KR101264300B1 - 좀개구리밥 식물에서의 신남산의 함량을 증가시키는 방법 - Google Patents

좀개구리밥 식물에서의 신남산의 함량을 증가시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프롤린 및 당(sugar)을 포함하는 배지에서 좀개구리밥 식물을 배양하는 단계를 포함하는 좀개구리밥 식물에서 신남산의 함량을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라, 프롤린과 당을 첨가한 배지에서 좀개구리밥 식물을 배양하면, 좀개구리밥 식물에서의 신남산 함량을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 좀개구리밥의 대사물질 중 증가된 페놀성 화합물, 특히 신남산은 티로시나아제를 억제하는 효과가 있었고, 활성산소를 제거하는 능력을 보였으므로, 항산화제 및 미백제의 활성성분으로 응용이 가능하다.

Description

좀개구리밥 식물에서의 신남산의 함량을 증가시키는 방법{Methods for Increasing Cinnamic Acid Contents in Lemna minor by Artificial Culture}
본 발명은 좀개구리밥 식물에서 신남산의 함량을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 프롤린 및 당을 포함하는 배지에서 좀개구리밥을 배양하는 단계를 포함하는 신남산의 함량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
좀개구리밥으로 알려진 Lemna minor는 천남성과(Araceae)에 속하고, 자연적 단백질의 원천으로 사용되는 빨리 자라는 식물이다1. 건조 중량에서 43%의 단백질을 함유하고 있고, 수면 위를 떠내는 것만으로도 쉽게 수확할 수 있는 좀개구리밥은 추가 가공이 필요 없는 물고기의 먹이이고 해열 및 진통제 생산의 원료이다2 ,3. 조류의 성장에 필요한 빛에서 좀개구리밥의 부유 효과는 공장폐수로부터 크롬(Cr;Vi)을 제거할 수 있다고 알려졌다4 ,5. 또한 좀개구리밥은 프로파닐(3,4-디클로로프로피오나닐라이드)의 독성을 평가할 때도 사용하였다6 ,7. 상기 식물의 펙틴질의 폴리사카라이드는 렘난(lemnan)으로 불려졌고, 식세포작용을 증가시키고 면역조절효과 활성을 나타낸다고 알려졌다8 ,9. 개구리 잎의 항산화 능력을 비롯한 항미생물, 항효모 능력은 구리로 인해 그 기능의 변화가 나타난다고 알려져 있기에, 다양한 인비보(in vivo) 방법에 사용되고 있다10 ,11. 게다가 좀개구리밥은 병원성 미생물과 공동 배양 하여 항미생물 스크리닝과 병원성 미생물 감염에 관한 모델 시스템으로 보고되기도 하였다1. 그러나 좀개구리밥에 있어서, 외부의 프롤린과 수크로오스가 티로시나아제 억제 능력과 활성산소 제거 능력에 영향을 미친다는 연구는 아직까지 알려지지 않았다. 식물배양액의 삼투성 물질이고 탄소원인 수크로오스의 역할에 대해 알려진 바에 의하면, 식물 배양액에 수크로오스의 농도가 증가되면 삼투압 효과가 발생하고, 이것은 유상조직의 중량 감소로 이어진다고 한다12 ,13. 그리고 프롤린은 삼투압 포텐셜을 조절하는 화합성 용질의 기능을 하고, 식물의 스트레스의 방어 메커니즘에도 중요한 역할을 한다고 알려졌다17 -23.
본 발명자들은 당(sugar)이나 프롤린과 같은 외부의 스트레스 요인들이 좀개구리밥 식물의 성장, 대사물질 프로파일, 활성산소 제거 및 티로시나아제 억제 능력에 영향을 줄 수 있는지에 대해 연구하여 왔으며, 이러한 연구 결과를 바탕으로 좀개구리밥 식물에서 유용한 물질을 생산하는데 요구되는 배지 및 배양 방법을 개발하고자하였다.
본 발명자들은 좀개구리밥 식물에서 유용한 물질의 함량을 증가시키는 배양 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 프롤린 및 당(sugar)을 포함하는 배지에서 좀개구리밥 식물을 배양함으로써 식물체내에 항산화물질인 페놀성 화합물 특히 신남산의 함량이 증가한다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 좀개구리밥 식물에서 신남산의 함량을 증가시키는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 프롤린 및 당(sugar)을 포함하는 배지에서 좀개구리밥을 배양하는 단계를 포함하는 좀개구리밥에서 신남산의 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 좀개구리밥 식물에서 신남산의 함량을 증가시키는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 프롤린 및 당을 포함시킨 배지에서 좀개구리밥 식물을 배양하게 되면 식물체내에 신남산의 함량이 증가한다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
프롤린과 당이 첨가된 배지내에서 좀개구리밥 식물을 배양하면 좀개구리밥 식물에서 식물의 방어기작에 중요한 역할을 담당하는 페놀성 화합물의 함량이 증가하는데, 특히 신남산의 함량이 가장 유의성 있게 증가한다.
따라서, 본 발명의 가장 큰 특징은 아미노산인 프롤린과 당을 포함하는 배지에서 좀개구리밥 식물을 배양하면 좀개구리밥 식물내의 페놀성 화합물, 특히 신남산의 함량이 증가한다는 것에 있다.
본 발명의 방법에서 좀개구리밥 식물에 존재하는 페놀성 화합물은 수산기, 카르복실기 및 메톡시기들과 같은 여러 가지 치환기가 결합된 방향족 고리구조 또는 비방향족 고리구조를 갖고, 유리형, 에테르, 에스테르 또는 당과 배당체 형태로 자연 식물체 내에 존재한다. 식물에 존재하는 페놀성 화합물로는 단순 페놀성 물질, 예를 들어, 카테콜, 과이어콜 및 플로로글루시놀; 신남산, 페닐프로파노이드, 쿠마린, 리그난, 퀴논, 스틸벤, 플라보노이드, 탄닌 및 리그닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에서 좀개구리밥 식물체내에서 함량이 증가하는 “신남산”은 항알러지, 항염, 항산화, 항미생물, 항혈전, 심장보호, 혈관 확장, 항박테리아 및 타감작용과 같은 광범위한 생물학적 기능을 하는 것으로 알려져 있으며, 상기 명시된 생물학적 기능이외에 향수 제조의 중간체로 사용될 수 있으며, 특히 신남산의 메틸 또는 에틸 에스테르 유도체는 향수의 제조에 사용가능하다. 또한, 신남산은 티로시나아제를 억제하는 효능을 가져 피부 미백효과를 나타냄으로써 미백용 화장품의 활성성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 배양되는 식물은 개구리밥과 식물에 속하는 좀개구리밥(Lemna minor)이다. 상기 개구리밥과 식물은 천남성과에 속하는 개구리밥아과 식물로서 단자엽식물이며 모두 초본성이며, 세계 열대와 아열대지방의 습윤한 지역을 중심으로 널리 분포하고 105 속에 1,500 종이 있고 한국에는 4 속 14 종이 있고, 작고, 자유롭게 부유하는 담수 식물이다(Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae - AMonograph Study Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich). 개구리밥 식물은 형태학적으로 가장 작은 식물로 알려져 있지만, 대부분의 개구리밥 종들은 뿌리, 줄기, 꽃, 종자 및 잎 등의 훨씬 큰 식물의 조직과 기관을 모두 갖추고 있다. 개구리밥 종에 대한 생태학, 계통 분류학, 생활주기, 대사, 질병 및 해충 감수성, 생식 생물학, 유전자 구조 및 세포 생물학에 관한 내용은 문헌 Hillman (1961) Bot. Review 27: 221; Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Familyof Duckweeds: The Family of Lemnaceae -A Monograph Study Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel,Zurich 에 상세히 기술되어 있으며 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
본 발명의 배지에는 당(sugar)이 첨가되며, 상기 당(sugar)은 탄소원으로 사용되며 바람직하게는 단당류, 이당류, 다당류 및 당알콜로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 상기 단당류는 예를 들어, 글루코오스, 프럭토오스, 만노오스, 아라비노오스, 자일로오스, 갈락토오스 및 리보오스를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 이당류는 예를 들어 멜리비오스, 셀로비오스, 말토오스, 수크로오스 및 락토오스를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 다당류는 예를 들어 녹말, 글리코겐, 덱스트린, 사이클로덱스트린 및 셀룰로오스를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 당알코올은 예를 들어 소르비톨, 만니톨 및 글리세롤을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 배지에 첨가되는 상기 당은 바람직하게는 글루코오스, 프럭토오스, 만노오스, 아라비노오스, 자일로오스, 갈락토오스, 리보오스, 멜리비오스, 셀로비오스, 말토오스, 수크로오스 및 락토오스이고, 보다 바람직하게는 글루코오스, 프럭토오스 또는 수크로오스이며, 가장 바람직하게는 수크로오스이다. 또한 당업계의 공지된 바에 따라 상기 당을 2가지 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 배지에 첨가된 당의 농도는 0.5 - 7 ％이며, 바람직하게는 1 - 7 ％, 보다 바람직하게는 2 - 6 ％, 보다 더 바람직하게는 3 - 6 ％ 이고, 가장 바람직하게는 2 - 4 ％이다.
본 발명의 배지는 신남산의 함유량을 증대시키는 작용을 하는 아미노산 성분으로서 프롤린(proline)을 포함한다. 프롤린은 일반적인 삼투물질의 하나로서 삼투압 포텐셜을 조절하는 화합성 용질의 기능을 하고, 식물의 스트레스 방어메커니즘에도 중요한 역할을 한다. 상기 프롤린은 배지에 첨가된 당, 특히 수크로오스와 작용하여 좀개구리밥 식물내의 신남산의 함유량을 증가시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 첨가되는 프롤린의 배지내 함량은 바람직하게는 0.1 - 5 mM 이며, 보다 바람직하게는 0.2 - 4 mM, 보다 더 바람직하게는 0.3 - 3 mM, 보다 더 바람직하게는 0.4 - 2 mM 이며, 가장 바람직하게는 0.5 - 1 mM 이다.
하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 프롤린 0.5 - 1 mM과 수크로오스 3 - 6 ％을 동시에 배지에 첨가하여 좀개구리밥을 배양한 경우 신남산의 함량이 크게 증대되었다.
본 발명에 사용되는 배지는 식물배양에 있어서 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 널리 알려진 무라쉬지 스쿡(Murashige and Skoog, MS) 배지이며, 고체 배지로 사용할 때는 배지의 지지매체로 아가의 한 종류인 젤라이트 0.1% 내지 1% (중량/중량), 식물생장조절물질로 벤질아미노퓨린 0.1 내지 5 mg/ℓ 및 탄소원으로 수크로오스 10 내지 50 g/ℓ를 포함하며, 상기 MS 배지는 바람직하게는 1/2MS, 1/3MS 및 1/4MS를 사용하며, 가장 바람직하게는 1/2MS를 사용한다. 액체배지로 사용할 때는 상기 첨가 물질에서 젤라이트를 제외한 벤질아미노퓨린을 포함하고, 프롤린과 수크로오스를 전술한 농도 범위내에서 첨가하여 제조한다.
상기 고체 배지의 지지매체로는 젤라이트만으로 한정되는 것은 아니며 아가로스를 이용할 수 있다. 상기 식물생장조절물질은 식물의 생장을 위해 인위적으로 첨가하는 물질이며, 바람직하게는 옥신, 제아틴, 키네틴, 나프탈렌 아세트산, 인딜 부티르산, 벤질아미노퓨린, 인돌 아세트산 또는 벤질아데닌이고, 가장 바람직하게는 벤질아미노퓨린이다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 사용되는 배지에 프롤린과 당을 특정의 농도로 첨가함으로써, 좀개구리밥 식물체내의 신남산의 함량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 좀개구리밥 식물의 배양에 있어서는, 고체 배지에서 배양할 경우 광조건은 1,000 내지 5,000 lux 이며, 온도는 23 내지 28 ℃ 조건하에 6-8 개월 동안 배양하고 이후 액체배지로 옮긴다. 액체 배지에서 배양할 경우 광조건은 1,000 내지 5,000 lux 이며, 온도는 23 내지 28 ℃에서 100 - 300 rpm 조건에서 상기 배지 조성물을 첨가하여 30일 내지 60일, 바람직하게는 40일 내지 50일 회전 진탕 배양한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명에 따르면 프롤린 및 당이 포함된 배지에서 좀개구리밥 식물을 배양하면, 좀개구리밥에서 신남산의 함량을 증가시킬 수 있었다.
(b) 본 발명에 따르면 좀개구리밥을 프롤린 및 당이 포함된 배지에서 좀개구리밥을 배양하면, 좀개구리밥의 바이오매스 축적이 증가되었고, 좀개구리밥의 대사물질 프로파일에 변화가 나타났다.
(c) 본 발명의 좀개구리밥의 대사물질 중 증가된 페놀성 화합물, 특히 신남산은 티로시나아제를 억제하는 효과가 있었고, 활성산소를 제거하는 능력을 보이므로써, 신남산은 항산화 기능 및 미백 기능을 포함하는 다양한 기능성 조성물의 유효성분으로 사용이 가능하다.
도 1은 0 mM, 0.5 mM, 및 1 mM 프폴린 및 3％ 및 6％ 수크로오스를 포함하는 배지에서 42 일간 배양한 좀개구리밥 전체 식물에서 바이오매스 축적량을 나타낸 그래프이다. 본 그래프에 표시한 약자는 3% 수크로오스/0 mM 프롤린:3S, 3% 수크로오스/0.5 mM 프롤린: 3S0.5P, 3% 수크로오스/1 mM 프롤린:3S1P, 6% 수크로오스/0 mM 프롤린:6S, 6% 수크로오스/0.5 mM 프롤린: 6S0.5P 및 6% 수크로오스/1 mM 프롤린: 6S1P로 나타내었다.
도 2a는 다양한 프롤린과 수크로오스의 농도에서 배양된 좀개구리밥의 대사물질 프로파일의 GC-MS 데이터를 부분최소제곱분포분석(PLS-DA)으로 분석한 스코어 플롯을 나타낸 그래프이다(PLS 구성 1은 주로 프롤린의 농도에 의해 분리된 샘플이고, PLS 구성 2는 수크로오스 농도에 의해 분리된 샘플을 보여준다.
도 2b는 다양한 프롤린과 수크로오스의 농도에서 배양된 좀개구리밥의 대사물질 프로파일의 GC-MS 데이터를 부분최소제곱분포분석(PLS-DA)으로 분석한 로딩 플롯을 나타낸 그래프이다. 본 그래프에 기입한 숫자는 다음과 같다. 1: 몰피난, 2: 글리신, 3: 알라닌, 4: N-카르복시 글리신, 5: 발린, 6: 아이소루신, 7: 트레오닌, 8: 세린, 9: 아스파라긴, 10: 글루타민, 11: 트립토판, 12: 글리세르산, 13: 라우르산, 14: 팔미트산, 15: α-리놀렌산, 16: 스테아르산, 17: 젖산, 18: 아세트산, 19: 말론산, 20: γ-아미노 부티르산, 21: 숙신산, 22: 푸마르산, 23: 프로파논산, 24: 미리스트산, 25: 시트르산, 26: 인산, 27: 글루쿠론산, 28: α-토코페롤 (비타민 E), 29: 신남산, 30: 캄페스테롤, 31: 스티그마스테롤, 32: β-시토스테롤, 33: N-아데닌, 34: 리보오스, 35: 소르보오스, 36: 프럭토오스, 37: 글루코피라노오스, 38: 만노오스, 39: 갈락토오스, 40: 자일로오스, 41: 이노시톨, 42: 글루코오스 및 43: 멜리비오스
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
재료 및 방법
1. 좀개구리밥의 배양
좀개구리밥은(KCTC-10605) 한국 유전자 은행(생물자원센터, 한국)에서 얻었다. 좀개구리밥은 젤라이트(Gelrite, Sigma, USA) 0.4% (중량/중량), 벤질아미노퓨린 1 mg/ℓ(Sigma, USA) 및 수크로오스 30 g/ℓ(Sigma, USA)을 포함하는 1/2무라쉬지 스쿡 고체배지(1/2 Murashige and Skoog, 1/2MS, Sigma, USA)에서 배양하였다. pH는 5.8로 맞추고 121 ℃에서 20분 동안 멸균하였다. 좀개구리밥은 1/2MS1BA 고체 배지를 포함하는 페트리 디쉬에서 3,000 lux, 25±1℃ 인큐베이터(NEX-202M, EYELA, 넥서스 기술, 한국) 조건하에 배양하였다. 1/2MS1BA 배지의 조성은 젤라이트가 없는 조건이고, 상기 MS배지와 동일하다. 알류미늄 호일로 포장하여 멸균한 200 ㎖ 에를렌마이어 플라스크로 좀개구리밥과 액체배지를 옮긴 후 밀리포어 수술용 테잎으로 포장하여 3000 lux 및 100 rpm 조건에서 흔들며 배양하였다. 좀개구리밥을 액체배양 하기 전 7개월 동안 매 14일 마다 새로운 고체배지로 바꿔주면서 계대배양 하였다. 좀개구리밥(10 thallies, 약 0.0065 g 생중량)은 0, 0.5 및 1 mM 프롤린, 3% 및 6% 수크로오스(중량/부피)를 포함하는 액체배지에(20 ml) 옮겼고, 각각의 배지 조건에 따라서, 3% 수크로오스/0 mM 프롤린:3S, 3% 수크로오스/0.5 mM 프롤린: 3S0.5P, 3% 수크로오스/1 mM 프롤린:3S1P, 6% 수크로오스/0 mM 프롤린:6S, 6% 수크로오스/0.5 mM 프롤린: 6S0.5P 및 6% 수크로오스/1 mM 프롤린: 6S1P로 기입하였다. 열 개의 플라스크에서 배양하였다. 수득된 샘플은 24 시간 동안 동결 건조하였고(FDU-1200, EYELA, 일본) -80℃에 보관하여 분석에 이용하였다.
2. 바이오매스 측정
좀개구리밥의 생중량과 건중량은 배양 42일 수확한 이후에 측정하였다. 생중량은 멸균수로 세척 후 여과지로(Whatman No. 4, Whatman, 영국) 여과한 후에 측정하였고, 24시간 동결 건조 하였다.
3. 젤크로마토그래피 - 매스 ( GC - MS ) 분석을 위한 샘플 준비 과정
각각 다른 조건에서 배양한 좀개구리밥 10 mg을 유리 원심분리관에 넣고, 100％ 메탄올 1 ml로 추출하였다. 샘플을 볼텍싱 하고 실온에서 30분간 방치 후 40분 동안 초음파처리를 하였다. 이 후 튜브를 10분 동안 2,000 rpm에서 원심분리 하였고, 상층액을 분리하여 0.45 ㎛ 필터(Acrodisc Syringe Filters, Pall Corporation, 미국)로 여과하였다. 각 샘플의 200 ㎕를 에펜도르프튜브에 옮긴 후 미리스트산 d27을 내부 표준 물질로 첨가하였다(2:5:2 물:메탄올:아이소프로파놀 용액(3,000 ㎍/㎖ 중 5㎕). 상기 샘플을 질산가스로 5분 건조시킨 후 옥심화 반응을 위해 피리딘-메톡실아민 하이드로 클로라이드(20,000 ㎍/㎖) 30 ㎕를 첨가하였고, 30℃에 90분 동안 배양하였다. 이 후 BSTFA 200 ㎕와 1% TMCS(N,O-비스 트리메킬실릴 트리프로로아세트아마이드, Alfa Aesar, 미국)를 첨가하였고, 다시 60℃에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후 즉시 GC-MS를 위한 GC바이알로 옮겼다.
4. 젤크로마토그래피 - 매스 시스템
자동 샘플러 (7683 B series, Agilent Technologies, 미국), 분할식 모세 분리관 주입장치, 주입 모듈 및 켐스테이션 소프트웨어를 탑재한 Agilent GC (7890A, Agilent Technologies. 미국) 모델에 MSD 디텍터 (5975 C, Agilent Technologies, 미국) 이용하여 샘플을 분석하였다. 주입구 온도는 250℃, 주입 볼륨 1.0 ㎕ 및 운반기체로 헬륨가스를 사용하였고, 1.0 ㎖/분 속도로 일정하게 흘려주었다. 디텍터 전압은 1529 V, 보조온도 280℃, 매스 원천 온도는 280℃, 매스 쿼드 온도는 150℃로 세팅하였다. 메스 범위는 50-600 Da 이고, 데이터는 전체 스캔 모드 메스 디텍터에서 수집하였다. 크기가 30 m X 0.25 mm i.d.X 0.25 인 5% 페닐 메틸폴리실록산 용융 실리카 모세관 컬럼을 사용하여 분석하였다. 초기 오븐 온도는 70℃도 5분간 고정하였고, 70 - 130℃ 에서 15℃/분, 130 - 160℃에서 4℃/분으로 15분 동안 고정하였고, 160-300℃에서 10℃/분으로 15분 동안 고정하였다. 화합물의 매스 스펙트럼은 NIST-Wiley 메스 스펙트럼 라이브러리와 비교하여 80% 이상 일치하는 것을 확인하였다.
5. 부분최소제곱법 ( PLS - DA ) 및 ANOVA
GC-MS로 분석된 대사물질의 상대적인 강도를 확인하였고, 대사물질의 양적 차이는 PASW 통계학 18 소프트웨어(IBM, somer, 미국)를 이용하여 터키 방법에 따른 ANOVA를 사용하여 분석하였다. 통계학적 유의성은 p < 0.05 이하로 세팅하였다. 부분최소제곱법은 SIMCA-P 소프트웨어(version 12.0, Umetrics, Ume, 스웨덴)를 사용하였고, 평균 중심점 단위 분산 스케일 데이터를통해 각 집잔의 명백한 차이점을 알 수 있었고, 집단을 각각의 샘플 집단에 렌더링하여 1차 조성물 분석에 비해 마커 조성물의 복잡성을 줄일 수 있었다25.
6. 활선상소 제거 능력
좀개구리밥의 활성산소 제거 능력은 Kovatcheva-Apostolova의 방법에 따랐고, 약간 변형하여 실험하였다26. 동결 건조한 좀개구리밥 샘플 0.5 g 을 24시간동안 70% 에탄올 25 ㎖ 로 3번 추출하였다. 샘플을 필터링 하고, 회전 증기 증발기를 사용하여 24시간동안 동결 건조하였다. 추출액(5,000 ㎕/mg) 중 0.1 ㎖ 를 2,2-디페닐-1-피크릴하이드라질(DPPH) 6 X 10-5 μM 용액(DPPH. Sigma, St.Louis 미국) 3.9 ㎖ 와 혼합한 후 실온의 암실에서 30분 동안 배양하였다. 좀개구리밥의 항산화 능력은 마이크로플레이트 스펙트로포토미터(xMark, Biorad, 미국)를 사용하여 515 nm 에서 측정하였다. 활성산소 제거 능력은 다음의 식을 사용하였다: DPPH 활성산소 제거 능력 (%) = [(A대조군-A샘플)/A대조군]ⅹ100
A샘플은 샘플이 없을 때의 흡광도 이고, A샘플은 샘플이 있을 때의 흡광도 이다.
7. 티로시나아제 억제 능력
티로시나아제 억제 능력은 Kubo에 의해 개발된 방법을 약간 수정하여 분석하였다27. 0.1 M 포타슘 인산 완충용액(pH=6.8) 제조를 위해 St.Louis(미국)에서 인산이칼륨(K2HPO4) 및 인산이수소이칼륨(KH2PO4) 용액을 구입하였다. 배양용액은 0.1 M 포타슘 인산 완충용액 1.8 ㎖ 및 탈이온수 0.5 ㎖과 혼합하였다. 샘플(5,000 ㎍/㎖) 0.1 ㎖ 및 티로시나아제(100 unit/㎖) 0.1 ㎖ 을 혼합액에 첨가하여 25℃에서 10분 동안 배양하였다. 배양 후 L-DOPA(6.3 mM, 3,4-디하드록시-L-페닐알라닌)을 0.4 ㎖ 첨가하였다. 티로시나아제 억제 능력은 마이크로플레이트를 사용하여 492 nm에서 3분 동안 일차 증가량의 기울기로 측정하였다.
8. 페놀성 화합물의 총량
다양한 배양조건에서 자란 좀개구리밥에 존재하는 페놀성 화합물의 총량의 측정을 위해, 좀개구리밥 추출물 0.1 ㎖을 이온수 4.9 ㎖과 혼합하였고, 폴린(folin) 및 Ciacalteu's 페놀 시약(Sigma, 미국)을 0.4 ㎖을 첨가하였다. 실온에서 2분 동안 배양 후 20 ％(중량/부피) 소듐 카보네이트 용액 1.5 ㎖을 첨가하였다. 마이크로플레이트 스펙트로포토미터로 765 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과는 갈산 표준 곡선으로 정량하였고, 건조 중량당(g) 갈산의 중량(mg)으로 표기하였다2 8.
결과 및 고찰
1. 프롤린과 수크로오스의 다양한 농도가 바이오매스 축적에 미치는 영향
다양한 프롤린과 수크로오스의 농도가 좀개구리밥의 성장에 주는 영향을 규명하였다. 오레가노(oregano)는 프롤린 5 mM 및 10 mM 에서 성공적으로 배양되었다는 보고가 있지만29, 좀개구리밥은 프롤린 5 mM 및 10 mM을 외부에서 공급하면 그 성장이 지연된다는 보고가 있다. 식물의 종류에 따라 각각 성장 저해율이 다른 것은 각각의 식물 종류에 따른 프롤린의 흡수율 차이에 의해 외부의 프롤린에 다양하게 반응하는 결과가 초래된다는 것을 암시한다30 -32. 따라서, 본 발명자들은 배지내에서 프롤린의 농도를 0.5 mM 및 1 mM로 낮추었다. 좀개구리밥을 수크로오스 3％ 및 프롤린 0.5 mM 조건에서 42일 동안 배양한 결과, 매우 높은 바이오매스의 축적을 나타내었고, 수크로오스 3%, 프롤린 1 mM 조건과 수크로오스 3% 및 프롤린 0 mM 순서로 바이오매스의 축적이 높았다(도 1). 수크로오스 6% 에서는 프롤린이 좀개구리밥의 성장 증진에 아무런 영향을 미치지 않았다.
2. 프롤린과 수크로오스의 다양한 농도가 좀개구리밥 배양의 대사물질 프로파일에 미치는 영향
프롤린(0.5 mM, 1 mM)과 수크로오스(3％, 6％)가 대사물질 프로파일에 미치는 영향을 분석하기 위하여 대사물질을 GC-MS를 사용하여 분석하였고, 분석 결과를 다음 표 1에 나타냈다. 하기 표 1에서 GC-MS 분석결과 각 값은 3회의 실험 결과의 평균이며, 3％ 수크로오스/0 mM 프롤린:3S, 3％ 수크로오스/0.5 mM 프롤린: 3S0.5P, 3％ 수크로오스/1 mM 프롤린:3S1P, 6％ 수크로오스/0 mM 프롤린:6S, 6％ 수크로오스/0.5 mM 프롤린: 6S0.5P 및 6% 수크로오스/1 mM 프롤린: 6S1P로 기입하였다. ND는 아무것도 관찰되지 않았음을 의미하고 유기물질들의 상대적인 값은 각각의 대사물질들의 면적을 내부표준물질의 면적으로 나눈 퍼센트(％) 값이다.
구성물 머무름
시간 		각 샘플의 상대적인 강도
3S 3 S0 .5P 3 S1P 6S 6 S0 .5P 6 S1P
알카로이드
몰피난 51.3 0.287ac±0.007 0.180b±0.021 0.132b±0.011 0.295a±0.028 0.201bc±0.005 0.160b±
0.012
아미노산
글리신 8.7 ND ND 0.057b±0.004 ND ND ND
알라닌 8.8 0.148a±0.005 0.142a±0.012 0.132a±0.010 0.178a±0.011 0.467b±0.021 0.490b±0.055
N-카르복시 글리신 9.3 0.547a±0.041 ND ND ND ND ND
발린 11.5 ND 0.059±0.006 0.060±0.004 ND 0.095±0.005 0.080±0.010
아이소루신 11.6 0.017a±0.0002 0.042b±0.005 ND ND ND ND
트레오닌 13.2 0.087a±0.003 0.066ab±0.006 0.054b±0.004 0.057b±0.004 0.077ab±0.005 0.080ab±0.010
세린 14.1 ND 0.047b±0.005 0.034b±0.004 ND 0.059b±0.006 0.056b±0.005
프롤린 16.1 0.085a±0.020 0.085a±0.011 0.206b±0.009 0.196b±0.012 0.609c±0.038 0.699ab±0.016
아스파라긴 20.5 2.432a±0.175 4.416b±0.537 3.442ab±0.213 0.622c±0.010 0.385c±0.010 0.329c±0.031
글루타민 25.5 0.583a±0.035 ND ND 0.218c±0.010 ND ND
트립토판 39.8 0.040a±0.002 ND ND 0.026c±0.002 ND ND
지방산
글리세르산 12.2 ND ND ND 0.013b±0.001 ND ND
라우르산 19.9 0.006a±0.001 ND ND ND ND ND
팔미트산 37.5 0.399a±0.018 0.321a±0.031 0.247a±0.003 0.748b±0.059 0.408a±0.002 0.408a±0.006
α-리놀렌산 39.9 0.075a±0.003 0.050a±0.001 ND 0.654b±0.047 0.059a±0.006 0.380b±0.032
스테아르산 40.3 0.760a±0.037 0.578bc±0.047 0.458c±0.005 0.717ab±0.060 0.586abc±0.003 0.547bc±0.032
유기산
젖산 9.1 ND 0.258b±0.012 ND ND ND ND
아세트산 9.3 ND ND ND ND ND 0.034±0.019b
말론산 10.7 0.010a±0.004 ND ND ND ND ND
γ-아미노 부티르산 11.7 0.105a±0.016 0.180ab±0.018 0.200ab±0.017 0.180ab±0.001 0.213b±0.001 0.405c±0.040
숙신산 12.0 0.039a±0.002 0.519b±0.045 0.322c±0.024 0.034a±0.002 0.077a±0.005 0.028a±0.002
푸마르산 12.6 0.024a±0.001 0.038b±0.006 0.032ab±0.003 0.022a±0.0005 0.036a±0.0002 ND
프로파논산 17.9 ND ND ND 0.034b±0.005 0.024b±0.006 ND
미리스트산 31.0 0.025a±0.001 ND ND 0.027a±0.004 ND 0.023a±0.003
시트르산 33.0 ND 0.201b±0.023 0.079c±0.007 ND 0.018a±0.0001 ND
인산 39.4 0.008a±0.002 0.467bc±0.048 0.195a±0.015 0.699d±0.049 0.503bcd±0.038 0.538bcd±0.063
글루쿠론산 41.6 3.137a±1.559 ND ND 3.631a±0.278 ND ND
α-토코페롤 (비타민 E) 47.9 0.048a±0.005 ND ND 0.051a±0.003 ND ND
페놀
신남산 38.2 0.046a±0.001 0.079c±0.012 0.047a±0.003 0.030ab±0.003 0.018b±0.0002 0.024a±0.006
파이토스테롤
캄페스테롤 49.2 ND ND ND 0.034b±0.003 ND ND
스티그마스테롤 49.5 0.046a±0.002 0.072b±0.009 ND 0.037a±0.004 ND ND
β-시토스테롤 50.3 0.017a±0.0002 ND ND 0.020a±0.005 ND ND
퓨린
N-아데닌 31.4 ND ND ND 0.007b±0.0005 ND ND
당류
리보오스 20.8 ND ND ND 0.038b±0.003 ND ND
소르보오스 32.4 ND 0.068b±0.004 ND ND ND ND
프럭토오스 32.8 0.996a±0.971 6.643a±0.642 2.817a±0.199 4.100a±1.062 73.157b±0.798 33.025c±2.957
글루코피라노오스 33.6 1.382a±0.635 1.818a±0.199 3.591a±0.193 ND 22.260b±0.455 20.627b±1.696
만노오스 33.8 0.853a±0.766 5.539b±0.511 5.083b±0.338 6.937bc±0.448 12.899d±0.059 8.571c±0.787
갈락토오스 34.9 0.328a±0.158 0.809a±0.082 0.022a±0.001 ND 52.379b±0.514 ND
자일로오스 34.9 ND ND 2.932b±0.994 ND ND 1.386ab±0.129
이노시톨 35.5 ND 0.031b±0.004 0.024b±0.001 ND 0.107c±0.001 0.070d±0.006
글루코오스 35.7 ND ND ND ND ND 41.271b±3.699b
멜리비오스 47.6 ND ND ND 0.400b±0.031 0.118c±0.011 0.193d±0.019
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 외부에서 첨가되는 프롤린이 내부의 아미노산의 함량에 미치는 영향은 수크로오스의 농도에 따라 다양하게 나타났다. 배양액에 프롤린을 첨가할 경우, 아스파라긴의 양은 수크로오스 3 ％ 에서 유의하게 증가하였지만, 수크로오스 6％ 에서는 변화가 없었다. 그러나 프롤린이 첨가된 수크로오스 6 ％에서 알라닌의 양이 유의하게 증가한 반면, 수크로오스 3％ 에서는 변화가 없었다.
가장 일반적인 삼투물질의 하나인 프롤린의 삼투보호효과는 많이 알려져 있다. 삼투압 스트레스 상태에 있는 식물은 프롤린의 분해가 감소되어 프롤린의 양이 높게 축적이 되고, 프롤린의 생합성이 증가된다33. 그 결과, 식물은 상기 메커니즘을 이용하여 삼투압 스트레스 인자들로부터 자신을 보호한다3 4.
수크로오스 6% 에서 배양한 좀개구리밥은 수크로오스 3% 에서 배양한 것에 비해 내부의 프롤린의 양이 높았고, 이는 이전의 보고된 연구와 일치하였다21. 다른 조건 보다 프롤린 0.5 mM 에서 좀개구리밥을 배양한 경우 젖산, 숙신산, 푸마르산 및 시트르산 같은 유기화합물의 양이 높았다. 수크로오스 6% 조건에서 배양한 경우, 몰피난 함량은 0.295를 나타냈었고, 이는 4 종류의 실험 조건 중 가장 높은 수치였다. 다음으로 수크로오스 3% 조건에서 배양한 경우 몰피난은 0.287을 나타내었고, 수크로오스 6% 조건에서 프롤린 0.5 mM을 첨가할 경우, 0.201을 나타내었다. 또한, 수크로오스 3% 조건에서 프롤린 0.5 mM을 첨가한 경우와, 수크로오스 6% 조건에서 프롤린 1 mM을 첨가한 경우, 몰피난 함량은 각각 0.180 및 0.160을 나타냈고, 수크로오스 3% 조건에서 프롤린 1 mM을 첨가한 경우, 0.132 로 가장 낮은 몰피난 함량을 나타내었다. 수크로오스 3% 및 6% 조건에서 외부에서 프롤린을 0.5 mM 및 1 mM을 첨가한 경우 좀개구리밥의 알카로이드 화합물인 몰피난의 함량은 유의하게 감소하였다.
프롤린이 없는 수크로오스 6% 조건에서 배양된 샘플에서 팔미트산, α-리놀렌산 및 스테아르산이 주요 지방산으로 나타났다. 이 중 팔미트산과 α-리놀렌산은 다른 조건의 샘플보다 상기 조건에서 가장 높았다. 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 β-시토스테롤 역시 상기 조건에서 배양된 샘플에서 주요하게 높았다.
프럭토오스, 글루코피라노오스, 만노오스, 갈락토오스 및 멜리비오스는 좀개구리밥 샘플에서 주로 관찰된 당이었고, 그 양은 수크로오스 3％에 비해 수크로오스 6％ 조건에서 배양된 샘플에서 보다 높게 관찰 할 수 있었다. 게다가 수크로오스 3％와 6％에 프롤린 0.5 mM 및 1 mM을 추가하여 배양한 경우 모두에서 식물체 내부의 당의 양이 증가하였다.
신남산은 본 연구에서 관찰된 좀개구리밥의 유일한 페놀성 화합물이었다. 신남산의 함량은 프롤린 0.5 mM을 첨가한 경우 유의하게 증가하였다. 신남산은 항알러지, 항염, 항산화, 항미생물, 항혈전, 심장보호, 혈관 확장, 항박테리아 및 타감작용과 같은 광범위한 생물학적 기능을 하는 페놀성 화합물이다35 -39. 다른 조건에서 배양한 좀개구리밥에 비해 수크로오스 3％ 및 프롤린 0.5 mM을 첨가한 조건에서 배양한 좀개구리밥에서 신남산의 함량이 매우 유의하게 높았다(표 1).
각각 샘플의 대사물질 프로파일을 비교하기 위하여, GC-MS에서 확보한 데이터베이스를 부분최소제곱분포분석(PLS-DA)을 통해 분석하였다. 도 2는 PLS-DA에서 구하여진 스코어 플롯과 로딩 플롯이다. 좀개구리밥 배양시 프롤린은 외부에서 추가되었기 때문에, PLS-DA 플롯 값 작성시 프롤린은 제외하였다. 다양한 프롤린과 수크로오스에서 배양된 샘플사이에서 명확한 차이가 있었다. PLS 구성 1은 주로 프롤린의 농도에 의해 분리된 샘플이고, PLS 구성 2는 수크로오스 농도에 의해 분리된 샘플을 보여준다. 이는 좀개구리밥의 대사물질 프로파일 변화에 있어서 수크로오스보다는 프롤린이 보다 많은 영향을 준다는 것을 의미하였다. 수크로오스 3% 조건과 6% 조건 사이에서 바이오매스의 축적이 유의한 차이를 보였음에도 불구하고, 수크로오스 3% 조건과 6% 조건인 경우 대사물질 프로파일은 유사하였고, 이는 프롤린을 첨가하거나 하지 않은 조건에 따른 차이보다도 더욱 유사하였다. PLS-DA에서 구한 플롯에 의하면 글리신, 알라닌, 발린, 아이소루신, 트레오닌, 세린, 아스파라긴, 젖산, 아세트산, γ-아미노 부티르산, 숙신산, 푸마르산, 시트르산, 인산, 신남산, 소르보오스, 프럭토오스, 글루코피라노오스, 갈락토오스, 자일로오스, 이노시톨 및 글루코오스는 프롤린이 추가된 경우가 높았다. 반면 몰피난, 카르복시글리신, 글루타민, 트립토판, 글리세르산, 라우르산, 팔미트산, α-리놀렌산, 스테아르산, 말론산, 프로파논산, 미리스트산, 글루쿠론산, α-토코페롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, β-시토스테롤, 아데닌, 리보오스 및 멜리비오스는 프롤린이 없는 수크로오스 3％ 와 6％(중량/부피) 조건에서 높았다.
3. 활성산소 제거 능력, 티로시나아제 억제 능력 및 좀개구리밥의 페놀성 화합물 함량
표 2에서 보는바와 같이, 수크로오스 3％에 프롤린 0.5 mM이 첨가된 조건에서 배양한 좀개구리밥에서 활성산소 제거 능력은 가장 높았고, 순차적으로 프롤린이 없는 수크로오스 3％, 프롤린이 1 mM 첨가된 수크로오스 3％ 및 프롤린이 없는 수크로오스 6％ 순서로 활성산소 제거 능력이 높았다. 티로시나아제 억제 능력은 프롤린 1 mM 이 첨가된 수크로오스 3％에서 배양한 좀개구리밥에서 가장 높았고, 순차적으로 프롤린이 1 mM 첨가된 수크로오스 3％, 프롤린이 없는 수크로오스 6％ 및 프롤린이 없는 수크로오스 3％ 순서로 티로시나아제 억제 능력이 높았다. 페놀성 화합물의 총량은 프롤린 0.5 mM 을 첨가한 수크로오스 3％에서 배양한 좀개구리밥에서 가장 높았고, 순차적으로 프롤린이 0.5 mM 첨가된 수크로오스 3％, 프폴린이 없는 수크로오스 3％, 프롤린이 1 mM 첨가된 수크로오스 3％ 및 프롤린이 없는 수크로오스 6％ 순서로 페놀성 화합물 총량이 높았다. 프롤린과 수크로오스의 다양한 농도에서 배양한 좀개구리밥에서의 활성 산소 제거능력, 티로시나아제 억제능력, 총 페놀성 화합물 및 신남산의 함량은 다음 표 2와 같다:
샘플 활성산소
제거 능력 (%)		 티로시나아제
억제 능력(%)		 총 페놀성 화합물 함량
(갈산상당량 mg/
건조중량g)		 신남산 함량
(신남산의 함량을 내부 표준물질로 나눈 값%)
3% 수크로오스 66.3a±2.2 20.6a±0.9 44.6a±2.0 0.046a±0.001
6% 수크로오스 51.7b±0.8 24.2b±0.3 38.0b±3.9 0.030ab±0.003
3% 수크로오스 및 프롤린0.5 mM 69.1c±0.9 43.4c±1.9 49.4c±0.8 0.079c±0.012
3% 수크로오스 및 프롤린 1 mM 60.5d±1.5 27.9d±1.3 38.4b±1.2 0.047a±0.003
아스코르브산
(100 ug/mL)		 70.0c±2.3 - - -
코직산
(50 ug/mL)		 - 44.6c±1.1 - -
하기 표 3은 활성산소 제거 능력 및 티로시나아제 억제 능력과 페놀성 화합물 함량 및 신남산 양과의 상관계수를 보여준다. 좀개구리밥 샘플 농도 5 g/ℓ 에서, 활성산소 제거 능력과 페놀성 화합물 총량 및 신남산의 양과의 상관계수는 0.774 및 0.432, 티로시나아제 억제 능력과 페놀성 화합물 총량 및 신남산의 양과의 상관계수는 0.771 및 0.792 로 나타났다(표 3). 이 결과는 활성산소 제거 능력과 티로시나아제 억제 능력이 샘플 속에 있는 신남산의 양과 좋은 연관성을 보이는 것을 제시하였다. 페놀성 화합물과 티로시나아제 억제 능력간에 양의 상관관계를 보인다는 결과는 이전에도 보고된바 있다40. 그리고 페놀성 화합물, 구체적으로 신남산의 역할은 티로시나아제 억제 능력에 중요하다고 여러해 동안 언급되어 왔다4 1 ,42. 프롤린과 수크로오스의 다양한 농도에서 배양한 좀개구리밥에서의 총 페놀성 화합물 및 상대적인 신남산의 함량과 따른 활성 산소 제거능력 및 티로시나아제 억제능력과의 상관계수는 다음 표 3에 나타내었다:
총 페놀성 함량에 따른 활성 산소 제거능력 상대적인 신남산의 함량에 따른 활성 산소 제거능력 총 페놀성 함량에 따른 티로시나아제 억제능력 상대적인 신남산의 함량에 따른 티로시나아제 억제능력
상관계수 0.774 0.432 0.771 0.792
페놀성 화합물의 주요 건강상 이점은 항산화 기능이고43 ,44, 페놀성 화합물의 총량은 식품의 항산화 능력을 결정하는 주요점이다. 더욱이 항산화 능력과 페놀성 화합물과의 양의 상관성은 여러해 동안 확인되어 왔다46 ,47. 본 발명의 결과에서 일관적으로 제시되는 결과와 같이, 프롤린이 0.5 mM 첨가된 수크로오스 3%에서 배양한 좀개구리밥에서 페놀성 화합물의 총량이 가장 높았고, 활성산소 제거 능력 역시 가장 높았다. 이는 표준 물질로 삼은 아스코르브산(100 ㎎/ℓ) 및 코직산(50 ㎎/ℓ)과 비교해도 유의한 차이는 보이지 않았다. 이 결과는 오레가노 배양에서 프롤린의 첨가는 페놀성 화합물 총량의 증가로 이어진다는 Lattanzio의 연구 결과와도 일치한다29.
결론
본 연구는 프롤린과 수크로오스의 다양한 농도에서 배양한 좀개구리밥 대사물질 프로파일을 GC-MS를 사용하여 측정하였고, 프롤린이 0.5 mM 첨가된 수크로오스 3％에서 배양한 좀개구리밥에서 신남산의 생산이 가장 크다는 것을 규명하였다. 또한 진통효과를 지닌 몰피난 성분이 좀개구리밥에서 최초로 발견되었으며, 프롤린은 몰피난의 생성을 저해하였다. 프롤린이 추가된 조건에서 배양된 좀개구리밥에서 아미노산 및 유기산의 함량이 다른 조건에 비해 증가하였고, 특별히 프롤린이 0.5 mM 첨가된 수크로오스 3% 조건에서 42일 동안 배양된 경우 가장 높은 항산화 능력 및 티로시나아제 억제 능력을 보였고, 덧붙여 바이오매스 축적 및 페놀성 화합물의 총량역시 가장 높게 나타났다. 페놀성 화합물 총량 및 신남산의 양은 좀개구리밥의 활성산소 제거 능력과 티로시나아제 억제 능력에 연관성이 있고, 본 연구는 프롤린이 0.5 mM 첨가된 수크로오스 3%에서 배양한 좀개구리밥은 항산화 능력 및 티로시나아제 억제 능력을 가진 유용물질의 생산에 사용될 수 있음을 제시한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

  1. 프롤린 및 수크로오스를 포함하는 배지에서 좀개구리밥(Lemna minor)을 배양하는 단계를 포함하는 좀개구리밥에서 신남산의 함량을 증가시키는 방법으로서, 상기 배지에 포함된 프롤린의 농도는 0.5 mM이고 수크로오스의 농도는 3중량%인 것을 특징으로 하는 방법.
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