KR101263069B1

KR101263069B1 - 폴리비닐알코올 및 젤라틴을 함유하는 골조직용 지지체 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR101263069B1
Application number: KR1020100048363A
Authority: KR
Inventors: 이병택; 김양희; 구엔두바린
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2010-05-25
Filing date: 2010-05-25
Publication date: 2013-05-09
Also published as: KR20110128990A

Abstract

폴리비닐알코올 및 젤라틴을 함유하는 생체 적합성 섬유 복합체가 개시된다. 해당 생체 적합성 섬유 복합체는, 폴리비닐알코올 및 젤라틴의 혼합 용액을 제조하는 단계 및 상기 혼합 용액을 이용하여 전기 방사 하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의하여 제조될 수 있다. 해당 생체 적합성 섬유 복합체는 약물 전달, 조직공학, 뼈이식재 등과 같은 정형외과와 같은 의료분야에 유용하게 적용될 수 있다.

Description

폴리비닐알코올 및 젤라틴을 함유하는 골조직용 지지체 및 그 제조 방법{Support for osseous tissue comprising polyvinyl alcohol and gelatin and method for preparing the same}

본 명세서는 폴리비닐알코올 및 젤라틴을 함유하는 생체 적합성 섬유 복합체 및 그 제조 방법에 관하여 기술한다. 상세하게는 전기 방사법을 이용하여 제조되는 생체 적합성 섬유 복합체로서, 폴리비닐알코올 및 젤라틴을 함유하는 생체 적합성 섬유 복합체 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 해당 생체 적합성 섬유 복합체는 약물 전달, 조직공학, 뼈이식재 등과 같은 정형외과와 같은 의료분야에 유용하게 적용될 수 있다.

전기 방사법이란 고분자 용액으로부터 전기 장을 이용하여 섬유를 방사하는 방법이다. 즉, 전기 방사법에서는 외부 정전기장에 의해 원뿔 모양의 작은 방울이 형성되는데 이 방울의 표면장력이 전기장에 의해 평형이 생기게 되며, 정전기장이 용액의 표면장력 이상의 값일 때 섬유가 제조될 수 있다.

이는 정전기장이 표면장력 이상의 값일 때 불안정해진 용액방울이 방출되어 컬렉터에 마이크로 또는 나노미터 단위의 섬유가 연속적으로 집전 되는 원리를 이용하는 것이다. 이러한 전기 방사법에 의하면 다양하고 간단하게 기공 구조를 제조할 수 있다.

전기 방사법은 천연고분자, 합성고분자 및 금속이나 세라믹과 같은 나노 분말을 함유하는 고분자를 제조하는 방법에 적용되고 있다.

미세 조직을 가지면서, 결정성, 기계적 특성 및 생체 적합성에서 모두 우수한 폴리비닐알코올 및 젤라틴을 함유하는 생체 적합성 섬유 복합체 및 전기 방사법을 이용한 해당 섬유 복합체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 구현예들에서는, 폴리비닐알코올 및 젤라틴을 함유하는 생체 적합성 섬유 복합체를 제공한다.

본 발명의 구현예들에서는, 또한, 전기 방사법으로 섬유 복합체를 제조하는 방법으로서, 폴리비닐알코올 및 젤라틴의 혼합 용액을 제조하는 단계; 및 상기 혼합 용액을 이용하여 전기 방사 하는 단계;를 포함하는 폴리비닐알코올 및 젤라틴을 함유하는 생체 적합성 섬유 복합체의 제조 방법을 제공한다.

예시적인 구현예에서, 상기 폴리비닐알코올 및 젤라틴을 함유하는 생체 적합성 섬유 복합체는 메탄올로 가교 처리되는 것이 바람직하다.

본 발명의 구현예들에 따른 제조 방법에 의하면, 미세 조직을 가지면서, 결정성, 기계적 특성 및 생체 적합성에서 모두 우수한 폴리비닐알코올 및 젤라틴을 함유하는 생체 적합성 섬유 복합체를 제조할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, 전기방사법을 이용하여 제조한 폴리비닐알코올 및 젤라틴 섬유 복합체에 있어서 그 비율을 달리한 경우[(a) 0/10, (b) 2/8, (c) 6/4, (d) 8/2 및 (e) 10/0; 이 비율은 폴리비닐알코올 용액[폴리비닐알코올 1.2g/10ml 용매(탈이온수)] 및 젤라틴 용액[1.2g 젤라틴/10ml 용매(탈이온수 및 아세트산)]의 중량비이다. 즉, 해당 폴리비닐알코올 용액 중량/해당 젤라틴 용액 중량]의 주사전자현미경 사진을 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 있어서, 도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중 2/8 비율(중량비)의 폴리비닐알코올 및 젤라틴 섬유 복합체에 방사노즐-컬렉터 거리 10cm에서 전압을 변경하여 가하였을 때[(a) 18 kV, (b) 20 kV, (c) 22 kV 및 (d) 24 kV]의 주사전자현미경 사진을 나타내는 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 있어서, 도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중 2/8 비율(중량비)의 폴리비닐알코올 및 젤라틴 섬유 복합체에 22kV 전압에서 방사노즐-컬렉터 거리를 변경하였을 때[(a) 7cm, (b) 10cm, (c) 15cm 및 (d) 20 cm]의 주사전자현미경 사진을 나타내는 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, 폴리비닐알코올 및 젤라틴 섬유 복합체에 있어서 그 중량 비율(도 1에서 설명한 바와 같은 중량 비율)을 달리한 경우[(a) 0/10, (b) 2/8, (c) 6/4, (d) 8/2 및 (e) 10/0]의 시차주사열량계 그래프를 나타내는 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, 폴리비닐알코올 및 젤라틴 섬유 복합체에 있어서 그 중량 비율(도 1에서 설명한 바와 같은 중량 비율)을 달리한 경우[(a) 0/10, (b) 2/8, (c) 6/4, (d) 8/2 및 (e) 10/0]의 X선 회절 분석을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, 폴리비닐알코올 및 젤라틴 섬유 복합체에 있어서 그 중량 비율(도 1에서 설명한 바와 같은 중량 비율)을 달리한 경우[(a) 0/10, (b) 2/8, (c) 6/4, (d) 8/2 및 (e) 10/0]의 응력-변형률 곡선을 각각 나타내는 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, (a) 폴리비닐알코올 섬유, (b) 젤라틴 섬유, (c) 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유[도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중 2/8(중량비)]의 인장 강도 측정 후 파단 표면 주사전자현미경 사진을 각각 나타내는 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, (a) 폴리비닐알코올 섬유, (b) 젤라틴 섬유, (c) 폴리비닐알코올/젤라틴 섬유[도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중 2/8(중량비)], (d) (c) 섬유를 메탄올로 처리하여 가교된 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유의 주사전자현미경 사진을 각각 나타내는 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, (a) 폴리비닐알코올 섬유, (b) 젤라틴 섬유, (c) 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유[도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중 2/8(중량비)], (d) (c) 섬유를 메탄올로 처리하여 가교된 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유의 시차주사열량계 그래프를 각각 나타내는 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, (a) 폴리비닐알코올 섬유, (b) 젤라틴 섬유, (c) 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유[도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중 2/8(중량비)], (d) (c) 섬유를 메탄올로 처리하여 가교된 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유의 응력-변형률 곡선을 각각 나타내는 것이다.
도 11은 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, (a) 폴리비닐알코올 섬유, (b) 젤라틴 섬유, (c) 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유[도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중 2/8(중량비)]를 메탄올로 처리하여 가교된 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유의 MG-63 조골세포 독성평가를 나타내는 결과 사진이다.
도 12a는 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, (a) 폴리비닐알코올 섬유, (b) 젤라틴 섬유, (c) 폴리비닐알코올/젤라틴 섬유[도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중 2/8(중량비)]를 메탄올로 처리하여 가교된 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유의 광학밀도를 나타내는 결과 사진이다.
도 12b는 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, 도 13a의 각 섬유에 대하여 면역화학염색분석 결과를 나타내는 것이다.
도 13은 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, 대조군 (a, b, c), 폴리비닐알코올/젤라틴 섬유[도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중 2/8(중량비)]를 메탄올로 처리하여 가교된 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유에 MG-63 조골세포를 1, 3 및 5일 동안 배양 후(각각 d, e, f)의 주사전자현미경 사진을 각각 나타내는 것이다. 위 대조군 a, b, c는 세포 배양시 사용하는 플레이트(멸균된 well)에 대한 것이다.

이하, 본 발명의 예시적인 구현예들을 설명한다.

폴리비닐알코올(PVA)은 반결정 및 친수성 고분자로 우수한 화학적 및 열 안정성을 보여주며 우수한 생체 적합성을 가진다.

또한, 젤라틴은 많은 기능성 그룹(glycine, proline, glutamic acid, hydroxyproline, arginine, alanine, aspartic acid and other amino acids)을 포함하고 있는 콜라겐으로부터 유래된 천연고분자로 우수한 생체친화력 및 생분해력을 가지고 있다.

본 발명의 구현예들에서는 폴리비닐알코올 및 젤라틴을 모두 포함하도록 하는 한편, 이를 특히 섬유 상으로 제조하도록 한다. 해당 섬유 복합체는 마이크로 내지 나노(100nm 이하) 사이즈 직경을 가지는 것으로서 미세 조직을 가지면서, 결정성, 기계적 특성 및 생체 적합성에서 모두 우수하다.

본 발명의 구현예들에서는, 또한, 전기 방사법(micro electrospinning)으로 섬유 복합체를 제조하는 방법으로서, 폴리비닐알코올 및 젤라틴을 함유하는 생체 적합성 섬유 복합체의 제조 방법을 제공한다.

구체적으로, 생체 적합성 섬유 복합체를 제조하는 방법은 다음과 같다.

폴리비닐알코올 및 젤라틴을 함유하는 용액을 제조한다(S1). 이 용액의 제조는 다음과 같이 할 수 있다.

우선, 폴리비닐알코올 분말을 탈이온수에서 교반하여(예컨대, 3 시간동안 80℃에 교반)하여 폴리비닐알코올 용액을 제조한다.

또한, 젤라틴은 탈이온수 및 아세트산의 혼합 용매(예컨대, 탈이온수:아세트산의 비율을 1:9로 한 용매)에서 교반(예컨대, 상온에서 30분 동안 교반)시킨다. 참고로, 아세트산은 전기전도도가 높은 용매이기 때문에 전기방사시에 적합한 용매이며, 탈이온수만을 가지고 방사하였을 때 보다 양호한 섬유를 얻을 수 있다.

젤라틴 용액을 폴리비닐알코올 용액에 서서히 넣어 원하는 특정 비율로 폴리비닐알코올 및 젤라틴의 혼합 용액을 제조하도록 한다. 이 혼합액을 예컨대 15분 동안 교반한다. 기포가 관찰되면, 기포를 없애기 위해 교반을 멈추도록 한다.

이상의 각 용액을 혼합하여 후술하는 전기 방사를 수행하는 경우 용매는 증발하고 고분자 자체만 섬유 형태로 제조될 수 있다.

다음으로, 폴리비닐알코올 및 젤라틴의 혼합 용액을 이용하여 전기 방사를 수행한다(S2).

전기 방사 장치는 일반적으로 잘 알려진 공지의 전기 방사 장치를 사용할 수 있다. 해당 용액을 전기 방사 장치의 주사기에 넣고 전기 방사 조건을 다르게 하여 방사를 수행하여 전기 방사 조건에 따른 영향을 평가하였다.

전기 방사 조건으로서 폴리비닐알코올 용액[폴리비닐알코올 1.2g/10ml 용매(탈이온수)] 및 젤라틴 용액[1.2g 젤라틴/10ml 용매(탈이온수 및 아세트산)]의 중량비를 각각 달리하거나, 전기 방사 장치의 전압을 달리하거나, 방사 노즐 및 컬렉터 사이의 거리(TCD- tip-to-collector distance)를 달리하도록 한다. 위 전기 방사 조건 중 특히 방사 노즐 및 컬렉터 사이의 거리가 섬유 직경에 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있으므로, 해당 변수를 조절함으로써 섬유 직경을 조절할 수 있다.

예시적인 하나의 구현예에서, 상기 혼합 용액을 폴리비닐알코올 용액 및 젤라틴의 용액의 혼합 용액으로 하는 경우, 폴리비닐알코올 용액[폴리비닐알코올 1.2g/10ml 용매(탈이온수)] 및 젤라틴 용액[1.2g 젤라틴/10ml 용매(탈이온수 및 아세트산)]의 중량비는 2:8인 것이 골조직을 위한 지지체에 적합한 인장강도가 높다는 측면에서 바람직하다.

예시적인 하나의 구현예에서, 상기 전기 방사 시, 방사 노즐 및 컬렉터의 거리는 7~10cm인 것이 바람직하고, 10cm인 것이 더욱 바람직하다.

예시적인 하나의 구현예에서, 상기 전기 방사 시, 방사 전압은 방사노즐 및 컬렉터 사이의 거리가 10cm인 경우 24kV인 것이 바람직하다.

한편, 제조된 폴리비닐알코올 및 젤라틴 섬유 복합체는 메탄올 처리하는 것이 바람직하다. 폴리비닐알코올 및 젤라틴 섬유 복합체는 친수성 고분자이므로 상온 또는 체온에서의 물이나 세포 배양 배지에 쉽게 용해될 수 있으므로 해당 섬유 복합체에 메탄올 처리하여 가교하는 것이 바람직하다. 이와 같이 가교한 경우에는 특히 섬유 구조가 치밀하게 될 뿐만 아니라 강도도 증가할 수 있다.

이하, 비제한적이고 예시적인 실시예 및 이에 대한 비교예를 통하여 본 발명의 예시적인 구현예 중 하나를 더욱 상세히 설명한다.

[폴리비닐알코올 및 젤라틴을 함유하는 생체 적합성 섬유 복합체 제조]

폴리비닐알코올 분말을 탈이온수에서 80℃에 용해하여 폴리비닐알코올 용액(12 wt%)을 제조하였다.

젤라틴을 탈이온수 및 아세트산의 혼합 용매[탈이온수: 아세트산=1:9 (부피 비)]에 상온에서 30분동안 교반하여 젤라틴 용액(12 w/v%)을 제조하였다.

위 젤라틴 용액을 폴리비닐알코올 용액에 각각 다른 비율[폴리비닐알코올/젤라틴 = 10/0(비교예 1), 8/2(실시예 1), 6/4(실시예 2), 2/8(실시예 3), 0/10(비교예 2), 중량비]로 넣어 폴리비닐알코올/젤라틴 혼합용액을 15분 동안 교반하여 준비하였다.

해당 실시예 및 비교예의 폴리비닐알코올/젤라틴 용액을 이용하여 전기 방사를 수행하였다. 전기 방사 장치는 공지의 장치를 사용하였다(eS-robot, Electro-spinning/Spray system, NanoNC, Korea).

10ml 주사기에 직경이 25게이지(내부직경 0.25mm)인 방사 노즐을 끼워놓고 주사기펌프(lure-lock type, Nano NC, Korea)의 방사 속도를 조절하여 전기 방사하였다. 참고로, 위 폴리비닐알코올/젤라틴 혼합용액을 교반 시 기포를 관찰한 경우 기포를 없애기 위해 교반을 멈추고 30분 후에 전기 방사를 위해 폴리비닐알코올/젤라틴 혼합용액을 주사기에 넣었다.

스테인레스 재질의 원통형을 섬유 컬렉터로 사용하였으며 전기 방사 전압은 고전압공급기(NNC30 kilovolts 2mA portable type, Korea)로 전압 인가하였다.

후술하듯이, 전압 인가 시 인가 전압을 달리하였다. 또한, 전기 방사 시의 방사 노즐과 컬렉터 사이의 거리를 달리하였다.

또한, 후술하듯이, 가교 처리를 한 것과의 대비를 위하여 필요한 경우에, 얻어진 섬유 복합체를 24 시간 동안 메탄올에 넣어 가교 처리한 후 24시간 동안 상온의 진공에서 건조하였다.

[실시예 및 비교예 섬유 복합체 특성 평가]

조골세포(MG-63)를 10% 송아지우태혈청(FBS, fetal bovine serum, Sigma), 5% 항생제 (penicillinstreptomycin, Sigma)를 넣은 DMEM(HyClone, Logan, UT, USA)배지에 습도 5%, 온도 37℃의 CO₂인큐베이터에서 배양하였다.

세포독성평가를 ISO 10993 기준에 의거하여 수행하였으며 3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma)으로 제조된 실시예 및 비교예 복합 섬유 지지체에 대한 조골세포(MG-63)의 독성평가를 수행하였다.

용출액은 DMEM 배지에 지지체를 담근 후에 72시간 동안 37℃의 진탕 인큐베이터에서 용출시켰다. 용출액과 배지를 각각 다른 비율(25%, 50%, 75%, 100%)로 하여 세포를 1, 3 및 5일로 배양하였으며 각각 다른 용출비율에 따른 흡광도를 측정하였다(EL, 312, Biokinetics reader, Bio-Tek instruments).

세포를 lysis buffer(Tris 50 mM, pH 7.4, NaCl 40 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 0.5%, Na₃VO₄ 1.5mM, NaF 50mM, sodiumpyrophosphate 10mM, glycerol -phosphate 10mM, PMSF 1mM, Proteaseinhibitorcocktail 10mM)로 수세 및 수확하여 4℃에서 1300rpm로 10분 동안 원심분리하였다.

그 후 30㎍의 단백질로 1:1000 희석된 (anti-PCNA)을 사용하여 면역화학염색법을 수행하였다. anti-β actin 항체를 대조군으로 하였으며 면역복합체는 화학발광 용액 (ECL, Amersham)으로 확인하였다.

실시예 및 비교예의 복합 섬유 지지체를 UV로 6 시간동안 노출시킨 후 70% 에탄올에 30분 동안 두어서 멸균하였다.

수세는 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 한 후 조골세포(MG-63)를 실시예 및 비교예의 복합 섬유 지지체 및 대조군[세포 배양시 사용하는 플레이트(멸균된 well)] 플레이트에 각각 분주하였다.

주사전자현미경(JSM-5410LV, JEOL, Japan) 관찰을 위해 세포를 2 v/v% 글루탄알데하이드로 고정시키고 에탄올 (50%, 70%, 90%, 및 100%)로 탈수시킨 후 hexamethyldisilazane (HMDS, Sigma)로 건조하였다.

[특성 평가 결과]

도 1은 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, 전기방사법을 이용하여 제조한 폴리비닐알코올 및 젤라틴 섬유 복합체에 있어서 그 비율을 달리한 경우[(a) 0/10, (b) 2/8, (c) 6/4, (d) 8/2 및 (e) 10/0; 이 비율은 폴리비닐알코올 용액[폴리비닐알코올 1.2g/10ml 용매(탈이온수)] 및 젤라틴 용액[1.2g 젤라틴/10ml 용매(탈이온수 및 아세트산)]의 중량비이다. 즉, 해당 폴리비닐알코올 용액 중량/해당 젤라틴 용액 중량]의 주사전자현미경 사진을 나타내는 것이다. 여기서, 전기 방사시 전압은 22kV로 하였고, 방사노즐 및 컬렉터 간 거리는 10cm로 하였다.

도 1로부터 알 수 있듯이, 얻어진 섬유 직경은 대략 50nm 내지 150nm이었다.

도 2는 본 발명의 실시예에 있어서, 도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중 2/8 비율(중량비)의 폴리비닐알코올 및 젤라틴 섬유 복합체에 방사노즐-컬렉터 거리 10cm에서 전압을 변경하여 가하였을 때[(a) 18 kV, (b) 20 kV, (c) 22 kV 및 (d) 24 kV]의 주사전자현미경 사진을 나타내는 것이다.

도 2의 섬유 형태로부터 알 수 있듯이, 가장 바람직한 전압은 22kV(방사노즐과 컬렉터 사이의 거리가 10cm인 경우)임을 알 수 있었다.

도 2a 및 b의 경우, 즉 18kV 및 20kV에서 덩어리 진 부분들이 있었고, d이 경우인 24kV에서는 섬유가 끊어진 부분들이 있었지만, c의 경우인 22kV에서는 그러한 덩어리 진 부분이나 끊어진 부분 없이 양호하였다.

그러나, 각각 다른 전압 인가하였음에도 불구하고 섬유 직경이 90±20 nm으로 섬유 복합체에 큰 영향을 주지는 않는 것을 알 수 있었다.

도 3은 본 발명의 실시예에 있어서, 도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중 2/8 비율(중량비)의 폴리비닐알코올 및 젤라틴 섬유 복합체에 22kV 전압에서 방사노즐과 컬렉터 거리를 변경하였을 때[(a) 7cm, (b) 10cm, (c) 15cm 및 (d) 20 cm]의 주사전자현미경 사진을 나타내는 것이다.

도 3에서 알 수 있듯이, 방사노즐과 컬렉터 거리가 7cm 에서 20cm로 증가함에 따라 나노 섬유 직경이 대략 80nm에서 350nm로 크게 증가함을 알 수 있었다. 이는 방사노즐과 컬렉터 거리에 따라 제조된 섬유 복합체의 섬유 직경에 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.

구체적으로, 7cm, 10cm 인 경우에는 섬유직경이 100nm 이하로 제조되고, 15cm, 20cm인 경우에는 섬유 직경이 100nm 이상의 마이크로미터로 제조되었다. 또한 7cm와 10cm를 비교하였을 때 10cm인 경우가 주사전자현미경 사진으로 보았을 때, 섬유가 덩어리 지어지지 않고 실가락처럼 되어있어서 양호하였다. 반면, 7cm인 경우에는 실가락처럼 된 부분도 있지만 덩어리 지어있는 부분도 발견되었다.

도 4는 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, 폴리비닐알코올 및 젤라틴 섬유 복합체에 있어서 그 중량 비율[도 1에서 설명한 바와 같은 중량 비율]을 달리한 경우[(a) 0/10, (b) 2/8, (c) 6/4, (d) 8/2 및 (e) 10/0]의 시차주사열량계 그래프를 나타내는 것이다. 도 4에서 대략 228에서의 피크는 폴리비닐알코올 섬유이며, 이는 폴리비닐알코올의 녹는점을 나타낸다. 젤라틴 섬유의 흡열 피크는 95.8이다. 시차주사열량계 곡선에서 폴리비닐알코올 및 젤라틴 복합 섬유 지지체의 피크는 폴리비닐알코올 섬유 피크, 젤라틴 섬유 피크와 거의 일치하였다. 또한, 폴리비닐알코올 및 젤라틴 복합 섬유의 Tg (유리전이온도) 및 Tm (녹는점)은 폴리비닐알코올 섬유 및 젤라틴 섬유의 값과 크게 다르지 않았다.

도 5는 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, 폴리비닐알코올 및 젤라틴 섬유 복합체에 있어서 그 중량 비율[도 1에서 설명한 바와 같은 중량 비율]을 달리한 경우[(a) 0/10, (b) 2/8, (c) 6/4, (d) 8/2 및 (e) 10/0]의 X선 회절 분석을 나타내는 그래프이다.

도 5의 XRD 패턴에서 폴리비닐알코올 섬유 및 젤라틴 섬유의 피크는 대략 19°2 및 22°2이며 강도는 각각 ~15000 및 5000이다. 이는 고분자량의 폴리비닐알코올 섬유가 뛰어난 결정체 특성을 지니는 것을 보여준다. 폴리비닐알코올/젤라틴의 비율을 2/8, 6/4 및 8/2로 한 경우의 복합 섬유에서는 대략 22°2에서 두드러진 피크값을 가지며 7000~ 7500 및 ~10000의 강도값을 나타냈다. 젤라틴 섬유는 전형적인 젤라틴 결정 구조를 가지기 때문에 폴리비닐알코올 및 젤라틴 복합 섬유의 결정성은 젤라틴보다는 오히려 폴리비닐알코올 때문으로 생각된다.

도 6은 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, 폴리비닐알코올 및 젤라틴 섬유 복합체에 있어서 그 중량 비율[도 1에서 설명한 바와 같은 중량 비율]을 달리한 경우[(a) 0/10, (b) 2/8, (c) 6/4, (d) 8/2 및 (e) 10/0]의 응력-변형률 곡선을 각각 나타내는 것이다.

도 6에서 보는 바와 같이, 젤라틴 함량이 증가함에 따라 폴리비닐알코올 및 젤라틴 복합 섬유의 응력 값은 증가하고 변형률은 감소함을 보였다.

도 7은 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, (a) 폴리비닐알코올 섬유, (b) 젤라틴 섬유, (c) 폴리비닐알코올/젤라틴 섬유[도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중 2/8(중량비)]의 인장 강도 측정 후 파단 표면 주사전자현미경 사진을 각각 나타내는 것이다.

도 7에서 특히 횡단면에서 보는 바와 같이 폴리비닐알코올 섬유는 탄성으로 인해 섬유가 서서히 끊어짐을 볼 수 있었다. 이와 반대로 젤라틴 섬유는 취성으로 인해 갑자기 끊어짐을 보였다. 이러한 현상은 폴리비닐알코올 및 젤라틴의 복합 섬유에서도 관찰할 수 있었다.

도 8은 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, (a) 폴리비닐알코올 섬유, (b) 젤라틴 섬유, (c) 폴리비닐알코올/젤라틴 섬유[도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중2/8(중량비)], (d) (c) 섬유를 메탄올로 처리하여 가교된 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유의 주사전자현미경 사진을 각각 나타내는 것이다.

도 8에서 알 수 있듯이, 각 섬유는 대략 50nm 에서 250nm의 직경으로 제조되었음을 관찰할 수 있었으며, 특히 메탄올로 가교 처리한 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유는 치밀한 섬유임을 확인할 수 있었다.

도 9는 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, (a) 폴리비닐알코올 섬유, (b) 젤라틴 섬유, (c) 폴리비닐알코올/젤라틴 섬유[도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중2/8(중량비)], (d) (c) 섬유를 메탄올로 처리하여 가교된 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유의 시차주사열량계 그래프를 각각 나타내는 것이다.

도 9에서 알 수 있듯이, (a) 폴리비닐알코올 섬유, (b) 젤라틴 섬유는 각각 221 및 88의 녹는점을 가지며, 이는 (d) 가교한 복합체 섬유 및 (c) 가교되지 않은 복합체 섬유의 녹는점인 227 및 95와 거의 비슷한 수치를 가짐을 알 수 있었다. 이와 같이 가교된 후에 녹는점이 상승되었음을 확인할 수 있었다. 가교는 고분자 간의 체인을 더 단단하기 때문에 녹는점을 상승하고 기계적 강도도 향상시킨다. 이 결과를 통하여 가교가 성공적으로 이루어진 것을 확인할 수 있었다.

도 10은 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, (a) 폴리비닐알코올 섬유, (b) 젤라틴 섬유, (c) 폴리비닐알코올/젤라틴 섬유[도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중2/8(중량비)], (d) (c) 섬유를 메탄올로 처리하여 가교된 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유의 응력-변형률 곡선을 각각 나타내는 것이다.

도 10에서 알 수 있듯이, 가교 전(c) 및 가교 후(d)의 복합체 섬유의 응력값은 각각 3.6 및 4.2 MPa 보였으며 변형률은 각각 19 및 31%를 나타냈다. 따라서 메탄올의 의한 물리적 가교가 기계적 특성을 향상시켰음을 알 수 있었다.

도 11은 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, (a) 폴리비닐알코올 섬유, (b) 젤라틴 섬유, (c) 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유[도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중 2/8(중량비)]를 메탄올로 처리하여 가교된 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유의 MG-63 조골세포 독성평가를 나타내는 결과 사진이다.

도 11에서 알 수 있듯이, 독성평가 결과 폴리비닐알코올 섬유의 생체적합성은 매우 낮으나 젤라틴 섬유나 가교 후 폴리비닐알코올 및 젤라틴 섬유 지지체는 80%로 우수한 세포 생존율을 보였다. 따라서 해당 폴리비닐알코올 및 젤라틴 섬유 지지체는 조골세포(MG-63) 독성이 없음을 알 수 있었다.

도 11은 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, (a) 폴리비닐알코올 섬유, (b) 젤라틴 섬유, (c) 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유[2/8(중량비)]를 메탄올로 처리하여 가교된 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유의 MG-63 조골세포 독성평가를 나타내는 결과 사진이다.

도 12a는 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, (a) 폴리비닐알코올 섬유, (b) 젤라틴 섬유, (c) 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유[도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중 2/8(중량비)]를 메탄올로 처리하여 가교된 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유의 광학밀도를 나타내는 결과 사진이다.

도 12b는 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, 도 13a의 각 섬유에 대하여 면역화학염색분석 결과를 나타내는 것이다.

도 12a에서는 1, 3 및 5일 동안 용출액을 포함한 배지에 조골세포(MG-63)를 배양시킨 후의 세포 증식률을 나타낸다. 1일 후에 모든 지지체의 초기 세포 분주양보다 증가하였으며 3일 및 5일 후에도 점차 증가함을 보였다.

세포의 증식능을 평가하기 위해 proliferating cell nuclear antigens (PCNA) 면역화학염색법으로 단백질의 발현정도를 확인하였다(도 12b). 참고로, 도 12b에서 control은 세포배양시 쓰는 plate(멸균된 well)을 나타낸다.

젤라틴 지지체에서 5일 동안 배양한 조골세포(MG-63)의 경우 PCNA 단백질 발현의 변화를 확인할 수 없었으며(도 12b, 왼쪽), 이와 반대로 폴리비닐알코올 섬유 지지체 표면에서 증식한 조골세포에서는 PCNA 단백질 발현량이 배양 3일 후부터 서서히 감소하는 경향을 보였다(그림 12b, 오른쪽).

이것으로 보아 폴리비닐알코올 섬유 지지체에서 세포증식의 한계가 있음을 확인할 수 있었으며, 가교된 폴리비닐알코올 및 젤라틴 복합 섬유 지지체에서는 배양 5일 후부터 PCNA 단백질의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다(도 12b, 가운데). 이로써 가교된 폴리비닐알코올 및 젤라틴 복합 섬유 지지체는 조골세포의 증식에 있어서 적합한 지지체임을 알 수 있었다.

도 13은 본 발명의 실시예 및 비교예에 있어서, 대조군 (a, b, c), 폴리비닐알코올/젤라틴 섬유[도 1에서 설명한 바와 같은 비율 중 2/8(중량비)]를 메탄올로 처리하여 가교된 폴리비닐알코올/젤라틴 복합체 섬유에 MG-63 조골세포를 1, 3 및 5일 동안 배양 후(각각 d, e, f)의 주사전자현미경 사진을 각각 나타내는 것이다. 위 대조군 a, b, c는 세포 배양시 사용하는 플레이트(멸균된 well)에 대한 것이다.

1, 3 및 5일 동안 배양 후 대조군 및 가교된 폴리비닐알코올 및 젤라틴 복합제 섬유 지지체에서 조골세포(MG-63)의 부착능 및 퍼짐을 주사현미경으로 관찰한 결과, 1일 후에 조골세포는 섬유 지지체에 잘 부착됨을 보였으며 3일 후의 세포는 섬유 지지체에서 서서히 퍼지고 있음을 관찰할 수 있었다. 5일 동안 배양 후에는 세포의 양은 크게 증가하지 않았으며 이는 지지체의 공간을 이미 세포가 차지했기 때문으로 생각된다.

Claims

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골조직용 지지체를 제조하는 방법으로서,
상기 골조직용 지지체는 폴리비닐알코올 및 젤라틴을 함유하는 섬유 복합체로 이루어지는 것이고,
상기 섬유 복합체는 전기 방사법으로 제조되는 것으로서, 폴리비닐알코올 및 젤라틴의 혼합 용액을 제조하는 단계; 및 상기 혼합 용액을 이용하여 전기 방사 하는 단계; 를 포함하고,
상기 혼합 용액의 제조 단계는, 폴리비닐알코올 분말을 탈이온수에 혼합하여 폴리비닐알코올 용액을 제조하고, 젤라틴을 탈이온수 및 아세트산의 혼합 용매에 혼합하여 젤라틴 용액을 제조한 후, 각각의 폴리비닐알코올 용액 및 젤라틴 용액을 혼합하는 것이며,
상기 전기 방사 시, 폴리비닐알코올 용액과 젤라틴 용액의 중량비는 2:8이고, 상기 폴리비닐알코올 용액은 탈이온수 10㎖에 대하여 폴리비닐알코올 1.2g을 포함하고, 상기 젤라틴 용액은 탈이온수 및 아세트산의 혼합 용매 10㎖에 대하여 젤라틴을 1.2g 포함하되,
상기 전기 방사 시, 방사 노즐 및 컬렉터의 거리는 10㎝이고, 방사 전압은 22kV이며,
상기 제조되는 섬유 복합체는 메탄올로 가교 처리하는 것을 특징으로 하는 골조직용 지지체의 제조 방법.
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