KR101253260B1 - Agglomerate formed from mussel adhesive proteins or mutants thereof and anionic polymer - Google Patents
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Abstract
본 발명은 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 함유하는 응집체에 관한 것으로, 구체적으로 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 응집체 및 이를 포함하는 접착체에 관한 것이다. 본 발명에서 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 응집체는 세포 나 금속 등 다양한 기질에 대하여 접착력이 매우 우수하고, 특히 수분이 존재하는 경우나 수중에서도 접착력이 유지될 수 있어, 접착제로 효과적으로 사용될 수 있다.The present invention relates to agglomerates containing mussel adhesive proteins and anionic polymers, and more particularly, to aggregates prepared by mixing mussel adhesive proteins and anionic polymers and adhesives including the same. In the present invention, the aggregates prepared by mixing the mussel adhesive protein and the anionic polymer have excellent adhesion to various substrates such as cells and metals, and in particular, even in the presence of water or in water, the adhesive strength can be maintained and effectively used as an adhesive. Can be used.
Description
본 발명은 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 함유하는 응집체에 관한 것으로, 구체적으로 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 응집체 및 이를 포함하는 접착체에 관한 것이다.The present invention relates to agglomerates containing mussel adhesive proteins and anionic polymers, and more particularly, to aggregates prepared by mixing mussel adhesive proteins and anionic polymers and adhesives including the same.
해양 생명체인 홍합(mussel)은 접착 단백질들(adhesive proteins)을 생산, 분비함으로써 홍합 자신을 바다 속의 바위와 같은 젖은 고체표면에 단단히 부착할 수 있어, 파도의 충격이나 바닷물의 부력 효과에 영향을 받지 않는다 (J.H. Waite 등, 1983, Biological Review 58, 209-231; H.J. Cha 등, 2008, Biotechnology Journal 3, 631-638).Mussels, a marine organism, produce and secrete adhesive proteins, which allow mussels to attach themselves to wet solid surfaces, such as rocks in the ocean, and are not affected by waves or buoyancy effects. (JH Waite et al., 1983, Biological Review 58, 209-231; HJ Cha et al., 2008, Biotechnology Journal 3, 631-638).
홍합 접착 단백질은 현재 알려진 화학 합성 접착제와 비교하였을 때 강력한 자연 접착제로 알려져 있으며, 대부분 에폭시 수지보다 약 두 배 정도의 높은 인장강도를 나타내면서도 휘어질 수 있는 유연성을 가지고 있다. 또한 홍합 접착 단백질은 플라스틱, 유리, 금속, 테플론 및 생체물질 등의 다양한 표면에 접착할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 젖은 표면에 몇 분 안에 붙을 수 있다. 이러한 특성은 아직까지 화학접착제 분야에서는 미완의 과제로 남아있다. 또한 접착 단백질은 인간세포를 공격하거나 면역반응을 일으키지 않는 것으로 알려져 수술시 생체조직의 접착이나 부러진 치아의 접착 등의 의료분야에 응용 가능성이 크다 (J. Dove 등, 1986, Journal of American Dental Association 112, 879). Mussel adhesive proteins are known as strong natural adhesives compared to currently known chemical synthetic adhesives, and have the flexibility to bend, while exhibiting a tensile strength of about twice that of epoxy resins. Mussel adhesive proteins also have the ability to adhere to a variety of surfaces, including plastics, glass, metals, Teflon and biomaterials, and can adhere to wet surfaces in minutes. These properties have not yet been an issue in the field of chemical adhesives. In addition, adhesive proteins are known to not attack human cells or cause immune reactions, and thus have great potential for application in medical fields such as adhesion of living tissues and adhesion of broken teeth during surgery (J. Dove et al., 1986, Journal of American Dental Association 112). , 879).
특히 상기 홍합 접착 단백질은 세포의 표면 접착 기술 분야에도 이용될 수 있는데, 세포의 표면 접착 기술은 세포 배양 및 조직 공학 분야에 필요한 매우 중요한 기술 중의 하나로, 즉 세포 및 조직 배양을 위해 세포를 세포배양 표면에 효율적으로 접착시키는 기술이므로 세포의 증식 및 분화를 촉진시키는 데 매우 중요하다 (M. Tirrell 등, 2002, Surf. Sci., 500, 61-83).In particular, the mussel adhesive protein may be used in the field of cell surface adhesion technology, which is one of the very important techniques required for the field of cell culture and tissue engineering, that is, the cell culture surface for cell and tissue culture. It is an important technique for promoting the proliferation and differentiation of cells because it is an effective adhesive technique (M. Tirrell et al., 2002, Surf. Sci., 500, 61-83).
한편, 코아세르베이트는 음이온성 고분자 전해질과 양이온성 고분자 전해질이 특정 조건에서 혼합되었을 때 형성되는 콜로이드 물질의 일종으로, 코아세르베이트가 형성되었을 때 용액의 흡광도는 증가하게 되고, 용액 상에서 동그란 구 형태로 외부 용액과 분리되어 존재한다. 코아세르베이트 형성 시, 참여 전해질은 용액에서 분리되어 응축되고 여전히 액상을 띠게 되며, 이때 표면장력이 줄어들고 점성이 늘어나는 등, 물성도 변화한다. 코아세르베이트는 단백질과 그 반대 성질을 띠는 고분자 전해질과의 혼합을 통해서도 일어날 수 있다 (C.G. de Kruif 등, 2004, Current Opinion in Colloid and Interface Science 9, 340-349). Meanwhile, coacervate is a type of colloidal material formed when anionic polymer electrolyte and cationic polymer electrolyte are mixed under specific conditions. When coacervate is formed, the absorbance of the solution increases, and the round sphere on the solution forms an external solution and Exist in isolation. In coacervate formation, the participant electrolyte separates from the solution, condenses and remains in a liquid phase, with changes in physical properties such as reduced surface tension and increased viscosity. Coacervates can also occur through the mixing of proteins with polyelectrolytes with opposite properties (C.G. de Kruif et al., 2004, Current Opinion in Colloid and Interface® Science 9, 340-349).
그러나 홍합으로부터 자연 추출한 접착물질이, 기존의 다른 코팅방법과 비교하여 높은 세포 접착능력과 세포의 증식 및 분화를 더욱 촉진시켜주는 결과를 바탕으로 상업적으로 사용되고 있지만, 자연추출물 1 그램을 얻기 위해 일만 마리의 홍합을 필요로 하는 문제가 야기되고 있다(C. V. Benedict 등, 1989, Adhesives from renewable resources, No. 385, 452-483). 따라서 홍합 접착 단백질을 기존 방법보다 효과적으로 이용할 수 있는 방법, 특히 세포접착 활성이 더욱 우수하여 세포의 표면 접착 기술에 효과적으로 적용할 수 있는 방법이 필요한 실정이다.However, although the adhesive material naturally extracted from mussels is commercially used due to its high cell adhesion ability and the result of further promoting cell proliferation and differentiation compared with other coating methods, it is used to obtain 10,000 g of natural extract. There is a need for mussels (CV Benedict et al., 1989, Adhesives from renewable resources, No. 385, 452-483). Therefore, there is a need for a method that can effectively use mussel adhesive proteins than conventional methods, in particular, cell adhesion activity is more effective in the cell surface adhesion technology.
이에 본 발명자들은 양이온성인 홍합 접착 단백질과 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 응집체가 홍합 접착 단백질보다 우수한 접착 활성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors completed the present invention by confirming that the aggregate prepared by mixing the cationic mussel adhesive protein and the anionic polymer has superior adhesive activity than the mussel adhesive protein.
따라서 본 발명은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합된 응집체를 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide an aggregate in which an anionic polymer is mixed in a mussel adhesive protein or a variant thereof.
또한 본 발명은 상기 응집체를 포함하는 접착제를 제공하는 것을 목적으로 한다.It is another object of the present invention to provide an adhesive including the aggregate.
또한 본 발명은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자를 pH 2.0내지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 혼합하는 단계를 포함하는 응집체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is another object of the present invention to provide a method for preparing an aggregate comprising mixing an anionic polymer with a mussel adhesive protein or a variant thereof in a weight ratio of 1: 0.01 to 1:10 at a pH of 2.0 to 10.0.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합된 응집체를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides an aggregate in which an anionic polymer is mixed with a mussel adhesive protein or a variant thereof.
또한 본 발명은 상기 응집체를 포함하는 접착제를 제공한다.The present invention also provides an adhesive comprising the aggregate.
또한 본 발명은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자를 pH 2.0내지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 혼합하는 단계를 포함하는 응집체의 제조방법을 제공한다.
In another aspect, the present invention provides a method for producing an aggregate comprising mixing an anionic polymer with a mussel adhesive protein or a variant thereof in a weight ratio of 1: 0.01 to 1:10 at pH 2.0 to pH 10.0.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명에서 홍합 접착 단백질은 홍합에서 유래된 접착 단백질로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 국제공개번호 제WO2006/107183A1호 또는 제WO 2005/092920호에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함한다.Mussel adhesive protein in the present invention is an adhesive protein derived from mussels, but preferably includes all mussel adhesive proteins described in WO2006 / 107183A1 or WO 2005/092920.
바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드, (b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드, (c) 서열번호 6의 아미노산 서열이 1 내지 10회 연속하여 연결된 폴리펩타이드 및 (d) 상기 (a)의 폴리펩타이드, (b)의 폴리펩타이드 및 상기 (c)의 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 이종 이상이 융합된 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 (c)에서 폴리펩타이드는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다. 또한 상기 (d)에서 융합된 폴리펩타이드는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.Preferably, the mussel adhesive protein is (a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, (b) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, (c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 1 to 10 times It may be a polypeptide fused with a heterologous polypeptide selected from the group consisting of a polypeptide connected in succession (d) the polypeptide of (a), the polypeptide of (b) and the polypeptide of (c). In (c), the polypeptide is not limited thereto, but may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO. In addition, the polypeptide fused in (d) may be, but is not limited to, a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
본 발명에서 홍합 접착 단백질의 변이체(mutants)는 바람직하게는 홍합 접착 단백질의 접착력을 유지하는 전제하에 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단이나 아미노말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것이거나 홍합 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%, 바람직하게는 5 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것일 수 있다.Mutants of the mussel adhesive protein in the present invention preferably include an additional sequence at the carboxyl or amino terminus of the mussel adhesive protein or some amino acids are substituted with other amino acids under the premise of maintaining the adhesion of the mussel adhesive protein. It may be. More preferably, a polypeptide consisting of 3 to 25 amino acids including RGD is linked to the carboxyl terminal or amino terminal of the mussel adhesive protein, or a polypeptide comprising 1 to 100% of the total number of tyrosine residues constituting the mussel adhesive protein, And 5 to 100% thereof may be substituted with 3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine (DOPA).
상기 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 RGD(Arg Gly Asp, 서열번호 8), RGDS(Arg Gly Asp Ser, 서열번호 9), RGDC(Arg Gly Asp Cys, 서열번호 10), RGDV(Arg Gly Asp Val, 서열번호 11), RGDSPASSKP(Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro, 서열번호 12), GRGDS(Gly Arg Gly Asp Ser, 서열번호 13), GRGDTP(Gly Arg Gly Asp Thr Pro, 서열번호 14), GRGDSP(Gly Arg Gly Asp Ser Pro, 서열번호 15), GRGDSPC(Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys, 서열번호 16) 및 YRGDS(Tyr Arg Gly Asp Ser, 서열번호 17)로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상일 수 있다.3 to 25 amino acids including the RGD include, but are not limited to, RGD (Arg Gly Asp, SEQ ID NO: 8), RGDS (Arg Gly Asp Ser, SEQ ID NO: 9), RGDC (Arg Gly Asp Cys, SEQ ID NO: 10), RGDV (Arg Gly Asp Val, SEQ ID NO: 11), RGDSPASSKP (Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro, SEQ ID NO: 12), GRGDS (Gly Arg Gly Asp Ser, SEQ ID NO: 13), GRGDTP (Gly Arg Gly Asp Thr Pro, SEQ ID NO: 14), GRGDSP (Gly Arg Gly Asp Ser Pro, SEQ ID NO: 15), GRGDSPC (Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys, SEQ ID NO: 16), and YRGDS (Tyr Arg Gly Asp Ser, SEQ ID NO: 17 It may be one or more selected from the group consisting of).
상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 홍합 접착 단백질의 변이체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.The variant of the mussel adhesive protein linked to the polypeptide consisting of 3 to 25 amino acids including RGD at the carboxyl or amino terminus of the mussel adhesive protein is not limited thereto but is preferably a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Can be.
본 발명에서의 상기 홍합 접착 단백질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 벡터에 발현 가능하도록 삽입하여, 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다. 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 방법 및 형질전환체로부터 재조합 단백질을 생산하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본원발명에 포함된다.
The mussel adhesive protein in the present invention is not limited thereto, but may be preferably inserted into a conventional vector designed to express an external gene so that it can be mass-produced by genetic engineering method. The vector may be appropriately selected or newly produced according to the type and characteristics of the host cell for producing a protein. The method for transforming the vector into a host cell and the method for producing a recombinant protein from the transformant can be easily carried out by conventional methods. Methods such as selection, production, transformation, and expression of recombinant proteins described above can be easily carried out by those skilled in the art, and some modifications are also included in the present invention.
본 발명에서 음이온성 고분자는 상기 양이온성인 홍합 접착 단백질과 결합하여 코아세르베이트 또는 침전물을 형성할 수 있는 고분자 물질이라면 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 상기 양이온성인 홍합 접착 단백질의 pI (Isoelectric point)보다 낮은 고분자, 더 바람직하게는 pI 수치가 2 내지 6인 고분자, 보다 더 바람직하게는 pI 수치가 2 내지 4인 고분자일 수 있다.In the present invention, the anionic polymer may be used without limitation as long as it is a polymer material capable of binding to the cationic mussel adhesive protein to form coacetate or a precipitate, but preferably lower than pI (Isoelectric point) of the cationic mussel adhesive protein. It may be a polymer, more preferably a polymer having a pI value of 2 to 6, even more preferably a polymer having a pI value of 2 to 4.
본 발명에서 음이온성 고분자는 예를 들면, 히아루론산(hyaluronic acid), 페레독신(ferredoxin), 폴리스티렌술폰산(poly styrene sulfonic acid), 아라비아 검(gum arabic), 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 카보폴(carbopol), 고 또는 저 메톡실 펙틴(high or low methoxyl pectin), 카르복시메틸 구아검 나트륨(sodium carboxymethyl guar gum), 잔탄 검(xanthan gum), 유청 단백질(whey protein), 레구민(faba bean legumin), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 알긴산(alginate), 캐러지넌(carrageenan), 헥사메타인산 나트륨(sodium hexametaphosphate), 카제인 나트륨(sodium casinate), 헤모글로빈(hemoglobin), 헤파린(heparin) 및 세포외 다당체 B40(exopolysaccharide B40)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 상기 음이온성 고분자의 평균 분자량은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 1kDa 내지 300kDa으로 이루어진 군에서 선택된 분자량을 가질 수 있으며 보다 바람직하게는 10kDa 내지 100kD, 더 바람직하게는 17kDa 내지 59kDa, 가장 바람직하게는 17kDa, 35kDa 또는 59kD의 분자량을 가질 수 있다. 상기 분자량을 초과하거나 미만인 경우 응집체가 형성되지 않을 수 있기 때문이다.
In the present invention, the anionic polymer is, for example, hyaluronic acid (hyaluronic acid), ferredoxin (ferredoxin), polystyrene sulfonic acid (poly styrene sulfonic acid), gum arabic, gelatin (gelatin), albumin (albumin), carbo Carbopol, high or low methoxyl pectin, sodium carboxymethyl guar gum, xanthan gum, whey protein, legamin legumin, carboxymethyl cellulose, alginate, carrageenan, sodium hexametaphosphate, sodium casinate, hemoglobin, heparin, and extracellular It may be one or more selected from the group consisting of polysaccharide B40 (exopolysaccharide B40), the average molecular weight of the anionic polymer is not limited thereto, but preferably a group consisting of 1kDa to 300kDa It may have a selected molecular weight and standing and more preferably from 10kDa to 100kD, more preferably from 17kDa to about 59kDa, and most preferably may have a molecular weight of 17kDa, 35kDa, or 59kD. This is because aggregates may not be formed when the molecular weight is above or below the molecular weight.
본 발명에서 응집체는 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자가 결합하여 형성된 코아세르베이트 또는 침전물을 말하며, 상기 코아세르베이트 또는 침전물은 각각 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자를 혼합함으로써 생성된 콜로이드의 일종이거나 침전물을 말한다.In the present invention, the aggregate refers to a coacervate or precipitate formed by combining the mussel adhesive protein or a variant thereof and an anionic polymer. It is a kind or sediment.
본 발명의 응집체는 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합된 것을 특징으로 한다. 상기 응집체는 양이온성인 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트(coacervate) 또는 침전물 형태일 수 있다. The aggregate of the present invention is characterized in that the anionic polymer is mixed with the mussel adhesive protein or a variant thereof. The aggregates may be in the form of coacervates or precipitates formed by mixing anionic polymers with mussel adhesive proteins or variants thereof that are cationic.
본 발명의 응집체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 수용성 용매, 보다 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아세톤, 아세트산 수용액에서 제조될 수 있으며, 더 바람직하게는 아세트산 수용액, 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 10%의 아세트산 수용액, 더욱 더 바람직하게는 0.5 내지 8%의 아세트산 수용액에서 제조될 수 있다.The aggregate of the present invention is not limited thereto, but may be preferably prepared in a water-soluble solvent, more preferably in methanol, ethanol, propanol, acetone, acetic acid aqueous solution, more preferably in acetic acid aqueous solution, even more preferably from 0.1% to It may be prepared in 10% aqueous acetic acid solution, even more preferably 0.5-8% aqueous acetic acid solution.
상기 용매에서 본 발명의 응집체를 제조하는 경우 적정 pH는 이에 한정되지만 바람직하게는 pH 2.0 내지 pH 10.0일 수 있으며, 보다 바람직하게는 pH 2.0 내지 pH 6.0일 수 있으며, 더 바람직하게는 pH 2.5 내지 pH 5.5일 수 있다. 상기 pH를 초과하거나 미만인 경우 응집체가 형성되지 않거나 고분자의 변형이 발생할 수 있기 때문이다.When preparing the aggregate of the present invention in the solvent, the appropriate pH is limited to this, but preferably may be pH 2.0 to pH 10.0, more preferably pH 2.0 to pH 6.0, more preferably pH 2.5 to pH May be 5.5. This is because when the pH is above or below the aggregate is not formed or the polymer may be deformed.
상기 용매에 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체 및 음이온성 고분자의 첨가량은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 각각 용매 전체 부피 대비 0.001 내지 100%(w/v)일 수 있으며 보다 더 바람직하게는 0.01 내지 30 %(w/v)일 수 있다.The amount of the mussel adhesive protein or a variant thereof and the anionic polymer added to the solvent is not limited thereto, but may be preferably 0.001 to 100% (w / v) relative to the total volume of the solvent, and more preferably 0.01 to 30% ( w / v).
본 발명의 응집체는 이에 한정되지만 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자를 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 혼합하여 제조될 수 있으며, 보다 바람직하게는 1:0.25 내지 1:2.5의 중량비로, 더 바람직하게는 1:0.25 내지 1:2.33의 중량비로 혼합하여 제조될 수 있다. 상기 혼합비를 초과하거나 미만인 경우 응집체가 효과적으로 형성되지 않을 수 있기 때문이다.The aggregate of the present invention is limited to this, but preferably may be prepared by mixing the mussel adhesive protein or a variant thereof and an anionic polymer in a weight ratio of 1: 0.01 to 1:10, more preferably 1: 0.25 to 1: It may be prepared by mixing at a weight ratio of 2.5, more preferably at a weight ratio of 1: 0.25 to 1: 2.33. This is because aggregates may not be effectively formed when the mixing ratio is above or below.
상기와 같이 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 응집체는 종래 홍합 접착 단백질이나 세포접착 활성이 있는 것으로 알려진 폴리-엘-라이신(poly-L-lysine)보다 세포접착 활성이 매우 우수하다. 특히 상기 응집체의 형태가 코아세르베이트일 때뿐만 아니라 침전물일 때도 세포접착 활성이 매우 우수하다. As described above, aggregates prepared by mixing mussel adhesive proteins or variants thereof and anionic polymers have a much higher cell adhesion activity than poly-L-lysine, which is known to have a mussel adhesive protein or cell adhesion activity. great. In particular, the cell adhesion activity is excellent when the aggregate form is coacervate as well as precipitate.
본 발명의 일실시예에서는 상기 응집체로 세포 배양 플레이트에 코팅하고 초파리(drosophila) S2 세포를 상기 코팅된 세포 배양 플레이트에 배양한 다음, PBS(phosphate buffered saline)로 씻어내고 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 실시하여 플레이트에 접착된 세포수를 측정함으로써 세포접착 활성을 측정하였다. 그 결과 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 응집체는 종래 홍합 접착 단백질이나 세포접착 활성이 있는 것으로 알려진 폴리-엘-라이신(poly-L-lysine)보다 세포접착 활성이 매우 우수함을 확인하였다(<실시예 2> 참조).In one embodiment of the present invention, the aggregates are coated on the cell culture plate, Drosophila S2 cells are cultured on the coated cell culture plate, washed with PBS (phosphate buffered saline), and MTT (3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay was performed to determine cell adhesion activity by measuring the number of cells adhered to the plate. As a result, it was confirmed that the aggregate prepared by mixing the mussel adhesive protein and the anionic polymer was much better in cell adhesion activity than the poly-L-lysine, which is known to have mussel adhesion protein or cell adhesion activity. (See <Example 2>).
또한 본 발명의 응집체는 상기 세포접착 활성 등의 미세접착 시스템뿐만 아니라 대용량 접착시스템, 예를 들면 알루미늄 등의 금속 물질의 접착에도 효과적인 접착력을 유지한다.In addition, the aggregate of the present invention maintains an effective adhesion force not only for the microadhesion system such as the cell adhesion activity but also for the adhesion of a large-capacity adhesion system, for example, metal materials such as aluminum.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 응집체를 이용하였을 때 단일 홍합접착 단백질보다 2배 가량 큰 접착력을 유지하며, 특히 가교제인 티로시나아제(tyrosinase) 또는 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 첨가한 경우 수분이 존재하는 경우 또는 수중에서도 우수한 접착력을 유지할 수 있다.(<실시예 3> 참조)In one embodiment of the present invention, when the aggregate of the present invention is used, the adhesive strength is maintained about twice as large as that of a single mussel adhesive protein, and in particular, when the crosslinking agent tyrosinase or glutaraldehyde is added, Can be maintained even in water or in water (see <Example 3>).
따라서 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 응집체는 접착용으로 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, the aggregate prepared by mixing the mussel adhesive protein or a variant thereof and an anionic polymer may be usefully used for adhesion.
본 발명의 접착제는 상기 응집체를 함유하는 것을 특징으로 한다. The adhesive agent of this invention contains the said aggregate, It is characterized by the above-mentioned.
상기 접착제는 통상의 바이오 접착제에 함유되거나 또는 약리학적으로 허용가능한 부형제를 0.0001 내지 99 중량%로 더 포함할 수 있다. 부형제의 예로는 계면활성제, 산화제, 가교제 및 충진제(filler)가 있으나, 이에 한정되진 않는다(참조: 미국 공개특허공보 제 2003-65060호 및 미국 특허 제 5,015,677호). 상기 계면활성제는 양이온성, 음이온성, 비이온성, 양쪽성 계면활성제일 수 있으며, 그 예로는 소듐 도데실설페이트(sodium dodecylsulfate) 및 소듐 도데실벤젠설포네이트(sodium dodecylbenzensulfonate)가 있다. 상기 산화제는 카테콜 옥시데이즈(catechol oxidase), 포름알데하이드, 비스(설포숙시니미딜) 수베레이트(bis(sulfosuccinimidyl) suberate), 3,3'-디티오비스(설포숙시니미딜프로피오네이트)(3,3'-Dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate), O2, Fe3 +, H2O2 및 IO4 -로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며(참조: Macromolecules 1998, 31, 4739-4745), 상기 충진제는 콜라겐, 히알루론 산, 콘드로이탄 설페이트(condroitan sulfate), 엘라스틴, 라미닌, 카세인, 하이드록시아페티트, 알부민, 피브로넥틴 및 하이브린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. The adhesive may further comprise 0.0001 to 99% by weight of a pharmaceutically acceptable excipient or contained in a conventional bio adhesive. Examples of excipients include, but are not limited to, surfactants, oxidants, crosslinkers and fillers (see, eg, US Patent Publication Nos. 2003-65060 and 5,015,677). The surfactant may be a cationic, anionic, nonionic, amphoteric surfactant, for example sodium dodecylsulfate and sodium dodecylbenzensulfonate. The oxidizing agent is catechol oxidase, formaldehyde, bis (sulfosuccinimidyl) subberate, 3,3'-dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate) (3,3'-Dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate) , O 2,
특히 상기 가교제는 티로시나제 또는 글루타알데하이드일 수 있으며, 상기 가교제의 첨가량은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체의 질량 대비 티로시나아제의 경우 0.0001 내지 1 중량%, 보다 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%, 보다 더 바람직하게는 0.01 내지 1 중량%일 수 있으며, 글루타알데하이드의 경우 전체 접착 용액 부피 대비 0.001 내지 5 부피%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 5 부피%, 보다 더 바람직하게는 0.1 내지 5 부피%일 수 있다. In particular, the crosslinking agent may be tyrosinase or glutaraldehyde, and the amount of the crosslinking agent is 0.0001 to 1% by weight, more preferably 0.001 to 1% by weight, more preferably 0.001 to 1% by weight for tyrosinase relative to the mass of the mussel adhesive protein or a variant thereof. Preferably it may be 0.01 to 1% by weight, in the case of glutaraldehyde may be 0.001 to 5% by volume, more preferably 0.01 to 5% by volume, even more preferably 0.1 to 5% by volume relative to the total adhesive solution volume have.
본 발명의 접착제를 수분이 존재하는 경우나 수중에서 적용하는 경우 상기 가교제는 이에 한정되지 않지만 글루타알데하이드를 사용하는 것이 보다 바람직하다.When the adhesive of the present invention is applied in the presence of water or in water, the crosslinking agent is not limited thereto, but glutaraldehyde is more preferably used.
본 발명의 접착제는 세포접착 활성 등의 미세접착 시스템뿐만 아니라 대용량 접착시스템, 예를 들면 알루미늄 등의 금속 물질의 접착에도 효과적인 접착력을 유지한다.(<실시예 2> 및 <실시예 3> 참조)The adhesive of the present invention maintains effective adhesion not only for microadhesion systems such as cell adhesion activity but also for adhesion of large-capacity adhesion systems, for example, metal materials such as aluminum (see <Example 2> and <Example 3>).
또한 본 발명의 접착제는 수분이 존재하는 경우에도 접착력을 유지할 수 있어, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 수중 접착용으로 이용될 수 있다. 상기와 같이 접착제를 수중 접착용으로 사용하는 경우 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 접착제의 유효성분인 응집체는 코아세르베이트일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 접착제는 수중구조물의 유지, 보수를 위한 친환경 접착제, 보다 바람직하게는 수영장, 욕조, 배 등의 균열의 봉합에 사용될 수 있으며 의료용 접착제, 보다 바람직하게는 연질 (연결) 조직 접착제 (예컨대, 열상 및/또는 절개부를 닫을 때 봉합술 및 스테이플을 대체하는 피부 접착제) 및 경질 (경화된) 조직 접착제 (예컨대, 골 또는 치과용 접착제로서)로 용이하게 사용될 수 있다.(<실시예 3> 참조)In addition, the adhesive of the present invention can maintain the adhesive force even in the presence of water, but is not limited thereto, and may be preferably used for underwater bonding. In the case of using the adhesive for underwater bonding as described above, but not limited to this, preferably, the aggregate which is an active ingredient of the adhesive may be coacervate. For example, the adhesive of the present invention can be used for the sealing of cracks, such as swimming pools, baths, boats, and the like, environmentally friendly adhesives for maintenance and repair of aquatic structures, and medical adhesives, more preferably soft (connected) tissue. Easily used as adhesives (eg, skin adhesives that replace sutures and staples when closing lacerations and / or incisions) and hard (cured) tissue adhesives (eg, as bone or dental adhesives). 3> see)
본 발명의 접착제는, 플라스틱, 유리, 금속, 및 고분자 합성수지로 이루어진 군으로부터 선택된 기질에 적용하기 위해 사용될 수 있으며, 즉 상기 기질을 접착시키거나 고정하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 사용방법은 통상의 접착제 사용방법에 준하며, 대표적인 방법은 도포법이다.The adhesive of the present invention can be used for application to a substrate selected from the group consisting of plastic, glass, metal, and polymeric synthetic resin, that is, it can be used for adhering or fixing the substrate. The method of use is in accordance with the usual method of using an adhesive, and a representative method is an application method.
특히 본 발명의 접착제는 생체 물질에 적용될 수 있는데, 상기 생체 물질은 생물로 분류되는 모든 동, 식물 및 상기 동, 식물로부터 유래된 일부를 의미하며, 일예로는, 세포, 조직, 기관, RNA, DNA, 단백질, 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 호르몬, 지질 및 화합물이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생체 물질에 사용되는 경우 본 발명의 접착제는 구체적인 사용법, 사용량 및 제형 등은, 현재 시판되는 Cell-Tak 제품(BD Biosciences, Two oak Park, Bedford, MA, 미국)에 준하여 사용될 수 있다. 일예로, 본 발명의 접착제는 용제형, 수용성, 무용제형일 수 있으며, 기질에 대하여 0.01 내지 100 ug/cm2로 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In particular, the adhesive of the present invention can be applied to a biomaterial, which refers to all the copper, plant and parts derived from the copper or plant classified as a living organism. Examples include cells, tissues, organs, RNA, DNA, proteins, peptides, polynucleotides, hormones, lipids and compounds, but are not limited thereto. When used in a biological material, the adhesive of the present invention may be used according to specific usage, dosage amount, and formulation according to currently available Cell-Tak products (BD Biosciences, Two oak Park, Bedford, MA, USA). In one example, the adhesive of the present invention may be a solvent type, water soluble, solvent-free, and may be used in 0.01 to 100 ug / cm 2 with respect to the substrate, but is not limited thereto.
본 발명의 접착제의 적용예는 이에 한정되지 않으나, (1) 수(물 또는 염분이 있는 물)중에 있는 기질간의 접착; (2) 뼈, 인대, 힘줄, 반월(meniscus) 및 근육 치료 및 인공재료 이식과 같은 정형외과적 치료; (3) 천공, 열창, 절개 등의 치료, 각막 이식, 인공 각막 삽입와 같은 안과적 접합; (4) 보정장치, 가공의치, 치관 장착, 흔들리는 치아 고정, 부러진 치아 치료 및 충진제 고정과 같은 치과적 접합; (5) 혈관 접합, 세포조직 접합, 인공재료 이식, 상처 봉합과 같은 외과적 치료; (6) 식물의 이식편 접합, 상처 치유와 같은 식물에서의 접합; 및 (7) 약물, 호르몬, 생물학적 인자, 의약물, 생리적 또는 대사적 관찰 장치, 항생제 및 세포의 이식과 같은 용도가 있다(참조: 미국 특허 제 5,015,677호).Application examples of the adhesive of the present invention include, but are not limited to, (1) adhesion between substrates in water (water or saline water); (2) orthopedic treatments such as bone, ligament, tendon, meniscus and muscle treatments and artificial material implants; (3) ophthalmic conjugation, such as treatment of perforation, fissures, incisions, etc., corneal transplantation, artificial corneal insertion; (4) dental abutments such as correction devices, dentures, crown mounts, rocking teeth fixation, broken tooth care and filler fixation; (5) surgical treatments such as vascular bonding, tissue bonding, artificial material implantation, wound closure; (6) graft conjugation of plants, conjugation in plants such as wound healing; And (7) use such as implantation of drugs, hormones, biological factors, drugs, physiological or metabolic observation devices, antibiotics and cells (see US Pat. No. 5,015,677).
또한 본 발명은 접착제에 계면활성제, 산화제, 가교제, 및 충진제(filler)로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 처리하거나, 또는 상기 접착제의 유효성분인 응집체의 농도를 조절함으로써 상기 접착제의 접착력을 조절할 수 있다(참조: 미국 특허 제 5,015,677호). 상기 산화제, 계면활성제, 가교제 및 충진제는 상기 기술한 바와 동일하다.
In addition, the present invention can control the adhesive strength of the adhesive by treating the adhesive with a material selected from the group consisting of a surfactant, an oxidizing agent, a crosslinking agent, and a filler, or by adjusting the concentration of aggregates which are active ingredients of the adhesive ( See US Patent No. 5,015,677). The oxidizing agent, surfactant, crosslinking agent and filler are the same as described above.
한편 본 발명의 응집체의 제조방법은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자를 pH 2.0내지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.On the other hand, the method for producing an aggregate of the present invention is characterized in that it comprises the step of mixing an anionic polymer in a mussel adhesive protein or a variant thereof in a weight ratio of 1: 0.01 to 1:10 at pH 2.0 to pH 10.0.
본 발명의 응집체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 수용성 용매, 보다 바람직하게는 인산염 수용액 또는 아세트산 수용액에서 제조될 수 있으며, 더 바람직하게는 아세트산 수용액, 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 10%의 아세트산 수용액, 더욱 더 바람직하게는 0.5 내지 8%의 아세트산 수용액에서 제조될 수 있다.The aggregate of the present invention is not limited thereto, but may preferably be prepared in a water-soluble solvent, more preferably in an aqueous phosphate solution or an aqueous acetic acid solution, more preferably in an aqueous acetic acid solution, even more preferably in an aqueous solution of 0.1% to 10% acetic acid. And even more preferably in an aqueous acetic acid solution of 0.5 to 8%.
상기 용매에서 본 발명의 응집체를 제조하는 경우 적정 pH는 pH 2.0 내지 pH 10.0일 수 있으며, 보다 바람직하게는 pH 2.0 내지 pH 6.0일 수 있으며, 더 바람직하게는 pH 2.5 내지 pH 5.5일 수 있다. 상기 pH를 초과하거나 미만인 경우 응집체가 형성되지 않거나 고분자의 변형이 발생할 수 있기 때문이다. 또한 적정 온도는 4 내지 100℃일 수 있으며 바람직하게는 10 내지 60℃일 수 있으며 상기 온도를 초과하거나 미만인 경우 응집체가 형성되지 않거나 고분자의 변형이 발생할 수 있기 때문이다When preparing the aggregate of the present invention in the solvent, the appropriate pH may be pH 2.0 to pH 10.0, more preferably pH 2.0 to pH 6.0, more preferably may be pH 2.5 to pH 5.5. This is because when the pH is above or below the aggregate is not formed or the polymer may be deformed. In addition, the proper temperature may be 4 to 100 ℃ and preferably 10 to 60 ℃ and if the temperature is above or below the aggregate is not formed or deformation of the polymer may occur.
상기 용매에 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체 및 음이온성 고분자의 첨가량은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 용매 전체 부피 대비 0.001 내지 100%(w/v)일 수 있으며 보다 더 바람직하게는 0.01 내지 30 %(w/v)일 수 있다.The amount of the mussel adhesive protein or its variant and the anionic polymer added to the solvent is not limited thereto, but may be preferably 0.001 to 100% (w / v) relative to the total volume of the solvent, and more preferably 0.01 to 30% (w). / v).
본 발명의 응집체는 이에 한정되지만 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자를 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 혼합하여 제조될 수 있으며, 보다 바람직하게는 1:0.25 내지 1:2.5의 중량비로, 더 바람직하게는 1:0.25 내지 1:2.33의 중량비로 혼합하여 제조될 수 있다. 상기 혼합비를 초과하거나 미만인 경우 응집체가 효과적으로 형성되지 않을 수 있기 때문이다.The aggregate of the present invention is limited to this, but preferably may be prepared by mixing the mussel adhesive protein or a variant thereof and an anionic polymer in a weight ratio of 1: 0.01 to 1:10, more preferably 1: 0.25 to 1: It may be prepared by mixing at a weight ratio of 2.5, more preferably at a weight ratio of 1: 0.25 to 1: 2.33. This is because aggregates may not be effectively formed when the mixing ratio is above or below.
본 발명에서 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 응집체는 세포 나 금속 등 다양한 기질에 대하여 접착력이 매우 우수하고, 특히 수분이 존재하는 경우 또는 수중에서도 접착력이 유지될 수 있어, 접착제로 효과적으로 사용될 수 있다.In the present invention, the aggregates prepared by mixing the mussel adhesive protein and the anionic polymer are excellent in adhesion to various substrates such as cells or metals, and especially in the presence of water or in water, the adhesion can be effectively maintained as an adhesive. Can be used.
도 1은 홍합 접착 단백질인 fp-151과 음이온성 고분자인 히아루론산(17kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 2는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(17kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 3은 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(17kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 4는 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(17kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 5는 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산(17kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 6은 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산(17kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 7은 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 8은 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 9는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 10은 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 11은 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(35kDa)을 pH 3.8의 아세트산 용액에서 80:20으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 12는 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(59kDa)을 pH 3.8의 아세트산 용액에서 80:20으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 13은 홍합 접착 단백질 fp-151과 헤파린을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 14는 홍합 접착 단백질 fp-131과 헤파린을 다양한 pH의 아세트산 용액에서 80:20으로 혼합하였을 때 침전물과 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 15는 홍합 접착 단백질 fp-151과 음이온성 단백질인 페레독신(ferredoxin)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 16는 홍합 접착 단백질 fp-151과 페레독신을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 70:30으로 혼합하였을 때 침전물이 생긴 것을 확인한 결과이다.
도 17은 홍합 접착 단백질 fp-131과 페레독신을 pH 4.5의 아세트산 용액에서 70:30으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 18는 홍합 접착 단백질 fp-151과 음이온성 고분자인 폴리스티렌술폰산을 pH 2.5에서 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 19는 홍합 접착 단백질 fp-151과 폴리스티렌술폰산을 pH2.5의 아세트산 용액에서 30:70으로 혼합하였을 때 침전물의 형성을 확인한 결과이다.
도 20은 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 폴리스티렌술폰산을 pH2.5에서 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 21은 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 폴리스티렌술폰산을 pH2.5에서 혼합하였을 때 침전물의 형성을 확인한 결과이다.
도 22는 홍합 접착 단백질 fp-5과 히아루론산(35kDa)을 pH 4.6의 아세트산 용액에서 80:20으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 23은 홍합 접착 단백질 fp-5과 히아루론산(35kDa)을 pH 4.6에서 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 24는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(17kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 25는 홍합 접착 단백질 fp-151과 폴리스티렌술폰산을 이용하여 침전물을 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 26은 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산(17kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 27은 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 폴리스티렌술폰산을 이용하여 침전물을 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 28은 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(17kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 29는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 30은 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 31은 홍합접착 단백질 mfp-151과 히아루론산(35kDa), 홍합접착 단백질 mfp-131과 히아루론산(35kDa)을 이용한 코아세르베이트의 건조상태에서의 접착력을 단일 홍합접착 단백질의 접착력과 비교 실험한 결과이다.
도 32는 티로시나아제와 글루타르알데히드를 첨가하였을 때 홍합접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa or 59kDa)로 형성된 코아세르베이트의 습윤상태에서의 접착력을 단일 홍합접착 단백질의 접착력과 비교 실험한 결과이다.
도 33은 티로시나아제와 글루타르알데히드를 첨가하였을 때 홍합접착 단백질 fp-131과 히아루론산(59kDa)을 이용한 코아세르베이트의 습윤상태에서의 접착력을 단일 홍합접착 단백질의 접착력과 비교 실험한 결과이다.
도 34는 티로시나아제와 글루타르알데히드를 첨가하였을 때 홍합접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)을 이용한 코아세르베이트의 수중상태에서의 접착력을 소혈청 알부민의 접착력과 비교 실험한 결과이다.1 is a result of measuring the change in absorbance when mussel adhesive protein fp-151 and anionic polymer hyaluronic acid (17kDa) is mixed at various pHs and ratios.
FIG. 2 shows the results of coacervate formation when mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (17kDa) were mixed at 60:40 in an acetic acid solution at pH 2.5.
Figure 3 is the result of measuring the change in absorbance when mussel adhesive protein fp-131 and hyaluronic acid (17kDa) is mixed at various pH and ratio.
Figure 4 shows the results of coacervate formation when the mussel adhesive protein fp-131 and hyaluronic acid (17kDa) is mixed at 60:40 in an acetic acid solution of pH 2.5.
5 is a result of measuring the change in absorbance when mussel adhesive protein fp-151-RGD and hyaluronic acid (17kDa) are mixed at various pHs and ratios.
FIG. 6 shows coacervate formation when mussel adhesive protein fp-151-RGD and hyaluronic acid (17kDa) were mixed at 60:40 in an acetic acid solution at pH 2.5.
7 is a result of measuring the change in absorbance when mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (35kDa) are mixed at various pHs and ratios.
8 shows coacervate formation when mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (35kDa) were mixed at 60:40 in an acetic acid solution at pH 2.5.
9 is a result of measuring the change in absorbance when mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (59kDa) are mixed at various pHs and ratios.
10 shows coacervate formation when mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (59kDa) were mixed at 60:40 in an acetic acid solution at pH 2.5.
FIG. 11 shows coacervate formation when mussel adhesive protein fp-131 and hyaluronic acid (35kDa) were mixed in an acetic acid solution of pH 3.8 at 80:20.
FIG. 12 shows coacervate formation when mussel adhesive protein fp-131 and hyaluronic acid (59kDa) were mixed in an acetic acid solution of pH 3.8 at 80:20.
FIG. 13 shows the results of measuring changes in absorbance when mussel adhesive protein fp-151 and heparin were mixed at various pHs and ratios.
Figure 14 shows the result of confirming the precipitate and coacervate formation when the mussel adhesive protein fp-131 and heparin was mixed at 80:20 in acetic acid solution of various pH.
15 is a result of measuring the change in absorbance when mussel adhesive protein fp-151 and anionic protein ferredoxin are mixed at various pHs and ratios.
FIG. 16 shows the result of the formation of a precipitate when the mussel adhesive protein fp-151 and ferredoxin were mixed at 70:30 in an acetic acid solution of pH 2.5.
Figure 17 shows the results of coacetate formation when mussel adhesive protein fp-131 and ferredoxin were mixed at 70:30 in an acetic acid solution at pH 4.5.
FIG. 18 shows the results of measuring the change in absorbance when mussel adhesive protein fp-151 and polystyrene sulfonic acid, an anionic polymer, were mixed at pH 2.5.
19 is a result of confirming the formation of a precipitate when the mussel adhesive protein fp-151 and polystyrene sulfonic acid were mixed at 30:70 in an acetic acid solution of pH2.5.
20 is a result of measuring the change in absorbance when mussel adhesive protein fp-151-RGD and polystyrene sulfonic acid were mixed at pH 2.5.
Figure 21 shows the result of confirming the formation of the precipitate when the mussel adhesive protein fp-151-RGD and polystyrene sulfonic acid were mixed at pH2.5.
22 shows coacervate formation when mussel adhesive protein fp-5 and hyaluronic acid (35kDa) were mixed at 80:20 in an acetic acid solution at pH 4.6.
Figure 23 shows the results of measuring the change in absorbance when mussel adhesive protein fp-5 and hyaluronic acid (35kDa) is mixed at pH 4.6.
FIG. 24 shows coacervates using mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (17kDa), followed by cell adhesion after coating the surface.
FIG. 25 shows the result of forming a precipitate using mussel adhesive protein fp-151 and polystyrenesulfonic acid, and coating the surface using the same, followed by cell adhesion.
FIG. 26 shows coacervates formed using mussel adhesive protein fp-151-RGD and hyaluronic acid (17kDa), and the result of cell adhesion after coating the surface.
Figure 27 is a result of forming a precipitate using the mussel adhesive protein fp-151-RGD and polystyrenesulfonic acid, after coating the surface using the cell adhesion.
FIG. 28 shows coacervates formed using mussel adhesive protein fp-131 and hyaluronic acid (17kDa), and the result of cell adhesion after surface coating.
FIG. 29 shows coacervates formed using mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (35kDa), and the result of cell adhesion after surface coating.
30 shows coacervates formed using mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (59kDa), and the result of cell adhesion after coating the surface.
Figure 31 shows the results of comparing the adhesion of the mussel adhesive protein mfp-151 with hyaluronic acid (35kDa), the mussel adhesive protein mfp-131 and hyaluronic acid (35kDa) in the dry state of coacervate with the adhesion of a single mussel adhesive protein.
Figure 32 shows the results of comparing the adhesion of the mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (35kDa or 59kDa) coacervate when wet with the addition of tyrosinase and glutaraldehyde compared to the adhesion of a single mussel adhesive protein.
33 is a result of comparing the adhesion of the mussel adhesive protein fp-131 and hyaluronic acid (59kDa) in the wet state of coacervate with the adhesion of the single mussel adhesive protein when tyrosinase and glutaraldehyde were added.
Figure 34 shows the results of comparing the adhesion of the serum serum albumin with the strength of coacervate using the mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (59kDa) when tyrosinase and glutaraldehyde were added.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
<< 참조예Reference Example 1> 1>
홍합 접착 단백질의 제조Preparation of Mussel Adhesive Proteins
<1-1> 홍합 접착 단백질 <1-1> mussel adhesive protein fpfp -151의 제조Preparation of -151
상기 홍합 접착 단백질 fp-151은 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 fp-1 중에서 80번 정도 반복되는 10개의 아미노산으로 구성된 데카펩타이드(decapeptide)가 대장균에서 발현될 수 있도록 6개의 데카펩타이드로 이루어진 fp-1 변이체를 합성하고 2개의 fp-1 변이체 사이에 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 넣은 후, 대장균에서 생산한 것이다 (D.S. Hwang et. al., Biomaterials 28, 3560-3568, 2007).The mussel adhesive protein fp-151 is a fp-1 consisting of six decapeptides so that a decapeptide (decapeptide) consisting of 10 amino acids repeated about 80 times among mussel adhesive proteins fp-1 present in nature can be expressed in Escherichia coli. Variants were synthesized and produced in Escherichia coli after inserting the Mgfp-5 gene (Genbank No. AAS00463 or AY521220) between two fp-1 variants (DS Hwang et. Al., Biomaterials 28, 3560-3568, 2007). ).
구체적으로 fp-1 (Genbank No. Q27409 또는 S23760)의 아미노산 서열에서, 서열번호 4로 표시되는 AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 fp-1 변이체(이하, 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하고 Mgfp-5의 N-말단에 상기 6xAKPSYPPTYK을 조합하고 또한 Mgfp-5의 C-말단에 6xAKPSYPPTYK를 조합하여 서열번호 1의 fp-151을 제조하였다.
Specifically, in the amino acid sequence of fp-1 (Genbank No. Q27409 or S23760), a fp-1 variant (hereinafter referred to as 6xAKPSYPPTYK), in which the peptide consisting of AKPSYPPTYK represented by SEQ ID NO: 4 is repeatedly linked, was prepared 6 times, hereinafter referred to as Mgfp-5 Fp-151 of SEQ ID NO: 1 was prepared by combining the 6xAKPSYPPTYK at the N-terminus of 6x and 6xAKPSYPPTYK at the C-terminus of Mgfp-5.
<1-2> 홍합 접착 단백질 <1-2> mussel adhesive protein fpfp -151--151- RGDRGD 의 제조Manufacturing
상기 <실시예 1-1>의 fp-151의 C-말단에 피브로넥틴(fibronectin) RGD 그룹에서 선택된 GRGDSP 서열을 추가하여 서열번호 2의 fp-151-RGD를 제조하였다.
Fp-151-RGD of SEQ ID NO: 2 was prepared by adding the GRGDSP sequence selected from the fibronectin RGD group to the C-terminus of fp-151 of <Example 1-1>.
<1-3> 홍합 접착 단백질 <1-3> mussel adhesive protein fpfp -131의 제조Preparation of -131
홍합 접착 단백질 fp-131은 상기 <실시예 1-1>의 fp-151과 마찬가지 방식으로 2개의 fp-1 변이체 사이에 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 Mgfp-3A의 유전자(Genbank No. BAB16314 또는 AB049579)를 넣은 후, 대장균에서 생산한 것이다.Mussel adhesive protein fp-131 is a gene of the mussel adhesive protein Mgfp-3A (Genbank No. BAB16314 or AB049579) that exists naturally between two fp-1 variants in the same manner as in fp-151 of Example 1-1. ) And then produced by E. coli.
구체적으로 fp-1 (Genbank No. Q27409 또는 S23760)의 아미노산 서열에서, 서열번호 6으로 기재되는 AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 서열번호 7로 표시되는 fp-1 변이체(이하, 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하고 Mgfp-3의 N-말단에 상기 6xAKPSYPPTYK을 조합하고 또한 Mgfp-3의 C-말단에 6xAKPSYPPTYK를 조합하여 서열번호 3의 fp-131을 제조하였다.
Specifically, in the amino acid sequence of fp-1 (Genbank No. Q27409 or S23760), a fp-1 variant represented by SEQ ID NO: 7 in which a peptide consisting of AKPSYPPTYK described in SEQ ID NO: 6 is repeatedly linked (hereinafter, referred to as 6xAKPSYPPTYK) Fp-131 of SEQ ID NO: 3 was prepared by combining 6xAKPSYPPTYK at the N-terminus of Mgfp-3 and 6xAKPSYPPTYK at the C-terminus of Mgfp-3.
<1-4> 홍합 접착 단백질 <1-4> mussel adhesive protein fpfp -5의 제조Manufacture of -5
홍합 접착 단백질 fp-5은 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 대장균에서 생산한 것이다(D.S. Hwang et. al., applied and environmental microbiology, 3352-3359, 2004).
Mussel adhesive protein fp-5 is produced by Escherichia coli genes of naturally occurring mussel adhesive protein Mgfp-5 (Genbank No. AAS00463 or AY521220) (DS Hwang et. Al., Applied and environmental microbiology, 3352-3359, 2004).
<< 실시예Example 1> 1>
홍합 접착 단백질을 이용한 Mussel adhesive protein 코아세르베이트Coacervate (( coacervatecoacervate ) 또는 침전물의 형성) Or the formation of sediment
코아세르베이트(coacervate)는 특정 pH조건에서 특정 비율로 음이온성 전해질 고분자와 양이온성 전해질 고분자를 혼합함으로써 생성된 콜로이드의 일종이다. 상기 코아세르베이트 또는 침전물이 형성되면 용액의 흡광도가 증가되기 때문에 코아세르베이트 또는 침전물의 형성 여부를 확인하기 위해 주로 흡광도를 측정하게 된다(V. Ducel et. al., Colloids and Surfaces a-Physicochemical and Engineering Aspects, 232, 239-247, 2004). 하기 실시예는 상기 참조예에서 제조된 홍합 접착단백질과 음가 전해질 고분자를 혼합한 경우 코아세르베이트 또는 침전물이 형성되는지 여부를 확인한 것이다.
Coacervate is a type of colloid produced by mixing anionic electrolyte polymer and cationic electrolyte polymer at a specific ratio under specific pH conditions. Since the absorbance of the solution increases when the coacetate or precipitate is formed, the absorbance is mainly measured to determine whether coacetate or precipitate is formed (V. Ducel et. Al., Colloids and Surfaces a-Physicochemical and Engineering Aspects, 232). , 239-247, 2004). The following examples confirm whether coacetate or a precipitate is formed when the mussel adhesive protein prepared in the reference example and the negative electrolyte polymer are mixed.
<1-1> 홍합 접착 단백질 <1-1> mussel adhesive protein fpfp -151과 히아루론산(17-151 and hyaluronic acid (17 kDakDa )을 이용한 ) 코아세르베이트Coacervate 형성 formation
상기 <참조예 1-1>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-151과 음가 전해질 고분자인 히아루론산(hyaluronic acid)을 혼합한 경우 코아세르베이트가 형성되는지 확인하였다. When mussel adhesion protein fp-151 prepared in <Reference Example 1-1> and hyaluronic acid, a negative electrolyte polymer, were mixed, it was confirmed whether coacetate was formed.
구체적으로 17kDa의 분자량을 지닌 히아루론산(Lifcore Biomedical; Minesota, 미국)을 0.05%(w/v) 농도로 5% 아세트산(수산화나트륨으로 pH 조절)에 녹이고, 상기와 동일한 용액에 녹인 홍합 접착 단백질 fp-151을 용질(홍합 접착 단백질 및 히아루론산) 부분에서 차지하는 비율을 10%(w/w)씩 상승시키면서 혼합하였다. 상기 혼합 후, UV-spectrphotometer (Optizen 3220UVbio, Mecasys, 대전, 한국)를 이용해 600nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 1에 기재하였다.Specifically, the mussel adhesive protein fp − dissolved in 5% acetic acid (pH adjusted with sodium hydroxide) at a concentration of 0.05% (w / v) was dissolved in hyaluronic acid (Lifcore Biomedical; Minesota, USA) having a molecular weight of 17 kDa. 151 was mixed while increasing the proportion of the solute (mussel adhesive protein and hyaluronic acid) in increments of 10% (w / w). After the mixing, the absorbance at 600 nm wavelength was measured using a UV-spectrphotometer (Optizen 3220UVbio, Mecasys, Daejeon, Korea) and the results are shown in FIG. 1.
상기 도 1에 기재된 바와 같이, pH 2.5에서 fp-151과 히아루론산(17kDa)의 중량비가 58:42, pH 3.0에서 63:37, pH 3.5에서 68:32일 때 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 알 수 있었다.As shown in FIG. 1, it was found that coacervate was best formed when the weight ratio of fp-151 and hyaluronic acid (17kDa) at pH 2.5 was 58:42, 63:37 at pH 3.0, and 68:32 at pH 3.5. .
또한 상기 흡광도의 증가가 코아세르베이트의 형성에 의한 것인지를 현미경 사진을 통해 확인하고 그 결과를 도 2에 기재하였다. In addition, it was confirmed whether the increase in absorbance was due to the formation of coacervate through a micrograph and the results are shown in FIG. 2.
상기 도 2에 기재된 바와 같이, 10 μm 정도 크기의 원형체가 형성된 것을 확인할 수 있었으며, 이는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(17kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트임을 알 수 있었다. 만일 단순 혼합물이 침전된 것이라면, 도 16 및 도 19에 기재된 바와 같이 불균일한 형태의 응집체가 형성되기 때문이다.As shown in FIG. 2, it was confirmed that a circular body having a size of about 10 μm was formed, which was a coacervate formed by mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (17kDa). If the simple mixture is precipitated, it is because aggregates of heterogeneous form are formed as described in FIGS. 16 and 19.
<1-2> 홍합 접착 단백질 <1-2> mussel adhesive protein fpfp -131과 히아루론산(17-131 and hyaluronic acid (17 kDakDa )을 이용한 ) 코아세르베이트Coacervate 형성 formation
상기 <참조예 1-3>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-131을 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 3 및 도 4에 기재하였다.Except for using the mussel adhesive protein fp-131 prepared in <Reference Example 1-3> was confirmed whether the coacervate is formed in the same manner as in <Example 1-1> and the results are shown in Figures 3 and 4 is described.
상기 도 3 및 도 4에 기재된 바와 같이, fp-131과 히아루론산 (17kDa)의 중량비가 pH 2.5에서 41:59, pH 3.0에서 56:44, pH 3.5에서 59:41에서 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 확인할 수 있었다.
3 and 4, the weight ratio of fp-131 to hyaluronic acid (17kDa) was 41:59 at pH 2.5, 56:44 at pH 3.0, and coacervate was formed at 59:41 at pH 3.5. Could.
<1-3> 홍합 접착 단백질 <1-3> mussel adhesive protein fpfp -151--151- RGDRGD 와 히아루론산(17And hyaluronic acid (17 kDakDa )을 이용한 ) 코아세르베이트Coacervate 형성 formation
상기 <참조예 1-2>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD를 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 5 및 도 6에 기재하였다.Except for using the mussel adhesive protein fp-151-RGD prepared in <Reference Example 1-2> was confirmed whether coacetate is formed in the same manner as in <Example 1-1> and the results are shown in Figure 5 And FIG. 6.
상기 도 5 및 도 6에 기재된 바와 같이, fp-151-RGD와 히아루론산의 (17kDa) 중량비가 pH 2.5에서 60:40, pH 3.0에서 70:30, pH 3.5에서 73:27에서 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 확인할 수 있었다. 특히 fp-151보다 fp-151-RGD를 이용한 경우 흡광도가 보다 많이 증가하므로 코아세르베이트 보다 잘 형성됨을 알 수 있었다.
As shown in FIGS. 5 and 6, the (17kDa) weight ratio of fp-151-RGD and hyaluronic acid is best formed at 60:40 at pH 2.5, 70:30 at pH 3.0, and 73:27 at pH 3.5. Could confirm. In particular, when fp-151-RGD was used rather than fp-151, the absorbance was increased more.
<1-4> 홍합 접착 단백질 <1-4> mussel adhesive protein fpfp -151과 히아루론산(35-151 and hyaluronic acid (35 kDakDa )을 이용한 ) 코아세르베이트Coacervate 형성 formation
히아루론산(35kDa)을 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 7 및 도 8에 기재하였다.Except for using hyaluronic acid (35kDa) was confirmed whether coacervate is formed in the same manner as in <Example 1-1> and the results are shown in Figures 7 and 8.
상기 도 7 및 도 8에 기재된 바와 같이, fp-151과 히아루론산 (35kDa)의 중량비가 pH 2.5에서 59:41, pH 3.0에서 70:30, pH 3.5에서 77:27에서 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 확인할 수 있었다. 특히 17kDa 히아루론산보다 35kDa 히아루론산을 이용한 경우 흡광도가 보다 많이 증가하므로 코아세르베이트 보다 잘 형성됨을 알 수 있었다.
As shown in FIGS. 7 and 8, the weight ratio of fp-151 and hyaluronic acid (35kDa) was 59:41 at pH 2.5, 70:30 at pH 3.0, and coacervate was formed at 77:27 at pH 3.5. Could. Particularly, when 35kDa hyaluronic acid was used rather than 17kDa hyaluronic acid, the absorbance increased more than that of coacervate.
<1-5> 홍합 접착 단백질 <1-5> mussel adhesive protein fpfp -151과 히아루론산(59-151 and hyaluronic acid (59 kDakDa )을 이용한 ) 코아세르베이트Coacervate 형성 formation
히아루론산(59kDa)을 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 9 및 도 10에 기재하였다.Except for using hyaluronic acid (59kDa) was confirmed whether coacervate is formed in the same manner as in <Example 1-1> and the results are shown in Figure 9 and 10.
상기 도 9 및 도 10에 기재된 바와 같이, fp-151과 히아루론산 (59kDa)의 중량비가 pH 2.5에서 62:38, pH 3.0에서 71:29, pH 3.5에서 75:25에서 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 확인할 수 있었다. 특히 17kDa 히아루론산보다 59kDa 히아루론산을 이용한 경우 흡광도가 보다 많이 증가하므로 코아세르베이트 보다 잘 형성됨을 알 수 있었다.
9 and 10, the weight ratio of fp-151 and hyaluronic acid (59kDa) was 62:38 at pH 2.5, 71:29 at pH 3.0, and coacervate was formed at 75:25 at pH 3.5. Could. In particular, when the use of 59kDa hyaluronic acid than 17kDa hyaluronic acid increases the absorbance was found to be better formed than coacervate.
<1-6> 홍합 접착 단백질 <1-6> mussel adhesive protein fpfp -151과 -151 and 페레독신(ferredoxin)을Ferredoxin 이용한 침전물 형성 Sediment formation
페레독신(ferredoxin)은 pI값이 약 3.48이어서, pH 3.5 이하에서의 실험은 의미가 없기 때문에 보다 높은 pH영역에서 흡광도 측정 실험을 수행하였다. 구체적으로 페레독신(ferredoxin)(대장균 발현용 벡터 pET28a에 삽입된 surrogate ferredoxin(Anabaena sp. PCC7119 유래)를 대량발현 및 정제하여 사용함)을 0.05%(w/v)의 농도로 수산화나트륨으로 pH를 조절한 1% 아세트산에 녹이고, 동일한 용액에 녹인 fp-151을 10%씩 비율 변화로 10~90%까지 혼합하고 흡광도를 특정하여 그 결과를 도 15 및 도 16에 기재하였다. Since ferredoxin has a pI value of about 3.48, experiments at pH below 3.5 have no meaning, so the absorbance measurement experiment was performed at a higher pH range. Specifically, the pH is adjusted with sodium hydroxide to ferredoxin (expressed and purified surrogate ferredoxin (derived from Anabaena sp. PCC7119) inserted into E. coli expression vector pET28a in a large amount) at a concentration of 0.05% (w / v). The fp-151 dissolved in 1% acetic acid and mixed in the same solution was mixed by 10% to 10-90% in proportional changes and the absorbance was specified. The results are shown in FIGS. 15 and 16.
상기 도 15 및 도 16에 기재된 바와 같이, fp-151과 페레독신의 중량비가 pH 4.5에서 70:30, pH 5.0에서 70:30, pH 5.5에서 80:20인 경우 흡광도가 가장 높았으며, 특히 본 실시예에서는 코아세르베이트 현미경 사진과 달리, 일정한 원형 액상이 아닌 입자가 뭉친 응집체 형태의 혼합 침전물이 형성됨을 확인하였다.
As described in FIG. 15 and FIG. 16, when the weight ratio of fp-151 and peredoxin was 70:30 at pH 4.5, 70:30 at pH 5.0, and 80:20 at pH 5.5, absorbance was the highest. In the examples, unlike coacervate micrographs, it was confirmed that a mixed precipitate was formed in the form of aggregates in which the particles were not a uniform circular liquid.
<1-7> 홍합 접착 단백질 <1-7> mussel adhesive protein fpfp -131과 -131 and 페레독신을Ferredoxin 이용한 Used 코아세르베이트Coacervate 형성 formation
홍합 접착 단백질로 상기 <참조예 1-3>에서 제조된 fp-131을 사용한 것을 제외하고는 상기 fp-131과 페레독신의 중량비가 pH 4.5에서 70:30일 때, <실시예 1-6>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 17에 기재하였다.Except for using the fp-131 prepared in the <Reference Example 1-3> as the mussel adhesive protein when the weight ratio of the fp-131 and perredoxin is 70:30 at pH 4.5, <Example 1-6> It was confirmed whether coacervate was formed in the same manner as described above and the results are shown in FIG. 17.
상기 도 17에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-131과 페레독신(ferredoxin)을 이용한 경우 코아세르베이트가 형성됨을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 17, coacervate was formed when mussel adhesive protein fp-131 and ferredoxin were used.
<1-8> 홍합 접착 단백질 <1-8> mussel adhesive protein fpfp -151과 폴리스티렌술폰산(-151 and polystyrenesulfonic acid ( polypoly styrenestyrene sulfoniculfonic acid)을 이용한 침전물 형성 precipitate formation with acid)
폴리스티렌술폰산(sigma사)을 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 실험을 진행하고 그 결과를 도 18 및 도 19에 기재하였다.Except for using polystyrenesulfonic acid (Sigma), the experiment was conducted in the same manner as in <Example 1-1> and the results are shown in Figure 18 and 19.
상기 도 18 및 도 19에 기재된 바와 같이, fp-151과 폴리스티렌술폰산을 pH 2.5에서 30:70로 혼합하였을 때 흡광도가 가장 많이 증가됨을 알 수 있었다. 특히 본 실시예에서는 코아세르베이트 현미경 사진과 달리, 일정한 원형 액상이 아닌 입자가 뭉친 응집체 형태의 혼합 침전물이 형성됨을 확인하였다.
As shown in FIG. 18 and FIG. 19, it was found that absorbance was most increased when fp-151 and polystyrenesulfonic acid were mixed at pH 2.5 to 30:70. In particular, in the present embodiment, unlike coacervate micrographs, it was confirmed that a mixed precipitate was formed in the form of aggregates in which the particles were not a uniform circular liquid.
<1-9> 홍합 접착 단백질 <1-9> mussel adhesive protein fpfp -151--151- RGDRGD 과 폴리스티렌술폰산을 이용한 침전물 형성Sediment Formation Using Sulfate and Polystyrenesulfonic Acid
폴리스티렌술폰산(Sigma)을 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-3>과 동일한 방법으로 침전물이 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 20 및 도 21에 기재하였다.Except for using polystyrenesulfonic acid (Sigma) was confirmed whether the precipitate is formed in the same manner as in <Example 1-3> and the results are shown in Figures 20 and 21.
상기 도 20 및 도 21에 기재된 바와 같이, fp-151-RGD와 폴리스티렌술폰산을 pH 2.5에서 80:20로 혼합하였을 때 흡광도가 가장 많이 증가되었으며, 침전물이 형성됨을 알 수 있었다.
As described in FIG. 20 and FIG. 21, when fp-151-RGD and polystyrenesulfonic acid were mixed at a pH of 2.5 to 80:20, the absorbance was most increased and a precipitate was formed.
<1-10> 홍합 접착 단백질 <1-10> mussel adhesive protein fpfp -131과 히아루론산(35-131 and hyaluronic acid (35 kDakDa )을 이용한 ) 코아세르베이트Coacervate 형성 formation
상기 <참조예 1-3>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-131을 사용한 것을 제외하고는 상기 fp-131과 히아루론산(35kDa)의 중량비가 pH 3.8에서 80:20일 때, <실시예 1-5>와 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 11에 기재하였다.
Except for using the mussel adhesive protein fp-131 prepared in <Reference Example 1-3> when the weight ratio of fp-131 and hyaluronic acid (35kDa) is 80:20 at pH 3.8, <Example 1-5 It was confirmed whether coacervate was formed in the same manner as> and the results are shown in FIG. 11.
<1-11> 홍합 접착 단백질 <1-11> mussel adhesive protein fpfp -131과 히아루론산(59-131 and hyaluronic acid (59 kDakDa )을 이용한 ) 코아세르베이트Coacervate 형성 formation
상기 <참조예 1-3>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-131을 사용한 것을 제외하고는 상기 fp-131과 히아루론산(35kDa)의 중량비가 pH 3.8에서 80:20일 때, <실시예 1-6>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 12에 기재하였다.
Except for using the mussel adhesive protein fp-131 prepared in <Reference Example 1-3> when the weight ratio of the fp-131 and hyaluronic acid (35kDa) is 80:20 at pH 3.8, <Example 1-6 It was confirmed whether coacervate is formed in the same manner as> and the results are shown in FIG. 12.
<1-12> 홍합 접착 단백질 <1-12> mussel adhesive protein fpfp -151과 헤파린(-151 and heparin ( heparinheparin )을 이용한 침전물 및 Precipitates and 코아세르베이트Coacervate 형성 formation
헤파린(heparin, sigma)과 fp-151의 흡광도 측정 실험이 pH 4.0, pH 5.0, pH 5.5에서 각각 수행되었다. 헤파린을 0.02%(w/v)의 농도로 상기 pH를 지니는 100mM sodium acetate buffer에 녹이고, 동일한 용액에 녹인 fp-151을 10%씩 비율 변화로 10~90%까지 혼합하고 흡광도를 특정하여 그 결과를 도 13 및 도 14에 기재하였다. Absorbance measurement experiments of heparin (sigma) and fp-151 were performed at pH 4.0, pH 5.0, and pH 5.5, respectively. Heparin was dissolved in 100mM sodium acetate buffer having the pH at a concentration of 0.02% (w / v), and fp-151 dissolved in the same solution was mixed in 10% increments by 10% and the absorbance was specified. Are described in FIGS. 13 and 14.
상기 도 13 및 도 14에 기재된 바와 같이, fp-151과 헤파린의 중량비가 pH 에 관계없이 90:10인 경우 흡광도가 가장 높았으며, 도 14에서 pH 5.0에서는 코아세르베이트, pH 4.0과 pH 5.5 에서는 응집침전물이 생김을 확인하였다.
As shown in FIG. 13 and FIG. 14, the absorbance was the highest when the weight ratio of fp-151 and heparin was 90:10 regardless of pH. In FIG. 14, coasorbate at pH 5.0 and coagulated precipitate at pH 4.0 and pH 5.5 were shown. This appearance was confirmed.
<1-13> 홍합 접착 단백질 <1-13> mussel adhesive protein fpfp -5과 히아루론산(35-5 and hyaluronic acid (35 kDakDa )을 이용한 ) 코아세르베이트Coacervate 형성 formation
상기 <참조예1-4>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-5를 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-4>와 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 22 및 도 23에 기재하였다.Except for using the mussel adhesive protein fp-5 prepared in <Reference Example 1-4> was confirmed whether coacervate is formed in the same manner as in <Example 1-4> and the results are shown in Figure 22 and Figure It was described in 23.
상기 도 22 및 도 23에 기재된 바와 같이, fp-5과 히아루론산 (35kDa)의 중량비가 pH 4.6에서 80:20로 혼합하였을 때 흡광도가 가장 많이 증가됨을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 22 and FIG. 23, it was found that the absorbance was most increased when the weight ratio of fp-5 and hyaluronic acid (35kDa) was mixed at pH 4.6 at 80:20.
<< 실시예Example 2> 2>
응집체의 세포접착 활성Cell adhesion activity of aggregates
<2-1> 홍합 접착 단백질 <2-1> mussel adhesive protein fpfp -151과 히아루론산(17-151 and hyaluronic acid (17 kDakDa )에 의해 형성된 Formed by 코아세르베이트의Coacervate 세포접착 활성 Cell adhesion activity
상기 <실시예 1-1>에서 형성된 코아세르베이트를 이용하여, 표면이 처리되지 않은 24-웰 배양 플레이트를 코팅하고 이를 통해 세포접착 활성을 확인하였다. 이때 양성 대조군으로 세포접착 활성이 있는 것으로 알려진 fp-151 및 poly-L-lysine을 사용하였다. 상기 양성 대조군에 대해서는 종래 공지된 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)에 의한 침전법을 이용하였다.(Fulkerson, J.P. 등 (1990) Journal of Orthopaedic Research 8 (6), pp. 793-798, (1990))Using coacervate formed in <Example 1-1>, the surface-treated 24-well culture plate was coated and confirmed cell adhesion activity through this. At this time, fp-151 and poly-L-lysine, which are known to have cell adhesion activity, were used as positive controls. For the positive control group was used for precipitation by a conventionally known aqueous sodium bicarbonate (sodium bicarbonate). (Fulkerson, JP , etc. (1990) Journal of Orthopaedic Research 8 (6), pp. 793-798, (1990))
구체적으로 본 실험에서 사용된 초파리(Drosophila) S2 세포(Invitrogen)를 10% IMS (insect medium supplement, Sigma), 1% antibiotic-antimycotic (Invitrogen) 및 3μl/ml hygromycin(hyclone)이 포함된 곤충세포배양액(M3 medium, Sigma)을 사용하여 27℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 상기 세포를 상기 배양액에 1x105개/ml 농도로 희석하고, 상기 코아세르베이트로 코팅된 세포배양접시에 웰당 5x104개로 상기 세포를 넣고 1시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다. 상기 배양 후, 살아있는 세포를 정량화하기 위해서 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석을 실시하였다. 먼저 상기 배양 후에 붙어있지 않은 세포를 제거하기 위해 PBS(phosphate buffered saline)로 씻어낸 후 300㎕의 MTT 용액을 웰에 주입하였다. 살아있는 세포는 미토콘드리아에서 MTT를 MTT 포르마잔(formazan)으로 환원시켜주기 때문에 MTT 시약을 넣고 2시간 추가 배양한 후, MTT 포르마잔으로 환원된 것을 dimethylsulfoxide(DMSO)로 용출한 다음, 분광기(spectrophotometer)를 통하여 570nm에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 24에 기재하였다. Specifically, Drosophila S2 cells (Invitrogen) used in this experiment were insect cell culture medium containing 10% IMS (insect medium supplement, Sigma), 1% antibiotic-antimycotic (Invitrogen), and 3μl / ml hygromycin (hyclone). (M3 medium, Sigma) was incubated in a 27 ℃ incubator. The cells were diluted to a concentration of 1 × 10 5 / ml in the culture solution, and the cells were placed at 5 × 10 4 per well in the cell culture dish coated with coacervate and incubated in an incubator for 1 hour. After the culture, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) analysis was performed to quantify living cells. First, after culturing, the cells were washed with PBS (phosphate buffered saline) to remove non-attached cells, and 300 μl of MTT solution was injected into the wells. The living cells reduce MTT to MTT formazan in mitochondria, so after incubating for 2 hours with MTT reagent, the reduced product with MTT formazan was eluted with dimethylsulfoxide (DMSO), and then the spectrophotometer was used. The absorbance at 570 nm was measured and the results are shown in FIG. 24.
상기 도 24에 기재된 바와 같이, fp-151 및 poly-L-lysine등의 양성 대조군에 비하여, 홍합접착단백질 fp-151과 히아루론산(17kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성이 더욱 우수함을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 24, it was found that the cell adhesion activity of the coacervate formed by mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (17kDa) was more excellent than the positive controls such as fp-151 and poly-L-lysine. .
<2-2> 홍합 접착 단백질 <2-2> mussel adhesive protein fpfp -151과 폴리스티렌술폰산에 의해 형성된 침전물의 세포접착 활성Adhesion Activity of Precipitate Formed by -151 and Polystyrenesulfonic Acid
상기 <실시예 1-8>에서 형성된 침전물을 이용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 세포접착 활성을 측정하고 그 결과를 도 25에 기재하였다.Except for using the precipitate formed in <Example 1-8> and the cell adhesion activity was measured in the same manner as in <Example 2-1> and the results are shown in Figure 25.
상기 도 25에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-151과 폴리스티렌술폰산에 의해 형성된 침전물의 세포접착 활성이 더욱 우수함을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 25, it was found that the cell adhesion activity of the precipitate formed by the mussel adhesive protein fp-151 and polystyrenesulfonic acid was more excellent.
<2-3> 홍합 접착 단백질 <2-3> mussel adhesive protein fpfp -151--151- RGDRGD 와 히아루론산(17And hyaluronic acid (17 kDakDa )에 의해 형성된 Formed by 코아세르베이트의Coacervate 세포접착 활성 Cell adhesion activity
상기 <실시예 1-3>에서 형성된 코아세르베이트을 이용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 세포접착 활성을 측정하고 그 결과를 도 26에 기재하였다.Except for using the coacervate formed in Example 1-3, the cell adhesion activity was measured in the same manner as in <Example 2-1> and the results are shown in FIG.
상기 도 26에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산(17kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성이 더욱 우수함을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 26, it was found that the cell adhesion activity of the coacervate formed by the mussel adhesive protein fp-151-RGD and hyaluronic acid (17kDa) was more excellent.
<2-4> 홍합 접착 단백질 <2-4> mussel adhesive protein fpfp -151--151- RGDRGD 과 폴리스티렌술폰산에 의해 형성된 침전물의 세포접착 활성Adhesion Activity of Precipitates Formed by Polystyrene Sulfonic Acid
상기 <실시예 1-9>에서 형성된 침전물을 이용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 세포접착 활성을 측정하고 그 결과를 도 27에 기재하였다.Except for using the precipitate formed in <Example 1-9> and the cell adhesion activity was measured in the same manner as in <Example 2-1> and the results are shown in Figure 27.
상기 도 27에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD과 폴리스티렌술폰산에 의해 형성된 침전물의 세포접착 활성이 더욱 우수함을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 27, it was found that the cell adhesion activity of the precipitate formed by the mussel adhesive protein fp-151-RGD and polystyrenesulfonic acid was more excellent.
<2-5> 홍합 접착 단백질 <2-5> mussel adhesive protein fpfp -131 과 히아루론산(17-131 and hyaluronic acid (17 kDakDa )에 의해 형성된 Formed by 코아세르베이트의Coacervate 세포접착 활성 Cell adhesion activity
상기 <실시예 1-2>에서 형성된 코아세르베이트을 이용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 세포접착 활성을 측정하고 그 결과를 도 28에 기재하였다.Except for using the coacervate formed in Example 1-2, the cell adhesion activity was measured in the same manner as in <Example 2-1> and the results are shown in FIG.
상기 도 28에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(17kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성이 매우 우수함을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 28, it was found that the cell adhesion activity of the coacervate formed by mussel adhesive protein fp-131 and hyaluronic acid (17kDa) was very excellent.
<2-6> 홍합 접착 단백질 <2-6> mussel adhesive protein fpfp -151과 히아루론산(35-151 and hyaluronic acid (35 kDakDa )에 의해 형성된 Formed by 코아세르베이트의Coacervate 세포접착 활성 Cell adhesion activity
상기 <실시예 1-4>에서 형성된 코아세르베이트을 이용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 세포접착 활성을 측정하고 그 결과를 도 29에 기재하였다.Except for using the coacervate formed in <Example 1-4> cell adhesion activity was measured in the same manner as in <Example 2-1> and the results are shown in Figure 29.
상기 도 29에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성이 매우 우수함을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 29, it was found that the cell adhesion activity of the coacervate formed by mussel adhesion protein fp-151 and hyaluronic acid (35kDa) was excellent.
<2-7> 홍합 접착 단백질 <2-7> mussel adhesive protein fpfp -151 과 히아루론산(59-151 and hyaluronic acid (59 kDakDa )에 의해 형성된 Formed by 코아세르베이트의Coacervate 세포접착 활성 Cell adhesion activity
상기 <실시예 1-5>에서 형성된 코아세르베이트을 이용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 세포접착 활성을 측정하고 그 결과를 도 30에 기재하였다.Except for using the coacervate formed in <Example 1-5> cell adhesion activity was measured in the same manner as in <Example 2-1> and the results are shown in Figure 30.
상기 도 30에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성이 더욱 우수함을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 30, it was found that the cell adhesion activity of the coacervate formed by the mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (59kDa) was more excellent.
<< 실시예Example 3> 3>
응집체의 접착력 측정Adhesion Measurement of Aggregates
<3-1> 홍합 접착 단백질 <3-1> mussel adhesive protein fpfp -151 또는 -151 or fpfp -131과 히아루론산(35-131 and hyaluronic acid (35 kDakDa )에 의해 형성된 코아세르베이트의 접착력 측정 (건조조건)Adhesion of coacervate formed by) (drying condition)
홍합접착단백질 fp-151과 fp-131의 타이로신 잔기를 도파로 바꾸기 위해 티로시나제 효소반응을 하였다. 구체적으로 5ug/ml의 버섯유래 티로시나제 효소와 2g/L의 단백질을 25mM의 아스코르빈산(ascorbic acid)을 포함한 PBS에 녹여 37℃에서 반나절 반응시키고 증류수에 두 번 투석하고 동결건조함으로써 수정된 홍합접착단백질 mfp-151과 mfp-131를 수득하였다.Tyrosinase enzyme reaction was performed to convert tyrosine residues of mussel adhesive proteins fp-151 and fp-131 into waveguides. Specifically, the mussel adhesive was modified by dissolving 5 ug / ml of mushroom-derived tyrosinase enzyme and 2 g / L protein in PBS containing 25 mM ascorbic acid, reacting for half a day at 37 ° C, dialysis twice in distilled water, and lyophilization. Proteins mfp-151 and mfp-131 were obtained.
수산화나트륨으로 pH 3.8로 맞춘 100mM 아세테이트 버퍼에 mfp-151과 히아루론산(35kDa)을 각각 10g/L로 녹인 용액을 질량비 8:2로 섞어 코아세르베이트를 제조하였다. 그리고 이를 원심분리하여 응축된 액상 콜로이드 상태의 코아세르베이트를 알루미늄 시편에 12mm x 10mm 넓이로 도말하여 접착시켰다. 비교실험을 위해 같은 농도의 BSA(bovine serum albumin)와 동결건조 상태의 단일 홍합접착 단백질 mfp-151 또는 mfp-131을 같은 버퍼에 녹여 동일한 방법으로 붙이고 이를 24시간 동안 상온에서 말려 접착된 알루미늄 시편의 양쪽에 힘을 가해 탈착시에 가해지는 힘을 인장강도 측정기기(Instron)로 정량하여 접착제의 인장강도를 측정하였고 그 결과를 도 31에 기재하였다.Coacervate was prepared by mixing a solution of mfp-151 and hyaluronic acid (35kDa) at 10 g / L in a 100 mM acetate buffer adjusted to pH 3.8 with sodium hydroxide in a mass ratio of 8: 2. The coacervate in the liquid colloidal state, which was condensed by centrifugation, was plated and bonded to an aluminum specimen with a width of 12 mm x 10 mm. For comparative experiments, the same concentration of BSA (bovine serum albumin) and lyophilized single mussel adhesive protein mfp-151 or mfp-131 were dissolved in the same buffer and glued in the same manner, followed by drying at room temperature for 24 hours. The force applied at the time of desorption by applying a force to both sides was quantified by a tensile strength measuring instrument (Instron) to measure the tensile strength of the adhesive, and the results are shown in FIG. 31.
상기 도 31에 기재된 바와 같이 홍합접착 단백질과 히아루론산을 이용한 코아세르베이트의 접착력이 단일 홍합접착단백질에 비해 더욱 우수함을 알 수 있다.
As shown in FIG. 31, it can be seen that coacervate using mussel adhesive protein and hyaluronic acid is more excellent than single mussel adhesive protein.
<3-2> 홍합 접착 단백질 <3-2> mussel adhesive protein fpfp -151과 히아루론산(35-151 and hyaluronic acid (35 kDakDa 또는 59 Or 59 kDakDa )에 의해 형성된 코아세르베이트의 접착력 측정 (수분조건)Adhesion of coacervate formed by) (moisture condition)
상기 <실시예 3-1>에서 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트에 가교제인 티로시나아제(tyrosinase)를 fp-151과 질량대비 1:200으로 섞거나, 혹은 상기 <실시예 1-5>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트에 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 전체 부피대비 0.5%로 섞어 알루미늄 시편에 10mm x 10mm 넓이로 도말하여 이를 접착시켰다. 비교실험을 위해 fp-151을 같은 버퍼에 녹여 동일한 양의 티로시나아제(tyrosinase)나 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 넣고 같은 방법으로 붙였다.In Example 3-1, tyrosinase, which is a crosslinking agent, is mixed with fp-151 at a mass ratio of 1: 200 to coacervate formed by mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (35kDa), or < In the coacervate formed by the mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (59kDa) prepared in Example 1-5>, glutaraldehyde was mixed with 0.5% of the total volume and plated 10 mm x 10 mm on an aluminum specimen. Adhesion. For comparative experiments, fp-151 was dissolved in the same buffer and the same amount of tyrosinase or glutaraldehyde was added and attached in the same manner.
상기 샘플 위에 증류수에 담근 거즈를 감고 건조되지 않도록 랩으로 감았다. 이를 3시간 동안 37℃에서 둔 후 접착제의 인장강도를 측정하고 그 결과를 도 32에 기재하였다. Gauze dipped in distilled water was wrapped on the sample and wrapped in a wrap to prevent drying. After leaving it at 37 ° C. for 3 hours, the tensile strength of the adhesive was measured and the results are shown in FIG. 32.
상기 도 32에 기재된 바와 같이, 두가지 가교제(tyrosinase, glutaraldehyde)를 첨가한 홍합 접착 단백질과 히아루론산에 의해 형성된 코아세르베이트의 접착력이 단일 홍합접착단백질에 비해 더욱 우수함을 알 수 있다.
As shown in FIG. 32, it can be seen that the adhesion between the mussel adhesive protein added with two crosslinking agents (tyrosinase, glutaraldehyde) and coacervate formed by hyaluronic acid is superior to that of the single mussel adhesive protein.
<3-3> 홍합 접착 단백질 <3-3> mussel adhesive protein fpfp -131과 히아루론산(59-131 and hyaluronic acid (59 kDakDa )에 의해 형성된 Formed by 코아세르베이트의Coacervate 접착력 측정 (수분조건) Adhesive force measurement (moisture condition)
상기 <실시예 3-2>에서와 같은 방법으로, 상기 <실시예 1-11>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(59kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트에 티로시나아제(tyrosinase)를 fp-131과 질량대비 1:1000으로 섞거나 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 전체 부피대비 0.5%로 섞어 알루미늄 시편에 10mm x 10mm 넓이로 도말하여 이를 접착시켰다.In the same manner as in <Example 3-2>, tyrosinase (tyrosinase) was added to coacervate formed by mussel adhesion protein fp-131 and hyaluronic acid (59kDa) prepared in <Example 1-11>. 131 and 1: 1000 by mass or glutaraldehyde was mixed with 0.5% of the total volume and plated to 10 mm x 10 mm width on the aluminum specimen to bond them.
비교실험을 위해 fp-131을 같은 버퍼에 녹여 동일한 양의 티로시나아제(tyrosinase)와 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 넣고 같은 방법으로 붙이고 이를 3시간 동안 온도 30℃, 습도 90%에서 둔 후 접착제의 인장강도를 측정하고 그 결과를 도 33에 기재하였다.For comparative experiments, fp-131 was dissolved in the same buffer, and the same amount of tyrosinase and glutaraldehyde were added and glued in the same manner. Tensile strength was measured and the results are shown in FIG. 33.
상기 도 33에 기재된 바와 같이, 두 가지 가교제(tyrosinase, glutaraldehyde)를 첨가한 홍합 접착 단백질과 히아루론산에 의해 형성된 코아세르베이트의 접착력이 단일 홍합접착단백질에 비해 더욱 우수함을 알 수 있다.
As shown in FIG. 33, it can be seen that the adhesion between the mussel adhesive protein added with two crosslinking agents (tyrosinase, glutaraldehyde) and coacervate formed by hyaluronic acid is superior to that of the single mussel adhesive protein.
<3-4> 홍합 접착 단백질 <3-4> mussel adhesive protein fpfp -151과 히아루론산(59-151 and hyaluronic acid (59 kDakDa )에 의해 형성된 Formed by 코아세Koace 르베이트의 접착력 측정 (수중조건)Measurement of adhesion of rebate (underwater condition)
상기 <실시예 3-2>에서와 같은 방법으로, 상기 <실시예 1-11>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트에 티로시나아제(tyrosinase)를 fp-151과 질량대비 1:1000으로 혼합하고 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 전체 부피대비 0.5%로 섞어 알루미늄 시편에 10mm x 10mm 넓이로 도말하여 이를 접착시켰다.In the same manner as in <Example 3-2>, tyrosinase (tyrosinase) was added to coacervate formed by mussel adhesion protein fp-151 and hyaluronic acid (59kDa) prepared in <Example 1-11>. 151 and 1: 1000 by mass, and glutaraldehyde was mixed with 0.5% of the total volume and plated to 10 mm x 10 mm width on the aluminum specimen to bond them.
비교실험을 위해 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)을 같은 버퍼에 녹여 동일한 양의 티로시나아제(tyrosinase)와 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 넣고 같은 방법으로 붙이고 이를 24시간 동안 PBS에 담근 후 접착제의 인장강도를 측정하고 그 결과를 도 34에 기재하였다.For comparative experiments, bovine serum albumin (BSA) was dissolved in the same buffer, and the same amount of tyrosinase and glutaraldehyde were added in the same manner. Tensile strength of was measured and the results are shown in FIG.
상기 도 34에 기재된 바와 같이, 두 가지 가교제(tyrosinase, glutaraldehyde)를 첨가한 홍합 접착 단백질과 히아루론산에 의해 형성된 코아세르베이트의 접착력이 BSA에 비해 더욱 우수함을 알 수 있다.As shown in FIG. 34, it can be seen that the adhesion between the mussel adhesive protein added with two crosslinking agents (tyrosinase, glutaraldehyde) and coacervate formed by hyaluronic acid is better than that of BSA.
<110> POSTECH Foundation <120> Agglomerate comprising adhesion protein isolated from mussel and anionic polymers <130> DPP20102958KR <150> KR2009-0078666 <151> 2009-08-25 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-151 <400> 1 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys 195 <210> 2 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-151-RGD <400> 2 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys Gly Arg Gly Asp Ser Pro 195 200 <210> 3 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-131 <400> 3 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ala 50 55 60 Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 65 70 75 80 Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn 85 90 95 Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser Ala 100 105 110 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 115 120 125 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 130 135 140 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 165 170 <210> 4 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-3 <400> 4 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp 20 25 30 Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 <210> 5 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-5 <400> 5 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment sequence derived from FP-1 <400> 6 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-1 <400> 7 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 50 55 60 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 1 <400> 8 Arg Gly Asp 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 2 <400> 9 Arg Gly Asp Ser 1 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 3 <400> 10 Arg Gly Asp Cys 1 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 4 <400> 11 Arg Gly Asp Val 1 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 5 <400> 12 Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 6 <400> 13 Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 7 <400> 14 Gly Arg Gly Asp Thr Pro 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 8 <400> 15 Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 9 <400> 16 Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 10 <400> 17 Tyr Arg Gly Asp Ser 1 5 <110> POSTECH Foundation <120> Agglomerate comprising adhesion protein isolated from mussel and anionic polymers <130> DPP20102958KR <150> KR2009-0078666 <151> 2009-08-25 <160> 17 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-151 <400> 1 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys 195 <210> 2 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-151-RGD <400> 2 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys 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Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ala 50 55 60 Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 65 70 75 80 Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn 85 90 95 Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser Ala 100 105 110 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 115 120 125 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 130 135 140 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 165 170 <210> 4 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-3 <400> 4 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp 20 25 30 Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 <210> 5 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-5 <400> 5 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly 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Group 2 <400> 9 Arg Gly Asp Ser One <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 3 <400> 10 Arg Gly Asp Cys One <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 4 <400> 11 Arg Gly Asp Val One <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 5 <400> 12 Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 6 <400> 13 Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 7 <400> 14 Gly Arg Gly Asp Thr Pro 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 8 <400> 15 Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 9 <400> 16 Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 10 <400> 17 Tyr Arg Gly Asp Ser 1 5
Claims (29)
상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드이고,
상기 홍합 접착 단백질의 변이체는 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열이 상기 폴리펩타이드의 카르복실말단(carboxyl-terminal) 또는 아미노말단(amino-termianl)에 결합된 것; 또는 상기 폴리펩타이드를 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것인, 응집체.As an aggregate in which an anionic polymer is mixed with a mussel adhesive protein or a variant thereof,
The mussel adhesive protein is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7,
The variant of the mussel adhesive protein is from the group consisting of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17 The selected amino acid sequence is linked to the carboxyl-terminal or amino-termianl of the polypeptide; Or 1 to 100% of the total number of tyrosine residues constituting the polypeptide is substituted with 3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine (DOPA).
상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드이고,
상기 홍합 접착 단백질의 변이체는 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열이 상기 폴리펩타이드의 카르복실말단(carboxyl-terminal) 또는 아미노말단(amino-termianl)에 결합된 것; 또는 상기 폴리펩타이드를 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것인, 응집체의 제조방법.Mixing an anionic polymer with a mussel adhesive protein or variant thereof at a weight ratio of 1: 0.01 to 1:10 at a pH of 2.0 to 10.0,
The mussel adhesive protein is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7,
The variant of the mussel adhesive protein is from the group consisting of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17 The selected amino acid sequence is linked to the carboxyl-terminal or amino-termianl of the polypeptide; Or 1 to 100% of the total number of tyrosine residues constituting the polypeptide is substituted with 3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine (DOPA).
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