KR101257914B1 - 검체 중에 포함되는 미생물의 생균수 측정에 이용되는 현탁용 희석액 및 생균수 측정 방법 - Google Patents

검체 중에 포함되는 미생물의 생균수 측정에 이용되는 현탁용 희석액 및 생균수 측정 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101257914B1
KR101257914B1 KR1020107029453A KR20107029453A KR101257914B1 KR 101257914 B1 KR101257914 B1 KR 101257914B1 KR 1020107029453 A KR1020107029453 A KR 1020107029453A KR 20107029453 A KR20107029453 A KR 20107029453A KR 101257914 B1 KR101257914 B1 KR 101257914B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
suspension
diluent
sample
tween
bacteria
Prior art date
Application number
KR1020107029453A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110019387A (ko
Inventor
마사미치 무토
Original Assignee
모리나가 뉴교 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 모리나가 뉴교 가부시키가이샤 filed Critical 모리나가 뉴교 가부시키가이샤
Publication of KR20110019387A publication Critical patent/KR20110019387A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101257914B1 publication Critical patent/KR101257914B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

미생물을 함유하는 검체, 특히 분유 등의 분제품에 포함되는 미생물의 생균수 측정에 있어서, 종래보다도 정확한 측정값이 얻어지는 현탁용 희석액 및 생균수 측정 방법을 제공한다. 검체 중에 포함되는 미생물의 생균수 측정을 할 때에, 해당 검체를 현탁액으로 하기 위해 이용되는 현탁용 희석액으로서, 0.5%이상의 농도로 폴리소르베이트류를 함유하는 것을 특징으로 하는 현탁용 희석액. 검체 중에 포함되는 미생물의 생균수 측정 방법으로서, 상기 검체를 0.5%이상의 농도로 폴리소르베이트류를 함유하는 현탁용 희석액을 이용하여 현탁액으로 하는 공정과, 상기 현탁액 중에 포함되는 미생물의 생균수를 측정하는 공정을 가지는 것을 특징으로 하는 생균수 측정 방법.

Description

검체 중에 포함되는 미생물의 생균수 측정에 이용되는 현탁용 희석액 및 생균수 측정 방법{Diluting solution for suspension for use in the measurement of number of living microbial cells contained in sample, and method for measurement of number of living microbial cells}
본 발명은, 검체 중에 포함되는 미생물의 생균수를 측정할 때에, 해당 검체를 현탁액으로 하기 위해 이용되는 현탁용 희석액 및 상기 현탁용 희석액을 이용한 생균수 측정 방법에 관한 것이다.
본원은, 2008년 6월 24일에 일본에 출원된 특원 2008-164226호에 기초하여 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.
비피더스균은 유용한 장내세균 중 하나로서 널리 알려져 있고, 그 생리학적 의의에 대해서는 다수의 보고가 있어, 장내에서 유산, 초산 등의 유기산을 생산하면서 유해균의 증식을 억제하는 작용, 비타민의 생산, 면역력의 부활화 등이 명백히 되어 있다 (비특허문헌 1). 그 때문에, 비피더스균을 섭취함으로써 건강을 유지하는 것을 목적으로 하여, 요구르트, 과자류, 음료류, 건강식품류 등의 비피더스균을 함유하는 여러 가지의 식품이 개발되어 있다 (비특허문헌 2). 또한, 유유아기(乳幼兒期)에서 모유를 접종하는 유유아는 비피더스균이 우세하게 되기 때문에, 일본 외에서는 비피더스균을 포함한 육아용 분유 등도 개발되어 있다.
이와 같이 비피더스균을 함유하는 여러 가지의 식품에 대해서는, 해당 식품에 어느 정도의 균수가 포함되어 있는지를 나타내기 위해 생균수 측정이 행해진다.
미생물의 생균수 측정에 종래 이용되고 있는 방법으로서는, 검체를 포함하는 현탁액을 조제한 후, 상기 현탁액을 희석액 (생리식염수 등)을 이용하여 단계적으로 희석하고, 그들을 혼석법, 평판도말법 등의 배양법에 의해 배양하여, 배지에 형성된 콜로니 수를 카운트하는 방법이 일반적이다. 검체가 분말형상 (예를 들면, 미생물의 균말이나, 분유 등의 분제품)인 경우, 현탁액은 해당 검체에 희석액을 첨가, 교반함으로써 조제되고 있다.
이러한 종래법은, 비피더스균말에 대해 직접 생균수 측정을 하는 경우는 문제가 되지 않지만, 식품 중에 배합된 비피더스균의 생균수를 측정하는 경우, 얻어지는 측정값에 편차가 크고, 또한 상기 측정값이 실제로 포함되어 있는 생균수 (실균수) 보다도 낮은 값이 되는 문제가 있다. 이러한 문제는, 분제품, 특히 분유 중에 배합된 비피더스균의 생균수를 측정하는 경우에 현저하다. 예를 들면, 분유 중에 포함되는 비피더스균의 생균수를 종래법에 의해 측정한 경우, 얻어지는 측정값은 실제로 포함되어 있는 생균수 (실균수) 보다도 대폭적으로 낮은 값 (예를 들면, 실균수의 60~70% 정도)이 되어 버린다.
이와 같이 각종 식품 중에 배합된 비피더스균에 대해서는, 생균수를 정확하게 측정할 수 없기 때문에, 분석 기관 등에서 생균수의 정확한 측정값이 얻어지는 측정 방법의 개발이 기대되었다.
상기와 같은 상황에서, 각종 식품 중의 비피더스균의 생균수 측정에 대한 공정법은 존재하지 않지만, 비특허문헌 3에는, 발효유·유산균 음료 중의 비피더스균의 생균수 측정 방법으로서, 사단법인 전국 발효유 유산균 음료 협회가 권장하는 방법이 기재되어 있다. 상기 방법에서는, 희석액에 대해 식품위생 검사지침에 기재된 염기성 검체 희석액 (이하, 희석액 (A)이라고 함.)이 권장되어 있다. 또한, 상기 비특허문헌 3에는, 희석액 (A) 대신에 생리식염수를 이용할 수 있는 것도 기재되어 있다.
희석액 (A)은, KH2PO4:4.5g, Na2HPO4:6.0g, L-시스테인 HCL·H2O:0.5g, Tween 80:0.5g, 한천:1.0g, 정제수:1,000mL로 이루어지는 액체로, 장내 플로라 중에 존재하는 혐기성균 검출시에 널리 사용되고 있다.
비특허문헌 1: 미츠오카 도모타리 편저, 「비피더스균의 연구」, 제1장, 제9~14페이지, 재단법인 일본 비피더스균 센터 (1994년) 비특허문헌 2: 미츠오카 도모타리 편저, 「비피더스균의 연구」, 제7장, 제267페이지 및 제282페이지, 재단법인 일본 비피더스균 센터 (1994년) 비특허문헌 3: 발효유·유산균 음료 중의 비피더스균의 균수 측정법」, 제6페이지, 사단법인 전국 발효유 유산균 음료 협회 비피더스균 검사법 검토 위원회 (2000년)
그러나, 분제품의 경우, 희석액으로서 상기와 같은 희석액 (A)이나 생리식염수를 이용해도, 분유 등의 분제품 중에 배합된 비피더스균의 생균수의 측정값은, 상기와 같이 실균수보다도 대폭적으로 낮은 값이 되어 버린다.
생균수가 낮게 검출되어 버리는 것은, 예를 들면 육아 분유 등의 분제품에 비피더스균을 배합하는 경우, 해당 분제품 중에 규격값의 배 이상의 비피더스균을 넣을 필요가 있는 등, 경제적인 면에서도 문제가 된다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해 이루어진 것으로, 미생물을 함유하는 검체, 특히 분유 등의 분제품에 포함되는 미생물의 생균수 측정에 있어서, 종래보다도 정확한 측정값이 얻어지는 현탁용 희석액 및 생균수 측정 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는, 면밀히 검토를 행한 결과, 미생물을 함유하는 검체를 현탁액으로 할 때에 이용하는 희석액 (현탁용 희석액)에 소정량 이상의 폴리소르베이트류를 함유시킴으로써 상기 과제가 해결되는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.
상기 과제를 해결하는 본 발명은 이하의 태양을 가진다.
[1] 검체 중에 포함되는 미생물의 생균수 측정을 할 때에, 해당 검체를 현탁액으로 하기 위해 이용되는 현탁용 희석액으로서, 0.5%이상의 농도로 폴리소르베이트류를 함유하는 것을 특징으로 하는 현탁용 희석액.
[2] 상기 폴리소르베이트류의 농도가 0.5% 내지 30%인 [1]에 기재된 현탁용 희석액.
[3] 상기 폴리소르베이트류가 Tween 40, Tween 60 및 Tween 80으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인 [1] 또는 [2]에 기재된 현탁용 희석액.
[4] 상기 미생물이 비피더스균인 [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 기재된 현탁용 희석액.
[5] 검체 중에 포함되는 미생물의 생균수 측정 방법으로서, 상기 검체를 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 기재된 현탁용 희석액을 이용하여 현탁액으로 하는 공정과, 상기 현탁액 중에 포함되는 미생물의 생균수를 측정하는 공정을 가지는 것을 특징으로 하는 생균수 측정 방법.
[6] 상기 미생물이 비피더스균인 [5]에 기재된 생균수 측정 방법.
[7] 상기 검체가 분말형상인 [5] 또는 [6]에 기재된 생균수 측정 방법.
[8] 상기 검체가 육아용 분유인 [7]에 기재된 생균수 측정 방법.
본 명세서 및 청구의 범위에 있어서, 농도 (%)는 w/v (질량/부피)에 의한 값이다.
비피더스균을 분말화한 것을 「비피더스균말」, 비피더스균 이외의 유산균류를 「유산균」, 유산균을 분말화한 것을 「유산균말」이라고 한다. 또한, 미생물의 세포 또는 균체를 합하여 「균체」라고 기재하는 경우가 있다.
여기서, 「비피더스균」은 비피도박테리움 (Bifidobacterium)에 속하는 미생물을 나타낸다. 「유산균류」는, 발효에 의해 유산을 생산하는 혐기성의 세균을 나타낸다.
본 발명에 의하면, 미생물을 함유하는 검체, 특히 분유 등의 분제품에 포함되는 미생물의 생균수 측정에 있어서, 종래보다도 정확한 측정값이 얻어지는 현탁용 희석액 및 생균수 측정 방법을 제공할 수 있다.
<현탁용 희석액>
본 발명의 현탁용 희석액은, 0.5%이상의 농도로 폴리소르베이트류를 함유한다.
폴리소르베이트류는, 소르비탄 지방산 에스테르에 에틸렌옥시드가 축합한 것 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르)이다. 소르비탄 지방산 에스테르에 축합하는 에틸렌옥시드의 수는 통상 약 20 분자이다.
소르비탄 지방산 에스테르는, 소르비톨과 지방산을 반응시킴으로써 얻어지고, 지방산으로서는, R-COOH에서의 R이 탄소수 11~17의 포화 또는 불포화 탄화수소기인 것이 일반적이다. 지방산의 구체예로서는, 라우린산, 스테아린산, 팔미틴산, 올레인산 등을 들 수 있다.
폴리소르베이트류로서, 구체적으로는 트윈 (이하, 「Tween」이라고 기재함.) 20, Tween 40, Tween 60, Tween 65, Tween 80 등을 들 수 있다.
Tween 20은, 폴리소르베이트 20, 모노라우린산 폴리옥시에틸렌 소르비탄 (Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate)이라고도 칭한다.
Tween 40은, 폴리소르베이트 40, 모노팔미틴산 폴리옥시에틸렌 소르비탄 (Polyoxyethylene Sorbitan Monopalmitate)이라고도 칭한다.
Tween 60은, 폴리소르베이트 60, 모노스테아린산 폴리옥시에틸렌 소르비탄 (Polyoxyethylene Sorbitan Monostearate)이라고도 칭한다.
Tween 65는, 폴리소르베이트 65, 트리스테아린산 폴리옥시에틸렌 소르비탄 (Polyoxyethylene Sorbitan Tristearate)이라고도 칭한다.
Tween 80은, 폴리소르베이트 80, 모노올레인산 폴리옥시에틸렌 소르비탄 (Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate)이라고도 칭한다.
이들 폴리소르베이트류는 모두 시판의 것을 이용할 수 있다.
본 발명에 이용되는 폴리소르베이트류는, 본 발명의 효과가 뛰어나기 때문에, Tween 40, Tween 60 및 Tween 80으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종이 바람직하다.
현탁용 희석액 중, 폴리소르베이트류의 농도는 0.5%이상이고, 1%이상이 바람직하다. 폴리소르베이트류의 농도가 0.5%미만이면, 본 발명의 효과를 얻을 수 없다.
또한, 폴리소르베이트류의 농도가 30%를 넘으면 용해성이 저하되기 때문에, 현탁용 희석액 중의 폴리소르베이트류의 농도는 0.5~30%가 바람직하다. 경제성을 고려하면, 상기 농도는 2%이하가 보다 바람직하다.
본 발명의 현탁용 희석액은, 임의로 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위에서 폴리소르베이트류 이외의 다른 성분을 함유해도 된다.
상기 다른 성분으로서는, 특별히 한정되지 않고, 일반적으로 희석액에 첨가되어 있는 성분을 첨가할 수 있다. 이러한 성분으로서, 구체적으로는 염화나트륨, 인산이수소칼륨, 인산수소이나트륨, L-시스테인염산염-수화물, 한천, 대두펩티드, L-아스코르빈산 나트륨, 펩톤, 효모 추출물, 링거액 등을 들 수 있다.
본 발명의 현탁용 희석액은, 폴리소르베이트류 및 임의의 성분을 물과 혼합함으로써 조제할 수 있다.
상기 본 발명의 현탁용 희석액은, 검체 중에 포함되는 미생물의 생균수 측정을 할 때에, 해당 검체를 현탁액으로 하기 위해 이용된다. 검체 및 생균수의 측정 방법에 대해서는, 자세하게는 이하의 본 발명의 생균수 측정 방법에서 설명한다.
<생균수 측정 방법>
본 발명의 생균수 측정 방법은, 미생물을 함유하는 검체를 상술한 본 발명의 현탁용 희석액을 이용하여 현탁액으로 하는 공정과, 상기 현탁액 중에 포함되는 미생물의 생균수를 측정하는 공정을 가진다.
미생물로서는, 예를 들면 비피더스균, 유산균 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 비피더스균이 바람직하다.
비피더스균으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum subsp. longum), 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium longum subsp. infantis), 비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 브레베 (Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 락티스 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis) 등을 들 수 있다. 이들은 모두 시판되어 있거나 또는 기탁 기관으로부터 용이하게 입수할 수 있는 균주이다. 또한, 분제품, 건강식품에서도 용이하게 구입할 수 있는 제품이다.
유산균으로서는, 락토바실러스속 (Lactobacillus), 락토코커스속 (Lactococcus), 엔테로코커스속 (Enterococcus), 스트렙토코커스속 (Streptococcus) 등을 들 수 있다.
본 발명에 의해 생균수를 측정하는 검체로서는, 미생물을 포함하는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 현탁액의 조제의 용이성 등을 고려하면, 분말형상인 것이 바람직하다.
분말형상의 검체로서, 구체적으로는 분제품에 비피더스균, 유산균 등의 미생물의 균체가 배합된 것을 들 수 있다. 분제품으로서는, 예를 들면 육아용 분유, 임부용 분유 등의 분유를 들 수 있다. 또한, 미생물의 균체가 배합된 고형의 검체에 대해 분쇄 처리를 하여 분말형상으로 한 것이어도 된다.
본 발명에 있어서, 검체로서는, 육아용 분유, 특히 비피더스균을 포함하는 육아용 분유가 바람직하다.
상기 검체의 현탁액은, 현탁을 위해 본 발명의 현탁용 희석액을 이용하는 것 이외에는 종래 현탁액을 조제하기 위해 이용되고 있는 주지의 방법에 의해 조제할 수 있고, 예를 들어 검체가 분말형상인 경우, 상기 검체와 본 발명의 현탁용 희석액을 혼합, 교반함으로써 조제할 수 있다.
현탁액 중에 포함되는 미생물의 생균수의 측정은, 한천 배지에서 배양을 하는 배양법 (고체 배양법)을 이용한 방법에 의해 실시할 수 있다.
상기 방법은, 구체적으로 현탁액을 단계적으로 희석하고, 각 희석물을 한천 배지에서 배양하며, 형성된 콜로니 수를 카운트함으로써 실시할 수 있다. 이때 형성된 콜로니 수가 해당 한천 배지에서 배양한 희석물 중에 포함되는 미생물의 생균수에 해당한다. 그 때문에, 콜로니 수의 값과 희석 배율로부터 현탁액 중에 포함되는 미생물의 생균수가 구해진다. 이와 같이 하여 구해진 현탁액 중의 생균수와 해당 현탁액 중에 포함되는 검체의 양으로부터, 해당 검체 중에 포함되는 미생물의 생균수 (/g)가 구해진다.
상기 방법에서는, 현탁액을 단계적으로 희석할 때에 희석액 (2차 희석액)이 이용된다. 본 발명에서는, 현탁액으로 할 때에 이용하는 희석액으로서 본 발명의 현탁용 희석액을 이용하면 되고, 2차 희석액의 종류에 대해서는 특별히 한정되지 않는다. 2차 희석액으로서는, 생리식염수, 상술한 희석액 (A) (식품위생 검사지침에 기재된 혐기성 검체 희석액) 등의 주지의 희석액을 이용할 수 있다.
배양법으로서, 구체적으로 혼석법, 평판도말법 등을 들 수 있다. 혼석법은, 적절히 희석한 현탁액을 가온 용해한 한천 배지와 혼화하고 냉각 고형화하여 배양하는 방법이다. 평판도말법은, 적절히 희석한 현탁액을 한천 배지 상에 도말하여 배양하는 방법이다.
배양에 이용하는 한천 배지의 종류, 배양 조건 (배양 온도, 배양 시간 등)에 대해서는, 측정 대상의 미생물에 따라 주지의 배양 조건을 이용할 수 있고, 예를 들어 한천 배지로서는 측정 대상의 미생물이 생육 가능한 것이면 된다. 예를 들어 비피더스균을 생육 가능한 배지로서는, 강화 클로스트리디아 한천 배지, TOS 프로피온산 한천 배지 등을 들 수 있다. 또한, 비피더스균의 경우, 콜로니 수의 카운트는 주로 37℃에서 72시간 혐기 배양한 후에 행해진다.
(실시예)
다음에, 시험예 및 실시예를 나타내어 본 발명을 더 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<시험예 1>
이 시험은, 비피더스균말을 분유에 배산(倍散)한 후에 생균수를 측정하고, 배산제에 의한 균수 저하를 관찰하기 위해 실시하였다.
1) 시험 시료의 조제:
비피더스균말 (원말)로서 BB536 균말 (모리나가 유업 주식회사 제품, 생균: 8.1×1010/g 함유품)을 준비하였다.
상기 원말에 모리나가 팔로우 업 밀크 "Chil-mil" (모리나가 유업 주식회사 제품)을 1:1000 (w/w)의 비율로 혼합한 것 (1000 배산)을 조제하고, 배산 시료로 하였다.
이하, 원말의 생균수 (실균수)를 1000으로 나눈 값을 배산 시료의 실균수로서 이용하였다.
시험 시료 균주 배산 비율 실균수
원말 BB536 균말 - 8.1×1010/g
배산 시료 BB536 균말 1000 배산
(Chil-mil)		 8.1×107/g
2) 현탁용 희석액의 조제:
현탁용 희석액으로서, 이하의 표 2에 나타내는 각 성분에 각각 전체량이 1000ml가 되도록 순수를 첨가하고 혼합함으로써, 생리식염수, 희석액 (A) 및 1% Tween 80 함유액을 조제하였다. 또, 각 현탁용 희석액은, 오토클레이브에서 121℃ 15분의 멸균을 행하였다.
성분 비율 생리식염수 희석액 (A) 1% Tween 80 함유액
염화나트륨 8.5 g
인산이수소칼륨 4.5 g 4.5 g
인산수소이나트륨 6.0 g 6.0 g
L-시스테인염산염-수화물 0.5 g 0.5 g
Tween 80 0.5 g 10.0 g
한천 (Agar) 1.0 g
3) 배양법 (혼석법)에 의한 생균수 측정:
소정량의 시험시료 (배산 시료 5g 또는 원말 1g)를 칭량하고, 거기에 현탁용 희석액 (생리식염수, 희석액 (A) 또는 1% Tween 80 함유액)을 전체량이 100g이 되도록 (배산 시료 5g에 대해 95g (20배 희석) 또는 원말 1g에 대해 99g (100배 희석)) 첨가하여 심하게 교반하여 현탁액 (시료 1-1~1-5)을 조제하였다.
다음에, 생리식염수를 2차 희석액으로서 이용하여 각 현탁액을 희석 (100배 희석 1회와 10배 희석 1회의 합계 1000배 희석)하고, 희석물을 미리 용해한 강화 클로스트리디아 한천 배지 (Reinforced clostridial medium Agar) (OXOID사 제품)와 함께 혼석법에 의해 플레이트에 뿌리고, 한천이 굳어진 후, 37℃ 3일간의 혐기 배양을 하였다. 배양 후, 배지에 생육한 콜로니 수를 카운트하여 해석을 하고, 각 시험 시료 중의 생균수의 측정값을 구하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.
시험 시료
[실균수]		 현탁용 희석액 생균수의 측정값
[실균수에 대한 비율]
시료 1-1 원말
[8.1×1010/g]		 희석액 (A) 7.7×1010/g
[95%]
시료 1-2 1% Tween 80 함유액 8.3×1010/g
[102%]
시료 1-3 배산 시료
[8.1×107/g]		 생리식염수 5.6×107/g
[69%]
시료 1-4 희석액 (A) 5.9×107/g
[73%]
시료 1-5 1% Tween 80 함유액 8.4×107/g
[104%]
상기 결과에 나타내는 바와 같이, BB536 균말의 원말에 대해 생균수를 측정한 시료 1-1, 1-2의 생균수의 측정값은 실균수의 95~102%로서, 현탁용 희석액으로서 희석액 (A), 1% Tween 80 함유액 중 어느 것을 이용한 경우에서도, 실균수에 가까운 정확한 값을 얻을 수 있었다.
한편, BB536 균말을 Chil-mil에서 1000 배산한 배산 시료에 대해, 생리식염수를 이용하여 현탁한 시료 1-3에서는, 생균수의 측정값이 5.6×107/g으로서, 실균수의 69%만 균을 검출할 수 있었다. 또한, 희석액 (A)을 이용하여 현탁한 시료 1-4도, 생균수의 측정값이 5.9×107/g으로서, 실균수의 73%만 검출할 수 있었다.
이에 대해, 배산 시료에 대해, 1% Tween 80 함유액을 이용하여 현탁한 시료 1-5에서는, 생균수의 측정값이 8.4×107/g으로서, 배산 시료의 실균수에 가까운 정확한 값을 얻을 수 있었다.
이상과 같이, 분유 중에 포함되는 균말의 생균수를 측정하는 경우, 현탁용 희석액으로서 생리식염수나 희석액 (A)을 이용하면, 생균수가 실균수의 69~73%로 크게 저하되어 검출되고, 생균수를 정확하게 측정할 수 없다. 이에 대해, 현탁용 희석액으로서 1% Tween 80 함유액을 이용하면, 분유 중에 포함되는 균말의 생균수를 측정하는 경우이어도, 원말의 생균수를 직접 측정하는 경우와 같이 생균수를 정확하게 측정할 수 있다.
<시험예 2>
이 시험은, 시험예 1에서 관찰된 균수 저하 현상에 현탁용 희석액의 배합 조성이 관여하는지를 조사하기 위해 실시하였다.
1) 현탁용 희석액의 조제:
인산이수소칼륨 4.5g, 인산수소이나트륨 6.0g, L-시스테인염산염-수화물 0.5g, 표 4에 나타내는 성분-1~성분-4 중 어느 하나와 순수를 혼합하여 현탁용 희석액 1~4를 조제하였다. 순수는, 각 현탁용 희석액의 전체량이 1000ml가 되도록 첨가하였다. 또, 각 현탁용 희석액은, 오토클레이브에서 121℃ 15분의 멸균을 행하였다.
표 4 중, 「RCM 배지」는 강화 클로스트리디아 배지 (Reinforced clostridial medium) (OXOID사 제품)를 나타낸다. 대두펩티드 (Soy Peptide)로서는 Becton Dickson사 제품의 것을 사용하였다.
Tween 80 RCM 배지 대두펩티드 L-아스코르빈산 나트륨
성분-1 10.0 g
성분-2 0.5 g 20.0 g
성분-3 0.5 g 20.0 g
성분-4 0.5 g 20.0 g
2) 시험 방법:
시험 시료로서 시험예 1에서 조제한 배산 시료 (BB536 균말을 1000배로 배산한 것)를 사용하고, 현탁용 희석액으로서 희석액 (A) 및 현탁용 희석액 1~4 중 어느 하나를 사용한 것 이외에는, 시험예 1과 같이 배양법 (혼석법)에 의한 생균수 측정을 하였다.
그 결과를 표 5에 나타낸다.
현탁용 희석액 생균수의 측정값
[실균수에 대한 비율]
Tween 80 농도
시료 2-1 희석액 (A) 0.05% 5.9×107/g
[73%]
시료 2-2 현탁용 희석액 1
(성분-1)		 1.0% 8.4×107/g
[104%]
시료 2-3 현탁용 희석액 2
(성분-2)		 0.05% 5.7×107/g
[70%]
시료 2-4 현탁용 희석액 3
(성분-3)		 0.05% 6.1×107/g
[75%]
시료 2-5 현탁용 희석액 4
(성분-4)		 0.05% 6.3×107/g
[78%]
표 5에 나타내는 바와 같이, 현탁용 희석액으로서 Tween 80을 0.05% 포함하는 희석액 (A)을 이용한 시료 2-1의 생균수의 측정값은 5.9×107/g (실균수의 73%)이었다.
이에 대해, Tween 80을 1% 함유하는 현탁용 희석액 1을 이용한 시료 2-2의 생균수의 측정값은 8.4×107/g (실균수의 104%)으로서, 시료 2-1보다도 실균수에 가까운 정확한 값을 얻을 수 있었다.
Tween 80의 농도를 0.05%로 하고, RCM 배지, 대두펩티드 또는 L-아스코르빈산 나트륨을 각각 첨가한 현탁용 희석액 2~4를 이용한 시료 2-3~2-5는, 생균수의 측정값이 실균수의 70~78%로서, 시료 2-1보다는 약간 실균수에 가까운 값이었지만, 시료 2-2만큼 정확한 결과는 얻을 수 없었다.
이상의 결과로부터, 균말을 분유로 배산한 시료에 대해, Tween 80을 1% 함유하는 현탁용 희석액을 이용함으로써, 생균수를 보다 정확하게 측정할 수 있는 것이 나타났다.
<시험예 3>
이 시험은, 현탁용 희석액에서의 Tween 80의 적절한 농도의 범위 및 Tween 80 이외의 폴리소르베이트류를 첨가한 경우의 균수를 조사하기 위해 실시하였다.
1) 현탁용 희석액의 조제:
인산이수소칼륨 4.5g, 인산수소이나트륨 6.0g, L-시스테인염산염-수화물 0.5g, 표 6에 나타내는 성분-5~성분-19 중 어느 하나와 순수를 혼합하여 현탁용 희석액 5~19를 조제하였다. 순수는, 각 현탁용 희석액의 전체량이 1000ml가 되도록 첨가하였다. 또, 각 현탁용 희석액은, 오토클레이브에서 121℃ 15분의 멸균을 행하였다.
현탁용 희석액 5~15는 각각 Tween 80의 농도를 0.2%부터 30%까지 단계적으로 변화시킨 것이고, 현탁용 희석액 16~19는 각각 Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 65를 각각 1.0% 함유시킨 것이다.
Tween 80 Tween 20 Tween 40 Tween 60 Tween 65
성분-5 2.0 g
성분-6 5.0 g
성분-7 10.0 g
성분-8 20.0 g
성분-9 40.0 g
성분-10 60.0 g
성분-11 80.0 g
성분-12 100 g
성분-13 150 g
성분-14 200 g
성분-15 300 g
성분-16 10.0 g
성분-17 10.0 g
성분-18 10.0 g
성분-19 10.0 g
2) 시험 방법:
시험 시료로서 시험예 1에서 조제한 배산 시료 (BB536 균말을 1000배로 배산한 것)를 사용하고, 현탁용 희석액으로서 희석액 (A) 및 현탁용 희석액 5~19 중 어느 하나를 사용한 것 이외에는, 시험예 1과 같이 배양법 (혼석법)에 의한 생균수 측정을 하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.
현탁용 희석액 생균수의 측정값
[실균수에 대한 비율]
폴리소르베이트류 농도 (%)
시료 3-1 희석액 (A) Tween 80 0.05 5.9×107/g
[73%]
시료 3-2 현탁용 희석액 5
(성분-5)		 Tween 80 0.2 5.5×107/g
[68%]
시료 3-3 현탁용 희석액 6
(성분-6)		 Tween 80 0.5 7.0×107/g
[86%]
시료 3-4 현탁용 희석액 7
(성분-7)		 Tween 80 1.0 8.4×107/g
[104%]
시료 3-5 현탁용 희석액 8
(성분-8)		 Tween 80 2.0 7.8×107/g
[96%]
시료 3-6 현탁용 희석액 9
(성분-9)		 Tween 80 4.0 8.0×107/g
[99%]
시료 3-7 현탁용 희석액 10
(성분-10)		 Tween 80 6.0 8.1×107/g
[100%]
시료 3-8 현탁용 희석액 11
(성분-11)		 Tween 80 8.0 7.4×107/g
[91%]
시료 3-9 현탁용 희석액 12
(성분-12)		 Tween 80 10 8.1×107/g
[100%]
시료 3-10 현탁용 희석액 13
(성분-13)		 Tween 80 15 8.7×107/g
[107%]
시료 3-11 현탁용 희석액 14
(성분-14)		 Tween 80 20 8.2×107/g
[101%]
시료 3-12 현탁용 희석액 15
(성분-15)		 Tween 80 30 8.2×107/g
[101%]
시료 3-13 현탁용 희석액 16
(성분-16)		 Tween 20 1.0 7.1×107/g
[88%]
시료 3-14 현탁용 희석액 17
(성분-17)		 Tween 40 1.0 7.9×107/g
[98%]
시료 3-15 현탁용 희석액 18
(성분-18)		 Tween 60 1.0 8.2×107/g
[101%]
시료 3-16 현탁용 희석액 19
(성분-19)		 Tween 65 1.0 6.9×107/g
[85%]
표 7에 나타내는 바와 같이, 현탁액용 희석액으로서 Tween 80을 0.05% 포함하는 희석액 (A)을 이용한 시료 3-1의 생균수의 측정값은 5.9×107/g (실균수의 73%)이었다. 또한, 0.2%의 Tween 80을 포함하는 현탁액용 희석액 5를 이용한 시료 3-2의 생균수의 측정값은 5.5×107/g (실균수의 68%)이었다.
이에 대해, Tween 80의 농도가 0.5~30%인 현탁액용 희석액 6~15를 이용한 시료 3-3~3-12의 생균수의 측정값은 실균수의 86~107%로서, 실균수에 근사한 정확한 값을 얻을 수 있었다. 특히, Tween 80의 농도가 1.0~30%인 Tween 80을 포함하는 현탁용 희석액 7~15를 이용한 시료 3-4~3-12는, 실균수와의 오차가 9%이내인 측정값 (91%~107%)을 얻을 수 있었다.
또한, Tween 80 이외의 폴리소르베이트류인 Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 65를 각각 1.0% 포함하는 현탁액용 희석액 16~19를 이용한 시료 3-13~3-16의 생균수의 측정값은 각각 실균수의 88%, 98%, 101%, 85%로서, 시료 3-1~3-2보다도 실균수에 가까운 정확한 값을 얻을 수 있었다. 그 중에서도, Tween 40, Tween 60을 각각 이용한 시료 3-14, 3-15에서 특히 정확한 측정값을 얻을 수 있었다.
이상의 결과로부터, 균말을 분유에서 배산한 시료의 생균수의 측정시에, Tween 80을 0.5~30%의 범위에서 함유함으로써 실균수에 가까운 정확한 측정값을 얻을 수 있는 것, 동일한 효과는 다른 폴리소르베이트류 (특히, Tween 40, Tween 60)의 경우에도 얻을 수 있는 것이 명백하게 되었다.
<실시예 1>
육아용 분유 또는 임부용 분유를 포함하는 비피더스균 함유 식품을 19종류 준비하였다. 표 8에 이들의 제품명, 회사명, 기재가 있는 것에 대해서는 그 비피더스균종을 나타낸다. 또, 이들은 모두 시판품이고, 용이하게 입수하는 것이다.
표 8 중의 회사명 중에서, 「Dairyland」는 PT Dairyland Indonesia이고, 「Morinagaa」는 Morinaga milk industry Co., Ltd.이며, 「Morinagab」는 PT Kalbe Morinaga Indonesia이고, 「Morinagac」는 PT SANGHIANG PERKASA이다. 또한, 「ABBOTT」는 P.T.ABBOTT INDONESIA이고, 「YILI」는 Inner Mongolia Yili Industrial Group Co., Ltd.이다.
표 8 중, B.lactis는 비피도박테리움 락티스 (Bifidobacterium animalissubsp. lactis)를 나타내고, B.longum은 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum subsp. longum)을 나타낸다.
또한, PCR (polymerase chain reaction)법에 의해 각 제품에 포함되는 비피더스균종을 확인하였다. 그 결과를 표 8에 병기한다.
현탁액용 희석액으로서 시험예 1에서 이용한 것과 같은 생리식염수, 희석액 (A), 1% Tween 80 함유액의 3종류를 이용하고, 상기 각 제품에 포함되는 비피더스균의 생균수 측정을 이하의 순서로 행하였다.
각 제품을 현탁액용 희석액을 이용하여 현탁하였다. 얻어진 현탁액을 생리식염수로 적절히 희석 (균수에 따라 1~106배로 희석)한 후, TOS 프로피온산 한천 배지 (에이켄 화학사)를 이용하여 혼석 배양에 의해 37℃ 3일간의 혐기 배양을 하고, 배양 후, 콜로니 수를 카운트하였다.
동일한 조작을 합계 3회 (1회당 3장의 샬레를 사용) 실시하여, 그들의 결과로부터 19 제품 각각에 대해 생리식염수, 희석액 (A), 1% Tween 80 함유액을 이용한 경우의 생균수 (/g)를 구하였다. 그 결과를 표 8에 병기한다. 또, 콜로니를 카운트하기 전에는, 대표적인 콜로니의 균을 현미경 관찰하여 비피더스균임을 확인하였다.
또한, 카운트된 콜로니 수 (콜로니 카운트 수)의 통계 해석을 하였다. 통계 해석은, JMP (버전 5.1.1, SAS 인스티튜트사 제품)의 소프트를 이용하여, 사용한 현탁용 희석액 및 제품을 인자로 한 2원 배치의 분산 분석에 의한 Tukey의 HSD 검정을 이용하여 검정하였다. 그 결과를 표 9에 정리하였다.
Figure 112010086877270-pct00001
생리식염수 희석액 (A) 1% Tween 80 함유액
콜로니 카운트 수의 최소 제곱 평균값 (%) 100 115 139*
가장 높은 생균수의 측정값을 얻을 수 있는 빈도 2/19 4/19 13/19
*: 통계학적으로 유의차 있음 (대 생리식염수 및 희석액 (A))
표 9에 나타내는 바와 같이, 19 종류의 시판 제품 중, 콜로니 카운트의 최소 제곱 평균값은, 생리식염수를 이용한 경우를 100%라고 하면, 희석액 (A)에서는 115%, 1% Tween 80 함유액에서는 139%로서, 1% Tween 80 함유액을 이용함으로써 통계적으로 유의하게 높은 생균수의 측정값을 얻을 수 있는 것이 나타났다. 또한, 이용한 제품 중에서 Morinaga Chil-kid 및 Morinaga Chil-school에 관해서는, 얻어진 생균수의 측정값이 실제로 배합되어 있는 실균수치와 거의 동등한 것을 알 수 있다. 이들의 결과로부터, 1% Tween 80 함유액을 이용함으로써, 생리식염수나 희석액 (A)을 이용하는 경우에 비해 보다 정확하게 생균수를 측정할 수 있는 것이 나타났다.
또한, 1% Tween 80 함유액을 이용한 경우, 19 제품 중 13제품에서 가장 높은 생균수의 측정값을 얻을 수 있었다. 이 결과로부터, 1% Tween 80 함유액을 이용함으로써, 제품 중의 비피더스균 수를 안정적으로 측정할 수 있는 것이 나타났다.
이상 상술한 바와 같이, 본 발명에서는, 육아용 분유에서 배산한 비피더스균말의 생균수를 배양법으로 측정할 때에, 현탁용 희석액으로서 0.5%이상의 농도로 폴리소르베이트류를 함유하는 것을 이용함으로써, 해당 육아용 분유 중에 포함되는 비피더스균의 생균수를 정확하게 측정할 수 있다.
본 발명에 의하면, 미생물을 함유하는 검체, 특히 분유 등의 분제품에 포함되는 미생물의 생균수 측정에 있어서, 종래보다도 정확한 측정값을 얻을 수 있는 현탁용 희석액 및 생균수 측정 방법을 제공할 수 있기 때문에, 식품의 제조분야 등에서 이용 가능성이 있다.

Claims (8)

  1. 검체 중에 포함되는 미생물의 생균수 측정을 할 때에, 해당 검체를 현탁액으로 하기 위해 이용되는 현탁용 희석액으로서, 0.5% 내지 30%의 농도로 폴리소르베이트류를 함유하고, 상기 미생물이 비피더스균인 것을 특징으로 하는 현탁용 희석액.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리소르베이트류가 Tween 40, Tween 60 및 Tween 80으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인 현탁용 희석액.
  4. 삭제
  5. 검체 중에 포함되는 미생물의 생균수 측정 방법으로서, 상기 검체를 제1항 또는 제3항 중 어느 한 항에 기재된 현탁용 희석액을 이용하여 현탁액으로 하는 공정과, 상기 현탁액 중에 포함되는 미생물의 생균수를 측정하는 공정을 가지고, 상기 미생물이 비피더스균인 것을 특징으로 하는 생균수 측정 방법.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서, 상기 검체가 분말형상인 생균수 측정 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 검체가 육아용 분유인 생균수 측정 방법.
KR1020107029453A 2008-06-24 2009-06-11 검체 중에 포함되는 미생물의 생균수 측정에 이용되는 현탁용 희석액 및 생균수 측정 방법 KR101257914B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2008-164226 2008-06-24
JP2008164226 2008-06-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110019387A KR20110019387A (ko) 2011-02-25
KR101257914B1 true KR101257914B1 (ko) 2013-05-06

Family

ID=41444385

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107029453A KR101257914B1 (ko) 2008-06-24 2009-06-11 검체 중에 포함되는 미생물의 생균수 측정에 이용되는 현탁용 희석액 및 생균수 측정 방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20110104746A1 (ko)
EP (1) EP2305831B1 (ko)
JP (1) JP5047358B2 (ko)
KR (1) KR101257914B1 (ko)
CN (1) CN102131937A (ko)
AU (1) AU2009263566B2 (ko)
CA (1) CA2728955C (ko)
DK (1) DK2305831T3 (ko)
WO (1) WO2009157316A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2554676T3 (en) * 2010-03-26 2015-01-12 Morinaga Milk Industry Co Ltd Measurement method for counting viable bacterial cells and culture medium
JP5650043B2 (ja) * 2011-04-20 2015-01-07 森永乳業株式会社 生菌数測定方法
JPWO2020189363A1 (ko) 2019-03-19 2020-09-24
CN111534566B (zh) * 2020-06-17 2022-02-15 江南大学 一种梯度稀释液及其在双歧杆菌计数中的应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0638795A (ja) * 1991-08-05 1994-02-15 Amano Pharmaceut Co Ltd 乳酸菌の分別測定法
DE9304954U1 (de) * 1992-04-13 1993-08-12 Biolac GmbH Gesellschaft für industrielle Nutzung von Milchinhaltsstoffen, 31097 Harbarnsen Analyse-Kit zur Bestimmung der bakteriellen Keimzahl in Molke und Molkeninhaltsstoffen
AU1854297A (en) * 1996-02-14 1997-09-02 Procter & Gamble Company, The Urogenital and intestinal disorder compositions comprising substance derived from plant species of the ericaceae family and a lactic acid bacteria growth factor
MXPA01006553A (es) * 1999-12-14 2002-03-14 Avon Prod Inc Composicion pare el cuidado de la piel que media la comunicacion de celula a celula. .
JP3363438B2 (ja) * 2000-05-02 2003-01-08 ビオフェルミン製薬株式会社 噴霧乾燥による菌体乾燥物
JP2002191394A (ja) * 2000-12-26 2002-07-09 Toray Ind Inc 生菌数測定方法
WO2008003810A1 (es) * 2006-07-03 2008-01-10 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Procedimiento para diferenciar y cuantificar bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas que emplea medios de cultivo selectivos libres de antibióticos

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Applied Microbiology, Vol. 87, No. 5, pp. 631-639 (1999.10.)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110019387A (ko) 2011-02-25
EP2305831B1 (en) 2014-08-13
EP2305831A1 (en) 2011-04-06
CN102131937A (zh) 2011-07-20
US20110104746A1 (en) 2011-05-05
CA2728955C (en) 2013-03-19
EP2305831A4 (en) 2013-01-09
AU2009263566B2 (en) 2012-08-30
JPWO2009157316A1 (ja) 2011-12-08
DK2305831T3 (da) 2014-09-01
WO2009157316A1 (ja) 2009-12-30
JP5047358B2 (ja) 2012-10-10
AU2009263566A1 (en) 2009-12-30
CA2728955A1 (en) 2009-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101257914B1 (ko) 검체 중에 포함되는 미생물의 생균수 측정에 이용되는 현탁용 희석액 및 생균수 측정 방법
JP5286424B2 (ja) 生菌数の測定方法
Walker et al. Rapid enumeration of Bifidobacterium lactis in milk powders using impedance
Steneryd Freeze‐dried mixed cultures as reference samples in quantitative and qualitative microbiological examinations of food
EP1362909B1 (en) Broad spectrum fastidious organism culture medium
Capell et al. A method and medium for the electrical detection of Listeria spp. from food
WO2021005813A1 (ja) 乳酸菌選択分離培地
DK2554676T3 (en) Measurement method for counting viable bacterial cells and culture medium
CN113981035B (zh) 用于双歧杆菌培养的组合式稀释液及其使用方法和双歧杆菌的检测方法
CN110791545B (zh) 一种检测双歧杆菌的培养基及检测方法
Liu et al. Rapid and accurate quantification of viable Bifidobacterium cells in milk powder with a propidium monoazide-antibiotic fluorescence in situ hybridization-flow cytometry method
JP6712126B2 (ja) 食品中の微生物の検出法
JPH0799995A (ja) ビフィドバクテリウム菌数の測定法
JPH03259095A (ja) ビフィドバクテリウム生菌数の測定に使用する培地およびその測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160303

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170309

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180226

Year of fee payment: 6