siRNA transfected group to H460 cells (FIG. 4). B).
따라서, H460 비소세포폐암주에서 DKK3 siRNA를 트랜스펙션한 후, DKK3의 발현은 완전히 억제되었으며, 암세포의 사멸과 세포내 ROS 수준이 증가되는 효과를 가지므로, DKK3 단백질 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, after transfection of DKK3 siRNA in H460 non-small cell lung cancer line, expression of DKK3 was completely inhibited and had an effect of increasing cancer cell death and intracellular ROS levels, and thus containing a DKK3 protein expression or activity inhibitor. It can be usefully used as a composition for the prevention and treatment of cancer.
상기 조성물은 DKK3의 발현 또는 활성 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있다. The composition may contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar function in addition to the expression or activity inhibitor of DKK3.
상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.The composition can be administered orally or parenterally during clinical administration and intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intrauterine dural injection, cerebrovascular injection or intrathoracic injection during parenteral administration. And can be used in the form of general pharmaceutical formulations.
상기 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.The composition can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers.
상기 조성물의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. The daily dosage of the composition is about 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg, preferably administered once or several times a day, but the weight, age, sex, health, diet of the patient The range varies depending on the time of administration, the method of administration, the rate of excretion and the severity of the disease.
본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
The composition of the present invention may be administered in various parenteral formulations during actual clinical administration, when formulated using a diluent or excipient such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc., which are commonly used. do. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories. Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used as the non-aqueous solvent and suspension agent. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol,
또한, 본 발명은 DKK3 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 항암 보조제를 제공한다. The present invention also provides an anticancer adjuvant containing an inhibitor of expression or activity of DKK3 protein.
상기 DKK3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The DKK3 protein preferably has an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
상기 DKK3 단백질의 발현 억제제는 DKK3 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The inhibitor of expression of the DKK3 protein is DKK3 It is preferably one selected from the group consisting of antisense nucleotides, short interfering RNAs, and short hairpin RNAs, which complementarily bind to mRNA of a gene, but are not limited thereto.
상기 DKK3 단백질의 활성 억제제는 DKK3 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The activity inhibitor of the DKK3 protein is preferably any one selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, aptamers, and antibodies that complementarily bind to DKK3 protein, but is not limited thereto.
상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고 간암, 대장암, 폐암 또는 대장암인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The cancer is preferably any one selected from the group consisting of liver cancer, colon cancer, cervical cancer, kidney cancer, gastric cancer, prostate cancer, breast cancer, brain tumor, lung cancer, uterine cancer, colon cancer, bladder cancer, blood cancer and pancreatic cancer. More preferably, but not limited to colorectal cancer, lung cancer or colorectal cancer.
본 발명의 한가지 실험예에서 H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 세포가 정상적으로 컬쳐 플레이트에 붙어서 자라지 못하고, 배지의 상층액에 부유하고 있는 세포 수가 증가하였고(도 2의 A 및 B 참조), 또한, 세포 생존율이 많이 감소됨을 확인할 수 있었다(도 2의 C 및 도 3 참조). 또한, H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 콜로니 형성이 정상적으로 이루어지지 않고 있음을 확인할 수 있었다(도 2의 D 참조). 또한, H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 세포사멸 관련 단백질의 발현이 증가하였다(도 4 참조). 또한, H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 세포 내의 ROS를 측정한 결과, ROS 수준이 H460 세포군과 H460 세포에 NC siRNA를 트랜스펙션시킨 군에 비해서 증가함을 확인할 수 있었다(도 4 참조).In one experimental example of the present invention, after transfecting DKK3 siRNA to H460 cells, the cells did not grow and adhere to the culture plate normally, and the number of cells suspended in the supernatant of the medium increased (see FIGS. 2A and 2B). In addition, it was confirmed that the cell viability is greatly reduced (see FIG. 2C and FIG. 3). In addition, after transfection of DKK3 siRNA to H460 cells, it was confirmed that colony formation was not normal (see FIG. 2D). In addition, after transfection of DKK3 siRNA to H460 cells, expression of apoptosis-related proteins increased (see FIG. 4). In addition, after transfecting the DKK3 siRNA to H460 cells, the ROS levels were measured in the cells. As a result, the ROS level was increased compared to the H460 cell group and the NC siRNA transfected group to H460 cells (FIG. 4). Reference).
따라서, H460 비소세포폐암주에서 DKK3 siRNA를 트랜스펙션한 후, DKK3의 발현은 완전히 억제되었으며, 암세포의 사멸과 세포 내 ROS 수준이 증가하는 효과를 가지므로, DKK3 단백질 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 항암 보조제로 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, after transfection of DKK3 siRNA in H460 non-small cell lung cancer, expression of DKK3 was completely inhibited and had an effect of increasing the death of cancer cells and intracellular ROS levels, and thus containing a DKK3 protein expression or activity inhibitor. It can be usefully used as an anticancer adjuvant.
아울러, 본 발명은 암의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for screening a composition for preventing or treating cancer.
본 발명의 암의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법은 하기의 단계들을 포함하는 방법인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:The method for screening a composition for preventing or treating cancer of the present invention is preferably, but not limited to, a method comprising the following steps:
1) 실험군으로서 암 세포에 피검물질을 처리하는 단계; 1) treating a test substance to cancer cells as an experimental group;
2) 상기 단계 1)의 처리된 세포에서 DKK3 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및2) measuring the expression level of DKK3 protein in the treated cells of step 1); And
3) 단계 2)의 DKK3 단백질 발현량이 대조군과 비교하여 감소된 피검물질을 선별하는 단계. 3) selecting the test substance whose DKK3 protein expression level in step 2) is reduced compared to the control group.
본 발명의 암의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법에 있어서, 단계 2)의 DKK3 단백질의 발현 정도는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
In the screening method for the composition for preventing or treating cancer of the present invention, the expression level of DKK3 protein in step 2) is reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), enzyme immunoassay (ELISA). , Immunohistochemistry, Western blotting and flow cytometry (FACS) is preferably measured by any one selected from the group consisting of, but not limited to.
이하, 본 발명을 실험예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기의 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실험예 및 제조예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by the experimental and production examples. However, the following Experimental Examples and Preparation Examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following Experimental Examples and Preparation Examples.
<실험예 1> H460 세포의 메틸화 측정과 DKK3 발혁 억제Experimental Example 1 Measurement of Methylation of H460 Cells and Inhibition of DKK3 Development
<1-1> H460 비소세포폐암 세포주의 배양<1-1> Culture of H460 Non-Small Cell Lung Cancer Cell Line
H460 비소세포폐암(non-small cell lung cancer) 세포주(American Type Culture Collection, USA)는 RPMI-1640 배지(Hyclone Laboratories, USA)에 10% 우태아 혈정(Hyclone Laboratories)과 100 U/㎖ 페니실린(penicillin)과 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)을 혼합하여 배양하였다. 세포는 37℃ 배양기에 5% CO2 조건에서 유지하였으며, 세포는 6웰 플레이트에 1×105cell의 수로 심은후 배양하였다.
H460 non-small cell lung cancer cell line (American Type Culture Collection, USA) was cultured in 10% Fetal Laboratories and 100 U / ml penicillin in RPMI-1640 medium (Hyclone Laboratories, USA). ) And 100 μg / ml streptomycin were cultured by mixing. Cells were maintained at 37 ° C. incubator at 5% CO 2 , and the cells were planted in 6-well plates with 1 × 10 5 cells and cultured.
<1-2> CpG 섬의 메틸화 측정<1-2> Methylation of CpG Island
DKK3의 메틸화(methylation)를 확인하기 위하여, 세포에서 DNA를 얻은 후, 바이설파이트-모디파이드 게놈 디엔에이(Bisulfite-modified genomic DNA, gDNA)를 만들기 위하여 EZ DNA Methylation-Gold Kit(Zymo Research, USA)를 이용하였다. EZ DNA Methylation-Gold Kit (Zymo Research, USA) to obtain DNA from cells to confirm methylation of DKK3, and then to make Bisulfite-modified genomic DNA (gDNA) Was used.
바이설파이트 반응을 하기 위하여, 400 ng의 genomic DNA (gDNA)와 130㎕ CT conversion 시약을 샘플 튜브에 넣고, 써멀 사이클로(thermal cycler)(MJ Research, USA)에서 반응시킨다. 반응의 조건은 98℃에서 10분, 64℃에서 2시간 30분을 반응 시킨후, 4℃에 보관한다. 반응이 끝난 DNA는 EZ DNA Methylation-Gold kit(Zymo Research)를 이용하여 정제하였다. 정제된 샘플은 600 ㎕의 M-binding 버퍼가 들어있는 Zymo-Spin IC colum(컬럼)에 넣고, 흔들어준다. Zymo-Spin IC 컬럼을 30 초간 원심분리한 뒤, 컬럼에 200 ㎕ M-wash 버퍼를 넣고 30 초간 원심분리한 뒤, 200 ㎕ M-desulphonation 버퍼를 컬럼에 넣고 상온(20~30℃)에서 15분~20분 정도 반응시킨다. 반응이 끝난 후, 컬럼을 30 초간 원심분리한 뒤, 마지막으로 200 ㎕ M-wash 버퍼를 넣고 30 초간 원심분리하였으며, 버퍼를 완전히 제거하기 위하여, 한번 더 원심분리를 시행하였다. 반응을 통해서 생성된 gDNA를 20 ㎕의 M-elution 버퍼를 컬럼에 넣어서 용해하여 획득하였다. 실험에 사용하기전 gDNA는 -20℃에 보관하였다. To perform the bisulfite reaction, 400 ng of genomic DNA (gDNA) and 130 μl CT conversion reagent are placed in a sample tube and reacted in a thermal cycler (MJ Research, USA). The reaction conditions are 10 minutes at 98 ℃, 2
메틸화를 측정하기 위하여, 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 이용하였다. 상기 제조된 gDNA를 주형으로 삼아 중합 효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 20ng 의 gDNA에 10×Taq buffer 5 ㎕, Hot/Start Taq polymerase(Enzynomics, Korea) 5U, 각각의 dNTP(2.5 mM) 혼합물 4 ㎕, 10 pmol/ 프라이머-S (서열번호 2: 5'-GGA GGG GTT AGG GTT TGA AT-3') 2 , 10 pmol/ biotinylated-프라이머-As (서열번호 3: 5'-biotin-TCR AAC ACA AAC TAA ACT CTA CTC CT-3') 2 를 넣어 총 부피가 50 ㎕가 되도록 남은 부피를 증류수로 채워 넣었다. PCR의 조건은 95℃에서 15 분후, 45 싸이클을 95℃에서 40초, 55℃에서 40초 72℃에서 40초 반응을 한후, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. PCR산물 5 ㎕은 3% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 에티디움 브로마이드(ethidium bromide, EtBr) 스테이닝을 이용하여 확인하였다. 20~25 ㎕의 상기 PCR 산물을 스트렙타비딘 세파로즈 HP 비드(streptavidin Sepharose HP beads)(Amersham Biosciences, Sweden)를 PSQ 96 sample preparation guide에 기재된 방법에 따라 멀티채널 파이펫(multichannel pipettes)을 이용하여 단일가닥 DNA(single-strand DNA, ssDNA)으로 만들었다. In order to measure the methylation, it was used for sequencing (pyrosequencing) Pyro. Using the prepared gDNA as a template A polymerase chain reaction (PCR) was performed. 5 μl of 10 × Taq buffer in 5 ng gDNA, 5 U of Hot / Start Taq polymerase (Enzynomics, Korea), 4 μl of each dNTP (2.5 mM) mixture, 10 pmol / primer-S (SEQ ID NO: 2: 5′-GGA GGG) GTT AGG GTT TGA AT-3 ') 2, 10 pmol / biotinylated-primer-As (SEQ ID NO: 3: 5'-biotin-TCR AAC ACA AAC TAA ACT CTA CTC CT-3') 2 The remaining volume was filled with distilled water. PCR conditions were 15 minutes at 95 ℃, 45 cycles were reacted for 40 seconds at 95 ℃, 40 seconds at 55 ℃ 40 seconds at 72 ℃, and finally reacted for 10 minutes at 72 ℃. 5 μl of PCR product was identified using ethidium bromide (EtBr) staining on a 3% agarose gel. 20-25 μl of the PCR product was prepared using multichannel pipettes according to the method described in PSQ 96 sample preparation guide using streptavidin Sepharose HP beads (Amersham Biosciences, Sweden). It was made from single-strand DNA (ssDNA).
PSQ 96 sample preparation guide에 기재된 방법에 따라 우선 PSQ 96 웰 플레이트 low에 1×어닐링버퍼(annealing buffer)[조성: 20 mM 트리스(Tris), 2 mM 마그네슘 아세테이트(magnesium acetate)] 40 ㎕와 100 pmole/㎕의 시퀀싱 프라이머(5'-GGG GTT TGG GAG TTA TT-3') 0.12 ㎕의 혼합액을 각 웰당 40 ㎕씩 분주하였다. 새로운 96 웰 PCR 플레이트에 2×바인딩 버퍼(binding buffer) 37 ㎕와 스트렙타비딘 세파로즈(streptavidin sepharose) 비드 3㎕를 넣었다. 바이오틴이 표지된 PCR 산물 40 ㎕를 스트렙타비딘 혼합액에 넣고 5분간 흔들었다. Vacuum prep workstation 장치에 있는 프로브(probe)를 진공 펌프를 이용하여 증류수로 1회 세척하고, 상기 바이오틴이 표지된 PCR 산물과 스트렙타비딘 비드의 혼합물을 포착하였다. 비드 혼합물이 결합된 프로브를 70% 에탄올로 1회 세척하고, 순차적으로 변성(denaturation)용액[조성: 0.2M 소디윰 하이드록사이드(sodium hydroxide)], ㅅ세척 버퍼[조성: 10 mM 트리스, pH 7.6] 및 3차 증류수로 세척하였다. 1×어닐링버퍼가 들어있는 PSQ 96 웰 플레이트에 프로브에 붙어있는 비드 혼합물을 교반하여 옮겼다. 비드 혼합물과 1×어닐링버퍼가 있는 PSQ 96 웰 플레이트를 80℃에서 2분간 가열하였다. According to the method described in the PSQ 96 sample preparation guide, first, 40 μl of 1 × annealing buffer (composition: 20 mM Tris, 2 mM magnesium acetate) and 100 pmole / 0.12 μl of a mixture of 5 μl of sequencing primer (5′-GGG GTT TGG GAG TTA TT-3 ′) was dispensed at 40 μl per well. 37
Pyro Gold reagents kit (Biotage, Charlottesville, VA, USA)를 이용하였으며, 15 pmol의 각각의 시퀀싱 프라이머(서열번호: 2, 3, 4)를 넣어 단일가닥 DNA를 PyroMark ID 시스템을 이용하여 분석하였다. Pyro Gold reagent kit에 포함되어 있는 기ㅈ질(S), 효소(E), dATP (A), dCTP (C), dGTP (G), dTTP (T)를 카트리지(cartridge)의 해당 되는 구역에 피펫팅하였다. 준비된 PSQ 96 웰 플레이트와 카트리지를 PyroMark ID 기기에 넣고, Pyro-Q-CpG 소프트웨어를 구동하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 수행하였다. 그 뒤, CpG의 메틸화는 파이로시퀀싱에서 5 또는 6번째 CpG의 메틸화를 평균적으로 계산하여 메틸화된 정도를 확인하였다. Pyro Gold reagents kit (Biotage, Charlottesville, VA, USA) was used, and 15 pmol of each sequencing primer (SEQ ID NO: 2, 3, 4) was added to analyze single-stranded DNA using the PyroMark ID system. Pipette the substrate (S), enzyme (E), dATP (A), dCTP (C), dGTP (G) and dTTP (T) included in the Pyro Gold reagent kit into the appropriate area of the cartridge. Was put on. The prepared PSQ 96 well plates and cartridges were placed in a PyroMark ID instrument, and pyrosequencing was performed by running Pyro-Q-CpG software. Subsequently, methylation of CpG was calculated on average by methylation of the fifth or sixth CpG in pyro sequencing to confirm the degree of methylation.
그 결과, 도 1의 A에 나타난 바와 같이, DKK3의 121~240번 뉴클레오티드의 164, 175, 181 및 193번의 CpG사이트(DKK3 121 ~ 240nt, y: CpG 사이트, 서열번호 5: tyggggatag agtttaggtg agttggggtt tgggagttat tag y gtagag gatt y gggtt y ggttttttt gg y gagggtt ttagtattat aggtgaggag tagagtttag tttgtgttyg)에서 메틸화가 관찰되며, 평균적으로 44% 정도가 발현되고 있음을 확인하였다(도 1의 A).
As a result, as shown in FIG. 1A, 164, 175, 181 and 193 CpG sites (DKK3 121 to 240nt, y: CpG site, SEQ ID NO: 5: tyggggatag agtttaggtg agttggggtt tgggagttat tag of nucleotides 121 to 240 of DKK3) y gtagag gatt y gggtt y ggttttttt gg y gagggtt ttagtattat aggtgaggag tagagtttag tttgtgttyg) and methylation was observed, on average, 44% of the expression was confirmed (A in Fig. 1).
<1-3> DKK3 siRNA 트랜스펙션후 감소된 DKK3 발현 확인<1-3> Confirmation of Reduced DKK3 Expression After DKK3 siRNA Transfection
비소세포폐암 H460 세포를 하루 배양한 후, DKK3 siRNA(small intefering RNA)(서열번호 6: 5'-AGC UGC UGC UAA AGC AUC AUC AGA A-3')(Invitrogen, USA)와 이에 대한 대조군 siRNA(NC siRNA)(Bioneer Co., Korea) 100 nM을 Lipofectamine RNAi MAX 시약(Invitrogen)를 이용하여 트랜스펙션(transfection)하였다. 트랜스펙션후, 2일 후에 세포에서 RNA extraction kit(Qiagen, USA)를 이용하여 RNA를 추출하였다. After one day of non-small cell lung cancer H460 cells were cultured, DKK3 siRNA (small intefering RNA) (SEQ ID NO: 6: 5'-AGC UGC UGC UAA AGC AUC AUC AGA A-3 ') (Invitrogen, USA) and its control siRNA ( NC siRNA) (Bioneer Co., Korea) 100 nM was transfected with Lipofectamine RNAi MAX reagent (Invitrogen). 2 days after transfection Later, RNA was extracted from the cells using an RNA extraction kit (Qiagen, USA).
추출한 RNA를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위하여 상보적 DNA(Complementary DNAs, cDNAs)를 PCR premix kit(Intron Biotechnology, Korea)을 사용하여 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 DKK3 정방향 프라이머(서열번호 7: 5'-GTT GAG GAA CTG ATG GAG GAC A-3'), DKK3 역방향 프라이머(서열번호 8: 5'-TTG CAC ACA TAC ACC AGG CTG T-3'), actin 정방향 프라이머(서열번호 9: 5'-ATG TGC AAG GCC CGC TTC G-3') 및 actin 역방향 프라이머(서열번호 10: 5'-TTA ATG TCA CGC ACG ATT TCC-3')를 이용하여 중합 효소 연쇄 반응을 수행하였다. GC가 많이 포함된 DKK3 주형을 증폭시키기 위해서, i-GC capture 솔루션(Intron Biotechnology, Korea)을 상기 PCR 혼합물에 첨가하여 사용하였다. DKK3의 PCR 조건은 94℃에서 30초 반응시킨 후, 40 싸이클을 94℃에서 30초, 61℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분동안 반응시킨 후, 마지막으로 72℃에서 5분 반응시킨다. 증폭된 PCR 산물을 1% 아가로즈젤에 전기영동으로 확인하였다. Complementary DNAs (complementary DNAs, cDNAs) were synthesized using PCR premix kit (Intron Biotechnology, Korea) to perform reverse transcription polymerase chain reaction using the extracted RNA. DKK3 forward primer (SEQ ID NO: 7: 5'-GTT GAG GAA CTG ATG GAG GAC A-3 '), DKK3 reverse primer (SEQ ID NO: 8: 5'-TTG CAC ACA TAC ACC AGG CTG T-) 3 '), actin forward primer (SEQ ID NO: 9: 5'-ATG TGC AAG GCC CGC TTC G-3') and actin reverse primer (SEQ ID NO: 10: 5'-TTA ATG TCA CGC ACG ATT TCC-3 ') Polymerase chain reaction was performed. In order to amplify the GK-rich DKK3 template, i-GC capture solution (Intron Biotechnology, Korea) was used in addition to the PCR mixture. After PCR reaction of DKK3 for 30 seconds at 94 ℃, 40 cycles were reacted for 30 seconds at 94 ℃, 30 seconds at 61 ℃, and 1 minute at 72 ℃, and finally 5 minutes at 72 ℃. The amplified PCR product was confirmed by electrophoresis on 1% agarose gel.
그 결과, DKK3 siRNA를 H460 세포에 트랜스펙션시킨 후, DKK3의 발현이 완전히 감소됨을 확인할 수 있었다(도 1의 B).
As a result, after transfecting the DKK3 siRNA to H460 cells, it was confirmed that the expression of DKK3 is completely reduced (Fig. 1B).
<실험예 2> 세포 성장 저해 효과 Experimental Example 2 Inhibition of Cell Growth
<2-1> DKK3 siRNA 도입으로 인한 H460 세포의 성장저해<2-1> Inhibition of Growth of H460 Cells by Introduction of DKK3 siRNA
H460 세포에 DKK3 siRNA와 이의 대조군인 NC siRNA를 상기 기재된 방법으로 트랜스펙션한 후, 2일 지난 후 세포를 이용하였다. 전체 세포와, 배지의 상층액에 부유되어 있는 세포 그리고 컬쳐 플레이트 바닥에 부착되어 있는 세포를 형광 현미경 (Leica Microsystems, USA)을 이용하여 관찰하였다. 형광 현미경으로 관찰한 이미지는 디지털 카메라(Cannon Power Shot S45)를 이용하여 촬영하였다.After transfecting the H460 cells with DKK3 siRNA and its control NC siRNA by the method described above, the cells were used two days later. Total cells, cells suspended in the supernatant of the medium, and cells attached to the bottom of the culture plate were observed using a fluorescence microscope (Leica Microsystems, USA). Images observed with a fluorescence microscope were taken using a digital camera (Cannon Power Shot S45).
그 결과, H460 세포와 대조군 NC siRNA를 트랜스펙션한 군에서 관찰되지 않는 부유하고 있는 세포가 DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 컬쳐 플레이트에 잘 붙어있지 못하고, 부유하는 세포가 증가하였다(도 2의 A).
As a result, floating cells which were not observed in the group transfected with H460 cells and the control NC siRNA did not adhere well to the culture plate after the transfection of DKK3 siRNA, and the floating cells increased (FIG. 2). A).
<2-2> 세포 생존율 측정<2-2> Cell viability measurement
세포의 생존율을 측정하기 위하여, 세포의 생존 분획(fraction)을 분석하였다. H460 세포에 트립신(trypsin)을 처리한 후, 세포의 수를 직접 카운팅하였다. 또한, 세포의 생존율을 알아보기 위하여 MTT assay(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 수행하였다. H460 세포는 1000~3000개의 세포를 96웰 플레이트에 실험군당 3배수로 심었다. 24, 48, 72시간이 경과한 후에, 100 ㎕의 MTT 용액을 웰에 넣고, 플레이트를 37℃에서 4시간 반응시킨다. 배지를 제거하고, 디메틸 술폭사이드(dimetyl sulfoxide, DMSO)를 웰에 첨가하여 MTT 크리스탈(crystal)을 용해시킨 후에, GLOMAX 96 마이크로플레이트 루미노미터(microplate luminometer)(Promega) 570nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 수치를 마이크로플레이트 매니저(Microplate manager)(Promega, USA)를 이용하여 분석하였다.In order to measure the viability of the cells, the survival fraction of the cells was analyzed. After trypsin treatment for H460 cells, the number of cells was counted directly. In addition, MTT assay (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) was performed to determine cell viability. H460 cells were planted 1000-3000 cells in 96-well plate at three-fold per experimental group. After 24, 48 and 72 hours have elapsed, 100 μl of MTT solution is placed in the wells and the plate is allowed to react at 37 ° C. for 4 hours. The medium was removed, dimethyl sulfoxide (DMSO) was added to the wells to dissolve the MTT crystals, and the absorbance was measured at a GLOMAX 96 microplate luminometer (Promega) 570 nm wavelength. . The measured values were analyzed using a Microplate manager (Promega, USA).
그 결과, DKK3가 발현되고 있는 H460에 비해서, DKK3 siRNA를 트랜스펙션한 군에서 약 70% 정도 세포수가 감소되는 결과를 확인할 수 있었다. 또한, MTT 측정시, DKK3 siRNA를 트랜스펙션한 군에서 H460 세포군과 대조군인 NC siRNA를 트랜스펙션한 군보다 세포의 성장이 크게 저하됨을 확인할 수 있었다. 이는 상기 세포의 형태에서 관찰된 부유된 세포의 증가로 인한 것으로 추정할 수 있었다(도 2의 B 및 C).
As a result, the cell number was reduced by about 70% in the group transfected with DKK3 siRNA, compared to H460 in which DKK3 was expressed. In addition, it was confirmed that the growth of cells was significantly reduced in the group transfected with the DKK3 siRNA group compared with the group transfected with the H460 cell group and the control group si siRNA. This could be attributed to the increase in suspended cells observed in the morphology of these cells (B and C in FIG. 2).
<2-3> 콜로니 형성 측정<2-3> colony formation measurement
세포의 성장 패턴을 확인하기 위하여 콜로니 형성 측정(colony forming assay)를 수행하였다. H460 세포에 DKK3 siRNA를 트랜스펙션 24시간 후, 세포를 트립신 처리하여 모은후에, 35mm 컬쳐 디쉬(dish)에 5×103으로 심있다. 7일 동안 배양한 후, 세포는 0.5% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색한 후, 사진을 찍었다. Colony forming assays were performed to confirm cell growth patterns. 24 hours after transfection of DKK3 siRNA into H460 cells, the cells were trypsinized and harvested, and then seeded at 5 × 10 3 in a 35 mm culture dish. After incubation for 7 days, the cells were stained with 0.5% crystal violet and then photographed.
그 결과, DKK3 siRNA를 트랜스펙션한 군에서 H460세포와 대조군인 NC siRNA를 트랜스펙션한 군에 비하여 확연히 콜로니의 생성이 저하됨을 확인할 수 있었다(도 2의 D).
As a result, in the group transfected with DKK3 siRNA, it was confirmed that the generation of colonies was significantly lower than the group transfected with H460 cells and NC siRNA as a control group (FIG. 2D).
<실험예 3> DKK3 발현억제로 유도되는 세포독성 측정Experimental Example 3 Measurement of Cytotoxicity Induced by DKK3 Expression Inhibition
DKK3 siRNA를 트랜스펙션으로 유도되는 세포 독성효과를 측정하기 위하여, H460 세포를 요오드화 프로피디엄(propidium iodide, PI)으로 염색한 후, 유세포 분석(flow cytometry)방법을 이용하였다. H460 세포를 어두운 곳에서 70% 에탄올을 이용하여 4℃에서 30분간 고정시칸뒤에, 에탄올을 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)으로 세척한 뒤, 요오드화 프로피디엄 50 ㎕/㎖로 세포를 염색하였다. 염색된 DNA는 FACScan(EPICS XL; Beckman Coulter Counter, USA)을 이용하여 측정하였다. 각 군당 최소 1×104 세포를 카운팅하였으며, Phoenix Multicycler software(Phoenix Flow System, USA)를 이용하여 각각의 세포의 변화를 측정하였다. In order to measure the cytotoxic effects induced by transfection of DKK3 siRNA, H460 cells were stained with propidium iodide (PI), and flow cytometry was used. After H460 cells were fixed for 30 minutes at 4 ° C. using 70% ethanol in a dark place, ethanol was washed with phosphate-buffered saline (PBS), and then the cells were treated with 50 μl / ml of iodide propidium. Was stained. Stained DNA was measured using FACScan (EPICS XL; Beckman Coulter Counter, USA). At least 1 × 10 4 cells were counted in each group, and changes in each cell were measured using Phoenix Multicycler software (Phoenix Flow System, USA).
그 결과, 트랜스펙션 후 첫날에는 H460 세포군과 NC siRNA군에서는 비슷한 패턴을 보였으며, 둘째날부터 세포사멸이 시작됨을 확인할 수 있었다. H460 세포군과 NC siRNA를 도입한 군에서 4%를 넘지 않는 세포사멸이 측정된 반면, DKK3 siRNA를 도입한 군에서는 세포사멸이 둘째날부터 H460 세포군과 NC siRNA군과 큰 차이를 보였으며, 3일째되는 날에 가장 큰 차이를 보였다(도 3). 즉, DKK3의 발현억제로 세포사멸이 유도됨을 확인할 수 있었다.
As a result, the first day after transfection showed a similar pattern in the H460 cell group and the NC siRNA group, and cell death started from the second day. Apoptosis was less than 4% in the H460 and NC siRNA groups, whereas apoptosis in the DKK3 siRNA group was significantly different from the H460 and NC siRNA groups from
<실험예 4> DKK3 발현억제 후 세포사멸 단백질 발현 및 ROS 측정Experimental Example 4 Apoptosis Protein Expression and ROS Measurement after DKK3 Expression Inhibition
<4-1> DKK3 발현억제 후 세포사멸 단백질의 발현 측정<4-1> Expression of Apoptosis Proteins after Inhibition of DKK3 Expression
H460 세포에서 관찰되는 세포사멸 경로를 알아보기 위하여, 세포사멸 경로 관련 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 이용하여 발현량을 확인하였다. 단백질의 농도는 Lowry kit(Bio-Rad Laboratories, USA)를 이용하여 측정하였다. 동량의 단백질을 10~12% SDS-SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide)에 분리한 후, 나이트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)(Hybond ECL; Amersham Pharmacia, USA)로 이동시켰다. 단백질이 이동된 나이트로셀룰로오스 막을 상온에서 2시간 동안 10% non-fat 밀크를 PBST(0.1% Tween in PBS)용액에 녹인 블로킹 버퍼로 비특이적 결합을 막았다. 그 뒤에 막은 1시간 동안 각각의 항체를 이용하여 반응시켰다. 사용한 항체는 p21WAF1/Cip1 (p21)(Abcam, USA), 베타-액틴(β-actin)(Cell Signaling, USA), 싸이클린 E(Cell Signaling, USA), 포스포-에이케이티(phospho-Akt, pAkt)(Cell Signaling, USA), 싸이클린 D1(Santa Cruz, USA), Cdk2(Santa Cruz, USA), (Cyclin-dependent kinase 2, Cdk)(Santa Cruz, USA), PTEN(phosphatase and tensin homolog)(Santa Cruz, USA), p53(Santa Cruz, USA), 백스(Santa Cruz, USA)로서 1:1,000으로 희석하여 사용하였다. 그 뒤에, HRP(horseradish peroxidase)가 달려있는 2차 항체와 반응시킨후, Westzol 화학 발광 염색 키트(Intron Biotechnology)를 이용하여 발광시켜 결과를 얻었다.In order to determine the apoptosis pathway observed in H460 cells, the expression level of the apoptosis pathway related protein was confirmed using Western blot. Protein concentration was measured using a Lowry kit (Bio-Rad Laboratories, USA). The same amount of protein was separated on 10-12% SDS-SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide) and then transferred to a nitrocellulose membrane (Hybond ECL; Amersham Pharmacia, USA). The protein-transported nitrocellulose membrane was prevented from nonspecific binding with blocking buffer in which 10% non-fat milk was dissolved in PBST (0.1% Tween in PBS) solution for 2 hours at room temperature. The membrane was then reacted with each antibody for 1 hour. Antibodies used were p21 WAF1 / Cip1 (p21) ( Abcam , USA), beta-actin (β-actin) (Cell Signaling, USA), cyclin E (Cell Signaling, USA), phospho-Akt, pAkt) (Cell Signaling, USA), Cyclin D1 (Santa Cruz, USA), Cdk2 (Santa Cruz, USA), (Cyclin-
그 결과, DKK3의 발현을 억제한 후, cyclin D1과 cyclin E의 발현이 H460 세포와 NC siRNA군에 비하여 증가되는 반면, Cdk2과 CdK4의 경우에는 발현의 차이가 관찰되지 않았다. 또한, PTEN과 pAkt의 발현량은 DKK siRNA를 도입한 군과 H460세포, NC siRNA를 도입한 군간의 차이가 관찰되지 않았다. 그러나 특이적으로 p53과 p21의 발현량은 DKK3 siRNA를 도입한 군에서 크게 증가됨을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 H460 세포에 DKK3 siRNA를 도입하여, 발현을 억제시킨 후 산화적 스트레스를 겪고 있음을 확인할 수 있었다. Bax의 발현이 DKK siRNA를 도입한 군에서 확연히 증가됨을 관찰할 수 있었는데, Bax는 세포사멸이 시작된 후에 핵으로 이동되므로, 이러한 증가를 통해서 세포사멸이 일어나고 있음을 확인할 수 있었다(도 4의 A).
As a result, after suppressing the expression of DKK3, the expression of cyclin D1 and cyclin E was increased compared to the H460 cells and NC siRNA group, whereas no difference in expression was observed in Cdk2 and CdK4. In addition, there was no difference in the expression level of PTEN and pAkt between the group in which DKK siRNA was introduced, the group in which H460 cells and NC siRNA were introduced. However, specific expression levels of p53 and p21 were significantly increased in the group introduced with DKK3 siRNA. These results confirm that DKK3 siRNA was introduced into H460 cells, thereby suppressing expression and experiencing oxidative stress. It was observed that the expression of Bax was significantly increased in the group in which the DKK siRNA was introduced. Since Bax is transferred to the nucleus after the apoptosis starts, it was confirmed that the apoptosis occurred through this increase (FIG. 4A). .
<4-2> DKK3 발현억제 후 ROS 수치 측정<4-2> ROS Level Measurement after DKK3 Expression Suppression
p53 전달회로는 ROS의 증가로 인해서 시작될 수 있기 때문에, 이를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏을 통해서 확인한 증가된 p53이 DKK3 단백질 발현 억제후 H460 세포 내부의 ROS의 변화에 의한 것인지 확인하기 위하여, ROS의 값을 측정하였다.Since the p53 transduction circuit can be initiated due to an increase in ROS, to determine whether the increased p53 identified by Western blot is due to a change in ROS inside H460 cells after inhibition of DKK3 protein expression, the value of ROS is determined. Measured.
H460 세포에 NC siRNA, DKK3 siRNA를 트랜스펙션시킨 후, 14시간, 20시간 24시간대의 세포를 트립신 처리하여 걷었다. 약 1×106 정도의 H460 세포를 트립신 처리로 걷은 후, PBS로 세척, 현탁시켜준 후, 디클로로플루오레세인 디아세테이트(Carboxydichlorofluorescein diacetate ,DCFH-DA)를 최종농도가 10uM가 되도록 첨가한다. DCFH-DA는 비극성 화합물로서, 세포내에 융합된 후 세포의 에스테라제(esterase)에 의해서 막불투과성 불광성 극성 파생물(membrane-impermeable nonfluorescent polar derivative, DCFH)로 전환된다. 세포내에 갇힌 DCFH는 세포내의 과산화수소(hydrogen peroxide)에 의해서 빠른 속도로 형광 2',7'-디클로로플루오레세인(fluorescent 2',7'-diclorofluorescein, DCF)으로 산화된다고 알려져 있다. 따라서, DCFH-DA를 어두운 곳에서 세포에 30분동 37℃의 조건에서 반응을 시킨뒤에, 유세포분석방법을 이용하여 ROS의 수치를 측정하였다. After transfecting H460 cells with NC siRNA and DKK3 siRNA, the cells for 14 hours, 20 hours and 24 hours were trypsinized and then walked. After about 1 × 10 6 H460 cells were walked by trypsin treatment, washed with PBS, suspended, and then dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) was added to a final concentration of 10 uM. DCFH-DA is a nonpolar compound that is fused intracellularly and then converted into a membrane-impermeable nonfluorescent polar derivative (DCFH) by the cell's esterase. Intracellularly trapped DCFH is known to be rapidly oxidized to fluorescent 2 ', 7'-diclorofluorescein (DCF) by hydrogen peroxide in the cell. Therefore, after DCFH-DA was reacted to the cells in a dark place for 30 minutes at 37 ° C., ROS levels were measured by flow cytometry.
그 결과, ROS의 수치는 DKK3 단백질 발현억제 후 상당히 증가됨을 관찰할 수 있었으며, H460 세포, NC siRNA 및 DKK3 siRNA군간의 차이는 DKK3 siRNA를 트랜스펙션 2시간 후에 가장 큼을 관찰할 수 있었다(도 4의 B). 즉, DKK3가 세포내부의 ROS 수치를 유지시키는데에 역할을 담당하고 있음을 확인할 수 있었다.
As a result, it was observed that the level of ROS was significantly increased after DKK3 protein expression inhibition, and the difference between H460 cells, NC siRNA and DKK3 siRNA groups was the largest after 2 hours of transfection of DKK3 siRNA (FIG. 4). B). In other words, it was confirmed that DKK3 plays a role in maintaining intracellular ROS levels.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 제시한다.
The preparation examples for the compositions of the present invention are given below.
<제조예 1> 약학적 제제의 제조Preparation Example 1 Preparation of Pharmaceutical Formulation
<1-1> 산제의 제조<1-1> Preparation of powder
DKK3발현 또는 활성 억제제 2 g2 g of DKK3 expression or activity inhibitor
유당 1 g1 g lactose
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
The above components were mixed and packed in airtight bags to prepare powders.
<1-2> 정제의 제조<1-2> Preparation of tablets
DKK3 단백질의 발현 또는 활성 억제제 100 ㎎100 mg of DKK3 protein expression or activity inhibitor
옥수수전분 100 ㎎Corn starch 100 mg
유 당 100 ㎎100 mg of milk
스테아린산 마그네슘 2 ㎎2 mg of magnesium stearate
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
After mixing the above components, tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.
<1-3> 캡슐제의 제조≪ 1-3 > Preparation of capsules
DKK3 단백질의 발현 또는 활성 억제제 100 ㎎100 mg of DKK3 protein expression or activity inhibitor
옥수수전분 100 ㎎Corn starch 100 mg
유 당 100 ㎎100 mg of milk
스테아린산 마그네슘 2 ㎎2 mg of magnesium stearate
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
After mixing the above components, the capsules were filled in gelatin capsules according to the conventional preparation method of capsules.
<1-4> 환의 제조≪ 1-4 >
DKK3 단백질의 발현 또는 활성 억제제 1 gInhibitor of expression or activity of DKK3 protein 1 g
유당 1.5 gLactose 1.5 g
글리세린 1 gGlycerin 1 g
자일리톨 0.5 g0.5 g of xylitol
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
After mixing the above components, they were prepared so as to be 4 g per one ring according to a conventional method.
<1-5> 과립의 제조<1-5> Preparation of granules
DKK3 단백질의 발현 또는 활성 억제제 150 ㎎150 mg of DKK3 protein expression or activity inhibitor
대두 추출물 50 ㎎Soybean extract 50 mg
포도당 200 ㎎200 mg of glucose
전분 600 ㎎600 mg of starch
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
After mixing the above components, 100 mg of 30% ethanol was added and dried at 60 ° C. to form granules, and then filled in fabric.
상기에서 보는 바와 같이, 비소세포폐암주에서 DKK3의 발현을 완전히 억제시킨 뒤, 암세포의 사멸과 세포내 활성산소 수준이 증가되는 효과를 가지므로, DKK3 단백질 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암의 예방 및 치료용 조성물 또는 항암 보조제로 유용하게 사용될 수 있다. As described above, since the expression of DKK3 is completely suppressed in non-small cell lung cancer lines, cancer cell death and intracellular reactive oxygen levels are increased, thus preventing the cancer containing DKK3 protein expression or activity inhibitors and It can be usefully used as a therapeutic composition or as an anticancer adjuvant.
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Claims (14)
Pharmaceutical composition for the prevention and treatment of lung cancer containing siRNA having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 complementary to the mRNA of the DKK3 gene
An anticancer adjuvant for lung cancer using a composition containing an siRNA having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 complementarily binding to the mRNA of the DKK3 gene.
2) 단계 1)의 처리된 세포에서 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 DKK3 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 DKK3 단백질 발현량이 대조군과 비교하여 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법.
1) treating the test substance to lung cancer cells as an experimental group;
2) measuring the expression level of the DKK3 protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the treated cells of step 1); And
3) A method for screening a composition for preventing or treating lung cancer, the method comprising selecting a test substance whose amount of DKK3 protein expression in step 2) is reduced compared to a control.
The method of claim 13, wherein the expression level of the DKK3 protein in step 2) is reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), enzyme immunoassay (ELISA), immunohistochemistry, Western blotting. And flow cytometry (FACS). The method for screening a composition for preventing or treating lung cancer, characterized in that it is measured by any one selected from the group consisting of.
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