KR101254662B1

KR101254662B1 - Preparation of saccharified solution containing high amounts of glucose from algal biomass Hydrodictyaceae

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Publication number: KR101254662B1
Application number: KR1020110024059A
Authority: KR
Inventors: 김진석; 최정섭; 황현진; 김재덕; 서보람
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2011-03-17
Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2013-04-15
Also published as: KR20120106154A

Abstract

본 발명은 조류 바이오매스로부터 글루코오스 고함유 당화액의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 담수 녹조류 중 그물말 과(Family Hydrodictyaceae)로부터 특별한 전처리 없이 직접 효소 가수분해 또는 화학적 가수분해하여 고농도의 단당류를 수득하는 방법으로, 상기 방법은 옥수수, 밀과 같은 식용자원이 아닌 조류 바이오매스를 활용하기 때문에 바이오매스의 산업적 수요가 높아졌을 때 식품 가격 폭등 및 윤리적 문제의 발생 소지가 없고, 안정적으로 자원의 지속적 공급이 가능할 뿐 아니라 생화학적/화학적 당화가 매우 용이한 특징을 가져 수집 후 생체를 직접 사용할 수 있고, 건조체를 이용할 때에도 특별한 전처리 없이도 높은 당화율을 나타내어 향후 산업바이오화학제품 생산으로의 크게 기여할 것이다.The present invention relates to a method for producing a high glucose-containing glycosylated solution from algal biomass, and more particularly, to a high concentration of monosaccharides by direct enzymatic hydrolysis or chemical hydrolysis from fresh hydrodictyaceae without fresh pretreatment. As a method of obtaining, the method utilizes algal biomass rather than edible resources such as corn and wheat, so that there is no possibility of food price spikes and ethical problems when the industrial demand of biomass is increased, and stable supply of resources Not only is this possible, biochemical / chemical saccharification is very easy, and it is possible to directly use a living body after collection, and when using a dry body, it shows a high glycation rate without special pretreatment, which will greatly contribute to the future production of industrial biochemical products.

Description

Preparation of saccharified solution containing high amounts of glucose from algal biomass Hydrodictyaceae

본 발명은 조류 바이오매스로부터 글루코오스 고함유 당화액의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 담수 녹조류 중 그물말 과(Family Hydrodictyaceae)로부터 특별한 전처리 없이 직접 효소 가수분해 또는 화학적 가수분해하여 고농도의 단당류를 수득하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a high glucose-containing glycosylated solution from algal biomass, and more particularly, to a high concentration of monosaccharides by direct enzymatic hydrolysis or chemical hydrolysis from fresh hydrodictyaceae without fresh pretreatment. It relates to a method of obtaining.

석유자원의 고갈, 에너지 수요 증가, 지구온난화와 CO₂ 배출 문제, 환경규제 강화 등의 여러 문제에 직면한 상황에서 미래 환경과 자원고갈을 슬기롭게 대비하기 위해서는 필수적으로 생물자원(바이오매스)의 효율적 활용기술 개발이 필요하다. In the face of various problems such as depletion of petroleum resources, increase in energy demand, global warming and CO ₂ emission, and enforcement of environmental regulations, it is essential to efficiently utilize biomass (biomass) in order to wisely prepare for future environment and depletion of resources. Technology development is needed.

상기 생물자원은 다음의 몇 가지 요인이 구비되어야 하는 바, 1) 식량 또는 사료로의 이용가치가 적어 산업적으로 대량 사용할 경우 식량가격 폭등의 우려가 낮을 것, 2) 생산성이 뛰어나거나 생산물의 산업적 가치가 높아 재배 또는 배양시 경제성이 상대적으로 높을 것, 3) 비농경지에서 재배되거나 비농업용수를 사용함으로서 농산물 생산을 위한 재배요인과 가능한 경합하지 않을 것, 4) 이산화탄소 저감 또는 환경오염을 경감시킬 수 있는 능력이 상대적으로 우수할 것 등이다. The biological resources should be provided with several factors, such as: 1) low value for food or feed, so there is little concern about the price of food in case of large industrial use, and 2) high productivity or industrial value of products. High economic efficiency in cultivation or cultivation, 3) not cultivated in non-farmland or using non-agricultural water, as much as possible to compete with cultivation factors for agricultural production, and 4) reducing carbon dioxide or reducing environmental pollution. The ability is relatively good.

상기 요인을 비교적 높게 만족시키는 생물자원은 조류(algae)이며, 당질/전분계 바이오매스(1세대 바이오매스), 섬유질계 바이오매스(2세대 바이오매스)와는 달리 제3세대 바이오매스로 분류되어 화학산업의 원료물질 공급원(chemical feedstocks)으로서 활발히 검토되고 있다. Biological resources that satisfy the above factors relatively well are algae and are classified as third generation biomass unlike the carbohydrate / starch biomass (first generation biomass) and fibrous biomass (second generation biomass) And is being actively studied as a chemical feedstock for the industry.

조류가 바이오매스로서 보다 적합한 이유들을 볼 것 같으면(Rodolfi 등 Biotechnol. Bioeng. 102: 100-112, 2009) 첫째, 종에 따라 여러 환경조건에서도 자랄 수 있기 때문에 토지 및 기타 자원 이용 효율이 높다. 둘째, 조류는 광합성을 하며 생육주기가 짧고 성장속도가 빨라 바이오매스 생산량이 총체적으로 높다. CO₂ 흡수율도 높아 1 ㎡에서 열대우림은 연간 15 내지 20 ton의 CO₂를 흡수하지만 같은 면적의 미세조류는 30 내지 40 ton을 흡수한다고 한다. 셋째, 조류 배양의 특별한 잇점 중의 하나는 폐이산화탄소를 이용할 수 있다는 것과 재배시 폐수(brackish water, gray water 등)를 영양분 공급원으로 활용함으로서 바이오매스 생산과 물정화 효과를 동시에 얻을 수 있다. 넷째, 조류 종중에는 탄수화물, 단백질, 지질 등 특정 성분이 상대적으로 고함량으로 존재하는 종들이 있어 이들을 잘 활용하면 산업원료물질로서의 자원화 효율이 매우 높다. 다섯째, 조류는 리그닌이 없기 때문에 섬유질계 바이오매스(리그닌 15-30% 함유)보다 전처리과정이 보다 용이한 이유에서 이다. If algae are likely to be more suitable as biomass (Rodolfi et al. Biotechnol. Bioeng. 102: 100-112, 2009) First, the efficiency of land and other resource utilization is high because different species can grow under different environmental conditions. Second, algae have photosynthesis, short growth cycles, and high growth rates, resulting in high biomass production. The CO ₂ uptake is also high. In 1 ㎡, tropical rainforests absorb 15 to 20 tonnes of CO ₂ per year, but microalgae of the same area absorb 30 to 40 tonnes per year. Third, one of the special advantages of algae cultivation is that biomass production and water purification effects can be achieved simultaneously by using waste carbon dioxide and by using wastewater (brackish water, gray water, etc.) as a nutrient source during cultivation. Fourth, there are species with a relatively high content of specific components such as carbohydrates, proteins, and lipids in birds, and their utilization as industrial raw materials is very high. Fifth, because algae lack lignin, it is easier to pretreat than fibrous biomass (containing 15-30% lignin).

그러나 3 내지 4만종의 존재가 알려진 조류의 모든 종이 상기의 장점을 보유하고 있는 것은 아니기 때문에 최근 들어 많은 연구자들이 보다 이용가치가 높은 조류종의 발굴 및 개선, 조류바이오매스의 생산, 이의 활용기술 개발에 많은 노력을 투입하고 있다. However, since all species of birds known to exist between 3 and 40,000 species do not possess the above merits, many researchers have recently developed technologies for exploiting and improving more valuable bird species, producing algae biomass, We are putting a lot of effort into.

한편, 유가 상승 경험 이전 동안 조류(algae)의 산업적 응용은 건강식품 및 기능성의약품, 색소생산, 양식사료, 화장품 소재 등의 분야로(Karina 등, Comparative Biochemistry and Physiology, Part C 146: 60-78, 2007) 제한되어 왔었으나 유가상승 경험 이후의 기술개발 경향을 보면, 대체에너지원 확보를 위한 미세조류 연구가 전세계적으로 대단한 열풍으로 진행되고 있다.In the meantime, the industrial application of algae prior to the experience of rising oil prices is in the fields of health foods and functional medicines, pigment production, aquaculture feed, cosmetic materials (Karina et al., Comparative Biochemistry and Physiology, Part C 146: 60-78, 2007), but the trend of technological development after the rise of oil prices has led to a great enthusiasm for microalgae research to secure alternative energy sources.

주로 바이오디젤 생산기술 개발에 집중되고 있으며(Scott 등, Current Opinion in Biotechnology 21:1-10, 2010; Mata 등, Renewable and Sustainable Energy Reviews 14 : 217232, 2010), 한편 미세조류 및 해양거대조류를 이용한 바이오에탄올, 바이오부탄올 등의 생산기술이 보고되고 있다(Ge 등, Renewable Energy. 36:84-89, 2011; Harun 등, Renewable and Sustainable Energy Reviews 인쇄중, 2011; Adams 등, J. Appl. Phycol. 21, 569574, 2009; Lee 등, J. Korean Ind. Eng. Chem. 20(3): 290-295, 2009; Isa 등, Journal of the Japan Institute of Energy, 88: 912-917, 2009; Ueno 등, Journal of Fermentation and Bioengineering. 86(1): 38-43, 1998; Brennan과 Owende, Renew. Sustain. Energy Rev. 14, 557577, 2010; Rojan 등, Bioresource Technology 인쇄중, 2011.; Choi 등, Bioresource Technology 101: 5330-5336, 2010; 강 등, 대한민국특허 10-0908425, 2009; 김 등, 대한민국 공개특허번호 10-2009-0025221, 2009; 이 등, 대한민국 공개특허 10-2010-0125104, 2010; 장 등, 대한민국특허 10-0919299, 2009).Mainly focused on developing biodiesel production technology (Scott et al., Current Opinion in Biotechnology 21: 1-10, 2010; Mata et al., Renewable and Sustainable Energy Reviews 14: 217232, 2010), while using microalgae and marine macroalgae Bioethanol, biobutanol and other production techniques have been reported (Ge et al., Renewable Energy. 36: 84-89, 2011; Harun et al., Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2011; Adams et al., J. Appl. Phycol. 21, 569574, 2009; Lee et al., J. Korean Ind. Eng. Chem. 20 (3): 290-295, 2009; Isa et al., Journal of the Japan Institute of Energy, 88: 912-917, 2009; Ueno et al. , Journal of Fermentation and Bioengineering.86 (1): 38-43, 1998; Brennan and Owende, Renew.Sustain.Energy Rev. 14, 557577, 2010; Rojan et al., Bioresource Technology, 2011 .; Choi et al., Bioresource Technology 101: 5330-5336, 2010; Kang et al., Korea Patent 10-0908425, 2009; Kim et al., Republic of Korea Publication No. 10-2009-0025221, 2009; Lee et al., Korea Patent 10-2010-0125104, 2010; pages, etc., the Republic of Korea Patent 10-0919299., 2009).

또한, 상기 바이오연료 이외의 분야에서는 식품 및 사료성분으로서 젖산 이용을 위해 전분 고함유 조류바이오매스의 발효 연구가 일부 보고되고 있다(Ike 등, Journal of Fermentation and Bioengineering. 84(5): 428-433, 1997). In addition, in the fields other than the biofuel, some fermentation studies of starch-rich algae biomass have been reported for lactic acid use as food and feed ingredients (Ike et al., Journal of Fermentation and Bioengineering, 84 (5): 428-433 , 1997).

우선, 바이오매스를 화학산업의 원료물질 공급원(chemical feedstocks)으로서 활용함에 있어서 가장 비중이 높은 물질은 탄수화물이다. 즉, 바이오매스의 전처리, 화학적 또는 생물학적 당화과정을 통해 얻어진 당용액을 발효나 화학적 전환을 통해 화학제품 생산 원료물질을 제조하게 된다. 그 중에서도 발효가 산업적으로 큰 비중을 차지하고 있으며 발효를 통해서 생산되는 주요 화학물질로서는 유기산(구연산, 글루콘산, 유산, 이타콘산 등), 아미노산(리신, 트레오닌, 메치오닌, 트립토판, 글루타민산나트륨 등), 비타민(아스코르브산, 리보플라빈, 시아노코발라민, 에리소르빈산염 등), 산업용 효소(리파아제, 셀룰라아제 등) 등이 있다. First of all, carbohydrates are the most important material in using biomass as chemical feedstocks in the chemical industry. That is, the sugar solution obtained through the pretreatment, chemical or biological saccharification process of the biomass is subjected to fermentation or chemical conversion to produce the chemical raw material. Among them, fermentation has a large industrial weight, and the main chemicals produced through fermentation are organic acids (citric acid, gluconic acid, lactic acid, itaconic acid, etc.), amino acids (lysine, threonine, methionine, tryptophan, sodium glutamate, etc.), vitamins. (Ascorbic acid, riboflavin, cyanocobalamin, erythorbate, etc.), and industrial enzymes (lipase, cellulase, etc.).

현재까지는 발효 원료로서 당질계(사탕수수, 사탕무) 또는 전분계(옥수수, 밀) 바이오매스의 당화물(글루코스, 프락토스, 포도당, 당밀 등)을 가장 많이 이용했으나 이들의 원료가 식품과의 경쟁 때문에 비식용자원(algae, 목질계 등)으로부터 원료를 대체 확보가 요구되고 있다. 그러나 이 경우 해결해야할 가장 큰 도전중의 하나는 당화물 생산비용의 절감이다. 식용자원과는 달리 비식용자원의 경우 전처리, 당화가 보다 어렵고 추가 공정이 요구되기 때문이다. Until now, most of the sugar materials (glucose, fructose, glucose, molasses, etc.) of carbohydrates (sugar cane, sugar beet) or starch (corn, wheat) biomass have been used as fermentation raw materials. However, Therefore, it is required to secure substitute raw materials from non-edible resources (algae, woody system, etc.). However, one of the biggest challenges to be solved in this case is the reduction of sugar production costs. Unlike edible resources, non-edible resources are more difficult to pretreat and saccharify and require additional processing.

따라서 현재 많은 연구자가 저비용으로 비식용 바이오매스 유래 당화물을 생산하는 기술개발에 노력을 경주하고 있다. 조류의 경우는 목질계 바이오매스와는 달리 당화를 위해 전처리가 필수적으로 요구되지는 않는다고 보고되고 있으나(Rojan 등, Bioresource Technology 102: 186-193, 2011) 이럴 경우 일반적으로 당수율이 낮아지는 한계점이 있다. Therefore, many researchers are now making efforts to develop a technology for producing non-edible biomass-derived saccharides at low cost. In the case of birds, unlike woody biomass, it is reported that pretreatment is not essential for saccharification (Rojan et al., Bioresource Technology 102: 186-193, 2011). In this case, have.

따라서 이를 해결하기 위해 전처리를 통해 당수율을 증가시키는 연구사례가 보고되고 있으며(Harun 등, Renewable and Sustainable Energy Reviews, 인쇄중. 2011), 지금까지 보고된 주요 방법으로는 대부분 해조류의 거대조류를 대상으로 산처리(김 등, 대한민국 공개특허번호 10-2009-0025221, 2009; Ge 등, Renewable Energy. 36:84-89, 2011; Thu 등, J. Microbiol. Biotechnol. 19: 161-166, 2009), 과산화수소 처리(Galynkin 등, WO 2010/074610 A1, 2010), NaClO2 처리(Wi 등, Bioresource Technology 100, 66586660, 2009), 고압 액화법(강 등, 대한민국 특허등록 10-0908425, 2009; Zhou 등, Energy Fuels 24(7): 40544061, 2010), 방사선처리(이 등, 대한민국 공개특허 10-2010-0125104, 2010), 산성 이온성 액체 이용(김 등, 대한민국 공개특허 10-2010-0024665, 2010), 초임계 처리(전과 노 등, 2010. 대한민국 공개특허 10-2010-0038905, 2010) 등이 보고된 바 있지만, 상기 전처리 과정을 추가 하면 당연히 비용이 발생되기 때문에 당용액 생산비가 증가되는 단점이 있다. In order to solve this problem, studies have been reported to increase sugar yield through pretreatment (Harun et al., Renewable and Sustainable Energy Reviews, in print. 2011). Acid treatment (Kim et al., Republic of Korea Patent No. 10-2009-0025221, 2009; Ge et al., Renewable Energy. 36: 84-89, 2011; Thu et al., J. Microbiol. Biotechnol. 19: 161-166, 2009) , Hydrogen peroxide treatment (Galynkin et al., WO 2010/074610 A1, 2010), NaClO2 treatment (Wi et al., Bioresource Technology 100, 66586660, 2009), high pressure liquefaction method (Kang et al., Korea Patent Registration 10-0908425, 2009; Zhou et al., Energy Fuels 24 (7): 40544061, 2010), radiation treatment (Lee et al., Republic of Korea Patent Publication 10-2010-0125104, 2010), use of acidic ionic liquid (Kim et al., Republic of Korea Patent Publication 10-2010-0024665, 2010) , Supercritical treatment (Jun and Roh et al., 2010. Republic of Korea Patent Publication No. 10-2010-0038905, 2010) has been reported, The addition of the pretreatment process, of course, incurs a disadvantage in that the sugar solution production cost increases.

또한, 상기 전처리 방법에 따라 처리과정중에 비의도적으로 발효억제물질이 생성될 수도 있는데, 이러할 경우엔 당용액내의 당농도가 높다 할지라도 발효 미생물 생장에 악영향을 미칠 수 있기 때문에 불량 당용액의 제조가 우려되는 문제점 역시 발생된다. In addition, according to the pretreatment method, fermentation inhibitors may be generated unintentionally during the treatment process. In this case, even if the sugar concentration in the sugar solution is high, it may adversely affect the growth of the fermentation microorganisms, thereby producing a poor sugar solution. Concerns also arise.

따라서 전처리 없이 또는 매우 약한 전처리를 통해서도 특정 유용 당성분이 많이 생산되는 조류 바이오매스를 선발하여 저비용, 친환경적으로 고품질의 당화액 제조기술을 개발하는 것이 본 산업 분야에서 지속적으로 추구해야 할 과제이다. Therefore, it is an ongoing challenge in the industry to develop low-cost, eco-friendly, high-quality saccharified liquid manufacturing technology by selecting algae biomass that produces a large amount of specific saccharide components without pretreatment or very weak pretreatment.

한편, 조류는 육상식물의 섬유소계와는 달리 셀룰로오스, 헤미셀루로오스 외에 여러 가지 다당류가 생산된다. 따라서 여러 종류의 당들이 복합되어 있는 것이 특징이다. On the other hand, unlike the fibrin system of land plants, algae, besides cellulose and hemicellulose, produce various polysaccharides. Therefore, it is characterized by the combination of various sugars.

그러나 발효의 경우 균주에 따라 여러 당을 모두 소화하는 계통이 있기는 하지만 대부분 몇 가지 당(글루코오스, 프락토오스, 포도당 등)을 우선적으로 선호함에 따라 이들 탄수화물이 상대적으로 높게 생산될 수 있는 조류 종을 골라 이로부터 발효용 당용액을 생산해야 하는 점 역시 고려해야 하는 과제이다.However, in the case of fermentation, there are strains which digest various sugars according to the strains. However, most of them prefer to prefer some sugars (glucose, fructose, glucose, etc.), so that these carbohydrates are relatively high- It is also a problem to consider that the fermentation sugar solution should be produced from the sugar.

본 발명자들은 조류 바이오매스로부터 발효에 가장 많이 사용되고 있는 고품질의 단당류를 경제적이면서 효율적으로 제조할 수 있는 방법에 대한 연구를 지속하던 중, 아직 보고된 바 없는 탄소화물 고함유 조류 바이오매스를 발견하고, 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention continue to study how to produce high-quality monosaccharides, which are most frequently used for fermentation from algae biomass, economically and efficiently. The invention was completed.

본 발명의 목적은 조류 바이오매스로부터 고농도의 당농축액 제조의 어려움과 재현성을 극복하기 위한 것으로, 아직 보고된 바 없는 탄소화물 고함유 조류 바이오매스로부터 특별한 전처리 없이 당화공정을 통해 저농도의 발효억제물질 및 고농도의 단당류를 효율적으로 수득하는 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to overcome the difficulty and reproducibility of preparing a high concentration of sugar concentrate from algae biomass, low concentration of fermentation inhibitors and high concentration through the saccharification process without special pretreatment from carbonaceous high algae biomass has not been reported yet It is to provide a method for efficiently obtaining monosaccharides of.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 아직 보고된 바 없는 담수 녹조류 중 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류를 이용하여 특별한 전처리 없이 직접 효소 가수분해 또는 화학적 가수분해하는 단계를 포함하는 고농도의 단당류를 수득하는 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention obtains a high concentration of monosaccharides, which comprises direct enzymatic hydrolysis or chemical hydrolysis without special pretreatment, using a family of Family Hydrodictyaceae algae, which has not been reported yet. Provide a way to.

또한, 본 발명은 담수 녹조류 중 그물말 과(Family Hydrodictyaceae)를 이용하여 특별한 전처리 없이 직접 효소 가수분해 또는 화학적 가수분해하는 단계; 및 원심분리 또는 여과방법으로 상등액을 수득한 후 감압건조 또는 막투과증발법으로 농축하는 단계;를 포함하는 글루코오스 고함유 당화액의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of direct enzymatic hydrolysis or chemical hydrolysis without special pretreatment using a family (Family Hydrodictyaceae ) of freshwater algae; And obtaining a supernatant by centrifugation or filtration and then concentrating by vacuum drying or membrane pervaporation.

본 발명에 따른 따른 단당류 수득방법은 히드로딕티온 속(Hydrodictyon sp.), 훈장말 속(Pediastrum sp.), 소라스트럼 속(Sorastrum sp.)으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 조류를 이용하는 것을 특징으로 한다. Monosaccharide obtained in accordance with method according to the invention is dihydro-thione in Dick (Hydrodictyon sp.), In the end of Medal (Pediastrum sp.), Sorastrum sp. is characterized in using one or two or more mixed algae selected.

본 발명에 따른 단당류 수득방법은 상기 조류가 생체; 건조체; 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올로 침출 여과 후 남은 잔사물; 유기물 정제 장치를 이용하여 물, 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올 또는 이들의 연속 용매로 추출 후 남은 잔사물; 유기용매를 이용하여 지질성분을 추출하고 남은 잔사물;로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물 형태인 것을 특징으로 한다.Monosaccharide obtaining method according to the invention is the algae living body; Dried body; Residues remaining after filtration with a lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms; Water, a lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms or residues after the extraction with a continuous solvent thereof using an organic material refining apparatus; It is characterized in that it is one or two or more mixtures selected from the residue; remaining after extracting the lipid component using an organic solvent.

본 발명에 따른 단당류 수득방법은 상기 조류는 고형분 함량이 1 내지 30 중량%인 것을 특징으로 한다.The monosaccharide obtaining method according to the present invention is characterized in that the algae has a solid content of 1 to 30% by weight.

본 발명에 따른 단당류 수득방법은 화학적 전환용 또는 생물학적 전환을 위한 발효용인 단당류를 수득할 수 있는 것을 특징으로 한다.The monosaccharide obtaining method according to the present invention is characterized in that it is possible to obtain monosaccharides for fermentation for chemical conversion or biological conversion.

보다 상세하게는 상기 단당류 수득방법은 글루코오스, 만노오스 또는 이들의 혼합 단당류를 고함량으로 수득할 수 있으며, 또한 상기 단당류는 하이드록시메틸풀푸랄(Hydroxymethylfurfural, HMF), 풀푸랄(furfural) 또는 이들의 혼합물이 5% 단당류(글루코오스) 함량 당 0.07% 이하인 것을 특징으로 한다.More specifically, the monosaccharide obtaining method can obtain a high content of glucose, mannose, or a mixed monosaccharide thereof, and the monosaccharide is hydroxymethylfurfural (HMF), furfural or a mixture thereof. It is characterized in that less than 0.07% per 5% monosaccharide (glucose) content.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 화학적, 물리적 전처리 공정 없이 그물말과 조류를 다당류 분해효소에 의해 당화시키는 당화공정, 또는 가수분해 촉매에 의해 당화시키는 당화공정, 또는 다당류 분해효소 및 가수분해 촉매에 의해 당화시키는 공정으로부터 단당류를 수득하는 단계;로부터 조류를 가수분해하여 고농도의 단당류를 수득하는 방법을 제공한다.The present invention provides a monosaccharide from a glycosylation step of glycosylating net horses and algae by a polysaccharide degrading enzyme without a chemical and physical pretreatment process, or a saccharification step of saccharifying by a hydrolysis catalyst, or a step of saccharifying by a polysaccharide degrading enzyme and a hydrolysis catalyst. It provides a method of hydrolyzing the algae from the step to obtain a high concentration of monosaccharides.

본 발명에 있어서, 상기 단당류는 원심분리 또는 여과방법으로 상등액을 수득한 후 감압건조 또는 막투과증발법으로 농축하는 단계;를 더 포함할 수 있다.In the present invention, the monosaccharide may further comprise a step of obtaining a supernatant by centrifugation or filtration and concentrating by drying under reduced pressure or membrane pervaporation.

본 발명에 있어서, 상기 조류는 담수 녹조류 중 그물말 과(Family Hydrodictyaceae)의 히드로딕티온 속(Hydrodictyon sp.), 훈장말 속(Pediastrum sp.), 소라스트럼 속(Sorastrum sp.)으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 조류이며, 보다 바람직하게는 그물말 과(Family Hydrodictyaceae)의 히드로딕티온 속(Hydrodictyon sp.)을 사용할 수 있다.In the present invention, the algae is Hydrodictyon sp. Of the family (Family Hydrodictyaceae ) of freshwater algae ( Hydrodictyon sp.), Genus ( Peldiastrum) sp.), one or two or more mixed algae selected from Sorastrum sp., more preferably Hydrodictyon sp. of Family Hydrodictyaceae can be used. .

보다 상세하게는 본 발명자들은 담수 녹조류 중 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류가 탄수화물 함량이 50 내지 70%까지 되는 조류로 특히, 주요 단당류는 글루코오스와 만노오스가 주성분이고, 효소 당화시 글루코오스 함량이 바이오매스 중량대비 30 내지 60%까지 생산될 수 있는 탄소화물 고함유 바이오매스로의 이용 가능성을 발견하였다.More specifically, the inventors of the present invention are fresh algae (Family Hydrodictyaceae ) algae of the carbohydrate content of 50 to 70% of the algae, in particular, the main monosaccharides of glucose and mannose are the main component, the glucose content of the enzyme glycosylated biomass It has been found to be available as a high carbonaceous biomass that can be produced from 30 to 60% by weight.

또한 상기 담수 녹조류 중 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류는 시료의 수집/선별시 단순히 건지개로만 이용해도 될 정도로 손쉬워 원심분리 또는 여과과정을 거쳐 수집해야만 하는 다른 미세조류의 공정에 비해 저에너지/저비용으로 시료를 공급받을 수 있으며, 세척, 탈수, 건조, 분말화 등의 작업도 매우 간편한 특징을 가진다. 또한, 리그닌이 없고 탄수화물이 보통 50 내지 70% 차지하고 있으며, 특히 발효에 가장 많이 활용되는 글루코오스 함량 비율이 기타 조류 종들에 비해 매우 높은 장점이 있다. In addition, the Family Hydrodictyaceae algae of the freshwater algae are easy to use only as a dry shell when collecting / selecting a sample, and thus have low energy / low cost compared to other microalgae processes that have to be collected through centrifugation or filtration. Samples can be supplied, and cleaning, dehydration, drying, and powdering are also very easy. In addition, there is no lignin and carbohydrates usually occupy 50 to 70%, in particular the ratio of glucose content that is most utilized for fermentation is very high compared to other algal species.

본 발명에 있어서, 상기 조류는 생체; 건조체; 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올로 침출 여과 후 남은 잔사물; 유기물 정제 장치를 이용하여 물, 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올 또는 이들의 연속 용매로 추출 후 남은 잔사물; 유기용매를 이용하여 지질성분을 추출하고 남은 잔사물;로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.In the present invention, the alga is a living body; Dried body; Residues remaining after filtration with a lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms; Water, a lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms or residues after the extraction with a continuous solvent thereof using an organic material refining apparatus; And a remnant remaining after extracting a lipid component using an organic solvent; or a mixture of two or more thereof.

보다 상세하게는 본 발명에 적용되는 그물말과 조류는 야외에서 직접 수집하거나 또는 배양과정을 통해서 얻어진 생체 또는 건조체를 고운 입자를 마쇄하여 이용할 수 있으며, 시료에 따라서는 마쇄 없이 직접 당화에 적용하여 사용할 수 있다. More specifically, the net horse and alga to be applied to the present invention can be used by grinding the fine particles of the living body or dry body obtained through direct collection or incubation process in the open air, depending on the sample can be used for direct saccharification without grinding Can be.

또한, 본 발명에 적용되는 그물말과 조류는 부가가치를 높이면서 고품질의 당화액을 제조하기 위하여 다음과 같이 별도의 추출과정을 거칠 수 있다. In addition, the net and algae applied to the present invention may be subjected to a separate extraction process as follows to produce high-quality saccharified solution while increasing the added value.

상기 고품질이란 당화액 내에 6탄당(글루코오스, 만노오스 등) 함량이 높고 발효에 저해역할을 하는 억제물질의 함량이 낮아서 발효에 용이하도록 제조된 상태를 말한다. The high quality refers to a state prepared to facilitate fermentation because of a high content of hexasaccharides (glucose, mannose, etc.) in the saccharification solution and a low content of inhibitors that inhibit the fermentation.

이를 위해 본 발명에서는 수집된 그물말 과의 생체 및 건조체 조류를 70 내지 100%의 메탄올 또는 에탄올로 추출한 다음, 추출물은 분리정제 과정을 거쳐 여러 생리활성물질(의약 또는 농약용 항균제, 살조제, 기능성 식품용 물질 등)로 활용하고, 추출 후 남은 잔사(고형분)를 고농도의 단당류의 제조에 이용할 수도 있다.To this end, in the present invention, the biological and dry algae of the collected nettles are extracted with 70 to 100% of methanol or ethanol, and then the extract is separated and purified through various bioactive substances (antimicrobial agents for medicines or pesticides, pesticides, and functionalities). It can also be used as a food substance) and the residue (solid content) remaining after extraction can be used for the production of high concentration monosaccharides.

또한 생체 또는 건조체의 그물말 과의 조류를 속슬렛 장치를 이용하여 물 또는 물과 에탄올로 연속하여 추출한 다음, 추출물(extractives)은 상기에 언급한 용도로 이용하고, 남은 잔사를 고농도의 단당류의 제조에 사용할 수도 있다. In addition, the algae of the living body or dried nets of algae are continuously extracted with water or water and ethanol using a Soxhlet apparatus, and then the extracts are used for the above-mentioned purposes, and the remaining residues are used to prepare high concentrations of monosaccharides. Can also be used for

또한, 생체 또는 건조체의 그물말 과(Family Hydrodictyaceae)의 조류를 유기용매(예, 클로로포름＋메탄올)를 가지고 지질성분을 추출한 다음, 남은 잔사를 고농도의 단당류의 제조에 사용할 수도 있다. In addition, the algae of the family (Family Hydrodictyaceae ) of the living body or dry body may be extracted with the organic solvent (for example, chloroform + methanol), and then the remaining residue may be used for the production of high concentration of monosaccharides.

본 발명에 있어서, 상기 조류는 고형분 함량이 1 내지 30 중량%인 것을 특징으로 한다. In the present invention, the algae is characterized in that the solid content of 1 to 30% by weight.

본 발명에 있어서, 상기 가수분해 촉매는 황산, 염산, 브롬산, 질산, 아세트산, 과염소산, 인산, 파라-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonic acid, PTSA) 및 고체산으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 산 촉매 또는 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼슘, 암모니아 수용액으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 알카리 촉매를 사용할 수 있다.In the present invention, the hydrolysis catalyst is one or two or more selected from sulfuric acid, hydrochloric acid, bromic acid, nitric acid, acetic acid, perchloric acid, phosphoric acid, para-toluenesulfonic acid (PTSA) and a solid acid. One or two or more alkali catalysts selected from acid catalysts or potassium hydroxide, sodium hydroxide, calcium hydroxide and aqueous ammonia solution can be used.

본 발명에 있어서, 상기 다당류 분해효소는 셀룰라아제, β-글루코시다제, β-아가라제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 라미나린나아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제, 락타아제, 드리할라제, 울바나아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 분해효소를 사용할 수 있다.In the present invention, the polysaccharide degrading enzyme is a cellulase, β-glucosidase, β-agarase, β-galactosidase, endo-1,4-β-glucanase, α-amylase, β-amylase 1 selected from amyloglucosidase, laminarinase, α-D-glucosidase, β-D-glucosidase, sucrase, maltase, isomaltase, lactase, drhalase, ulvanase Species or two or more mixed enzymes can be used.

본 발명의 제조방법을 통해 수득되는 단당류는 갈락토오스, 갈락토오스 유도체, 3,6-안하이드로갈락토오스, 크실로오스, 글루코오스, 람노오스, 크실로오스 및 만노오스로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 단당류인 것으로, 보다 바람직한 것은 글루코오스, 만노오스 또는 이들의 혼합 단당류인 것을 특징으로 한다.The monosaccharide obtained through the preparation method of the present invention is one or two or more mixed monosaccharides selected from galactose, galactose derivatives, 3,6-anhydrogalactose, xylose, glucose, rhamnose, xylose and mannose. More preferred is glucose, mannose or mixed monosaccharides thereof.

보다 상세하게는 글루코오스 고함유 당화액을 제조하기 위하여, 우선 고농도의 단당류를 수득하는 방법으로 바이오매스 공급을 초기에 모두 공급하거나 또는 분할하여 공급할 수 있으며, 최종 공급된 고형분 함량은 배양액 무게대비 1 내지 30%까지 투입할 수 있다. 효소공급의 경우도 바이오매스 공급 직후에 필요량 모두를 공급할 수 있으나 조건에 따라 분할하여 투입할 수 있다. More specifically, in order to prepare a high glucose-containing glycosylated solution, the biomass feed may be initially supplied all or dividedly by a method of obtaining a high concentration of monosaccharides, and the final solid content may be 1 to the weight of the culture solution. 30% can be added. Even in the case of enzyme supply, all the necessary amount can be supplied right after the biomass supply, but it can be divided according to conditions.

또한, 당화과정중의 온도조절은 분해효소 투입시기와 효소 반응 최적조건에 따라 달라질 수 있으며, 20 내지 60℃에 0.5 내지 5일 동안 반응한다. 그리고 품질이 좋은 고농도 당화액을 제조하기 위해 효소 반응시 완충액 염농도가 최소화되도록 당화를 실시하며, 바람직하게는 증류수 또는 0.01 mM 내지 1.0 M 범위의 완충액에서 당화를 실시한다. 한편 화학적 가수분해의 경우는 발효억제물질 생성을 최소화 하기 위해서 낮은 반응온도와 반응시간을 설정하는 것이 바람직하다. In addition, the temperature control during the saccharification process may vary depending on the timing of the enzyme digestion and the optimum conditions for the enzyme reaction, and reacts at 20 to 60 ° C. for 0.5 to 5 days. In order to prepare a high quality saccharification solution of good quality, saccharification is performed to minimize the buffer salt concentration during the enzyme reaction, and saccharification is preferably performed in distilled water or a buffer in the range of 0.01 mM to 1.0 M. On the other hand, in the case of chemical hydrolysis, it is desirable to set a low reaction temperature and reaction time in order to minimize the production of fermentation inhibitors.

보다 상세하게는 본 발명의 단당류는 그물말과 조류에 대하여, 황산, 염산, 브롬산, 질산, 아세트산, 과염소산, 인산, 파라-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonic acid, PTSA) 및 고체산으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 산 촉매 또는 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼슘, 암모니아 수용액으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 알카리 촉매를 이용하여 20 내지 200℃의 온도에서 0.5 내지 6시간 동안 1차 가수분해 후 2차 가수분해시킴으로써 생성될 수 있다. More specifically, the monosaccharides of the present invention are selected from sulfuric acid, hydrochloric acid, bromic acid, nitric acid, acetic acid, perchloric acid, phosphoric acid, para-toluenesulfonic acid (PTSA) and solid acids, for net horses and algae. After the first hydrolysis for 0.5 to 6 hours at a temperature of 20 to 200 ℃ using one or two or more acid catalysts or one or two or more alkali catalysts selected from potassium hydroxide, sodium hydroxide, calcium hydroxide and aqueous ammonia solution Can be produced by secondary hydrolysis.

또한, 본 발명의 단당류는 그물말과 조류에 대하여, 셀룰라아제, β-글루코시다제, β-아가라제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 라미나린나아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제, 락타아제, 드리할라제, 울바나아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 분해효소를 이용하여 증류수 또는 0.01 mM 내지 1.0 M 범위의 완충액에서 20 내지 60℃, 0.5 내지 5일 반응시킴으로써 생성될 수 있다.In addition, the monosaccharides of the present invention are cellulase, β-glucosidase, β-agarase, β-galactosidase, endo-1,4-β-glucanase, α-amylase, for net horses and algae. , β-amylase, amyloglucosidase, laminarinase, α-D-glucosidase, β-D-glucosidase, sucralase, maltase, isomaltase, lactase, drihalase, ulvanase It can be produced by reacting 20 to 60 ℃, 0.5 to 5 days in distilled water or a buffer in the range of 0.01 mM to 1.0 M using one or two or more mixed digestases selected from.

상기 단당류는 하이드록시메틸풀푸랄(Hydroxymethylfurfural, HMF), 풀푸랄(furfural) 또는 이들의 혼합물이 5% 글루코오스 함량 당 0.07% 이하로서, 최종 목적으로 하는 글루코오스 함량이 1 내지 20%의 화학적 전환용 또는 생물학적 전환을 위한 발효용 당농축액을 제조할 수 있는 특징이 있다.The monosaccharide is hydroxymethylfurfural (HMF), furfural or a mixture thereof of 0.07% or less per 5% glucose content, the final glucose content for the chemical conversion of 1 to 20% or There is a characteristic that can prepare a sugar concentrate for fermentation for biological conversion.

본 발명에 따른 단당류 수득방법은 담수 녹조류 중 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류를 이용함에 따라 생화학적/화학적 당화가 매우 용이한 특징을 가져 수집 후 생체를 직접 사용할 수 있고, 건조체를 이용할 때에도 특별한 전처리 없이도 높은 당화율을 가짐으로써 보다 저비용으로 당화할 수 있는 경제성 뿐 아니라 당화공정시 환경오염물질 배출가능성도 낮은 장점이 있다.The method for obtaining monosaccharides according to the present invention has the characteristics of biochemical / chemical saccharification very easy by using the family of family family (Family Hydrodictyaceae ) algae in freshwater algae, can directly use the living body after collection, and special pretreatment even when using a dry body Without having a high saccharification rate, it is economical to be able to saccharify at a lower cost as well as a low possibility of emitting environmental pollutants in the saccharification process.

상기 방법으로 제조된 단당류를 이용하여 고농도 당농축액을 제조하기 위해서 1차적으로 당화한 용액을 2회 이상 원심분리를 하거나 여과방법을 통해 모은 다음, 이를 감압건조 또는 막투과증발법 등을 더 진행하여 농축시킬 수 있다.In order to prepare a high concentration of sugar concentrate using the monosaccharide prepared by the above method, the first saccharified solution was collected by centrifugation or filtration twice or more times, and then further dried under reduced pressure or membrane permeation evaporation. Can be concentrated.

본 발명에 따른 담수 녹조류로부터의 화학물질 생산은 옥수수, 밀과 같은 식용자원이 아닌 비식용자원인 조류(algae)를 활용하기 때문에 바이오매스의 산업적 수요가 높아졌을 때 식품 가격 폭등 및 윤리적 문제의 발생 소지가 없고, 안정적으로 자원의 지속적 공급이 가능한 장점이 있다.The production of chemicals from freshwater algae according to the present invention utilizes algae, which is a non-edible resource, rather than an edible resource such as corn and wheat, which may cause food price surges and ethical problems when industrial demand for biomass increases. There is no advantage, and there is an advantage that the continuous supply of resources can be stable.

본 발명에 따른 담수 녹조류는 시료의 수집/선별시 단순히 건지개로만 이용해도 될 정도로 손쉬워 원심분리 또는 여과과정을 거쳐 수집해야만 하는 다른 미세조류의 공정에 비해 저에너지/저비용으로 시료를 공급받을 수 있으며, 세척, 탈수, 건조, 분말화 등의 작업도 매우 간편한 특징을 가진다. 또한, 리그닌이 없고 탄수화물이 보통 50 내지 70% 차지하고 있으며, 특히 발효에 가장 많이 활용되는 글루코오스 함량 비율이 기타 조류 종들에 비해 매우 높은 장점이 있다. The freshwater green algae according to the present invention can be supplied at low energy / low cost compared to other microalgae processes that have to be collected through centrifugation or filtration because it is easy to use only as a tether when collecting / selecting a sample. Washing, dehydration, drying and powdering are also very easy. In addition, there is no lignin and carbohydrates usually occupy 50 to 70%, in particular the ratio of glucose content that is most utilized for fermentation is very high compared to other algal species.

본 발명에 따른 담수 녹조류는 생화학적/화학적 당화가 매우 용이한 특징을 가져 수집 후 생체를 직접 사용할 수 있고, 건조체를 이용할 때에도 특별한 전처리 없이도 높은 당화율을 나타내며, 이는 보다 저비용으로 당화할 수 있는 경제성 뿐 아니라 당화공정시 환경오염물질 배출가능성도 낮아 향후 산업바이오화학제품 생산으로의 크게 기여할 것이다.Freshwater green algae according to the present invention has the characteristics of easy biochemical / chemical saccharification and can directly use the living body after collection, and shows a high glycosylation rate without special pretreatment even when using a dry body, which can be saccharified at lower cost. In addition, it is unlikely to release environmental pollutants during the saccharification process, which will greatly contribute to the production of industrial biochemical products.

도 1은 본 발명에 따른 그물말과 조류를 이용한 고농도의 단당류를 수득하는 방법을 모식화한 도면이고,
도 2는 본 발명에 따른 그물말의 주요 당 조성을 가스크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이며,
도 3은 본 발명에 따른 그물말의 주요 당 조성 및 함량을 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이고,
도 4는 본 발명에 따른 그물말의 효소당화에 있어서 완충용액의 염 농도(buffer strength)별 당화정도를 비교한 결과이며,
도 5는 본 발명에 따른 그물말의 효소당화에 있어서 여러 멸균처리 온도 차이에 따른 당화정도를 확인한 결과이고,
도 6은 본 발명에 따른 그물말의 효소당화에 있어서 온도처리 시간에 따른 글루코오스 생성정도를 확인한 결과이며,
도 7은 본 발명에 따른 그물말의 효소당화에 있어서 당화온도에 따른 글루코오스 생성정도를 확인한 결과이고,
도 8은 본 발명에 따른 그물말의 시료 형태(생체 시료, 건조체 시료)에 따른 효소 당화율을 확인한 결과이며,
도 9는 본 발명에 따른 그물말 건조시료의 분말화 여부에 따른 효소 당화율을 확인한 결과이고,
도 10은 본 발명에 따른 그물말의 효소당화시 첨가되는 고형분 함량에 따른 효소 당화율을 확인한 결과이다.1 is a diagram schematically illustrating a method for obtaining a high concentration of monosaccharides using a net horse and algae according to the present invention,
2 is a result of analyzing the main sugar composition of the net horse according to the present invention using gas chromatography,
3 is a result of analyzing the main sugar composition and content of the net according to the present invention using high performance liquid chromatography,
Figure 4 is a result of comparing the degree of saccharification by salt strength (buffer strength) of the buffer solution in the enzyme glycation of the net according to the present invention,
5 is a result of confirming the degree of saccharification according to the different sterilization temperature difference in the enzyme saccharification of the net horse according to the invention,
6 is a result of confirming the glucose production degree according to the temperature treatment time in the enzyme saccharification of the net horse according to the invention,
7 is a result of checking the glucose production according to the saccharification temperature in the enzyme saccharification of the net horse according to the invention,
8 is a result of confirming the enzyme glycosylation rate according to the sample form (biological sample, dry sample) of the net according to the present invention,
9 is a result confirming the enzyme glycosylation rate according to whether or not the powdered dry powder according to the present invention,
10 is a result of confirming the enzyme glycosylation rate according to the solid content added during the enzyme saccharification of the net according to the present invention.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are provided to aid understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples in any sense.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.Hereinafter, the technical and scientific terms used herein will be understood by those skilled in the art without departing from the scope of the present invention. Descriptions of known functions and configurations that may be unnecessarily blurred are omitted.

[실시예 1] 그물말의 탄수화물 함량 및 조성 분석[Example 1] Analysis of carbohydrate content and composition of a horse

1. 화학적 성분조성 조사1. Chemical composition investigation

수집된 담수조류 중 그물말 과의 대표적인 히드로딕티온 속(Hydrodictyon sp.) 그물말에 대하여 총탄수화물, 단백질, 조지질, 회분의 상대적 함량 비율을 조사하기 시험하였다.The ratio of total carbohydrate, protein, crude lipid, and ash content to total hydrodictyon sprouts was measured to investigate the relative ratio of total carbohydrates, crude lipids, and ash contents to representative horses.

우선, 수집된 그물말은 2회 이상 수돗물로 세척하였다. 이를 45℃ 컨벤션 오븐에 1일 이상 두어 건조시킨 다음 분쇄기를 이용하여 1 mm 이하의 분말로 조제하여 분석용 시료로 사용하였다.First, the harvested horses were washed twice with tap water. The mixture was dried in a 45 ° C convention oven for 1 day or more and then dried and pulverized to a powder having a size of 1 mm or less.

건조시료의 성분분석은 한국식품연구원에 의뢰하여 실시하였으며, 수분은 식품공전(2009) 상압가열건조법, 조지질은 식품공전(2009) 에테르추출법, 단백질은 Kjeldahl법, 회분은 식품공전(2009) 회분시험법에 준하여 정량하였다.The analysis of the components of the dried samples was carried out by the Korea Food Research Institute (KRIBB). The moisture content was measured by the atmospheric pressure heating method (2009), the crude lipid was determined by ether extraction method, the protein was analyzed by Kjeldahl method, And quantified according to the test method.

그 결과, 그물말은 수분 5.3%, 조지질 1.9%, 단백질 12.9%, 총 탄수화물 64.6%, 회분 15.3%의 화학적 조성을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 일반적으로 성분조성은 생육단계 및 환경에 따라 다소 변화가 있는 것으로 보고되기 있기 때문에 향후 분석시 이를 참고하였다.As a result, it was confirmed that the net has a chemical composition of 5.3% moisture, 1.9% crude lipid, 12.9% protein, 64.6% total carbohydrate, 15.3% ash. In general, the composition of the composition is reported to be somewhat changed depending on the growth stage and environment, so the analysis was used for future analysis.

2. 그물말의 탄수화물 조성 및 함량 조사2. Carbohydrate Composition and Content of Net Horse

조류 바이오매스 내 총 탄수화물 함량 뿐 아니라 어떤 종류의 당이 어느 정도 함유되어있는지를 안다는 것은 당화처리 조건의 효율성, 발효 균주 선택, 발효에 의한 특정성분으로의 전환율 등을 판단하는데 있어서 근간이 된다. 바이오매스의 탄수화물 조성 및 함량은 일반적으로 산 가수분해를 통해 조사되는데 보다 정확한 데이터를 얻기 위해서는 바이오매스 각 종류별로 온도, 산농도, 처리시간, 압력 등 제반 처리조건의 최적화가 필요하다. 본 연구에서는 그물말 내의 주요 탄수화물 조성과 그 함량을 알아보기 위하여 실험하였다. Knowing how much sugar is contained, as well as the total carbohydrate content in algal biomass, is the basis for determining the effectiveness of saccharification conditions, selection of fermentation strains, and conversion to specific components by fermentation. The carbohydrate composition and content of biomass is generally investigated through acid hydrolysis. To obtain more accurate data, it is necessary to optimize various treatment conditions such as temperature, acid concentration, treatment time, and pressure for each type of biomass. In this study, the main carbohydrate composition and its contents in the net were tested.

(1) 그물말의 탄수화물의 조성을 알기위한 GC분석(1) GC analysis to know the composition of carbohydrates in the net

그물말 조류의 탄수화물 조성을 알기 위해서 먼저 산 가수분해를 실시하였다. 바이오매스 준비, 바이오매스 내의 추출성분(extractives) 제거, 시료의 1차/2차 산 가수분해 등은 “NREL protocol(NREL, 2009, Laboratory anayltical procedure)”에 준하여 실험하였다. In order to know the carbohydrate composition of the birds, acid hydrolysis was performed first. Biomass preparation, removal of extractives in biomass, primary and secondary acid hydrolysis of samples were performed according to the "NREL protocol (NREL, 2009, Laboratory anayltical procedure)".

그물말의 산처리에 의해 단당류로 변환된 당용액을 GC를 이용하여 단당류의 종류를 파악하였다. 정성분석은 0.5 g 정도의 시료를 취하여 동결 건조한 후 실리레이션(silylation)하여 분석하였다. 실릴화제(silylating agent)는 헥사메틸디실라젠(Hexamethyldisilazane), 클로로트리메틸실란( Chlorotrimethylsilane), 피리딘(pyridine)을 각각 3:1:9의 부피비로 혼합한 것으로, 0.5 ㎖의 동결 건조된 샘플에 투입하여 30분 교반한 후 상부의 맑은 액만 사용하여 분석을 진행하였다.The monosaccharide was converted to monosaccharide by acid treatment of net horses and the kinds of monosaccharides were determined by GC. For qualitative analysis, 0.5 g of sample was taken, lyophilized, and then silylated. The silylating agent is a mixture of hexamethyldisilazane, chlorotrimethylsilane, and pyridine in a volume ratio of 3: 1: 9, respectively, and is added to a 0.5 ml freeze-dried sample. After stirring for 30 minutes, the analysis was performed using only the clear liquid at the top.

정성분석에 사용된 기기는 Agilent사의 GC(model : 6890N)을 사용하였다. 검출기는 FID, 컬럼은 DB-1HT(30 m×0.32 ㎜×0.1 ㎛)을 사용하였다. 온도조건은 주입구와 검출기는 250℃를 유지하였으며, 오븐의 온도는 초기 100℃에서 분당 5℃씩 250℃까지 승온하여 5분간 대기하였다. 그리고 표준당과 시료의 체류시간을 비교하여 시료의 당 성분을 정성 분석하였다. The instrument used for qualitative analysis was Agilent's GC (model: 6890N). The detector used FID and the column used DB-1HT (30 m × 0.32 mm × 0.1 μm). Temperature conditions were maintained at 250 ° C. for the inlet and detector, and the temperature of the oven was raised to 250 ° C. at 5 ° C. per minute from 100 ° C. for 5 minutes. And the sugar component of the sample was qualitatively analyzed by comparing the residence time of the standard sugar and the sample.

(2) 그물말 효소가수분해물의 단당류 정량분석(2) Quantitative Analysis of Monosaccharides of Enzyme Hydrolysates

그물말의 효소가수분해를(하기 실시예 2 참조) 통해 얻어진 당류의 정량분석을 위해 HPLC 분석을 실시하였으며, 제반 분석조건은 NREL protocol(NREL, 2009, Laboratory anayltical procedure)을 참고하였다. HPLC analysis was carried out for quantitative analysis of sugars obtained through enzymatic hydrolysis of the net horse (see Example 2 below), and the analytical conditions were referred to NREL protocol (NREL, 2009, Laboratory anayltical procedure).

그 결과, 그물말 건조시료를 속슬렛 추출시 물 추출성분(water-extractive) 무게는 29.5%, 물 추출성분 제거후 남은 고형분 (WEFS)은 건조시료 전체 무게의 70.5%를 차지하였다. 상기 시료에 대해 고압멸균기를 이용하여 1차, 2차 가수분해를 실시한 다음 얻어진 가수분해물을 GC 정성분석한 결과, 그물말 시료의 주요 당성분은 글루코오스와 만노오스인 것을 확인할 수 있었다 (도 2).As a result, the weight of the water-extractive extract was 29.5%, and the remaining solids (WEFS) accounted for 70.5% of the total weight of the dried sample. GC qualitative analysis of the hydrolyzate obtained after performing primary and secondary hydrolysis using autoclave on the sample showed that the major sugar components of the net sample were glucose and mannose (FIG. 2).

상기의 결과를 기반으로 하여 그물말 조류에 대한 효소 가수분해물의 당조성 및 함량을 HPLC(RI detector)로 분석하였다. 그 결과 도 3에서 보는 바와 같이 글루코오스와 만노오스가 주요 성분임을 재확인 할 수 있었으며, 각각의 함량은 건조된 바이오 매스 100 g 당 46.82±0.46 g, 10.56±0.48 g이었다. Based on the above results, the sugar content and the content of the enzyme hydrolyzate on the wild horse algae were analyzed by HPLC (RI detector). As a result, as shown in Figure 3, it was confirmed that glucose and mannose are the main components, each content of 46.82 ± 0.46 g, 10.56 ± 0.48 g per 100 g of dried biomass.

이는 그물말의 총탄수화물이 64.6%이었던 것을 감안할 때 효소가수분해에 의한 육탄당(glucose＋mannose) 수득율은 총탄수화물 기준 88.8%였고, 바이오매스 건물중 기준 57.4%였다. 이는 조류로부터의 당생성율에 있어서 현재까지 보고된 결과들 중에서 매우 높은 수준임을 확인할 수 있었다.Considering that 64.6% of the total carbohydrates in the horses were produced, the yield of glucose + mannose by enzymatic hydrolysis was 88.8% based on total carbohydrate and 57.4% based on biomass. It was confirmed that this is a very high level of sugar production from birds to date.

이상의 결과는 그물말 시료가 발효용, 바이오리파이너리 또는 바이오에너지용 바이오매스로서 매우 우수한 품질의 재료가 될 수 있음을 확인한 결과이다. 왜냐하면 대부분의 상업용 발효균주는 오탄당보다 육탄당을 잘 이용하며 육탄당 중에서도 글루코오스가 다량 함유된 시료를 가장 선호하기 때문이다.
These results are the result of confirming that the netting sample can be a very high quality material for fermentation, biorefinery, or biomass for bioenergy. This is because most commercial fermenting bacteria prefer the hexane sugar rather than the pentane sugar and prefer the sample containing a large amount of glucose among the hexane sugar.

[[ 실시예Example 2] 2] 효소당화에In enzyme glycosylation 의한 여러 조류종간의 글루코오스 Glucose between several bird species 생성정도Creation degree 비교 compare

본 발명의 온실조건에서 생장된 그물말이 다른 조류종에 비해 동일조건의 효소당화에서 어느 정도 글루코오스 생성량이 높은지를 상대비교해 보고자 실험하였다. Experiments were conducted to compare the amount of glucose produced in the green algae of the present invention with those of other algal species under the same conditions.

수집된 조류 종 총 15건에 대하여 조사하였다. 해조류의 경우 제염을 하기 위해 수돗물로 2회 이상 세척하였고, 야외에서 수집된 담수조류의 경우는 미세물질을 제거하기 위해 3회 이상 수돗물로 세척하였다. 이를 온실조건에 두어 1차로 말리고 45℃ 컨벤션 오븐에 1일 이상 두어 건조시킨 다음 거대조류는 분쇄기를 이용하여 1 mm 이하의 분말로 조제하여 분석용 시료로 사용하였다. 미세조류는 분쇄 없이 건조시료를 그대로 사용하였다.A total of 15 bird species collected were investigated. In the case of seaweed, two or more times were washed with tap water for decontamination, and in the case of freshwater algae collected outdoors, three times or more were washed with tap water to remove fine substances. This was first dried in a greenhouse condition, dried in a 45 ° C. convention oven for at least one day, and dried. The macroalgae was prepared as a powder of 1 mm or less using a grinder and used as an analytical sample. The microalgae used a dry sample as it was without grinding.

한편 옥수수대(corn stover)는 수확 후 남은 생체를 온실에서 충분히 말린 다음 분쇄기를 이용하여 0.1 mm 이하의 분말로 조제한 후 분석용 시료로 사용하였다. Corn stover (corn stover) was dried in the greenhouse enough after harvesting and then prepared by using a grinder to powder less than 0.1 mm was used as an analytical sample.

상기 제조된 건조 분말시료 0.5 g을 125 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 0.1M citrate buffer(pH 4.8) 23.9 ㎖과 1% NaN₃의 1.1 ㎖를 가한 다음, 120℃에서 20분 고압살균하였다. 무균상에서 효소 E1＋E2＋E3＋E4 용액을(아래 참조) 각각 건조물 1 g 당 0.2, 0.04, 0.2, 0.2 ㎖ 양으로 가한 후 50℃, 150 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시키고, 당화가 끝난 시료는 원심분리를 통해 잔사를 제거시켰다. 0.5 g of the dry powder sample prepared above was added to a 125 ml Erlenmeyer flask, and 23.9 ml of 0.1 M citrate buffer (pH 4.8) and 1.1 ml of 1% NaN ₃ were added thereto, followed by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes. Aseptically, the enzyme E1 + E2 + E3 + E4 solution (see below) was added in 0.2, 0.04, 0.2, and 0.2 ml amounts per 1 g of dry matter, and then hydrolyzed by incubating at 50 ° C and 150 rpm for 2 days. The residue was removed through.

잔사 제거 후 상등액을 취하여 Biochemistry analyzer(YSI 2700)를 통해 글루코오스함량을 정량하였고, 상기 사용된 효소 용액 중에는 단백질 안정화를 위해 당이 소량 포함된 경우도 있는 바, 이를 감하여 결과로 나타내었다. After removal of the residue, the supernatant was taken to quantify glucose content using a Biochemistry analyzer (YSI 2700), and a small amount of sugar was included in the enzyme solution used for protein stabilization.

사용된 효소는 셀룰라아제(Celluclast 1.5L, Novozymes사 제품, E1으로 표시), β-글루코시다제(Sigma C6105, E2로 표시), α-아닐라아제(Sigma A8220, E3로 표시), 아밀로글루코시다아제(Sigma A7095, E4로 표시) 이었다. Enzymes used were cellulase (Celluclast 1.5L, manufactured by Novozymes, indicated as E1), β-glucosidase (denoted Sigma C6105, E2), α-anilase (denoted Sigma A8220, E3), amyloglucose Sidase (denoted Sigma A7095, E4).

여러 조류 종에 대해서 전처리 없이 효소가수분해를 실시한 결과 하기 표 1에서 나타낸 바와 같이, 그물말로부터의 글루코오스 생성량이 48.5 g/100 g 건조 바이오매스로서 다른 조류 종들에 비해 매우 우수한 결과를 보였고, 동일조건 실험에서의 옥수수대 경우보다 3배 정도 높은 함량을 보였다. 이는 상대적으로 그물말 조류가 전처리 없이도 당화가 잘됨과 동시에 글루코오스 함량 자체도 매우 높은 재료임을 확인한 결과이기도 하다.As a result of enzymatic hydrolysis without pretreatment for various algae species, as shown in Table 1 below, the production of glucose from the net horse was 48.5 g / 100 g of dry biomass, which was very good compared to other algae species. It was about three times higher than corn in the experiment. This is also a result of confirming that the net algae are saccharified well without pretreatment and have a very high glucose content.

[실시예 3] 물 또는 알코올 추출물 제거에 따른 그물말의 당화 Example 3 Saccharification of Net Horse due to Water or Alcohol Extract Removal

식물세포 내에는 탄수화물 뿐 아니라 단백질, 지질, 무기물, 기타 이차대사산물 등의 다양한 화합물이 존재한다. 그리고 그들은 세포내에 자유롭게 존재할 수도 있지만 조직 구성물 내에 치밀하게 존재할 수도 있어 어떤 식으로든 조직의 와해 및 셀룰로오스의 당화에 직간접적으로 영향을 미친다. There are various compounds in plant cells such as carbohydrates as well as proteins, lipids, minerals, and other secondary metabolites. And they may exist freely in the cell, but they may be dense in the tissue, which directly or indirectly affects the tissue breakdown and the saccharification of the cellulose in some way.

따라서 본 실시예에서는 그물말 시료에 대해 물 또는 알코올로 추출될 수 있는 성분이 제거된 조직이 그렇지 않은 것에 비해 당화효율이 우수한지 여부를 알아보고자 실험하였다. Therefore, in the present embodiment, the experiment was performed to find out whether the tissues which can be extracted with water or alcohol with respect to the net sample are superior in saccharification efficiency as compared to the other.

식물재료로는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말 또는 분말화 하지 않은 건조체를 실험재료로 사용하였다. As the plant material, the harvested horses cultivated in the greenhouse were harvested and dehydrated, and then dried in a convention oven at 45 ° C. for 1 day, and then pulverized with a blender to obtain a finely divided powdery or non-powdery dried body used as an experimental material .

물 추출성분이 제거된 고형분(Water-extractive free solid, WEFS) 제조의 경우, 2 g의 건조 분말시료를 thimble(28×100 mm)에 넣고 190 ㎖의 물을 이용하여 250℃에서 약 8시간 추출한 다음, 잔사를 취하여 45℃에 1일 동안 건조시켜 조제하였다. In the case of water-extractive free solid (WEFS) preparation, 2 g of dry powder sample was placed in thimble (28 × 100 mm) and extracted for about 8 hours at 250 ° C using 190 ml of water. The residue was then taken to dry at 45 ° C. for 1 day to prepare.

물 및 에탄올 추출성분이 제거된 고형분(Water&ethanol-extractive free solid, EFS) 제조의 경우는 2 g의 건조 분말시료를 thimble(28×100 mm)에 넣고 190 ㎖의 물을 이용하여 250℃에서 약 8시간 추출한 후, 이를 다시 190 ㎖ 에탄올로 150℃에서 3 내지 4시간 추출한 후, 잔사를 취하여 45℃에 1일 동안 건조시켜 조제하였다. For the manufacture of water and ethanol-extracted solids (Water & ethanol-extractive free solid, EFS), 2 g of dry powder sample is placed in thimble (28 x 100 mm) and 190 ml of water is used at about 8 ° C at 250 ° C. After extraction for time, this was again extracted with 190 ml ethanol at 150 ° C. for 3 to 4 hours, and the residue was taken and dried at 45 ° C. for 1 day.

70% 메탄올 추출성분이 제거된 고형분(70% methanol-extractive free soild, MEFS) 제조는 상기 건조체 미분말 시료를 70% 메탄올에 실온에서 1주일 담궈 추출하였다. 즉 100 g의 건조체 미분말 시료를 대형병에 넣고 4 L의 70% 메탄올을 이용하여 실온에서 3일 추출한 다음, 잔사를 취하여 다시 70% 메탄올로 3일 동안 한 번 더 추출하였다. 추출 후 남은 잔사를 취하여 45℃에 1일 동안 건조시켜 실험에 사용하였다. In the preparation of 70% methanol-extreactive free soild (MEFS) from which the 70% methanol extract was removed, the dried fine powder sample was soaked in 70% methanol for 1 week at room temperature. That is, 100 g of dried fine powder sample was put into a large bottle and extracted with 4 L of 70% methanol for 3 days at room temperature. Then, the residue was taken out again and further extracted with 70% methanol for 3 days once more. After the extraction, the remaining residue was dried at 45 ° C for 1 day and used in the experiment.

상기와 같이 조제된 고형분 WEFS, EFS, MEFS의 효소당화는 상기 실시예 2에서와 동일하게 진행하였고, 당화액 내의 글루코오스 함량은 HPLC(Waters, Corona detector)로 분석, 정량하였다. Enzymatic saccharification of the solids WEFS, EFS, MEFS prepared as described above was performed in the same manner as in Example 2, and the glucose content in the saccharified solution was analyzed and quantified by HPLC (Waters, Corona detector).

상기 시료에 대해 당화 후 생성된 글루코오스 함량을 분석한 결과, 하기 표 2에서도 확인할 수 있듯이 100 g 건조 바이오매스 중량당 35.2, 41.6, 42.0, 47.8g으로서 무처리 < WEFS, MEFS < EFS 순으로 글루코오스 생성량이 증가되었다. As a result of analyzing the glucose content generated after saccharification for the sample, as shown in Table 2 below, 35.2, 41.6, 42.0, 47.8 g per 100 g dry biomass weight, and the amount of glucose produced in the order of <WEFS, MEFS <EFS This has been increased.

WEFS와 EFS의 증가된 글루코오스 생성은 당화효율이 증가 되었다기 보다는 추출물이 제거된 상태에서 셀룰로오스 성분을 가진 조직이 상대적으로 높게 포함되었기 때문으로 해석된다. 이는 그물말의 경우 당화율을 높이기 위해 추출과 같은 다른 처리가 필수적으로 필요치 않음을 의미하는 것으로서 경제적 당용액 생산에 유리한 특성을 보여 주는 결과이기도 하다.Increased glucose production of WEFS and EFS is interpreted as a result of the relatively high content of cellulose-containing tissues in the absence of extracts, rather than increased glycosylation efficiency. This suggests that other treatments such as extraction are not necessary in order to increase the glycation rate in the case of a horse, and this is also a favorable characteristic for producing an economical sugar solution.

[[ 실시예Example 4] 4] 당화효소Saccharogenic enzyme 조합 Combination 처리별Per treatment 당화Glycation

당화효소의 종류 및 조합, 처리농도에 따라 당화에 있어서 현저한 차이를 초래할 수 있음을 확인하기 위하여 그물말 시료의 당화 최적화를 위한 효소조합을 탐색하고자 연구를 수행하였다.In order to confirm that the glycosylation may cause significant difference in the glycosylation according to the type, combination, and concentration of the glycosylase, a study was conducted to search for an enzyme combination for the saccharification optimization of the net samples.

식물재료는 온실배양을 통해 수확한 다음 45℃에서 건조시키고 믹서기로 분말화 시킨 그물말 시료(FG-HR-d2)를 사용하였다Plant material was harvested through greenhouse cultivation, dried at 45 ° C. and powdered with a blender (FG-HR-d2).

상기 준비된 시료를 이용하여 효소당화는 상기 실시예 2에서와 같이 진행하였고 당화액 내의 글루코오스 함량은 Biochemistry analyzer(YSI 2700)를 통해 정량하였다. 그 후 효소내 당농도를 감하여 바이오매스로부터의 글루코오스 생성 정도를 결과로 나타내었다. Enzymatic glycosylation was carried out using the prepared sample as in Example 2, and the glucose content in the saccharified solution was quantified by a Biochemistry analyzer (YSI 2700). Subsequently, the glucose concentration in the enzyme was subtracted, and the degree of glucose production from biomass was shown as a result.

(1) (One) E1E1 단독처리 농도별 By individual concentration 당화Glycation

E1 효소 단독처리에 의해 어느 정도 당화가 일어나는지를 실험한 결과, 당화개시 24시간이면 가수분해가 거의 완료되는 경향이었고, 건조물 1 g당 0.2 ㎖/g 까지 효소량 추가에 따라 글루코오스 생성량이 증가되어 36g/100g 건조바이오매스에 이르렀으며 그 이상의 효소처리에서는 증가되지 않았다. As a result of experiments on how much glycosylation occurred by E1 enzyme treatment, hydrolysis tended to be completed almost 24 hours after the start of saccharification, and the amount of glucose was increased by adding the amount of enzyme to 0.2 ml / g per 1 g of dry matter, resulting in 36 g / 100 g dry biomass was reached and there was no increase in further enzymatic treatment.

(2) (2) E1E1 ＋+ E2E2 혼합처리에 따른 According to the mixing process 당화Glycation

E1을 건조물 당 0.2 ㎖/g로 고정시키고 이에 E2를 건조물 1 g당 0.02 내지 0.4 ㎖/g을 혼합시켜 처리했을 때 당화율의 증가정도를 측정하였다. The degree of increase in glycation was measured when E1 was fixed at 0.2 ml / g per dry matter, and E2 was treated with 0.02 to 0.4 ml / g per 1 g dry matter.

그 결과 하기 표 3에서도 확인할 수 있듯이, E1 단독처리에 비해 E2의 추가는 당화율을 증가시켰으며 건조물 1 g당 0.02 ㎖/g의 양 추가로도 충분함을 확인할 수 있었다.As a result, as can be seen in Table 3 below, the addition of E2 increased the glycation rate compared to the E1 alone treatment, and it was confirmed that an amount of 0.02 ml / g per 1 g of dry matter was sufficient.

(3) E1＋E2＋E3＋E4 혼합처리에 따른 당화(3) Saccharification by Mixing E1 + E2 + E3 + E4

E1＋E2를 건조물 1 g당 0.2＋0.04 ㎖로 고정시키고 이에 전분분해와 관련된 E3, E4를 각각 건조물 1 g당 0.2 ㎖로 혼합시켜 처리했을 때 당화율의 증가정도를 측정하였고, 글루코오스 생성량의 결과는 효소내 당함량을 제외한 후 표시하였다.The degree of increase in glycation was measured when E1 + E2 was fixed at 0.2 + 0.04 ml per g of dry matter, and E3 and E4 related to starch decomposition were mixed at 0.2 ml per g of dry matter, respectively. It was displayed after excluding sugar content in enzyme.

그 결과 하기 표 4에서도 확인할 수 있듯이, E1＋E2 혼합처리에 비해 E3+E4의 추가는 당화속도를 아주 미약하게 증가시키는 경향이었으나 당화율을 높이지는 않는 경향이었다. 따라서 당화율과 효소비용 측면을 종합적으로 고려해 볼 때 그물말의 당화에는 E1＋E2의 혼합만으로도 충분함을 확인할 수 있었다. 또한 경험적으로 볼 때 다른 바이오매스 종류에 비해 가수분해를 위해 소요되는 효소량이 상대적으로 낮은 경향인 바, 이는 그물말 조류가 자체 특성상 당화가 보다 용이한 재료임을 확인한 결과이기도 하다. As a result, as can be seen in Table 4, the addition of E3 + E4 tended to increase the saccharification rate slightly compared to the E1 + E2 mixing treatment, but did not increase the glycation rate. Therefore, in consideration of the glycosylation rate and the enzyme cost, it was confirmed that the mixture of E1 + E2 is sufficient for the saccharification of the net horse. In addition, experience shows that the amount of enzyme required for hydrolysis is relatively low compared to other types of biomass, which is a result of confirming that net algae are more easily glycosylated due to their characteristics.

[[ 실시예Example 5] 5] BufferBuffer strengthstrength 차이에 따른 By difference 당화Glycation

효소당화시 적정 pH는 효소의 활력과 관계가 있어 매우 중요하며 buffer strength 역시 당화중의 pH 변동과 관련이 있어 당화시 중요하게 고려되어야 한다.Proper pH during enzyme saccharification is very important because it is related to enzyme vitality, and buffer strength is also related to pH fluctuations during saccharification.

그러나 buffer strength가 높으면 고농도 당농축액을 조제할 때 염도가 높아져 발효에 부정적으로 작용할 수 있다. 따라서 당화율에 영향을 미치지 않는 범위에서 buffer strength가 낮으면 낮을수록 바람직한데 이를 알아보기 위하여 실험하였다. However, higher buffer strength may result in higher salinity when formulating high concentration of sugar concentrate, which may negatively affect fermentation. Therefore, it is desirable that the lower the buffer strength is, the better the lower the buffer strength is.

상기 그물말 건조 분말시료 0.5 g을 125 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 0.0 내지 0.1M 범위에서 여러 농도의 citrate buffer(pH 4.8) 23.9 ㎖와 1% NaN₃의 1.1 ㎖를 가한 다음, 120℃에서 20분 고압살균하였다. 이후 효소당화는 상기 실시예 4에서와 같이 진행하였고 당화액 내의 글루코오스 함량은 Biochemistry analyzer(YSI 2700)를 통해 정량하였다. 0.5 g of the dried powder sample was added to a 125 ml Erlenmeyer flask, and 23.9 ml of various concentrations of citrate buffer (pH 4.8) and 1.1 ml of 1% NaN ₃ were added in a range of 0.0 to 0.1 M, followed by high pressure at 120 ° C. for 20 minutes. Sterilized. Thereafter, enzyme glycosylation was performed as in Example 4, and the glucose content in the saccharified solution was quantified by a Biochemistry analyzer (YSI 2700).

그 결과 도 4에서도 확인할 수 있듯이, 0.0 내지 0.1M 범위의 buffer strength간에 효소당화로 인해 생성된 글루코오스 함량에 있어서는 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 이는 그물말 시료의 경우 0.1 mM 또는 증류수만을 가지고서도 당화가 충분히 이루어지기 때문에 필요한 경우 본 조건을 활용함으로서 고품질의 당화액을 조제할 수 있음을 확인한 결과이기도 하다.
As a result, as shown in Figure 4, it was confirmed that there is no difference in the glucose content generated by the enzyme glycosylation between the buffer strength in the range of 0.0 to 0.1M. This is also the result of confirming that it is possible to prepare a high quality saccharified liquid by using this condition when necessary, because the saccharification is sufficiently carried out with only 0.1 mM or distilled water in the case of a netting sample.

[[ 실시예Example 6] 온도 전처리에 따른 6] according to the temperature pretreatment 당화Glycation

그물말 시료의 멸균을 위하여 120℃에서 20분 동안 고압멸균을 실시하였는데, 이 때의 당화공정 전 온도처리에 따른 당화 정도를 알아보고자 실험하였다. Autoclaving was carried out at 120 ° C. for 20 minutes to sterilize the net samples, and the experiment was performed to determine the degree of saccharification according to the temperature treatment before the saccharification process.

상기 준비된 그물말 건조시료 0.5 g을 125 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 0.1M citrate buffer(pH 4.8) 23.9 ㎖와 1% NaN₃의 1.1 ㎖를 가한 다음, 25℃ 내지 120℃까지 여러 온도를 설정하여 20분간 두어 전처리 온도에 따른 당화 정도를 확인하였다. 0.5 g of the dried net dried sample was added to a 125 ml Erlenmeyer flask, 23.9 ml of 0.1M citrate buffer (pH 4.8) and 1.1 ml of 1% NaN ₃ were added, and various temperatures were set at 25 ° C. to 120 ° C. for 20 minutes. The degree of saccharification according to the pretreatment temperature was confirmed.

또 다른 실험에서는 55℃와 120℃를 한정하고 온도처리 시간을 5, 20, 60분 동안 두어 전처리 시간에 따른 당화정도를 확인하였다. 이후 효소당화는 실시예 4에서와 같이 진행하였고 당화액 내의 글루코오스 함량은 Biochemistry analyzer(YSI 2700)를 통해 정량하였다. In another experiment, the degree of saccharification according to the pretreatment time was confirmed by limiting 55 ° C. and 120 ° C. and placing the temperature treatment time for 5, 20, and 60 minutes. Thereafter, enzyme glycosylation proceeded as in Example 4, and the glucose content in the saccharified solution was quantified by a Biochemistry analyzer (YSI 2700).

그 결과 도 5에서도 확인할 수 있듯이, 25 내지 120℃ 온도범위에서 20분 처리하였을 경우, 120℃에 비해 그 이하의 온도처리에서는 생성된 글루코오스 함량이 약간 낮은 경향을 보였으나 그 정도는 10% 내외였으며, 이는 상온처리에서도 당화가 잘 이루어지는 특징을 보여 필요에 따라 상온멸균으로도 당용액을 생산할 수 있음을 확인한 결과이다.As a result, as can be seen in Figure 5, when treated for 20 minutes at a temperature range of 25 to 120 ℃, the resulting glucose content tended to be slightly lower than the temperature treatment below 120 ℃, but the degree was about 10% This is a result of confirming that the saccharification is well performed even at room temperature treatment, so that the sugar solution can be produced even at room temperature sterilization if necessary.

또한, 55℃와 120℃로 온도를 고정하고 처리 시간에 따른 당화 정도를 실험한 결과, 도 6에서도 확인할 수 있듯이 처리시간 간에 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았다. In addition, as a result of fixing the temperature at 55 ° C and 120 ° C and experimenting with the degree of saccharification according to the treatment time, as shown in FIG. 6, no significant difference was observed between the treatment times.

상기의 결과로부터 그물말은 특별한 온도 전처리가 없어도 당화가 잘 이루어지는 매우 흥미로운 특징을 가진 것을 확인할 수 있었다.
From the above results, it was confirmed that the net horses have a very interesting feature that saccharification is performed well without special temperature pretreatment.

[[ 실시예Example 7] 7] 당화Glycation 적정온도 범위 Temperature range

당화시의 온도는 효소활력과 밀접한 관련이 있다. 특히 당화/발효를 동시에 하기 위해서는 발효균주의 활성온도(일반적으로 37℃)에서 효소당화가 잘 이루어지는 것이 필요하기에, 당화온도를 확인하고자 실험하였다. The temperature at saccharification is closely related to enzyme activity. In particular, the saccharification / fermentation at the same time because the enzyme saccharification at the active temperature (typically 37 ℃) of the fermentation strain is required to be well, was tested to confirm the saccharification temperature.

상기 식물재료를 이용하여 효소당화하는 동안의 온도를 40℃와 50℃로 설정한 것 이외에 모든 실험과정은 상기 실시예 4와 동일하게 진행하였다.Except for setting the temperature during the enzyme saccharification using the plant material to 40 ℃ and 50 ℃ all the experiment proceeded in the same manner as in Example 4.

그 결과 도 7에서도 확인할 수 있듯이, 그물말 시료를 가지고 40℃와 50℃ 조건에서 효소당화를 실시하였을 때 당화 정도차이는 없이 건조물 100 g당 45g 내외의 글루코오스가 생산되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 통상의 발효미생물의 경우 일반적인 생육온도에서도 당화가 잘 이루어지기 때문에 향후 동시 당화/발효 공정 개발이 가능함을 확인한 결과로서, 화학제품 원료물질 생산에 있어서 경제성 확보에 매우 유리한 특성을 가짐을 확인한 결과이기도 하다.
As a result, as can be seen in Figure 7, it was confirmed that when the enzyme saccharification was carried out at 40 ℃ and 50 ℃ conditions with a net sample, glucose of about 45g per 100g of dry matter is produced without difference in degree of glycation. This is a result of confirming that in the case of normal fermentation microorganisms, saccharification is well performed at general growth temperature, it is possible to develop a simultaneous saccharification / fermentation process, and it is also a result of confirming that it has very advantageous characteristics to secure economic feasibility in producing raw materials for chemical products. Do.

[[ 실시예Example 8] 생체시료와 8] biological samples 건조시료간의Between drying samples 당화정도Degree of glycation 비교 compare

당용액 제조시 일반적으로 건조된 시료를 가지고 사용하지만 필요에 따라 건조없이 수집된 생체시료를 직접 당화/발효시킬 수도 있을 것이다. 특히 경제성 측면에서는 건조과정을 두지 않는 것이 더 유리하다. 따라서 그물말의 경우 생체시료 자체를 직접 당화 재료로 이용할 때 당화가 잘 이루어지는지를 확인하고자 실험하였다.The preparation of the sugar solution is generally carried out with a dried sample, but if necessary, the collected biological sample may be directly glycosylated / fermented without drying. Especially in terms of economics, it is more advantageous to leave no drying process. Therefore, in the case of the net horse was tested to confirm that the saccharification is good when using the biological sample itself as a glycosylation material.

식물재료로는 6월 야외에서 배양한 그물말을 수확한 후 물기만 제거된 생체시료와 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조한 것을 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 것을 시료로 사용하였다. The plant material was harvested in June, the net horses were harvested in the open air, and only the water was removed and dried in a convention oven at 45 ° C. for 1 day.

상기 시료의 최종 건물중이 1.0 g이 되도록 생체 및 건조체 시료를 250 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 최종적으로 용액부피가 50 ㎖되도록 0.1M citrate buffer(pH 4.8)＋1% NaN₃를 가한 다음, 120℃에서 20분 고압살균하였다. The biological and dry samples were placed in a 250 ml Erlenmeyer flask so that the final dry weight of the sample was 1.0 g, and 0.1 M citrate buffer (pH 4.8) + 1% NaN ₃ was added to make 50 ml of the final solution volume. Min autoclaved.

무균상에서 효소용액을 상기 실시예 2에서와 같이 가한 후 50℃ 조건에서, 150 rpm에 2일 동안 가수분해하였다. 당화 시료를 시간 경과별로 취하여 원심분리를 통해 잔사를 제거하고 상등액을 취하여 Biochemistry analyzer(YSI 2700)로 분석, 글루코오스함량을 정량하였으며 투입된 그물말 바이오매스 건물중량을 기준으로 환산하여 결과를 나타내었다. Aseptically, the enzyme solution was added as in Example 2, and then hydrolyzed at 150 ° C. for 2 days at 50 ° C. conditions. Glycosylated samples were taken over time, the residue was removed by centrifugation, and the supernatant was taken and analyzed by Biochemistry analyzer (YSI 2700) to quantify glucose content and converted based on the net weight of the biomass dry weight.

그 결과 도 8에서도 확인할 수 있듯이, 당화 후 2시간째에는 생체 보다는 건조체 시료에서 글루코오스 함량이 보다 높게 나타났는데 이는 건조조직이 효소 작용에 적합한 환경조건으로 빨리 변화될 수 있었기 때문으로 추정된다. As a result, as can be seen in Figure 8, 2 hours after saccharification, the glucose content was higher in the dry sample than the living body, which is presumably because the dry tissue was able to quickly change to environmental conditions suitable for enzyme action.

그러나 4시간 이후부터는 건조체 시료보다 생체시료에서 글루코오스 생성량이 높았으며 16시간째에는 두 시료 모두 당화가 거의 완료되는 경향을 보였다. 이는 그물말 시료가 생체 조건에서도 당화가 충분히 진행될 수 있기 때문에 보다 폭 넓은 당화공정 기술을 개발할 수 있음을 확인한 결과이기도 하다.
However, after 4 hours, the amount of glucose was higher in the biological sample than in the dried sample, and at 16 hours, the saccharification tended to be almost complete in both samples. This is also the result of confirming that a broad range of glycation process technology can be developed because the glycation can proceed sufficiently in vivo even in a sample of a horse.

[[ 실시예Example 9] 조직 9] organization 분쇄여부에Crushing 따른 According 당화정도Degree of glycation

일반적으로 곱게 분쇄된 바이오매스일수록 효소 당화효율이 높다고 알려져 있다. 그러나 분쇄의 경우도 조직에 따라 에너지가 많이 소요되기 때문에 경제적 당화를 위해서는 분쇄과정이 생략될수록 유리하다. 본 실시예에서는 그물말 시료의 분쇄여부에 따른 당화정도에 차이가 있는지를 알아보고자 실험하였다. Generally, it is known that finely pulverized biomass has higher enzyme saccharification efficiency. However, even in the case of pulverization, since it takes a lot of energy depending on the structure, it is advantageous that the pulverization process is omitted for economic saccharification. In this example, the experiment was conducted to determine whether there is a difference in the saccharification degree depending on whether or not the crushing of the netting sample is performed.

식물재료는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조하였다. 이를 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말과 분쇄하지 않은 상태의 건조시료를 실험재료로 사용하였다. The plant material was harvested and dehydrated in nets grown in a greenhouse and then dried in a convention oven at 45 ° C. for 1 day. The resultant was pulverized with a blender, and powders of finely crushed state and dry samples without pulverization were used as experimental materials.

상기의 건조시료 0.5 g을 125 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 0.1M citrate buffer(pH 4.8) 23.9㎖와 1% NaN₃의 1.1 ㎖를 가한 다음, 120℃에서 20분 고압살균하였다. 이하 모든 과정은 상기 실시예 2와 동일하게 진행하였다.0.5 g of the dried sample was added to a 125 ml Erlenmeyer flask, 23.9 ml of 0.1 M citrate buffer (pH 4.8) and 1.1 ml of 1% NaN ₃ were added, followed by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes. Hereinafter all processes were performed in the same manner as in Example 2.

그 결과 도 9에서도 확인할 수 있듯이 당화 개시 후 24시간과 48시간째의 것을 취하여 생성된 글루코오스함량을 측정한 결과, 그물말 시료를 분쇄한 것과 분쇄하지 않은 것 간에 함량차이가 거의 없음을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 9, the resultant glucose content was measured by taking 24 and 48 hours after the start of saccharification. As a result, it was confirmed that there was almost no content difference between the pulverized and unpulverized net sample. .

이는 그물말을 수확한 다음 조직을 분쇄하지 않고 그대로 당화시킬 수 있음을 의미하므로 당용액을 경제적으로 생산하는데 있어서 우수한 특징을 가짐을 확인한 결과이기도 하다.
This means that the tissue can be saccharified as it is without grinding after harvesting the horses, thus confirming that the sugar solution has excellent characteristics in economical production.

[[ 실시예Example 10] 고형분 함량에 따른 10] according to the solid content 당화율Rate

고농도 당용액을 경제적으로 생산하기 위해서는 당화액 내의 고형분 함량(solid loading)이 높을수록 바람직하다. 그러나 고형분 함량이 너무 높으면 물리적으로 교반이 어려워질 뿐 아니라 효소의 조직 내 침투가 어렵고 또한 생성된 고농도의 당은 피드백 저해(feedback inhibition)에 의해 효소의 활성을 억제하기도 하여 오히려 비효율적일 수 있으며, 그 정도는 식물종류 및 조직 상태에 따라 다른 것으로 알려져 있다. The higher the solid loading in the saccharified liquid is, the more desirable it is to economically produce the high concentration sugar solution. However, if the solid content is too high, it is difficult to physically stir, and it is difficult to penetrate the enzyme into the tissue. Also, the produced high concentration of sugar may inhibit the activity of the enzyme by feedback inhibition and may be rather inefficient. It is known that the degree varies depending on the plant type and the tissue condition.

따라서 고형분 함량에 따른 당화정도를 실험하여 적정조건을 탐색하는 것은 고품질 당용액 생산에 있어서 매우 중요하다. 본 실시예에서는 그물말 시료에 대해 고형분 함량에 따른 당화 및 글루코오스 생성 패턴을 파악하기 위해 실험하고자 하였다. Therefore, it is very important to investigate the degree of saccharification according to the solid content and to search for proper conditions for the production of a high quality sugar solution. In this example, the net sample was tested to determine the glycation and glucose generation pattern according to the solid content.

식물재료는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다(HR-d3). 본 시료는 글루코오스 함량이 약 40 내지 45% 함유되는 것으로 조사되었다. The plant material was harvested from the greenhouse harvested and dehydrated. The plant material was dried in a convention oven at 45 ° C for 1 day, and then pulverized with a blender to obtain finely pulverized powder (HR-d3). This sample was found to contain about 40 to 45% of glucose.

125 ㎖ 삼각 플라스크에 상기 건조시료를 고형분 함량이 2 내지 10%(w/v) 되도록 넣고 0.1M citrate buffer(pH 4.8) 23.9 ㎖와 1% NaN₃의 1.1 ㎖를 가한 다음, 120℃에서 20분 고압살균하였다. The dried sample was added to a 125 ml Erlenmeyer flask so that the solid content was 2 to 10% (w / v), 23.9 ml of 0.1 M citrate buffer (pH 4.8) and 1.1 ml of 1% NaN ₃ were added, Followed by autoclaving.

무균상에서 효소용액을 고형분 함량에 비례하여 가하였는 바, 사용된 효소량은 E1＋E2＋E3＋E4를 건조물 1 g당 0.2＋0.04＋0.2＋0.2 ㎖ 수준이었다. 이후 50℃, 150 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시키고, 당화액내의 글루코오스 생성정도를 biochemistry analyzer(YSI 2700)로 분석, 정량하였다. The amount of enzyme used was as follows: E1 + E2 + E3 + E4 was 0.2 + 0.04 + 0.2 + 0.2 ml per gram of the dried product. Thereafter, the mixture was hydrolyzed while incubated at 50 ° C. and 150 rpm for 2 days, and glucose production in the saccharified solution was analyzed and quantified by a biochemistry analyzer (YSI 2700).

그 결과 도 10에서도 확인할 수 있듯이, 그물말 건조시료의 고형분의 함량이 10% 될 때 까지는 어떠한 장애 없이 비례적으로 글루코오스 생성량이 증가되어 10%(w/v)의 고형분이 함량 된 처리구에서는 약 4.1% 내외의 글루코오스 당용액이 생산되었다. As a result, as can be seen in Figure 10, until the content of the solid content of the net dried sample is 10%, the amount of glucose produced proportionally increased without any obstruction, about 10% (w / v) in the treated content of about 4.1 A glucose sugar solution of about% was produced.

본 그물말 시료의 경우는 건조물 100 g당 약 45 g 전후의 글루코오스가 생성될 수 있는 시료로서 10%의 고형분 함량까지도 당화율에 있어서는 큰 변함이 없는 것으로 나타났다.In the case of this net sample, glucose of about 45 g per 100 g of dry matter can be produced, and even a solid content of 10% showed no significant change in the glycosylation rate.

그러나 15% 이상의 고형분 함량에서는 건조시료 투입량에 따른 글루코오스 생성량이 비례적으로 증가되지는 않았고 당화율도 점점 낮아지는 경향을 보였다. 상기의 결과로부터 보다 경제적으로 당용액을 얻기 위해서는 10%(w/v) 고형분 함량에 의해서 달성될 수 있을 것으로 판단되었다.
However, at 15% solids content, glucose production amount did not increase proportionally with the amount of dry sample, and the glycation rate tended to decrease gradually. From the above results, in order to obtain a sugar solution more economically, it could be achieved by the 10% (w / v) solids content.

[[ 실시예Example 11] 산 가수분해에 따른 11] due to acid hydrolysis 그물말로부터의From the net 글루코오스 생산 Glucose production

그물말의 산가수분해에 따른 글루코오스 생성정도를 알아보기 위하여 실험하였다. Experiments were conducted to determine the degree of glucose production by acid hydrolysis of the horsetail.

식물재료는 45℃에서 1일 건조된 그물말 시료를 분말화 하여 1 내지 2 mm 체에 통과되도록 하였다. 물 추출성분이 제거된 고형분(WEFS)과 물 및 에탄올 추출성분이 제거된 고형분 시료는(EFS) 시료는 상기 실시예 3에서와 같이 제조하였다. The plant material was powdered and dried for 1 day at 45 ℃ net sample was passed through a 1-2 mm sieve. Solid content (WEFS) from which the water extract component was removed and solid sample from which the water and ethanol extract components were removed (EFS) were prepared as in Example 3 above.

산 가수분해는 건조분말시료 0.3 g을 취한 다음 72% 황산 3 ㎖를 넣고, 30℃ 항온기에 1시간 두었다가(1차 가수분해, 5 내지 10분 마다 교반), 이후 증류수를 가하여 1 내지 4%로 희석한 다음 마개를 한 후, 위 아래로 흔들어 혼합시켜 121℃에서 1시간 가수분해하였다(2차 가수분해). 그 후 가수분해물을 탄산칼슘(calcium carbonate)으로 중화시켰다.0.3 g of dry powder sample was added, and 3 ml of 72% sulfuric acid was added, and the mixture was placed in a thermostat at 30 ° C. for 1 hour (first hydrolysis, stirred every 5 to 10 minutes), and then distilled water was added to 1 to 4%. After dilution, the stopper was then shaken up and down to mix and hydrolyzed at 121 ° C. for 1 hour (secondary hydrolysis). The hydrolyzate was then neutralized with calcium carbonate.

중화된 그물말 가수분해물을 막여과 또는 원심분리한 후, HPLC 분석을(Corona detector) 상기 실시예 3에서와 같이 실시하였다. 글루코오스 정량을 위해서 글루코오스 표준곡선과 동일조건에서의 글루코오스 손실률(loss factor)을 구하여 환산해 주었다. After neutralizing the net hydrolyzate was membrane filtered or centrifuged, HPLC analysis (Corona detector) was performed as in Example 3 above. To quantify glucose, the glucose loss factor was calculated and converted under the same conditions as the glucose standard curve.

상기 시료에 대해 산 가수분해 후 생성된 글루코오스 함량을 분석한 결과, 하기 표 5에서 확인할 수 있듯이 속슬렛 추출을 하지 않은 시료는 건조물 100 g당 38.22 g의 글루코오스를 생성하였고, WEFS 및 EFS는 각각 56.35 g, 53.72 g의 글루코오스 생성량을 나타내었다.As a result of analyzing the content of glucose generated after acid hydrolysis on the sample, as shown in Table 5, the sample without Soxhlet produced 38.22 g of glucose per 100 g of dry matter, and WEFS and EFS were 56.35, respectively. g, 53.72 g of glucose was produced.

추출 후 남은 잔사(WEFS, EFS)가 무처리의 경우 보다 글루코오스함량 높은데, 이는 추출물이 제거된 상태에서 셀룰로오스 성분을 가진 조직이 상대적으로 높게 포함되었기 때문이며, 또한 산 가수분해에 의한 글루코오스 생성정도가 효소 가수분해의 경우(실시예 3)보다 약간 증가된 것을 확인할 수 있었다.Residues after extraction (WEFS, EFS) are higher in glucose than in untreated treatment, because the tissues containing cellulose components are relatively high in the state where the extract is removed. It was confirmed that slightly increased than in the case of hydrolysis (Example 3).

[[ 실시예Example 12] 12] 당화시료내의In saccharified samples 발효억제물질( Fermentation inhibitors HMFHMF , , furfuralsfurfurals ) 함량조사) Content investigation

바이오매스 기원 당용액으로부터 화학제품 원료물질을 생산하기 위해서는 고농도 당용액을 제조하여 생물학적 전환을 위한 발효용 기질로서 제공하여야 한다. 이때 중요하게 고려되어야 할 사항은 발효에 유용한 당이 가능한 한 최대로 많이 함유되면서 발효균주의 생육을 저해하는 물질이 최소화되어야 한다. 그런데 일반적으로 당화효율을 높이기 위해 바이오매스를 고온/고압처리 하거나, 산 가수분해 처리를 하게 되는데 이 작업과정에서 당이 화학적 전환을 일으켜 하이드록시메틸풀푸랄(Hydroxymethylfurfural, HMF) 및 풀푸랄(furfural)이 생성되고, 이는 발효균주의 강력한 저해제로 보고되고 있다. To produce chemical raw materials from solutions per biomass source, high-concentration sugar solutions should be prepared and provided as a fermentation substrate for biological conversion. At this time, it is important to minimize the substances that inhibit the growth of fermented strains while containing as much sugar as possible for fermentation. However, in general, biomass is subjected to high temperature / high pressure treatment or acid hydrolysis treatment to increase glycosylation efficiency. In this process, sugars undergo chemical conversion, which results in hydroxymethylfurfural (HMF) and furfural. Is produced and it is reported to be a potent inhibitor of fermented strains.

본 실시예에서는 그물말 시료를 가지고 효소당화 또는 산 가수분해하는 과정에서 HMF와 furfurals가 어느 정도 생성되는지를 알아보고 발효균주의 억제여부를 예측해 보고자 실험하였다. In this example, experiments were conducted to determine the extent to which HMF and furfurals were produced during enzymatic saccharification or acid hydrolysis with a net sample and to predict the inhibition of fermented strains.

효소당화는 상기 실시예 10에서와 동일하게 진행하였고, 산 가수분해는 상기 실시예 11에서와 같이 실험하였다. Enzymatic glycosylation was performed in the same manner as in Example 10, and acid hydrolysis was performed as in Example 11.

발효억제물질의 분석은 HPLC(Waters)로 HMF와 furfurals를 정량하였다. 컬럼은 Comosil 5C18-MS-II(4×150 mm)을 사용하였고, 이동상은 100% 증류수(Pump A)와 100% 메탄올(Pump B)로 시간별 구배를 두었으며, 유량은 0.6 ㎖/min, 측정 파장은 280 nm이었다. Analysis of fermentation inhibitors quantified HMF and furfurals by HPLC (Waters). The column was Comosil 5C18-MS-II (4 x 150 mm), and the mobile phase was diluted with 100% distilled water (Pump A) and 100% methanol (Pump B) The wavelength was 280 nm.

(1) 효소 당화물 내의 발효억제물질 함량(1) Content of Fermentation Inhibitor in Enzymatic Glycosaccharide

고형물 함량이 2 내지 10%(w/v)이 되도록 하여 효소당화시킨 시료의 퓨란 유도체를 분석한 결과, 하기 표 6에서도 확인할 수 있듯이, HMF는 미량 검출되었으나 furfurals는 검출되지 않았다. As a result of analyzing the furan derivative of the enzyme-glycosylated sample with a solid content of 2 to 10% (w / v), as shown in Table 6 below, trace amounts of HMF were detected but furfurals were not detected.

상기의 결과를 바탕으로 그물말 건조시료로부터 10% 글루코오스 함량의 당농축액을 제조했을 때 포함될 수 있는 HMF의 농도가 15 내지 28.3 ppm(0.12 내지 0.23 mM)임을 확인할 수 있었다. 보고에 의하면 HMF의 경우 대장균(E. coli)에 대해 0.265% 농도에서 50% 생육을 저해하고, 기타 균주에 대해서 0.1 내지 0.5%에서 저해하는 것으로 보고된 바, 이에 준하면 본 그물말 유래 당용액(10% 글루코오스 함량)은 HMF의 생육저해활성 농도 보다 50배 이상 낮게 함유되어 있기 때문에 발효균주를 전혀 저해하지 않음을 예측할 수 있었다.On the basis of the above results, it was confirmed that the concentration of HMF that can be included when preparing a sugar concentrate having a 10% glucose content from a net dried sample was 15 to 28.3 ppm (0.12 to 0.23 mM). It has been reported that HMF inhibits 50% growth at 0.265% concentration against E. coli and at 0.1-0.5% against other strains. (10% glucose content) was more than 50 times lower than HMF growth inhibitory activity, it can be expected that it does not inhibit the fermentation strain at all.

(2) (2) 산가수분해물의Acid hydrolyzate 발효억제물질 함량 Fermentation Inhibitor Content

물 및 에탄올 추출 후 남은 잔사 시료를(EFS) 고압멸균기에서 산 가수분해 시켰을 경우, HMF과 furfural 생성량이 각각 건조물 1 g당 3.8, 3.3 mg으로서 HMF가 furfural보다 약간 높게 생성됨을 확인할 수 있었다. 이를 근간으로 그물말 건조시료로부터 산 가수분해를 통해 5% 글루코오스 함량의 당농축액을 제조했을 때 포함될 수 있는 퓨란 유도체 총량은 약 0.07%가 되는 것으로 추측할 수 있었고, 이는 보고된 문헌을 통해서 볼 때 발효균주를 심하게 억제하지는 않을 것으로 판단되었다.
When the residue sample after the extraction of water and ethanol (EFS) was acid hydrolyzed in an autoclave, HMF and furfural production amount was 3.8 and 3.3 mg per 1 g of dry matter, respectively, indicating that HMF was slightly higher than furfural. Based on this, it was estimated that the total amount of furan derivatives that could be included when preparing a sugar concentrate having 5% glucose content by acid hydrolysis from dried powder samples was about 0.07%. The fermented strains would not be severely inhibited.

[[ 실시예Example 13] 13] 그물말로부터From the net 글루코오스 Glucose 고함유High content 당용액Sugar solution 생산 production

바이오매스 기원 당용액으로부터 화학제품 원료물질을 생산하기 위해서는 당 자체를 고순도로 분리정제하여 화학적 전환용으로 사용하든지, 또는 고농도 당용액을 제조하여 생물학적 전환을 위한 발효용 기질로서 제공하여야 한다. In order to produce a chemical raw material from the solution per biomass source, the sugar itself must be separated and purified at high purity and either used for chemical conversion or as a fermentation substrate for biological conversion by preparing a high concentration sugar solution.

이를 위해서는 유용한 당이 가능한 최대로 많이 함유되면서 화학적 간섭 또는 생육억제물질이 최소화되도록 조제하는 기술이 확보되어야 한다. 본 실시예에서는 그물말 시료를 가지고 고농도 당용액을 제조하는 방법을 실험하고자 하였다. To this end, it is necessary to secure a technology that contains the maximum amount of useful sugars while minimizing chemical interference or growth inhibitory substances. In this example, a method of preparing a high concentration sugar solution with a net horse sample was intended.

식물재료는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후, 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다. The plant material was harvested and dehydrated in a greenhouse grown in a greenhouse, then dried in a convention oven at 45 ° C. for 1 day, and then pulverized with a blender to use finely divided powder as an experimental material.

당농축액 제조는 그물말 건조시료를 직접 사용하거나 물/에탄올 추출물이 제거된 잔사를 가지고 제조하였다. Sugar concentrate was prepared by directly using a dry sample or with a residue from which water / ethanol extract was removed.

상기 물 및 에탄올로의 추출은 상기 실시예 3에서와 같이 실시하였다. The extraction with water and ethanol was carried out as in Example 3.

건조시료(8 g)를 500 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 0.5 mM citrate buffer(pH 4.8) 100 ㎖를 가한 다음, 120℃에서 20분 고압살균 또는 당화효율을 높이기 위해 열에 안정한 알파-아밀라아제를 첨가하여 90 내지 110℃에서 고압살균 하였다. 무균상에서 여과멸균된 당화효소용액을 상기 실시예 3에서와 같이 고형분 양에 비례하여 가한 후, 50℃ 조건에서 170 rpm에 36 내지 48시간 동안 배양하면서 가수분해 시켰다. Dry sample (8 g) was added to a 500 ml Erlenmeyer flask, and 100 ml of 0.5 mM citrate buffer (pH 4.8) was added. Then, heat stable alpha-amylase was added at 90 ° C. for 20 minutes to increase autoclaving or saccharification efficiency. Autoclaved at 110 ℃. Aseptically filtered sterilized saccharase solution was added in proportion to the amount of solids as in Example 3, and then hydrolyzed while incubating at 170 rpm for 36 to 48 hours at 50 ° C.

당화 시료를 취하여 원심분리를(8000 rpm, 20분) 통해 1차 상등액을 취하고, 이어 멸균수를 넣고 부유시킨 다음 동일한 조건으로 원심분리하여 2차 상등액을 취하였다. 1차와 2차 상등액을 모아 혼합한 다음 적당량의 알코올을 가하면서 감압건조기로 물 및 용매를 건조시켰다. 당농축액 내의 글루코오스 함량은 시료를 증류수에 희석하여 biochemistry analyzer(YSI 2710)로 분석, 정량하였다. Saccharified samples were taken, and the primary supernatant was taken through centrifugation (8000 rpm, 20 minutes), and then sterile water was added and suspended, followed by centrifugation under the same conditions to take the secondary supernatant. The primary and secondary supernatants were collected and mixed, and then water and solvents were dried with a reduced pressure dryer while adding an appropriate amount of alcohol. The glucose content in the sugar concentrate was analyzed and quantified by diluting the sample in distilled water with a biochemistry analyzer (YSI 2710).

그 결과, 88 g의 건조 그물말에서 약 89 g의 당농축액을 수득할 수 있었고, 이를 적당량의 멸균수와 혼합하여 조제된 당용액의 글루코오스 함량은 14.5% 정도였다. As a result, about 89 g of sugar concentrate was obtained from 88 g of dry netting, and the glucose content of the sugar solution prepared by mixing it with an appropriate amount of sterile water was about 14.5%.

한편 WEFS 및 EFS 48 g을 동일한 방법으로 조제하였을 때 약 40 g 내외의 당농축액을 얻을 수 있었고, 이를 적당량의 멸균수와 혼합하여 얻어진 당용액의 글루코오스 함량은 각각 15.8%, 18% 정도였다. On the other hand, when 48 g of WEFS and EFS were prepared by the same method, a sugar concentrate of about 40 g was obtained, and the glucose content of the sugar solution obtained by mixing it with an appropriate amount of sterile water was about 15.8% and 18%, respectively.

따라서 상기의 방법으로 그물말 시료로부터 당용액을 조제할 경우, 적어도 글루코오스 함량이 10% 이상이 되면서 발효에 직접 적용할 수 있는 정도의 용액을 손쉽게 확보할 수 있음을 확인할 수 있었고, 최적조건에서는 보다 많은 량의 당농축액을 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다. Therefore, when preparing a sugar solution from the net sample by the above method, it was confirmed that at least 10% glucose content can be easily obtained a solution that can be directly applied to fermentation, under the optimum conditions It was confirmed that a large amount of sugar concentrate can be prepared.

Claims

Hydrodictyaceae dihydro Dick thione in (Hydrodictyon sp.), Medal end in (Pediastrum sp.), Soraseu spectrum in (Sorastrum sp.) 1 or two or more kinds of mixed algae polysaccharide degrading enzyme is selected from the (Family Hydrodictyaceae) Obtaining monosaccharides from the saccharification step of saccharification by a saccharification step, or of the saccharification step of saccharification by a hydrolysis catalyst, or of a saccharification step by a polysaccharide degrading enzyme and a hydrolysis catalyst; hydrolyzing the net and algae from glucose and mannose Or a method of obtaining mixed monosaccharides thereof.

delete

The method of claim 1,
Algae with the net is a living body; Dried body; Residues remaining after filtration with a lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms; Water, a lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms or residues after the extraction with a continuous solvent thereof using an organic material refining apparatus; Residue after extracting the lipid component using an organic solvent; 1 or 2 or more selected from the mixture.

The method of claim 1,
The hydrolysis catalyst is one or two or more acid catalysts selected from sulfuric acid, hydrochloric acid, bromic acid, nitric acid, acetic acid, formic acid, perchloric acid, phosphoric acid, para-toluenesulfonic acid (PTSA) and solid acids, or 1 or 2 or more alkali catalysts chosen from potassium hydroxide, sodium hydroxide, calcium hydroxide, and ammonia aqueous solution.

The method of claim 1,
The polysaccharide degrading enzyme is a cellulase, β-glucosidase, β-agarase, β-galactosidase, endo-1,4-β-glucanase, α-amylase, β-amylase, amyloglucosida 1 type or 2 or more types selected from anase, laminarinase, α-D-glucosidase, β-D-glucosidase, sucralase, maltase, isomaltase, lactase, drihalase, ulvanase The method is characterized in that the mixed enzyme.

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The method of claim 1,
The monosaccharide is about algae with the net horse,
One or two or more acid catalysts selected from sulfuric acid, hydrochloric acid, bromic acid, nitric acid, acetic acid, formic acid, perchloric acid, phosphoric acid, para-toluenesulfonic acid (PTSA) and solid acids or potassium hydroxide, sodium hydroxide And calcium hydroxide, produced by primary hydrolysis after secondary hydrolysis for 1 to 6 hours at a temperature of 20 to 200 ℃ using one or two or more alkali catalysts selected from aqueous ammonia solution.

The method of claim 1,
The monosaccharide is about algae with the net horse,
Cellulase, β-glucosidase, β-agarase, β-galactosidase, endo-1,4-β-glucanase, α-amylase, β-amylase, amyloglucosidase, laminarinana Using one or two or more mixed enzymes selected from α-D-glucosidase, β-D-glucosidase, sucrase, maltase, isomaltase, lactase, drihalase, and ulbanase Produced by reacting 20 to 60 ° C., 0.5 to 5 days in distilled water or a buffer in the range of 0.01 mM to 1.0 M.

The method of claim 9,
Algae with the nettle is characterized in that the solid content of 1 to 30% by weight.

The method of claim 1,
The monosaccharide is further obtained by centrifugation or filtration to obtain a supernatant, followed by concentration under reduced pressure drying or membrane pervaporation.

The method according to any one of claims 1, 3 to 5, and 8 to 11,
Wherein said monosaccharide is hydroxymethylfurfural (HMF), furfural, or mixtures thereof, wherein said sugar content is less than 0.07% per 5% glucose content.