KR101257376B1 - 시신경 보호를 위한 열충격 단백질 발현 유도 제재 및 이의 망막 내 주입방법 - Google Patents

시신경 보호를 위한 열충격 단백질 발현 유도 제재 및 이의 망막 내 주입방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시신경 보호를 위한 열충격 단백질 발현 유도 제재 및 이의 망막 내 주입방법에 관한 것으로, 페라이트 계열의 초상자성 나노입자로 이루어진 본 발명의 열충격 단백질 발현 유도 제재는 침전 없이 인체 내에 안전하게 주입가능하고 높은 생체 적합성을 가지며, 두뇌에 무해한 주파수와 자장 범위에서 열충격 단백질을 국부적으로 효과적으로 발현시킬 수 있어 환자의 고통이나 불편 및 부작용을 최소화 할 수 있다. 이와 같이 발현된 열충격 단백질은 시신경 질환 및 퇴행성 신경질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

시신경 보호를 위한 열충격 단백질 발현 유도 제재 및 이의 망막 내 주입방법 {MATERIALS TO INDUCE HEAT SHOCK PROTEINS FOR OCULAR NEUROPROTECTION AND THEIR INFUSION TECHNIQUE TO THE RETINA}
본 발명은 자기유도 발열이 가능한 초상자성 열충격 단백질 발현 유도 제재 및 이를 망막 내 주입하는 방법, 및 상기 열충격 단백질 발현 유도 제재를 이용하여 시신경 보호를 위해 안구 내에 국부적으로 열충격 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.
녹내장은 당뇨 및 선천적 또는 후천적 질병에 의한 안압의 상승 때문에 발생하는 망막 신경절 세포의 소실 및 축색돌기의 상실 등의 시신경 손상에 의한 진행성 질병으로서 전체 실명원인 중 두 번째로 높지만, 이를 위한 효과적인 치료방법은 부족한 실정이다.
현재는 상승된 안압을 낮추어 더 이상의 시신경 손상을 막아 질병의 진행을 늦추는 치료방법이 주로 사용되고 있으며, 이를 위해서 약물치료, 레이저치료 및 섬유주절제술이나 방수유출장치 삽입술과 같은 외과적 수술방법이 이용되고 있다. 하지만, 안압 하강을 위한 수술을 시행한 뒤에도 약 10% 이상의 환자군의 시야 결손을 막지 못하며, 목표 안압에 도달하였음에도 불구하고 녹내장이 계속 진행하거나 치료에도 불구하고 목표 안압까지 도달하지 못하는 환자들을 임상에서 흔히 접하게 된다. 더욱이, 정상 안압에서도 녹내장 환자가 존재하므로 안압 하강을 위한 수술요법은 녹내장의 치료에 있어서 제한적이다.
따라서 보다 근본적인 치료방법을 개발하기 위한 연구가 이루어지고 있다. 이러한 연구개발 중, 열충격 단백질(heat shock protein: HSP)의 신경보호 효과 (허혈손상에 대한 내성증가: Chopp et al., 1989; Kitagawa et al., 1991, 빛에 의한 쥐 망막의 손상 억제: Barbe et al., 1988)가 보고된 뒤로, 이를 녹내장 치료에 적용하는 것이 관심을 받게 되었다. 열충격 단백질이란 단백질의 한 종류로서 박테리아부터 사람에 이르기까지 모든 생명체에 존재한다. 이는 열, 신진대사, 산소결핍, 외부충격 등의 모든 스트레스에 의해서 발현된다 (스트레스 단백질로도 불림). 특히 여러 종류의 열충격 단백질 중에서도 열충격 단백질 70 계열이 신경보호에 필수적인 것으로 알려져 있다 (Amin et al., 1996; Sato et al., 1996; Missen & Welch, 1988).
이러한 열충격 단백질의 신경보호 효과를 직접적으로 시신경 관련 치료에 응용하기 위해서 안구 내에서 열충격 단백질을 유도하기 위한 방법으로 전신 고온열처리 (Kwong et al., 2003), 복강내 아연 및 제라닐제라닐아세톤(geranylgeranylacetone) 주입 (Park et al., 2001; Caprioli et al., 2003) 및 레이저 조사 (Kim et al., 2006) 등의 다양한 방법이 보고되었다. 하지만, 이들을 통해서 열충격 단백질의 유도는 확인하였으나, 국부화되지 않은 열 및 약물 인가방식, 그리고 고온의 레이저 파워로 인해서 원하지 않는 곳에서의 과잉 면역 유발 및 안구 손상 등의 한계점이 나타났다.
이에, 상기의 부작용을 최소화할 수 있는 국부화된 열충격 단백질 유도법에 대한 개발이 요구되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 자기유도 발열이 가능하여 국부적으로 열충격 단백질을 발현할 수 있는 열충격 단백질 발현 유도 제재를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 열충격 단백질 발현 유도 제재를 망막 내 주입하는 방법, 및 상기 열충격 단백질 발현 유도 제재를 이용하여 시신경 보호를 위해 안구 내에 국부적으로 열충격 단백질을 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,
페라이트 계열의 초상자성 나노입자로 이루어진 열충격 단백질 발현 유도 제재를 제공한다.
본 발명은 또한
상기 열충격 단백질 발현 유도 제재를 유리체강을 통해 주입하여 안구 내 망막으로 확산시키는 것을 포함하는, 열충격 단백질 발현 유도 제재의 망막 내 주입방법을 제공한다.
본 발명은 또한
(1) 상기 열충격 단백질 발현 유도 제재를 유리체강을 통해 주입하여 안구 내 망막으로 확산시킨 후,
(2) 상기 망막으로 확산된 열충격 단백질 발현 유도 제재에 대해 외부에서 자기장을 인가하여 자기유도 발열을 유도하여 열충격 단백질을 발현시키는 것을 포함하는, 열충격 단백질의 안구 내 발현방법을 제공한다.
본 발명에 따른 열충격 단백질 발현 유도 제재는 침전 없이 인체 내 안전하게 (외과적 수술이 전혀 필요 없이) 주입가능하고 높은 생체 적합성을 가지며, 두뇌에 무해한 주파수와 자장 범위에서 열충격 단백질을 국부적으로 효과적으로 발현시킬 수 있어 환자의 고통이나 불편 및 부작용을 최소화 할 수 있다. 이와 같이 발현된 열충격 단백질은 시신경 질환 (녹내장, 당뇨성 망막질환 등) 및 퇴행성 신경질환 (알츠하이머병, 파킨슨씨병 등)의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 초상자성 나노입자 4종 (Co-페라이트(ferrite), 가공된 Mg-도핑된-페라이트, 가공된 MnZn-페라이트, 및 NiZn-페라이트) 각각의 투과전자현미경(TEM) 사진이고,
도 2는 2 nm 두께의 실리카로 코팅된, 가공된 MnZn-페라이트 나노입자의 TEM 사진이고,
도 3은 초상자성 나노입자들의 시험관 내(in vitro) 고체 상태에서의 자기유도 발열 특성 그래프이고,
도 4는 실리카 코팅된, 가공된 MnZn-페라이트 나노입자의 혈액 및 세포질과 같은 점성을 갖는 용액에서의 자기유도 발열 결과 그래프이고,
도 5는 초상자성 나노입자들의 뇌신경 줄기 세포에서의 세포 생존율 그래프이고,
도 6은 초상자성 나노입자들의 망막 신경절 세포에서의 세포 생존율 그래프이고,
도 7은 실리카 코팅 전·후의 가공된 MnZn-페라이트 나노입자의 망막 신경절 세포에서의 세포질 내 침투도 및 이에 수반되는 부작용을 조사하기 위한 TEM 사진이고,
도 8은 가공된 MnZn-페라이트 나노입자의 쥐 안구 내 확산 실험 결과로서, 도 8-1 및 8-2는 각각 가공된 MnZn-페라이트 나노입자를 헤밀톤 주사기를 이용하여 쥐 안구에 주입하는 시술 장면 및 주입된 나노입자의 사진이고, 도 8-3은 쥐 안구의 망막의 각 층에 대한 설명이고, 도 8-4 및 8-5는 각각 실리카 코팅 전·후의 가공된 MnZn-페라이트 나노입자의 망막 내의 내 망상층에서의 분포 결과이고, 도 8-6은 도 8-5에서의 내 망상층 확대 사진이다.
본 발명에 따른 열충격 단백질 발현 유도 제재는 페라이트 계열의 초상자성 나노입자로 이루어지는 것을 특징으로 하며, 안구 내 열충격 단백질 유도가 필요한 국부적 위치 (망막 내 신경절 세포층)에서 사용된다.
본 발명에 사용되는 페라이트 계열의 초상자성 나노입자는 5 내지 13 nm의 평균 입경을 가지며 고체 상태에서 18℃ 이상의 자기유도 발열 온도를 나타내는 것이 적합하다. 초상자성 나노입자를 안구 내 국부적 열충격 단백질 발현 유도 제재로 사용하기 위해서는, 두뇌에 영향을 미치지 않는 낮은 주파수 범위 (120 kHz 미만) 및 자장 범위 (15 kA/m 미만)에서 안구 내부의 온도를 열충격 단백질 유도에 필요한 온도인 39 내지 41℃로 상승시킬 수 있어야 하며, 이러한 온도를 얻기 위해서는 고체 상태에서 최소 ΔT = 18℃ 이상의 자기유도 발열 온도를 나타내야 한다.
본 발명에서는 상기 자기유도 발열 특성을 나타내는 페라이트 계열 초상자성 나노입자이면 무엇이든 사용할 수 있으며, 이의 구체적인 예로는 Co-페라이트(ferrite) 및 가공된(engineered) Mg-도핑된-페라이트와 같은 3성분계 초상자성 나노입자; NiZn-페라이트 및 가공된 MnZn-페라이트와 같은 4성분계 초상자성 나노입자; 및 이들의 혼합물을 들 수 있다.
이때, 예컨대, Co-페라이트와 NiZn-페라이트 나노입자는 통상적인 고온 열분해법 (high temperature thermal decomposition: HTTD)에 의해, 가공된 MnZn-페라이트와 가공된 Mg-도핑된-페라이트 나노입자는 변형된 고온 열분해법 (modified-HTTD)에 의해 합성될 수 있다.
본 발명에 따르면, 초상자성 나노입자는 5 내지 13 nm의 평균 입경을 가질 수 있는데, 안구에 적용시 유리체강을 통해 주입되어 안구 내 망막으로 확산되기 위해서는 침전 없이 인체 내 주입 및 안구 내 확산이 용이하도록 가능한 한 작은 크기를 갖는 것이 바람직하다.
또한, 확산시 초상자성 나노입자의 뭉침 현상을 방지하기 위하여, 본 발명의 초상자성 나노입자는 생체 친화물질로 코팅된 것일 수 있으며, 상기 생체 친화물질의 구체적인 예로는 실리카, 키토산 (chitosan), D-글루코스 덱스트란 (D-glucose dextran), 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 디머캅토숙신산 (DMSA) 및 이들의 혼합물을 들 수 있다. 상기 생체 친화물질은 0.1 내지 5 nm의 두께로 코팅될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 열충격 단백질 발현 유도 제재를 유리체강을 통해 주입하여 안구 내 망막으로 확산시키는 것을 포함하는, 열충격 단백질 발현 유도 제재의 망막 내 주입방법을 제공한다.
이때, 초상자성 나노입자의 열충격 단백질 발현 유도 제재를 적절한 용매에 적절한 농도로 희석하여 예컨대 주사기 등을 사용하여 유리체강을 통해 주입할 수 있다. 주입된 초상자성 나노입자는 주입과 동시에 확산을 시작하여 안구 내 망막으로 확산되는데, 특히 열충격 단백질 유도가 필요한 국부적 위치인 망막 내 신경절 세포층 주변으로 확산될 필요가 있다. 확산시 필요하면, 주입된 열충격 단백질 발현 유도 제재에 대해 외부에서 자기장을 인가하여 열충격 단백질 발현 유도 제재의 확산거동을 조절, 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따른 초상자성 나노입자의 확산기술이 혁신적인 이유는, 의학기술적으로 초상자성 나노입자를 망막에 주입하기 위해서 맥락막 (혈관조직)을 이용할 경우 맥락막이 안구의 뒤쪽에 위치하고 있어 외과적 수술요법을 적용하여야 하고, 이를 이용하더라도 주입을 위한 혈관을 찾는 것이 매우 어렵기 때문이다.
또한, 본 발명은 (1) 상기 열충격 단백질 발현 유도 제재를 유리체강을 통해 주입하여 안구 내 망막으로 확산시킨 후, (2) 상기 망막으로 확산된 열충격 단백질 발현 유도 제재에 대해 외부에서 자기장을 인가하여 자기유도 발열을 유도하여 열충격 단백질을 발현시키는 것을 포함하는, 열충격 단백질의 안구 내 발현방법을 제공한다.
상기 단계 (2)에서, 상기 망막으로 확산된 열충격 단백질 발현 유도 제재에 대해 외부에서 자기장을 인가하여 열충격 단백질 발현 유도 제재의 자기유도 발열을 유도함으로써 원하는 열충격 단백질을 발현시킨다. 특히, 본 발명의 열충격 단백질 발현 유도 제재는 두뇌에 영향을 미치지 않는 낮은 주파수 범위 (120 kHz 미만) 및 자장 범위 (15 kA/m 미만)에서 자기장 인가시 충분한 자기유도 발열 온도를 나타낸다는 장점을 갖는다.
안구로 주입된 초상자성 나노입자는 직접적으로 두뇌와 연결된 시신경 및 이와 연결된 망막 내 신경절 세포층에 분포되므로 두뇌 신경세포에서의 세포 생존율은 매우 중요하다. 본 발명에 따른 초상자성 나노입자는 70% 이상의 높은 세포 생존율(생체 적합성)을 나타내며 세포질 내에 침투가 가능하되 세포에 부작용을 발생시키지 않는다.
이와 같이 발현된 열충격 단백질은 녹내장 및 당뇨성 망막질환과 같은 시신경 질환, 및 나아가서는 알츠하이머병 및 파킨슨씨병과 같은 퇴행성 신경질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 열충격 단백질 발현 유도 제재는 침전 없이 인체 내에 안전하게 (외과적 수술이 전혀 필요 없이) 주입가능하고 높은 생체 적합성을 가지며, 두뇌에 무해한 주파수와 자장 범위에서 열충격 단백질을 국부적으로 효과적으로 발현시킬 수 있어 환자의 고통이나 불편 및 부작용을 최소화할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] : 초상자성 나노입자의 합성 및 자기유도 발열 특성
안구 내에서의 열충격 단백질 유도를 위한 초상자성 나노입자로서 Co-페라이트와 NiZn-페라이트 나노입자를 통상적인 고온 열분해법에 의해, 그리고 가공된 MnZn-페라이트와 가공된 Mg-도핑된-페라이트 나노입자를 변형된 고온 열분해법에 의해 합성하였다. 이때, Co-페라이트와 NiZn-페라이트 나노입자는 문헌[Shouheng Sun et al., J. Am . Chem . Soc . 2004, 126, 273-279]을 참고하여 합성하였고, 가공된 Mg-도핑된-페라이트 나노입자는 국내 특허공개 제2008-133348호에 개시된 방법을 참고하고 가공된 MnZn-페라이트 나노입자는 이 방법을 응용하여 각각 합성하였다.
합성된 초상자성 나노입자의 투과전자현미경(TEM) 사진을 도 1에 나타내었다. 도 1로부터, 합성된 초상자성 나노입자들이 5.5 ~ 8.2 nm의 직경과 12% 미만의 편차를 갖는 분포를 보이는 것을 알 수 있다. 초상자성 나노입자가 안구 내에서 확산에 의해 인가된다는 점을 고려할 때, 초상자성 나노입자의 크기는 고온 자기유도 발열이 가능한 범위 내에서 최대한 작아야 하며 (바람직하게는 5 ~ 8 nm), 본 발명의 실시예에서는 5.5 nm의 평균 직경을 갖는 초상자성 MnZnFe2O4 나노입자를 사용하여 안구 내에서의 확산 현상을 실현하였다.
초상자성 나노입자는 외부자기장이 없을 경우 자기모멘트가 존재하지 않아 이에 의한 뭉침 현상은 없으나, 나노 크기의 특성상 불안정한 표면에너지로 인한 뭉침 및 주변 생체 물질과의 반응이 있을 수 있다. 이를 최소화하기 위하여, 합성 된 초상자성 나노입자 중 가공된 MnZn-페라이트 나노입자를 실리카로 2 nm의 두께로 코팅하여 이의 TEM 사진을 도 2에 나타내었다. 안구 내에서 열충격 단백질을 유도하기 위해서는 안구 내 열충격 단백질 유도 위치의 온도를 체온 (37 ℃)에서 약 2 내지 4℃ (즉 39 내지 41℃가 되도록) 상승시켜야 하는데, 이를 위해서는 인체 외부, 고체 상태의 나노입자에서 최소한 18℃ 이상의 상승 발열 온도를 나타내어야 한다. 특히, 안구에서의 열충격 단백질 유도 특성상 두뇌와 근접해 있으므로 강한 주파수에 의한 뇌파의 간섭으로 인해 발생되는 비이상적인 생체전기 변화로 인한 시신경 및 뇌신경의 손상을 방지하기 위해서, 상기 온도는 가능한 한 낮은 주파수 (< 120 kHz) 및 자장 (< 15 kA/m)에서 발생되어야 한다.
도 3은 초상자성 나노입자들의 시험관 내(in vitro) 고체 상태에서의 자기유도 발열 특성 그래프로서, 모든 초상자성 나노입자가 열충격 단백질 유도에 충족하는 온도를 나타내었다. 특히, 가공된 MnZn-페라이트와 가공된 Mg-도핑된-페라이트는 그 직경이 각각 5.5 nm와 7.7 nm에도 불구하고 44℃와 67℃의 높은 자기유도 발열 온도를 나타내었다.
실제 인체 내에서의 발열 온도를 예상해 보고자, 혈액 및 세포질과 같은 점성 (3 ~ 4 x 10-3 Ps·s)을 갖는 용액을 제작한 후 실리카 코팅된, 가공된 MnZn-페라이트 나노입자의 자기유도 발열 특성을 이용하여 용액의 온도를 측정하여 도 4에 나타내었다. 도 4로부터, 1.2 mg/10 ㎕의 작은 양의 나노입자의 경우도 아가(agar) 용액이 열충격 단백질을 유도할 수 있는 온도인 39℃ 이상에 도달함을 알 수 있다. 이러한 초상자성 나노입자의 자기유도 발열 특성은 이를 안구 내 열충격 단백질 발현 유도 제재로서 사용가능하다는 것을 입증한다.
[실시예 2] : 초상자성 나노입자의 생체 적합성
열충격 단백질 유도에 충분한 자기유도 발열 특성을 보이는 초상자성 나노입자들을 안구에 주입시 안구 내에 머무르면서 얼마만큼의 세포괴사 및 자연사를 유도하는지, 그리고 세포 변형 및 세포 (또는 핵) 분열 유발 등의 부작용 없이 세포 내에 침투가 가능한지를 조사하기 위해서, 시험관 내(in vitro) 조건에서 세포 생존율 실험과 나노입자를 주입한 세포의 TEM 분석을 실시하였다.
초상자성 나노입자들을 주입한 뒤 조사한, 태아의 중뇌 (mid-brain)에서 추출한 뇌신경 줄기 세포 (neuronal stem cells)의 생존율을 도 5에 나타내었다. 안구로 주입된 초상자성 나노입자는 직접적으로 두뇌와 연결된 시신경 및 이와 연결된 망막 내 신경절 세포층에 분포되므로 두뇌 신경세포에서의 세포 생존율은 매우 중요하다. 도 5로부터 알 수 있듯이, 모든 초상자성 나노입자가 80% 이상 (최대 95%)의 높은 세포 생존율을 나타내었다.
초상자성 나노입자가 실제 집중적으로 위치하게 될 망막 신경절 세포 (retinal ganglion cells)에서의 생존율을 도 6에 나타내었다. 도 6으로부터 알 수 있듯이, 모든 초상자성 나노입자가 평균 80% 이상 (10 μg/ml 나노입자 농도의 경우는 70% 이상)의 높은 세포 생존율을 나타내었다. 특히 2 nm 두께의 실리카로 코팅된 가공된 MnZnFe2O4 나노입자의 경우는 세포 생존율이 10% 이상 증가하여 최대 98%의 매우 높은 세포 생존율을 나타내었다. 하지만, 7 nm의 두꺼운 실리카가 코팅된 나노입자의 경우, 오히려 세포 생존율이 줄어드는 것을 알 수 있는데, 이는 부피가 커진 초상자성 나노입자가 세포에 스트레스를 유도하여 세포의 괴사 및 자연사를 유도하기 때문이다. 따라서, 세포 내에 초상자성 나노입자를 주입하기 위해서는 최대한 얇은 두께의 코팅이 이루어져야 함을 알 수 있다.
시험관 내(in vitro)에서 망막 신경절 세포에 초상자성 MnZnFe2O4 나노입자를 투여한 뒤 세포 내 초상자성 나노입자의 침투 여부 확인 및 이로 인한 세포의 변형, 괴사 (또는 자연사), 및 핵 또는 세포의 분열 등의 부작용이 있는지를 확인하여 그 TEM 사진을 도 7에 나타내었다. 도 7에서, 세포 내 주입된 초상자성 MnZnFe2O4 나노입자가 세포질 내로 잘 침투하는 것을 확인하였으며, 세포의 변형, 괴사 및 세포 분열 등의 부작용을 유발하지 않음을 확인하였다. 또한 주입된 나노입자는 핵으로는 침투를 하지 않아 이로 인한 핵에서의 부작용을 초래하지 않았다. 한편, 실리카로 코팅되지 않은 초상자성 MnZnFe2O4 나노입자에서 실리카로 코팅 (두께: 2 nm)된 경우보다 큰 뭉침 현상이 확인되었다. 이는 실리카 코팅층이 초상자성 나노입자들의 뭉침 현상을 방지할 수 있음을 보여준다.
[실시예 3] : 열충격 단백질 유도를 위한 쥐 안구에서의 초상자성 MnZnFe 2 O 4 나노입자의 망막으로의 확산
초상자성 나노입자 제재의 자기유도 발열 특성을 이용한 열충격 단백질을 유도하기 위해서는 초상자성 나노입자를 안구 내 망막 (신경절 세포)에 위치시켜야만 한다. 하지만 앞서 언급했듯이, 이를 위한 방법으로 맥락막을 이용하여 주입하는 것은 의학기술적으로 상당한 어려움이 있다. 따라서 본 발명에서는 이러한 어려움을 극복하고자, 유리체강을 통한 초상자성 나노입자의 확산현상을 이용하여 이를 망막에 주입하는 기술을 실현하였다. 상기에 열거된 초상자성 나노입자의 검증된 자기유도 발열 특성 및 시험관 내에서의 생체 적합성 결과를 바탕으로, 쥐 안구모델을 통하여 가공된 초상자성 MnZn-페라이트 나노입자의 안구 내 확산을 확인하여 도 8에 나타내었다.
가공된 MnZn-페라이트 나노입자를 헤밀톤 주사기를 이용하여 쥐 안구 유리체강 내에 주입하는 시술 장면 및 주입된 나노입자의 사진을 도 8-1 및 8-2에 나타내었다 (이에 대한 모든 시술은 동물모델 실험에 대한 자격을 갖추고 있는 병원에서 시행되었다). 이때 가공된 MnZn-페라이트 나노입자는 DMEM (Dulbeco's modified Eagle's medium), 10 % FBS (fetal bovine serum), 1 % PS (Penicillin streptomycin), 2 mM의 글루타민 (glutamine)이 혼합된 용액에 30 μg/㎖의 농도가 되도록 분산시켜서 주입하였다. 본 실시예에서도 실리카 코팅의 효과를 보기 위해서 실리카 코팅 전·후의 가공된 MnZn-페라이트 나노입자를 모두 사용하였다. 나노입자가 주입된 쥐의 안구는 2주 후 세포조직검사를 위해서 파라핀 블록으로 만들어져 주입된 가공된 MnZn-페라이트의 확산 상태 및 이로 인한 망막에서의 염증 등의 부작용을 검사하였다. 도 8-2에서 볼 수 있듯이, 마취된 쥐의 안구의 유리체강 내에 주입된 가공된 MnZn-페라이트 나노입자는 주입과 동시에 유리체강 내에서 확산을 시작하였다.
쥐 안구의 망막의 각 층에 대한 설명을 도 8-3에 나타내었다. 시신경 보호를 통한 녹내장 등의 시신경 관련 질병을 치료하기 위해서는 열충격 단백질이 망막 신경절 세포층 주위에서 집중적으로 발현되어야 한다. 이를 위해서는 초상자성 나노입자가 직접적으로 망막 신경절 세포층 또는 그 최인접 층에 집중적으로 분포가 되어 있어야 한다.
도 8-4는 실리카 코팅 전의 가공된 MnZn-페라이트 나노입자의 조직검사 사진, 도 8-5는 실리카 코팅된 가공된 MnZn-페라이트 나노입자의 조직검사 사진, 그리고 도 8-6은 내 망상층 (inner plexiform layer: 신경절 세포층의 최인접 층) 내에 분포되어 있는 실리카 코팅된 가공된 MnZn-페라이트 나노입자의 사진이다. 도 8-4 내지 8-6으로부터, 유리체강을 통해서 주입된 가공된 MnZn-페라이트 나노입자가 확산을 통해서 성공적으로 망막에 도달했음을 알 수 있다. 또한 대부분의 가공된 MnZn-페라이트 나노입자가 확산을 통해서 내 망상층에 위치했음을 확인하였다. 본 실시예는, 본 발명에서 제안한 열충격 단백질 유도를 목적으로 한 초상자성 나노입자의 망막 내 주입을 위한 유리체강 내 확산방법이 매우 효과적으로 이루어졌음을 증명한다. 또한 본 실시예에서 사용된 확산 방법은 외부에서 자기장을 인가하여 유리체강에서의 초상자성 나노입자의 확산거동을 조절, 향상시킬 수 있다.
도 8-4 내지 8-6의 조직검사 결과 망막 내로 침투된 가공된 MnZn-페라이트 나노입자는 2주 동안 어떠한 세포의 변형이나 염증을 유발하지 않아, 실제 망막 내에서 매우 높은 생체 적합성을 나타내었다. 확산된 가공된 MnZn-페라이트 나노입자의 분산 정도를 살펴보면, 실리카 코팅 전의 나노입자의 경우 내 망상층에서 일부 큰 뭉침 현상이 있는 것을 확인할 수 있는 반면, 실리카 코팅된 나노입자의 경우 매우 고르게 분포가 되어 있음을 알 수 있다. 이는 매우 중요한 요소로서, 내 망상층에서의 초상자성 나노입자의 고른 분포는 고른 자기유도 발열을 유도해서 열충격 단백질을 균일한 분포로 유도할 수 있다. 하지만, 상대적으로 크게 뭉쳐 있는 나노입자는 국부적으로 높은 자기유도 발열을 나타낼 수 있어서 이에 의한 건강 세포의 손상이 발생할 수 있다.
이와 같이, 상기 실시예 1 내지 3에서 확인한 초상자성 나노입자의 자기유도 발열 온도, 시험관 내 생체 적합성, 및 성공적인 초상자성 나노입자의 망막으로의 확산결과는 본 발명에서 제안한 초상자성 나노입자의 안구 내 확산방법을 이용한 망막 내 초상자성 나노입자의 인가 및 이의 자기유도 발열을 이용한 열충격 단백질 유도 모델의 실현 가능성을 입증해 준다. 본 발명에서 제안한 방법을 이용한 시신경 보호는 향후 녹내장을 비롯한 시신경 관련 질환 치료에 획기적인 치료 방법을 제공할 것이다.

Claims (12)

  1. 0.1 내지 5nm 두께로 실리카로 코팅된 초상자성 MnZnFe2O4 나노입자를 포함하는, 녹내장 또는 당뇨성 망막질환 치료용 제재.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 초상자성 나노입자가 5 내지 13 nm의 평균 입경을 가지며 고체 상태에서 18℃ 이상의 자기유도 발열 온도를 나타내는 것을 특징으로 하는 녹내장 또는 당뇨성 망막질환 치료용 제재.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 발열 온도가 120 kHz 미만의 주파수 범위 및 15 kA/m 미만의 자장 범위에서 유도되는 것을 특징으로 하는 녹내장 또는 당뇨성 망막질환 치료용 제재.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 초상자성 나노입자가 70% 이상의 세포 생존율을 나타내고 세포질 내에 침투가 가능하되 세포에 부작용을 발생시키지 않는 것을 특징으로 하는 녹내장 또는 당뇨성 망막질환 치료용 제재.
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