KR101248758B1 - 톨 유사 수용체 2를 약물타겟으로 이용한 신경변성 질환에 치료효과를 가지는 물질을 동정하는 방법 및 그 키트 - Google Patents

톨 유사 수용체 2를 약물타겟으로 이용한 신경변성 질환에 치료효과를 가지는 물질을 동정하는 방법 및 그 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 톨 유사 수용체 2를 약물타겟으로 이용한 신경변성 질환에 치료효과를 가지는 물질을 동정하는 방법 및 그 키트에 관한 것이다.

Description

톨 유사 수용체 2를 약물타겟으로 이용한 신경변성 질환에 치료효과를 가지는 물질을 동정하는 방법 및 그 키트{Method for identifying substance applicable to treatment of neurodegenerative diseases using toll-like receptor 2 as a drug target and kit using the same}
본 발명은 톨 유사 수용체 2를 약물타겟으로 이용한 신경변성 질환에 치료효과를 가지는 물질을 동정하는 방법 및 그 키트에 관한 것이다.
응집된 단백질들의 비정상적인 축적 및 지속된 소신경교세포 활성화는 퇴행성 뇌질환에서 신경세포 퇴화(neurodegenerative) 과정의 중요한 기여자이다(Block, M.L., 등. Nat Rev Neurosci 8 (1), 57-69 (2007);Ross, C.A. & Poirier, M.A., Nat Med 10 Suppl, S10-17 (2004)). 최근 연구들에서 파킨슨 병(PD)에 관련된 알파-시누클레인과 같은 응집되기 쉬운 성향을 가진 단백질이 뉴런 세포에서 분비되고, 세포외액에 존재한다는 것이 알려졌고(Lee, H.-J., 등 J Neurosci 25 (25), 6016-6024 (2005);Mollenhauer, B., 등. Biomark Med 4 (5), 683-699 (2010)), 소신경교세포의 면역 반응에 관여함이 보고되었다. 그러나 현재까지 퇴행성 뇌질환의 대표적 증상인 소신경교세포 활성화에 대한 상세한 메커니즘과 이 과정에서의 뉴런 단백질의 역할에 대해서는 알려지지 않았다.
뉴런 단백질 알파-시누클레인은 PD, 루이스체 치매(dementia with Lewy bodies), 다계통 위축(multiple system atrophy), 및 알츠하이머 질환의 루이스체 변종(Lewy body variant)을 포함하는 많은 신경변성 질환에 관련된다(Kim, C. & Lee, S.-J., J Neurochem 107 (2), 303-316 (2008)).
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신경변성 질환에 치료효과가 있는 물질을 동정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신경변성 질환에 치료 효과가 있는 물질을 동정하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 신경변성 질환에 치료 효과가 있는 물질을 동정하는 방법에 있어서,상기 물질을 톨 유사 수용체(TLR) 2와 접촉시키고,
톨 유사 수용체(TLR) 2에 대한 상기 물질의 효과를 경쟁, 비경쟁 또는 비교 에세이로 결정하는 단계를 포함하는 신경변성 질환에 치료 효과가 있는 물질을 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 톨 유사 수용체(TLR) 2는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이들 아미노산 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 전좌 등의 돌연변이를 유도하여 톨 유사 수용체(TLR) 2 활성을 가지는 모든 돌연변이체도 본 발명의 톨 유사 수용체(TLR) 2에 포함된다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 톨 유사 수용체(TLR) 2에 대한 상기 물질의 효과를 에세이하는 방법은 상기 톨 유사 수용체 2에 대한 톨 유사 수용체 2 항체의 결합이 감소되는지를 평가하여 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 톨 유사 수용체(TLR) 2에 대한 상기 물질의 효과를 에세이 하는 방법은 톨 유사 수용체 2 유전자 결손된 마우스로부터 분리된 소신경교세포에 상기 물질을 처리하여서 IL-1, IL-6, TNF, CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4, iNOS과 같은 사이토카인 또는 키모카인 유전자 발현 유도 감소; 또는 상기물질에 노출된 소신경세포가 신경세포체의 손실 및 초로성 블렙 형성을 유도하는지를 평가하여 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 일 구현 예에 있어서, 상기 신경변성 질환은 파킨스병, 치매, 알쯔하이머병, 루이소체 치매 (dementia with Lewy bodies), 다계통위축 (multiple system atrophy), 또는 뇌에 철 축적을 가진 신경변성(neurodegeneration with brain iron accumulation)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 톨 유사 수용체(TLR) 2 또는 상기 톨 유사 수용체(TLR) 2에 대한 항체 또는 뉴런-분비된 알파-시누클레인을 유효성분으로 포함하는 신경변성 질환에 관여하는 물질을 동정하기 위한 키트를 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서 본 발명자들은 뉴런 세포들에서 분비된 세포외 알파-시누클레인이 toll-like receptor 2 (이하, 'TLR 2'라 함)의 내생적인 리간드이고 소신경교세포를 활성화하고 그것이 신경변성을 유도한다는 것을 밝혔다. 뉴런-분비된-알파-시누클레인 및 TLR2 사이의 상호작용 및 TLR2 신호전달의 그 이후 활성화는 인 비트로 및 인 비보 모두에서 TLR2- 결손 소신경교세포에서 실험적 입증 및 신호전달 네트워크의 계산 모델링(computational modeling)을 사용하여 나타내었다. 뉴런-분비된 알파-시누클레인과 대조적으로, 단량체, 중합체, 소섬유체, 및 질산화형태를 포함하는 재조합 알파-시누클레인은 TLR2를 활성화하거나 상호작용할 수 없었고, 이것은 알파-시누클레인이 뉴런 세포에서 분비되는 과정에서 TLR2를 활성화시킬 수 있는 특정 능력을 부여받는 기작이 있다는 것을 암시한다. 이들 결과들은 뉴런-분비된 세포외 알파-시누클레인 및 TLR2 모두가 PD 및 관련 신경변성 질환에서 신경 염증을 조절하는 새로운 치료 타깃이 될 수 있음을 보여준다.
본 발명자들은 인간 알파- 시누클레인(aSCM) 또는 베타-갈락토시데이즈(LZCM)를 과발현하는 분화된 SH-SY5Y 세포로부터 배양 배지를 수집하고(도 6), 1.1 M의 알파-시누클레인의 농도에서 쥐에서 분리 배양된 소신경교세포에 이들 배지를 처리하였다. aSCM로 처리된 소신경교세포는 LZCM을 처리한 소신경세포에 비하여, 아메바 형태로 형상 변화 증가(도 7), 산화질소 및 세포내 반응성 산소족의 생성 증가, 세포 증식 증가 및 염증유발성 사이토카인의 발현 및 분비의 증가를 포함하는 염증유발(proinflammatory) 활성화를 나타내는 일련의 변화를 수반한다(도 1a-f). 조건배지에 의한 소신경세포의 사이토카인 생성의 유도는 조건화된 배지 (aSCM) 에서 알파-시누클레인 단백질을 점차적으로 결핍시킴에 의하여 점차적으로 감소된(도 1g) 반면에, aSCM으로부터 정제된 알파-시누클레인 단백질들은 용량 의존적인 형태로 사이토카인 생성을 유도하였다(도 1h). 이들 결과로부터 본 발명자들은 뉴런 세포에서 분비된 알파-시누클레인은 소신경교세포에서 염증유발 반응을 유도한다는 결론을 얻었다.
활성화된 소신경교세포의 신경독성 효과를 평가하기 위하여, aSCM 또는 LZCM로 전 처리된 소신경교세포의 배양 배지를 쥐의 피질에서 분리 배양된 신경세포(cortical neurons)에 첨가하였다. LZCM로 처리된 것이 아니라 단지 aSCM로 전 처리된 소신경교세포만이 신경세포체 결손(도 1i) 및 초로성 블렙(neuritic bleb) 형성(도 1j)을 유도하였다. aSCM 단독으로는 상당한 정도의 신경세포사멸을 일으키지 않았다(도 1i,j).
알파-시누클레인-유도된 소신경교세포 활성화를 이해하기 위하여, 본 발명자들은 두 다른 시간인 6시간 및 24 시간에서 aSCM 또는 LZCM으로 처리된 소신경교세포의 전사체(transcriptome) 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 전체 2009 개의 발현 변화된 차별적으로 발현된 유전자들(DEGs)을 검출하였다 (6시간에서만 변화 877 DEGs, 24시간에서만 변화 797 DEGs, 그리고 6시간, 24시간 모두에서 공통으로 변화 335 DEGs)(도 8a).
TLR 신호전달, 사이토인 수용체 신호전달, 및 다른 면역 수용체 신호전달 경로는 초기 및 후기 시간 모두에서 높은 통계학적 유의성을 가지고 활성화되었다. 이들 경로에 관여하는 DEGs를 사용하여, 본 발명자들은 뉴런 분비된 알파-시누클레인에 노출되어 활성화된 소신경교세포 신호전달 모델을 구축하였다. 그 모델에 따르면, 그 TLR2 및 사이토카인 수용체 신호전달 경로는 염증유발 사이토카인 및 키모카인을 생성하는 초기에 활성화된다. 후기에는, 세포 이동 및 액틴 사이토스켈레톤 재배열 경로가 활성화되고, TLR 신호전달 기작 및 사이토카인/키모카인 생성도 유지된다(도 2a). 이들 신호전달에서 유전자 발현 변화는 RT-PCR에 의하여 입증되었고(도 9a), TLR2 하위 신호전달 경로의 활성화는 증가된 IkB 분해 및 p38 인산화에 의하여 입증되었다(도 9b,c).
TLR 시스템의 관여를 입증하기 위하여, 본 발명자들은 TLR2, 3, 또는 4 유전자 결손된 마우스로부터 분리된 소신경교세포에서 뉴런-유래된 알파-시누클레인에 대한 염증 반응을 조사하였다. TLR2 유전자 결손은 aSCM에 노출에 대하여 사이토카인/키모카인 유전자 유도를 완전하게 제거하였다(도 2b,c). 조건화된 배지로부터 정제된 뉴런-분비된 알파-시누클레인 또한 TLR2-의존적 사이토카인 생성을 나타내었다(도 10). 이와 대조적으로, TLR3 또는 4 유전자 결손은 알파-시누클레인 유도된 염증형성 사이토카인/키모카인 유전자 유도에 대한 효과를 나타내지 않았다(도 2b). 알파-시누클레인-유도된 IkB 분해 및 p38 인산화는 TLR2-결손 소신경교세포에서 현저하게 감소되었다(도 2d,e). 이들 결과는 TLR2 신호전달 경로는 뉴런-분비된 알파-시누클레인에 대한 소신경교세포의 염증유발 반응에 특이적으로 관여하는 신호전달 네트워크 모델을 입증하였다.
본 발명자들은 이들 단백질들에 대한 소신경교세포 반응에서 TLR2의 역할을 평가하기 위하여 재조합 알파-시누클레인 단백질의 단량체, 중합체, 소섬유체, 및 질산화형태(도 11a)를 테스트하였다. 본 발명자들이 테스트한 모든 형태의 재조합 알파-시누클레인보다 유사한 양의 알파-시누클레인을 포함하는 aSCM이 사이토카인 유전자 유도에서 훨씬 더 강력하였다(>30배)(도 2f). 더 중요하게, 재조합 알파-시누클레인 단백질은 야생형 소신경교세포와 동일한 정도로 TLR2-결손 소신경교세포에서 사이토카인 유전자 유도를 나타내었다. 그 후 본 발명자들은 뉴런 세포의 배양 배지 및 세포로부터 분비된 알파-시누클레인 단백질과 세포질 내 알파-시누클레인 단백질을 분리 정제하였고 (도 11b), 단지 분비된 알파-시누클레인만이 TLR2-의존 형태로 소신경교세포를 활성화하였다(도 2g). 이들 결과는 뉴런 세포로부터 분비된 알파-시누클레인 단백질만이 강력한 TLR2 활성자로서의 특이한 특성을 소유하고, 재조합 단백질 및 뉴런 세포내부의 정상 알파-시누클레인 단백질은 이들 특성들을 가지지 않는다는 것을 암시한다.
알파-시누클레인-유도된 소신경교세포 활성화에서 TLR2의 기능적 중요성에 기반하여, 본 발명자들은 TLR2가 뉴런-분비된 알파-시누클레인에 대한 수용체인지를 테스트하였다. 첫 번째, 본 발명자들은 알파-시누클레인 및 항-TLR2 항체 (T2.5) 사이에 결합 경쟁을 평가하여 BV2 소신경교세포에서 뉴런-분비된 알파-시누클레인 및 TLR2 사이에 상호작용을 조사하였다. BV2 세포들은 세포 표면에 대한 TLR2 항체의 강력한 결합을 나타내었다(도 3a, DMEM 대조군). 그러나 aSCM로 전처리는 TLR2 항체의 결합을 현저하게 감소시킨 반면에, LZCM로 전처리는 거의 효과가 없었다. 이것은 뉴런-분비된 알파-시누클레인 및 TLR2 사이에 직접적인 상호작용을 암시한다. 다음, 본 발명자들은 외부적으로 처리된 뉴런-분비된 알파-시누클레인의 소신경교세포 내부로의 흡수 (internalization)가 TLR2 유전자 결손(도 3b) 또는 TLR2 블럭킹 항체로 선처리에 의하여 현저하게 감소되었다(도 12a). TLR2 단백질들이 COS-7 세포에서 이소성적으로(ectopically) 발현될 때, 알파-시누클레인의 세포 내부로의 흡수는 증가되었다 (도 12c). 또한, 세포 내부로 흡수된 알파-시누클레인이 동일한 내부 컴파트먼트에서 TLR2와 같이 위치하였다(도 3c). 이들 결과는 TLR2가 신호전달 및 염증 반응뿐 아니라 이들 단백질의 결합 및 내부화에 관여하는 뉴런-분비된 세포외 알파-시누클레인에 대한 수용체라는 것을 나타낸다. 뉴런-분비된 알파-시누클레인과는 대조적으로, 재조합 알파-시누클레인 소섬유체(fibril)는 소신경교세포로 내부화를 위하여 TLR2가 필요하지 않거나(도 12b) 내면화 후에 TLR2와 같은 위치에 존재하지 않았다(도 3c).
소신경교세포 활성화에 의한 신경독성 작용에서 TLR2가 중추적인 역할을 함을 유추할 수 있다. aSCM에 노출된 정상 소신경교세포의 배양 배지를 신경세포에 처리하면 신경세포체 손실 및 초로성 블렙(neuritic bleb) 형성이 유도되는 반면, TLR2-결손 소신경교세포로부터 얻어진 배양 배지는 위의 현상을 유도하지 못했다. 반면 LPS-유도된 소신경교세포 신경독성은 TLR2 유전자 결손에 의하여 영향을 받지 않았다(도 3d,e).
인 비보에서 TLR2의 역할을 입증하기 위하여, 본 발명자들은 TLR2 결손된 생쥐 또는 야생형 생쥐의 SN에서 알파-시누클레인을 이소성적으로 발현하였다. 알파-시누클레인 및 그린 형광 단백질(GFP)의 발현을 위해 아데노바이러스 벡터를 피각(putamen)의 양 사이드로 스테레오택시컬하게(stereotaxically) 주사하였고, 그곳으로부터 바이러스 벡터가 SN의 도파민 신경세포로 역행적으로(retrogradely) 운반되었다(도 4a). 바이러스 벡터의 역행성(retrograde) 운반 및 발현을 SN에서 타이로신 하이드록시레이즈-양성 뉴런 세포체에서 GFP의 발현을 통하여 확인하였다(도 13). 알파-시누클레인이 야생형 생쥐의 SN 뉴런에서 발현된 경우, 활성화된 소신경교세포가 증가된 반면에, GFP 발현은 소신경교세포의 활성화를 거의 유도하지 않았다(도 4b,c). SN 뉴런의 알파-시누클레인의 발현 량과 소신경교세포 활성화의 정도 사이에 현저한 상호관련이 있는(r=0.8519, p=0.0035) 반면, GFP 발현 량과의 상호관련성은 거의 없었다(r=0.5217, p=0.122) (도 4e). 또한, TLR2 결손 마우스의 SN 뉴런에서 알파-시누클레인의 발현은 야생형 마우스와 비교하여 훨씬 낮은 소신경교세포 활성화를 이끌었고(도 4b,d), 뉴런 알파-시누클레인 발현량 및 소신경교세포 활성화 사이의 상호관련성도 거의 없다(r=0.0722, p=0.8777) (도 4e). 이들 결과는 신경세포에서의 알파-시누클레인의 과발현이 TLR2를 통하여 파라크라인 형태로 소신경교세포를 활성화할 수 있다는 결론을 인 비보에서 입증하였다. 공용 데이터베이스의 인간 PD 환자의 사후(postmortem) SN조직의 전사체 데이터를 분석한 결과, TLR2, CD14, IRAK2, 및 NFkB을 포함하는 TLR2 신호전달 경로에서 유전자의 발현에서 현저한 증가를 나타내었고(도 14), 이것은 TLR2 신호전달 경로가 PD에서 활성화된다는 것을 암시한다.
본 발명은 퇴행성 뇌질환에 관련된 신호전달 경로 및 수용체를 동정하는 계산적 접근의 능력을 예시한다. 본 발명자들은 구축된 가설적인 신호전달 네트워크가 실험적 결과와 일치한다는 것을 입증하였고, 그것은 뉴런-분비된 알파-시누클레인에 의하여 소신경교세포가 활성화되고 신경독성이 유도되는 것을 통하여, 뉴런-분비된 알파-시누클레인이 TLR2의 내생적 리간드라는 것을 나타낸다. 알파-시누클레인으로 유도된 소신경교세포 활성화에서 TLR2의 역할은 뉴런 알파-시누클레인 과발현에 의한 SN에서 소신경교세포 활성화가 TLR2 결손 마우스에서 제거된다는 것을 나타내어서 인 비보 입증되었다. 이들 결과들은 응집되기 쉬운 단백질이 파라크라인 인자로 신경세포와 소신경교세포 사이의 상호작용을 매개하고 그것에 의해서 뇌 실질조직에서 염증성 환경을 유도하여 신경세포 퇴화 과정을 촉진하는 새로운 기작을 시사한다(도 5). 이것은 TLR2에 대해 작용하는 약제는 알파-시누클레인-관련된 뇌질환에서 신경염증을 조절할 수 있음을 시사하고, 또한 TLR2가 PD 및 다른 관련 질환의 기작-기반된 약제 타깃의 후보라는 예측을 가능하게 한다. 이들 결과들은 신경세포에서 유래된 응집하기 쉬운 단백질에 의한 소신경교세포 활성화가 퇴행성 뇌질환에서 신경염증의 일반적 기작일 수 있다는 가능성을 나타낸다.
도 1은 뉴런 분비된 알파-시누클레인이 소신경교세포를 활성화한다는 것을 나타낸 그림.
a, 아메바 형태를 가지는 소신경교세포의 퍼센테이지(n = 6). b, 소신경교세포로부터 생성된 NO(n = 5). c, 소신경교세포 증식 (n = 6). d, IL-1b mRNA의 상대적 발현. 실시간 PCR 데이터를 LZCM의 평균값으로 표준화함(n = 3). e, 유세포 분석을 사용한 세포내 ROS 수준의 정량화. 이것은 3회 독립적 실험의 대표적인 결과. f, 소신경교세포 배양 배지에서 ELISA를 사용한 사이토카인의 정량화(n = 3). g, aSCM으로부터의 알파-시누클레인의 제거 및 그에 따른 소신경교세포 활성화 변화. 연속적인 세 번의 알파-시누클레인 제거 과정을 친화 레진을 사용하여 수행하였다. 사이토카인 유도를 위하여(n = 3), 사용된 aSCM의 양은 다른 실험에 사용된 양의 1/50이었다. h, his-aSCM로부터 분리 정제된 his-알파-시누클레인에 의한 사이토카인 유전자 발현 유도. 웨스턴 블럿은 소신경교세포 활성화에 사용된 여러 다른 양들의 풀다운 (pull-down)된 알파-시누클레인을 보여줌(n = 3). i, 세포체 카운트에 의하여 측정된 쥐 신경세포의 퇴화(n = 6). MgCM: 소신경교세포 배양유래한 배지. j, 신경돌기 블렙에 의하여 측정된 신경세포의 퇴화(n = 3). 에러 바는 표준편차를. 별표 둘, p<0.01; 별표 셋, p<0.001을 각각 나타낸다.
도 2는 신경세포에서 분비된 알파-시누클레인에 의한 소신경교세포 활성화가 TLR2에 의하여 매개된다는 것을 나타내는 그림.
a, 신경세포에서 분비된 알파-시누클레인에 의하여 활성화된 소신경교세포의 가상적인 신호전달 네트워크. 배경 색들은 특정 시간(청색: 6 h, 녹색: 6 h 및 24 h 모두, 분홍: 24 h)에 활성화되는 경로를 나타냄. b, 야생형, TLR 2, 3, 및 4 결손 마우스 소신경교세포에서 aSCM의 처리에 대한 사이토카인 및 키모카인의 발현(n = 3). c, 야생형 및 TLR2-/- 소신경교세포에서 aSCM -유도된 사이토카인 생성 및 분비(n=3). d, e, aSCM 노출된 소신경교세포에서 TLR2-의존적 IkB 분해(d) 및 p38 MAP kinase의 인산화(e)(n = 3). f, 여러 형태의 알파-시누클레인에 의한 야생형 및 TLR2 결손 마우스에서 IL-1b mRNA 유도(n = 3). g, 신경세포의 내부 (cyt. aS) 및 aSCM (ext. aS)로부터 분리된 다른 여러 양의 알파-시누클레인에 의한 IL-1b mRNA 유도. 에러 바는 표준편차를. 별표 둘, p<0.01; 별표 셋, p<0.001을 각각 나타낸다.
도 3은 TLR2가 신경세포에서 분비된 알파-시누클레인에 의한 신경독성을 매개하는 수용체라는 것을 나타낸 그림.
a, DMEM, LZCM, 또는 aSCM로 전 처리한 후 BV-2 소신경교세포의 표면에 대한 TLR2 항체(T2.5)의 결합(n=3). b, 야생형 및 TLR2-/- 소신경교세포에 의한 aSCM의 알파-시누클레인의 업테이크. c, 마우스 소신경교세포에서 TLR2와 뉴런 분비된 알파-시누클레인의 동위치화(탑 패널). TLR2-/- 소신경교세포는 현저하게 감소된 업테이크를 나타냄(중앙 패널). 내면화된 알파-시누클레인 소섬유는 TLR2와 같은 위치에 존재하지 않음(하단 패널). 스케일 바: 10 μm. d, e, LZCM 또는 aSCM으로 전 처리된 야생형 및 TLR2-/- 소신경교세포의 배양 배지에 노출된 쥐의 신경세포 세포 생존(d, n = 6) 및 신경돌기 블렙 수(e). 신경돌기 블렙 분석을 위하여, 세 독립적인 실험으로부터 50개의 신경돌기를 분석함. 에러 바는 표준편차를. 별표 둘, p<0.01; 별표 셋, p<0.001을 각각 나타낸다.
도 4는 흑질 도파민생성(nigral dopaminergic) 뉴런에서 알파-시누클레인 과발현에 의한 TLR2 의존적인 소신경교세포 활성화를 나타낸 그림.
a, 실험 개략도. b, SNpc의 면역형광 이미지(점선). 스케일 바: 100 μm c, GFP- 및 알파-시누클레인을 발현하는 바이러스 벡터의 선조(striatal) 주입을 받은 야생형에서 SNpc에서 MHC II 형광(n = 5). d, 선조 주입 후 야생형 및 TLR2-/- 마우스의 SNpc에서 MHC II 형광(n = 5). e, 생쥐의 SNpc에서 MHC II 형광과 GFP/알파-시누클레인 형광 사이의 상관관계 (WT; n = 9, TLR2-/-; n = 7, GFP; n = 12). 에러 바는 표준편차를, 별표, p<0.05를 나타낸다.
도 5는 신경세포에서 분비된 알파-시누클레인이 TLR2를 통해서 소신경교세포로부터 염증유발 반응을 유도한다는 것을 나타내는 그림.
뉴런 분비된 알파-시누클레인은 TLR2와 상호작용을 통하여 소신경세포를 활성화, 염증반응을 유발한다. 활성화된 소신경교세포로부터 분비된 수용성 인자는 신경세포 퇴화를 유발한다. 이 모델은 TLR2-알파-시누클레인은 병리학적 신경염증 및 차후의 신경세포 퇴화를 조절하는 PD에 대한 잠재적인 치료 타깃인 것을 암시한다,
도 6은 조건배지에서 신경세포로부터 분비된 알파-시누클레인을 나타낸 그림.
a, 다양한 시기에 제조된 LZCM 및 aSCM의 알파-시누클레인에 대한 웨스턴 분석. b, 재조합 알파-시누클레인 소섬유를 토대로한 aSCM내의 알파-시누클레인 세미-정량적 분석. aSCM (5x 농축)은 약 1.1 μM 농도의 알파-시누클레인을 포함.
도 7은 조건화된 배지에서 노출한 소신경교세포의 형태학적 변화를 나타낸 그림.
소신경교세포는 DMEM (왼쪽), LZCM (중앙), 및 aSCM (오른쪽)으로 24시간 동안 배양하였다. aSCM에 노출된 세포는 '아메바' 형으로 변환되었지만 다른 군들은 '분기(ramified)' 형태를 유지함. 스케일 바: 10 μm
도 8은 aSCM 및 LZCM에 노출된 소신경교세포에서 전사체 분석을 나타낸 그림.
a, 히트(Heat) 맵. b, 밴 다이어그램. aSCM-처리된 소신경교세포로부터 유래한 차별적으로 발현된 유전자들을 시간에 따라 그룹 화함. 각 군에서 도출된 KEGG 경로들을 오른편에 나타냄.
도 9는 신호전달 네트워크의 실험적 입증.
a, 마이크로어레이 분석에서 동정된 유전자들의 RT-PCR 분석. b, c, aSCM에 노출된 소신경교세포에서 IkB 분해(b) 및 p38 MAP kinase의 인산화 (c)(n = 4). 에러바는 표준편차를. 별표 두 개, p<0.01을 각각 나타냄.
도 10은 뉴런 분비된 알파-시누클레인에 의한 소신경교세포의 활성화는 TLR2를 필요로 한다는 것을 나타낸 그림.
야생형 및 TLR2 결손 마우스로부터 분리된 소신경교세포를 His-aSCM로부터 분리 정제된 his-알파-시누클레인으로 배양하였다(n = 3). 에러바는 표준편차를. p<0.001을 각각 나타냄.
도 11은 알파-시누클레인 응집체의 여러 형태들을 웨스턴 블럿 분석을 통하여 나타낸 그림.
a, aSCM, 알파-시누클레인 소섬유, 다량체, 질산화 알파-시누클레인 응집체(N-aS agg)가 웨스턴 블럿 상에서 분석됨. b, 세포 내부 및 배양 배지로부터 분리 정제된 알파-시누클레인 단백질의 웨스턴 분석. (a) 및 (b)에서 나타낸 단백질 조제물을 각각 도 2f 및 2g에서 나타낸 소 신경교세포 활성화에 사용함.
도 12는 소신경교세포로 뉴런 분비된 알파-시누클레인의 TLR2- 의존적인 업테이크를 나타낸 그림.
a, b, 소신경교세포를 TLR2 블럭킹 항체(T2.5) 또는 대조군 IgG으로 30분간 전 처리한 후 aSCM (a) 또는 알파-시누클레인 소섬유(b)를 첨가하여 2분 동안 배양하였다. 패널(a)에서 64 및 180 kDa 사이즈 마커 사이의 고 분자량 밴드는 내면화된 항체임. c, 신경세포에서 분비된 알파-시누클레인의 업테이크는 인간 TLR2를 이소성 발현한 COS-7 세포에서 증진됨.
도 13은 흑질 도파민생성(nigral dopaminergic) 신경세포에서 이소성(Ectopic) 유전자 발현을 나타낸 그림.
GFP-아데노바이러스를 마우스 선조체(striatum)로 주입하고, 7일 후 SN에서GFP의 발현 분석. 스케일 바: 100 μm
도 14는 PD 환자의 SN에서 DEGs를 나타낸 그림.
a, 밴 다이어그램은 변경된 유전자 발현을 가지는 유전자들의 수를 나타냄. 신경세포에서 분비된 알파-시누클레인에 노출된 소신경교세포 (2009 종 유전자)와 PD환자의 SN (1683 종 유전자)에서 공통적으로 차별적으로 발현된 213 종 유전자들, 그 중 70 종 유전자가 발현 증가 되었다. 16명의 환자로부터 온 DEG 데이터를 9명 정상 대상의 결과로 표준화 b, PD 환자의 SN 및 알파-시누클레인에 노출된 소신경교세포에서 공통적으로 발현 증가된 유전자. TLR2 신호전달에 직접적으로 관련된 유전자들을 붉은색으로 기재. c, 공통으로 발현 증진된 유전자와 연관된 생물학적 과정.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
본 발명에서 사용된 All-트랜스 레티노익산, 폴리믹신 B, 프로테이즈 저해제 칵테일, Phosphatase 저해제 칵테일 1 및 2, 리포폴리사카라이드, 및 DCF-DA는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 하기의 항체들을 사용하였다: TLR2 (clone T2.5) 및 MHC 클래스 II (eBioscience, San Diego, CA), IkB, p38 MAPK, phospho-p38 MAPK, 및 알파-시누클레인(다클론) (Cell Signaling Tenchnology, Beverly, MA), 베타-액틴(Sigma Aldrich), 질산화된 알파-시누클레인, 알파-시누클레인(LB509), 타이로신 하이드록시레이즈, 및 TLR2 (Abcam, Cambridge, MA), 및 알파-시누클레인(Syn-1; BD Bioscience, San Diego, CA).
본 발명에 사용된 Spraque-Dawley 랫트 및 C57BL/6 마우스는 샘타코(오산, 대한민국)로부터 구입하였다. TLR2-결손 마우스는 Oriental Bioservice (교토, 일본)으로부터 구입하였다, TLR3-결손 마우스는 R. Flavell (Yale University, School of Medicine, New Haven, CT)로부터(Alexopoulou, L.,등 Nature 413 (6857), 732-738 (2001), 그리고 TLR4-결손 마우스는 S. Akira (Hyogo 의대, Hyogo, Japan)(Hoshino, K. et al., . J Immunol 162 (7), 3749-3752 (1999))로부터 제공받았다. 모든 마우스들은 특이적인 무균 조건에서 유지되었다. 마우스들의 유전자형을 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR에 의하여 분석하였다(표 1).
SH-SY5Y 인간 신경모세포종(neuroblastoma), 쥐의 신경세포, 쥐 및 생쥐의 소신경교세포, BV2 생쥐 소신경교세포주 및 COS-7 세포들의 유지 및 분화는 Lee, H.-J., 등. J. Neurosci. 24 (8), 1888-1896 (2004) 및 Lee, H.-J.,등. Biochem Biophys Res Commun 372 (3), 423-428 (2008)에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
실시예 1: 조건화된 배지(CM)의 제조
조건화된 배지를 생성하기 위하여, 분화된 SH-SY5Y 세포들을 알파-시누클레인, mychis-태그된 알파-시누클레인 및 LacZ를 발현하는 아데노바이러스 벡터로 100의 다중 감염(m.o.i.)으로 감염시켰다. 감염 2일 후, 배지를 혈청 없는 DMEM로 대체하였다. 배양 18 시간 후, 배지를 10분간 1,000 x g로 원심분리하고, 세포 찌꺼기 및 죽은 세포를 제거하기 위하여 추후 10분간 10,000 x g에서 원심분리하였다. 회수된 상등액을 10,000 분자량 컷오프 원심분리 필터(Millipore, Carrighwohill, Cork, Ireland)를 사용하여 농축하였다. 세포에 처리하기 위하여, 1/10 희석된 조건화된 배지를 사용하는 풀-다운 실험을 제외하고 5x 농축액을 사용하였다.
실시예 2: 소신경교세포의 형태 분석
소신경교세포를 24시간 동안 CM 또는 LPS로 처리하였다. 아메바 및 분기된(ramified) 형태를 가지는 세포들을 각 실험에 대하여 10군데 랜덤하게 선택된 지역에서 카운트하여 평균값을 얻었다.
실시예 3: 산화 질소 및 세포 생존력 분석
산화질소 생성 측정 및 세포 생존력 분석은 동일 배지에서 동시에 수행하였다. 요약하면, 소신경교세포를 PDL-코팅된 96-웰 다크 세포 배양 플레이트에 시딩하였다. 다음 날, 세포들을 CM 또는 LPS로 처리하였다. 24시간 배양 후, 산화질소는 제조업자의 지시에 따라 Griess reagent 시스템(Promega, Madison, WI)을 사용하여 배양 배지로부터 측정되었다. 세포 생존력은 Cyquant 세포 증식 분석 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 플레이트에 부착된 세포로부터 결정되었다.
실시예 4: 세포내 ROS의 측정
소신경교세포플 24시간 동안 CM으로 처리한 후 2'-7'-다이클로로다이하이드로프루오르센스(dichlorodihydrofluorescence) 다이아세테이트(DCF-DA)로 암조건에서 20분간 처리하였다. 인산완충식염수(PBS)로 2회 세척 후, 세포를 트립신처리하고 전체 10,000 세포들을 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여 분석하였다. DCF-DA의 산화된 형태를 488 nm/530 nm에서 검출하였다.
실시예 5: 알파-시누클레인 풀-다운
알파-시누클레인의 금속 이온과의 친화도로 인하여 Talon 메탈 친화 레진(Clontech, Mountain View, CA) (데이터 도시 안 함)에 결합한다. aSCM으로부터 알파-시누클레인을 제거하기 위하여, aSCM를 Talon 메탈 친화 레진과 회전하면서 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 원심분리에 의하여 레진을 제거한 후, 신선한 레진을 상등액에 첨가하여 배양한다. 이 풀-다운 과정을 전체 3회 수행하였다. 신경세포 내부 및 외부로 분비된 알파-시누클레인을 분리하기 위하여, His-aSCM 및 세포 추출물을 Talon 메탈 친화 레진으로 풀 다운하였다.
실시예 6: 세포 추출물의 제조 및 웨스턴 블럿 분석
세포를 프로테이즈-포스파테이즈 저해제 혼합물을 가지는 RIPA 버퍼(150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 및 50 mM Tris-HCl)에서 파쇄하였다. 웨스턴 블럿 분석은 Lee, H.-J., 등. J Biol Chem 277 (7), 5411-5417. (2002)에 기재된 것과 같이 수행되었다.
실시예 7:중합효소 연쇄반응
동량의 전체 RNA를 iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 역전사하였다. 통상적인 RT-PCR을 위하여, cDNA 산물들을 지시된 사이클에 대하여 특정 프라이머를 사용하여 증폭하였다(표 1). 정량적인 실시간-PCR을 수행하기 위하여, 타깃 유전자들을 특정 프라이머로 SYBR Premix ex taq II (Takara)을 사용하여 증폭하였다(표 1). DNA 산물의 증폭을 7500 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)으로 측정하였다. 상대적인 mRNA 레벨을 Livak, K.J. & Schmittgen, T.D., Methods 25 (4), 402-408 (2001)에 따라서 계산하였다. 모든 CT 값을 GAPDH 또는 베타-액틴의 값으로 표준화하였다.
Figure 112011007496800-pat00001
Figure 112011007496800-pat00002
표 1은 PCR 분석에 대한 프라이머 및 반응 조건 리스트임. 표는 왼쪽 컬럼부터 오른쪽으로 프라이머 정보를 나타냄: i) 유전자 심벌; ii) 프라이머 서열: 포워드 프라이머 (F), 리버스 프라이머(R); iii) PCR 산물의 크기; iv) 종: 마우스(M), 랫트(R); v) 적용; vi) Entrez 유전자 ID; 및 vii) 6시간 및 24시간에서 마이크로어레이 분석의 배수 변경(log2 스케일). TLR 결손 마우스의 유전자형을 표시된 프라이머의 특정화된 세트로 수행함.
실시예 8:TNF알파 및 IL-6 측정
배지 TNF-알파 및 IL-6의 농도는 BIOSOURCE 면역어세이 키트(Invitrogen)에 의하여 결정되었다.
실시예 9: 신경세포의 퇴화 분석
aSCM, LZCM, 또는 LPS를 1일 동안 소신경교세포에 첨가하고 그 소신경교세포 배양 배지(Mg-CM)를 수집하여 세포 찌꺼기를 제거하기 위하여 원심분리하였다. 이후 상등액을 1일 동안 쥐의 신경세포에 처리하였다. 대조군으로 쥐의 신경세포를 aSCM, LZCM, 또는 LPS로 직접 처리하였다. 뉴런의 현미경 분석은 FV10-ASE 1.7 소프트웨어(Olympus, Tokyo, Japan)를 사용하여 수행되었다. 뉴런세포체 수는 1 mm2 면적에서 분석되었고, 각 실험에 대하여, 10개의 랜덤하게 선택된 면적을 분석하였다. 블렙 수들을 각 실험에 대하여 50개의 랜덤하게 선택된 신경돌기(neurite)에서 카운트하였다.
실시예 10: 마이크로어레이 실험
각 조건에 대하여 3회 반복 실험을 수행하였다. 각 조건에서, 본 발명자들은 RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 전체 RNA를 독립적으로 얻었고 Bioanalyzer 2100 (Agilent)를 사용하여 RNA 무결성(integrity)을 평가하였다. RINs는 모든 샘플에 대하여 10이었다. 그 다음 Illumina 스탠다드 프로토콜에 따라서 RNA를 증폭하고 RatRef-12 BeadChip에 교잡하였다. 그 프로브 강도를 표준화하고 그 프로브들을 Lee, H.J. et al., J Biol Chem 285 (12), 9262-9272 (2010)에 기재한 것과 같이 설명화하였다.
실시예 11:마이크로에레이 데이터의 통계학적 분석 및 네트워크 분석
표준화된 강도를 사용하여,LZCM 및 aSCM 노출된 세포들 사이에 DEGs (FDR0.01)를 Lee, H.J. et al., J Biol Chem 285 (12), 9262-9272 (2010)에 기재된 통계학적 방법을 사용하여 결정하였다. 9 개의 정상 공여체 및 16개의 PD 환자들(GSE7621)로부터 유전자 발현 데이터에 대하여, 본 발명자들은 정상 및 환자들(FDR0.05) 사이에 DEG들을 동정하기 위하여 동일한 방법을 사용하였다. 네트워크 분석에 대하여, 본 발명자들은 주요 경로에 관여하는 DEGs를 선택한 후 BIND, HPRD, BioGRID, 및 KEGG를 포함하는 공용 데이터베이스로부터 상호작용 데이터에 기반한 그들의 상호작용 및 관련 경로를 묘사하는 네트워크를 재구축하였다.
실시예 12: 재조합 알파-시누클레인 및 응집의 제조
Escherichia coli BL21 DE3에서 발현된 알파-시누클레인을 음이온 교환(High-trap Q 컬럼, GE healthcare Life science, Pittsburgh, PA) 및 크기 배제 컬럼 크로마토그래피 (Sephacryl S-200, GE healthcare Life science)를 포함하는 연속적인 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 박테리아 엔도톡신을 Toxineraser 엔도톡신 제거 키트(Genscript, Piscotaway, NJ)를 사용하여 재조합 알파-시누클레인으로부터 제거하였다. 엔도톡신 수준을 Toxinsensor 발색 LAL 엔도톡신 분석 키트(Genscript) (<0.015 엔도톡신 유닛/1 mg의 알파-시누클레인)을 사용하여 측정하였다. 소섬유(Fibril)를 Lee, H.-J. et al., Int J Biochem Cell Biol 40 (9), 1835-1849 (2008)에 기재된 것과 같이 제조하였다. 질산화 알파-시누클레인 응집체를 Thomas, M.P. et al., J Neurochem 100 (2), 503-519 (2007)에 기재된 방법에 따라서 생성하였다. 알파-시누클레인 다량체를 제조하기 위하여, 1 mg/ml의 알파-시누클레인을 37℃에서 1주일 동안 1.4 mM HNE (Cyman chemical, Ann Arbor, MI)로 배양하고 PBS에 대하여 투석하였다. 이 배양은 약 절반의 알파-시누클레인 형성하는 비 섬유상(non-fibrillar) 응집체를 야기하였다.
실시예 13: 세포의 면역형광 분석
면역형광에 대한 방법은 Lee, H.-J. & Lee, S.-J., . J Biol Chem 277 (50), 48976-48983. (2002) 등에 기재된 방법에 의하여 수행되었다.
실시예 14: 알파-시누클레인 업테이크 분석
일차 마우스 소신경교세포를 aSCM로 처리하고 냉 PBS로 2회 세척하였다. 그 세포를 Laemmlie 샘플 버퍼(62.5 mM Tris-HCl, 1% SDS, 1% 베타-mercaptoethanol, 10% glycerol, 및 0.005% w/v bromophenol blue)로 파쇄하고, 그 파쇄액을 짧게 소니케이션하였다. 알파-시누클레인 섬유 업테이크의 경우에, 소신경교세포를 알파-시누클레인 섬유(400 nM)로 처리하고 1%의 TritonX-100/PBS로 파쇄하였다. 그 Triton-불용성 펠렛을 Laemmlie 샘플 버퍼에 재부유하고 간단하게 소니케이션하였다. TLR2의 이소성 발현을 위해, COS-7 세포를 리포펙타민 2000 (Invitrogen)를 사용하여 pcDNA3.1 벡터 또는 pcDNA3.1/Hygro-인간 TLR2 발현 벡터로 형질전환 하였다.
실시예 15:TLR2-알파-시누클레인 블럭킹 어세이
BV2 쥐 소신경교세포주를 poly-L-라이신-코팅된 커버슬립 상에서 배양하였다. 모든 과정을 콜드 룸에서 얼음 상에서 수행하였다. 세포들을 DMEM, LZCM, 또는 aSCM으로 30분간 미리 배양하였다. 얼음-냉각 PBS로 짧게 세척한 후, 세포들을 2 mM Dithiobis[succinimidylpropionate]로 2시간 동안 배양하였다. 그 후 세포들을 TLR2 항체(T2.5, 20 mg/ml) 또는 정상 IgG (20 mg/ml)로 배양한 후, Rhodamine Red X-부착된 2차 항체로 배양하였다. 이미지들은 Olympus FV1000 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 얻었고, 형광 강도는 FV10-ASE 1.7 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 정량화를 위하여, 적어도 120 세포들을 각 실험에 대하여 분석하였다.
실시예 16: 바이러스 벡터의 스테레오탁식(Stereotaxic) 주입
실험 프로토콜은 건국대학교 동물실험 윤리위원회의 승인을 얻었다. 아데노바이러스 미니 정제 virakit (Virapur, San Diego, CA)를 사용하여 아데노바이러스 벡터를 정제하고 농축하였다. 연령-매치된 마우스들을 깊은 마취조건하에서 스테레오탁식하게 위치하게 한 후 1.33 x 108 주입 단위(IU)의 정제된 아데노바이러스 벡터를 선조체(AP; 0.8 mm, ML; 1.7 mm, and DV; -3.2 mm)에 주입하였다. 주입 7일 후, 마우스들로부터 뇌를 분리 면역형광 염색을 위하여 가공하였다. 단위 면적의 형광 강도를 SN 부위에서 측정하고 비-SN 부위의 것을 통하여 표준화하였다. MHC II 및 알파-시누클레인/GFP 발현 사이의 관계성을 결정하기 위하여, 상관관계 비율을 GraphPad Instat 소프트웨어를 사용하여 Pearson 프로덕트-모멘트 상관관계 계수 방법 (Pearson'sr)에 의하여 결정하였다.
본 실시예의 모든 데이터들을 평균표준편차로 나타낸다. 데이터들의 통계적 유의성을 계수적 및 비계수적 테스트를 사용하여 결정하였다. 동물에서 MHC II 형광의 비교를 제외하고, 모든 데이터들을 페어드 t-test에 의하여 분석하였다. MHC II 형광 데이터의 유의성은 Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 분석하였다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Method for identifying substance applicable to treatment of neurodegenerative diseases using toll-like receptor 2 as a drug target and kit using the same <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 784 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro His Thr Leu Trp Met Val Trp Val Leu Gly Val Ile Ile Ser 1 5 10 15 Leu Ser Lys Glu Glu Ser Ser Asn Gln Ala Ser Leu Ser Cys Asp Arg 20 25 30 Asn Gly Ile Cys Lys Gly Ser Ser Gly Ser Leu Asn Ser Ile Pro Ser 35 40 45 Gly Leu Thr Glu Ala Val Lys Ser Leu Asp Leu Ser Asn Asn Arg Ile 50 55 60 Thr Tyr Ile Ser Asn Ser Asp Leu Gln Arg Cys Val Asn Leu Gln Ala 65 70 75 80 Leu Val Leu Thr Ser Asn Gly Ile Asn Thr Ile Glu Glu Asp Ser Phe 85 90 95 Ser Ser Leu Gly Ser Leu Glu His Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Tyr Leu 100 105 110 Ser Asn Leu Ser Ser Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ser Ser Leu Thr Phe 115 120 125 Leu Asn Leu Leu Gly Asn Pro Tyr Lys Thr Leu Gly Glu Thr Ser Leu 130 135 140 Phe Ser His Leu Thr Lys Leu Gln Ile Leu Arg Val Gly Asn Met Asp 145 150 155 160 Thr Phe Thr Lys Ile Gln Arg Lys Asp Phe Ala Gly Leu Thr Phe Leu 165 170 175 Glu Glu Leu Glu Ile Asp Ala Ser Asp Leu Gln Ser Tyr Glu Pro Lys 180 185 190 Ser Leu Lys Ser Ile Gln Asn Val Ser His Leu Ile Leu His Met Lys 195 200 205 Gln His Ile Leu Leu Leu Glu Ile Phe Val Asp Val Thr Ser Ser Val 210 215 220 Glu Cys Leu Glu Leu Arg Asp Thr Asp Leu Asp Thr Phe His Phe Ser 225 230 235 240 Glu Leu Ser Thr Gly Glu Thr Asn Ser Leu Ile Lys Lys Phe Thr Phe 245 250 255 Arg Asn Val Lys Ile Thr Asp Glu Ser Leu Phe Gln Val Met Lys Leu 260 265 270 Leu Asn Gln Ile Ser Gly Leu Leu Glu Leu Glu Phe Asp Asp Cys Thr 275 280 285 Leu Asn Gly Val Gly Asn Phe Arg Ala Ser Asp Asn Asp Arg Val Ile 290 295 300 Asp Pro Gly Lys Val Glu Thr Leu Thr Ile Arg Arg Leu His Ile Pro 305 310 315 320 Arg Phe Tyr Leu Phe Tyr Asp Leu Ser Thr Leu Tyr Ser Leu Thr Glu 325 330 335 Arg Val Lys Arg Ile Thr Val Glu Asn Ser Lys Val Phe Leu Val Pro 340 345 350 Cys Leu Leu Ser Gln His Leu Lys Ser Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Ser 355 360 365 Glu Asn Leu Met Val Glu Glu Tyr Leu Lys Asn Ser Ala Cys Glu Asp 370 375 380 Ala Trp Pro Ser Leu Gln Thr Leu Ile Leu Arg Gln Asn His Leu Ala 385 390 395 400 Ser Leu Glu Lys Thr Gly Glu Thr Leu Leu Thr Leu Lys Asn Leu Thr 405 410 415 Asn Ile Asp Ile Ser Lys Asn Ser Phe His Ser Met Pro Glu Thr Cys 420 425 430 Gln Trp Pro Glu Lys Met Lys Tyr Leu Asn Leu Ser Ser Thr Arg Ile 435 440 445 His Ser Val Thr Gly Cys Ile Pro Lys Thr Leu Glu Ile Leu Asp Val 450 455 460 Ser Asn Asn Asn Leu Asn Leu Phe Ser Leu Asn Leu Pro Gln Leu Lys 465 470 475 480 Glu Leu Tyr Ile Ser Arg Asn Lys Leu Met Thr Leu Pro Asp Ala Ser 485 490 495 Leu Leu Pro Met Leu Leu Val Leu Lys Ile Ser Arg Asn Ala Ile Thr 500 505 510 Thr Phe Ser Lys Glu Gln Leu Asp Ser Phe His Thr Leu Lys Thr Leu 515 520 525 Glu Ala Gly Gly Asn Asn Phe Ile Cys Ser Cys Glu Phe Leu Ser Phe 530 535 540 Thr Gln Glu Gln Gln Ala Leu Ala Lys Val Leu Ile Asp Trp Pro Ala 545 550 555 560 Asn Tyr Leu Cys Asp Ser Pro Ser His Val Arg Gly Gln Gln Val Gln 565 570 575 Asp Val Arg Leu Ser Val Ser Glu Cys His Arg Thr Ala Leu Val Ser 580 585 590 Gly Met Cys Cys Ala Leu Phe Leu Leu Ile Leu Leu Thr Gly Val Leu 595 600 605 Cys His Arg Phe His Gly Leu Trp Tyr Met Lys Met Met Trp Ala Trp 610 615 620 Leu Gln Ala Lys Arg Lys Pro Arg Lys Ala Pro Ser Arg Asn Ile Cys 625 630 635 640 Tyr Asp Ala Phe Val Ser Tyr Ser Glu Arg Asp Ala Tyr Trp Val Glu 645 650 655 Asn Leu Met Val Gln Glu Leu Glu Asn Phe Asn Pro Pro Phe Lys Leu 660 665 670 Cys Leu His Lys Arg Asp Phe Ile Pro Gly Lys Trp Ile Ile Asp Asn 675 680 685 Ile Ile Asp Ser Ile Glu Lys Ser His Lys Thr Val Phe Val Leu Ser 690 695 700 Glu Asn Phe Val Lys Ser Glu Trp Cys Lys Tyr Glu Leu Asp Phe Ser 705 710 715 720 His Phe Arg Leu Phe Asp Glu Asn Asn Asp Ala Ala Ile Leu Ile Leu 725 730 735 Leu Glu Pro Ile Glu Lys Lys Ala Ile Pro Gln Arg Phe Cys Lys Leu 740 745 750 Arg Lys Ile Met Asn Thr Lys Thr Tyr Leu Glu Trp Pro Met Asp Glu 755 760 765 Ala Gln Arg Glu Gly Phe Trp Val Asn Leu Arg Ala Ala Ile Lys Ser 770 775 780

Claims (6)

  1. 신경변성 질환에 치료효과가 있는 물질을 동정하는 방법에 있어서,
    상기 물질을 톨 유사 수용체(TLR) 2와 접촉시키고,
    톨 유사 수용체(TLR) 2에 대한 상기 물질의 효과를 상기 톨 유사 수용체 2에 대한 톨 유사 수용체 2 항체의 결합이 감소되는지를 평가하여 수행하는 단계를 포함하는 신경변성 질환에 치료효과가 있는 물질을 동정하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 톨 유사 수용체(TLR) 2는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 신경변성 질환에 치료효과가 있는 물질을 동정하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 톨 유사 수용체(TLR) 2에 대한 상기 물질의 효과는 톨 유사 수용체 2 유전자 결손된 마우스로부터 분리된 소신경교세포 또는 톨 유사 수용체 2를 과발현하는 세포주에 상기 물질을 처리하여서 사이토카인 또는 키모카인 유전자 유도 파괴; 또는 상기물질에 노출된 소신경세포가 신경세포체의 손실 및 초로성 블렙 형성을 유도하는지를 평가하여 수행하는 것을 특징으로 하는 신경변성 질환에 치료효과가 있는 물질을 동정하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 신경변성 질환은 파킨스병, 치매, 알쯔하이머병, 루이소체 치매 (dementia with Lewy bodies), 다계통위축 (multiple system atrophy), 또는 뇌에 철 축적을 가진 신경변성(neurodegeneration with brain iron accumulation)인 신경변성 질환에 치료효과가 있는 물질을 동정하는 방법.
  6. 톨 유사 수용체(TLR) 2 또는 상기 톨 유사 수용체(TLR) 2에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 신경변성 질환에 치료효과가 있는 물질을 동정하기 위한 키트.
KR1020110009291A 2011-01-31 2011-01-31 톨 유사 수용체 2를 약물타겟으로 이용한 신경변성 질환에 치료효과를 가지는 물질을 동정하는 방법 및 그 키트 KR101248758B1 (ko)

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