KR101244794B1 - 2,4-비스(ｐ-히드록시페닐)-2-부텐알을 유효성분으로 포함하는 치매의 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알을 유효성분으로 포함하는 치매의 치료, 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 유효성분 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알은 뇌신경세포인 성상세포에서 염증반응을 억제하며 아밀로이드의 생성을 억제하므로, 알츠하이머병 또는 이로 인한 치매의 치료제로 개발될 수 있다.

Description

2,4-비스(ｐ-히드록시페닐)-2-부텐알을 유효성분으로 포함하는 치매의 치료용 조성물{Composition for Treating Dementia Comprising 2,4-bis(p-hydroxyphenyl)-2-butenal) As Acitive Ingredient}

본 발명은 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알을 유효성분으로 포함하는 치매의 치료, 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 뇌의 세포외에 축적되어 노인성 반점을 일으키는 불용성 베타-아밀로이드 펩타이드(Aβ)의 축적을 특징으로 하는 나이와 관련된 신경퇴행성 질환이다[1]. 이 소수성 폴리펩타이드 Aβ는 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP)으로부터 단백질 분해에 의해 생성된다. 알츠하이머병 환자의 뇌는 심각한 시냅스 손실, 소신경교세포 활성화(microglial activation), 염증과정과 같은 다양한 비정상적 병리 특성을 보여준다[2]. 형질전환 동물에서 행해진 연구에 의하면 염증이 뇌 아밀로이드 침착 과정에서 매우 중요한 역할을 한다는 것이 보고되었다[3, 4]. 염증성 반응과 매개자들이 APP 발현 및 Aβ 형성을 증대시키고[5, 6], Aβ 생성에 대해 핵심 효소로 작용하는 β-세크리타아제(secretase)의 mRNA 발현, 단백질 발현과 효소적 활성을 상향조절한다[7]. 최근 염증 유발인자 LPS(lipopolysaccharide)가 Aβ의 침착을 유도할 수 있고[8, 9], 배양된 신경세포와 알츠하이머병 마우스 모델에서 항-염증제가 Aβ 침착을 저해한다는 연구결과가 보고되었다[9-12]. 또한, McGeer 등은 알츠하이머병 환자에 대해 항염증제가 치료효과를 가질 수 있음을 제안하였다[13]. 이러한 실험결과들은 신경 염증이 알츠하이머병의 발달과 진행에 있어서 중요한 원인이라는 것과, 항염증제가 Aβ 생성과 침착의 감소를 통해 알츠하이머병 예방에 효과적으로 작용할 것을 입증하고 있다.

iNOS(inducible NO synthase)에 의해 생성되는 자유 라디칼인 NO(nitric oxide)와, COX(cyclooxygenase)의 생성물인 PGs(prostaglandins)는 숙주 선천성 면역과, 병리학적 과정 특히 다발성 경화증, 파킨슨 병, 및 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환에 관여되는 염증반응에 있어서 매우 중요한 매개자이다[14]. 대부분의 신경퇴행성 질환에 있어서, 조절되지 않는 신경 염증반응에 의해 대량의 신경 세포들이 사멸되며, 조절되지 않는 신경 염증반응에서 활성화된 성상세포(astrocyte) 및 소신경교세포(microglia)와 이들의 세포독성물질이 매우 중요한 역할을 담당한다[15]. 성상세포와 소신경교세포로 구성되는 신경교세포(glia cell)는 사이토카인, 반응성 산소 라디칼, NO 및 PGs를 생성할 수 있어 질환을 더욱 악화시킨다[16]. 사이토카인 뿐만 아니라 iNOS 및 COX-2와 같은 염증성 유전자들의 발현은 NF-κB의 활성화에 의해 조절될 수 있다. 선행연구에서는 NF-κB DNA 결합 활성을 갖는 NF-κB 컨센서스 DNA 서열이 COX-2 프로모터 내부와, iNOS 프로모터 내부에 2개가 존재함이 알려져 있다[17, 18]. 또한, NF-κB DNA 컨센서스 서열은 신경 β-세크리타아제의 프로모터에도 존재한다. 따라서, NF-κB의 비정상적 조절은 Aβ의 생성 뿐만 아니라 다수의 염증 관련 질환과도 관련이 있다. 따라서, NF-κB 활성을 적절하게 조절하는 것은 Aβ 생성의 감소 뿐만 아니라 신경염증의 감소를 통해 알츠하이머병의 잠재적 치료 방법을 제공할 수 있다[19]. STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3)는 신경염증과 Aβ 생성의 중요한 조절자이며, 사이토카인에 의해 유도되는 NF-κB 매개 Aβ 유전자 발현에 대해서도 조절기능을 한다[20, 21].

메일라드 반응(Maillard reaction)이란 글루코오스-티로신, 글루코오스-라이신, 프럭토오스-라이신, 리보오스-라이신, 자일로오스-아르기닌, 자일로오스-글리신 및 자일로오스-트립토판과 같은 유색 또는 무색의 생성물을 생성할 수 있는 공지된 비-효소적 갈변 반응을 지칭한다[22-25]. 메일라드 반응은 반응물(카보닐 및 아미노 화합물)의 종류 및 농도, 열처리 반응온도 및 시간, 반응물의 pH, 산소 등에 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 메일라드 반응에 관한 연구는 다양한 식품 및 모델 시스템을 활용하여 광범위하게 이루어져 있다. 특히, 메일라드 반응 생성물은 항산화능, 항돌연변이능, 항심장질환능 및 항균 효과를 갖는 것으로 알려져 있다[22-24, 26-29]. 그러나, 메일라드 반응 생성물물로부터 생리활성물질의 분리ㅇ동정에 관한 시도는 미비한 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 치매 치료용 활성성분을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 티로신-프럭토오스 메일라드 반응(Maillard reaction) 생성물인 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알이 뇌신경세포를 구성하는 성상세포(astrocyte)에서 아밀로이드의 생성을 억제한다는 것을 실험적으로 확인함으로써 치매의 예방 및 치료 물질로 개발될 수 있음을 증명하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알을 유효성분으로 포함하는 치매의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알을 유효성분으로 포함하는 치매의 개선용 기능성 식품 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 의하면, 본 발명은 (a) 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 치매의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 의하면, 본 발명은 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알을 유효성분으로 포함하는 치매의 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 치매 치료용 활성성분을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 티로신-프럭토오스 메일라드 반응(Maillard reaction) 생성물인 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알이 성상세포(astrocyte)에서 염증반응과 아밀로이드의 생성을 억제한다는 것을 확인함으로써 치매의 예방 및 치료 물질로 개발될 수 있음을 증명하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 유효성분인 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 티로신-프럭토오스 메일라드 반응(Maillard reaction) 생성물이다.

하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알 화합물은 배양된 성상세포(astrocyte)에서 APP(amyloid precursor protein), BACE(β-site APP claevage enzyme), C99 단백질의 발현을 억제하고, β-세크리타아제(secretase)의 활성을 감소시키며, Aβ_1-42의 분비를 억제함으로써 결과적으로 β 아밀로이드의 생성을 억제하는 활성을 갖는다.

따라서, 본 발명은 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 치매 치료, 예방 또는 개선제로서의 새로운 용도를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "치매" 는 기억, 언어, 판단력 등의 여러 영역 걸쳐 후천적으로 인지 기능이 퇴화하는 뇌신경퇴행성 질환을 의미한다. 본 발명의 치매는 바람직하게는 알츠하이머병에 의한 치매, 즉, 노인성 치매이다.

본 발명은 (a) 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 치매의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 "예방" 은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 (ⅰ) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (ⅱ) 질환 또는 질병의 경감; 및 (ⅲ) 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다양한 방법으로 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분인 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요 기간, 질환의 위중도 등을 고려하여 결정하며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알을 유효성분으로 포함하는 치매의 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알 화합물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.

본 발명은 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알을 유효성분으로 포함하는 치매의 치료, 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 유효성분 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알은 뇌신경세포인 성상세포에서 염증반응을 억제하며 아밀로이드베타의 생성을 억제하므로, 치매, 특히 알츠하이머병에 의한 치매의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 화학구조식이다.
도 2는 성상세포의 생존능에 미치는 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 효과에 관한 것이다. 세포 생존능은 실시예에 기재된 방법에 따라 WST-8 분석을 사용하여 평가하였다. 세포는 LPS의 부존재하에 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알(1-10μM)과 함께 72시간 동안 배양하고(패널 A), 또는 LPS(1μg/㎖)의 존재하에 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알(10 μM)과 함께 배양하였다(패널 B). 결과는 비처리 대조군에 대해 백분율로 나타내었다. 이 데이터는 3회 중복 행한 3개의 독립적 실험의 평균±S.E.으로 표시하였다.
도 3은 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알이, LPS에 의해 유도된 ROS 및 NO 방출과, 성상세포에서의 사이토카인 발현에 미치는 영향을 보여준다. 세포는 1 μg/㎖의 LPS 단독 또는 LPS + 상이한 농도(1, 2, 5 μM)의 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알을 37℃에서 24시간 동안 처리하였다. 세포내 ROS의 수준은 DCF 형광을 측정하여 평가하였다(패널 A). NO 수준은 성상세포의 상등액내에서 Griess 반응을 통해 측정하였다(패널 B). TNF-α 및 IL-1β의 mRNA 수준은 실시간 PCR 방법으로 측정하였다(패널 C). 측정값들은 3회 중복 행한 3개의 독립적 실험의 평균±SD으로 표시하였다. *은 LPS 처리군과 비교하여 통계학적 유의성을 갖는 값이다(P < 0.05).
도 4는 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알이, 성상세포에서 NF-κB DNA 결합 활성, NF-κB 의존성 루시퍼라아제 활성 및 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현에 미치는 영향을 측정한 결과이다. 세포는 1 μg/㎖의 LPS 단독 또는 LPS + 상이한 농도(1, 5, 10 μM)의 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알로 37℃에서 24시간 동안 처리하였다. 총 단백질 동량(40 μg/레인)을 10％ SDS-PAGE를 행하고, iNOS 및 COX-2의 발현은 특이 항체를 사용한 웨스턴 블로팅으로 평가하였다. β-액틴 단백질은 내부 대조군으로서 사용하였다. 도면에 나타난 결과와 유사한 결과가 3번의 반복실험에서도 재현되었다(패널 A). 성상세포를 p-NF-κB-Luc 플라스미드(5x NF-κB)으로 트랜스펙션시키고, LPS (1μg/㎖) 단독 또는 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알과 함께 37℃에서 8시간 동안 처리하였다. 이어서 실시예 실험방법에 기재된 바와 같이 루시퍼라아제 활성을 측정하였다(패널 B). 세포는 1μg/㎖의 LPS 단독 또는 LPS + 상이한 농도(1, 5, 10 μM)의 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알로 37℃에서 24 시간 동안 처리하였다. NF-κB의 활성은 EMSA를 사용하여 측정하였다. 성상세포로부터 얻은 핵 추출물을 LPS(1μg/㎖) 단독 또는 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알(1, 5, 10 μM)와 함께, NF-κB에 특이적인 ³²P 말단 표지된 올리고뉴클레오타이드하에서 DNA 결합 반응을 시켰다. 화살표로 표시한 부위가 NF-κB 복합체의 특이적 DNA 결합이 있는 부위이다. 도면에 나타난 결과와 유사한 결과가 3번의 반복실험에서도 재현되었다(패널 C). 동량(40μg의 총단백질에 대해 10％ SDS-PAGE를 행하였다. p50 및 p65의 핵안으로의 이동 및 IκB의 분해는 특이 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅으로 측정하였다. β-액틴 단백질은 내부 표준으로 사용하였다(패널 D). 측정값들은 3회 중복하여 행한 3개의 독립적 실험의 평균ㅁS.E.으로 표시하였고, 각 루시퍼라제 활성은 단백질양으로 보정하였다. *은 LPS 처리군과 비교하여 통계학적 유의성을 갖는 값이다(P < 0.05).
도 5는 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알이, BACE1, C99 및 Aβ의 발현, 세크리타아제 활성, Aβ_1-42 수준에 미치는 영향을 보여준다. BACE1, Aβ_1-42, C99의 발현은 특이 항체를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 평가하였다. 각 블롯은 3회 실험의 대표이다. β-액틴 단백질은 내부 대조군으로 사용하였다(패널 A). *P <0.05는 LPS 처리군과 비교하여 유의성 있는 차이를 지시한다. 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알과 LPS를 24시간 동안 공동처리하였다. 배지를 회수하여 ELISA에 의해 Aβ_1-42 분비양을 측정하였다 (패널 B). 측정값들은 3회 반복된 3개의 독립 실험의 평균±S.E.를 대푯값이다. β-세크리타아제 및 γ-세크리타아제의 활성은 상업적으로 구입가능한 분석 키트를 사용하여 측정하였다(패널 C). 측정값들은 3회 반복된 3개의 독립 실험의 평균±S.E.를 대푯값이다. *는 LPS 처리군과 비교하여 통계학적 유의성을 갖는 값이다(P < 0.05).
도 6은 GFAP 및 Aβ_1-42의 발현을 이중 형광에 의해 관찰한 결과이다. 실시예 실험방법에 기재된 바와 같이 공초점 현미경으로 관찰하였다. 배양된 성상세포는 항-GFAP 및 항-Aβ_1-42 1차 항체와 함께, 이어서 Alexa 568-컨쥬게이트된 항-래빗 및 Alexa 488-컨쥬게이트된 항-마우스 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. GFAP(붉은색) 및 Aβ_1-42(녹색) 항체로 이중 표지된 성상세포의 이미지는 형광 항체 염색을 각각 분리 혹은 겹쳐서 나타내었다.
도 7은 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알이, 배양된 성상세포에서 STAT3 활성화에 미치는 영향을 보여준다. 세포는 1μg/㎖의 LPS 단독 또는 LPS + 상이한 농도(1, 5, 10 μM)의 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알로 37℃에서 24시간 동안 처리하였다. 총 단백질 동량(40μg/레인)을 10％ SDS-PAGE를 행하고, STAT3의 활성화(인산화)는 특이 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해 검출하였다(패널 A). STAT3 경로를 차단하기 위해, 세포를 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알로 처리하기 전에 STAT3 억제자 AS640(50μM)으로 또는 STAT3의 siRNA(50 nM)으로 1시간 동안 처리하였다. 패널 B는 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알이, NF-κB DNA 결합 활성에 미치는 영향이며, 패널 C는 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알이 Aβ_1-42의 수준에 미치는 영향을 보여준다. Aβ_1-42의 수준을 측정하기 위해, 세포들을 1μg/㎖의 LPS 단독 또는 LPS + 상이한 농도(1, 5, 10 μM)의 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알로 37℃에서 24시간 동안 처리하였다. 측정값들은 3회 중복하여 행한 3개의 독립적 실험의 평균±S.E.으로 표시하였다. *은 LPS 처리군과 비교하여 통계학적 유의성을 갖는 값이다(P < 0.05).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

1. 화합물 및 시약

LPS는 Sigma Aldrich (St Louis, MO)으로부터 구입하였다. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), FBS(fetal bovine serum), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)은 Invitrogen (Carlsbad, CA)으로부터 구입하였다. 비-타겟팅 대조군 siRNA는 Bioneer (Daejeon, Korea)로부터 구입하였고, STAT3에 대한 siRNA는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)으로부터 구입하였다. AG490은 JAK2-특이적 억제자로서 STAT3 인산화를 특이적으로 억제한다. 상기 시약(Sigma Aldrich)을 DMSO (Sigma Aldrich)에 용해시켜 50 mM의 스톡 용액으로 제조하고, 사용하기 전에 통상의 배양배지를 사용하여 최종 50 mM의 농도로 희석한 후에 사용하였다. 2, 4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 특성 확인은 선행문헌에 기재된 바에 따라 행하였다[30]. 이 화합물의 구조는 도 1에 나타내었다. 2, 4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알을 0.01％ DMSO에 녹이고, 배양된 세포에 대해 2.5, 5, 10 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다.

2. 성성세포(astrocyte) 배양

2일령의 랫트 새끼를 얼음 마취시키고 희생시켰다. 피부를 절개한 후에, 두개골을 꺼내어 뇌를 두개골로부터 들어내었다. PBS로 세척한 후에, 뇌를 쇠뇌 및 뇌 줄기로부터 분리하고, 각각의 뇌 반구를 겸자의 날카로운 끝을 사용하여 중앙의 길게 갈라진 틈을 따라 약하게 터치하여 분리하였다. 뇌척수막을 개개의 피질엽으로부터 벗기고, 대뇌피질을 F12 영양성분 혼합물(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 함유한 DMEM과 세포 여과기(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용한 기계적 분해 방법을 사용하여 분리하였다. 얻어진 세포들을 1,500 rpm에서 5 분간 원심분리하고 혈청-보충된 배양 배지내에서 재현탁한 후, 100 mm 디쉬에 플레이팅하였다. 혈청-보충된 배양 배지는 F12, FBS (5％), NaHCO₃ (40 mM), 페니실린(100 units/ml), 및 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖)으로 구성하였다. 세포들을 배양배지를 사용하여 습화된 인큐베이터에서 37℃, 5％ CO2 조건하에서 9일간 배양하였다. 컨플루언스에 도달하였을 때(9일 배양), 플라스크를 37℃에서 16 - 18 시간 동안 진탕시키고, 배양물을 시토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside)로 48 시간 동안 처리하고, 배지를 10％ FBS가 포함된 DMEM/F12HAM으로 교체하였다. 세포단일층을 1.25％ 트립신-EDTA으로 짧은 기간 동안 처리한 후에, 세포들을 분리하여 코팅하지 않은 글라스 커버슬립상에 플레이팅하였다. 성상세포 배양물은 GFAP-포지티브 세포를 형성하였다. 성상세포 배양물의 순도는 GFAP-면역염색에 의해 평가하였다. 본 실험의 조건하에서는, 세포의 95％ 이상이 성상세포일 것으로 가정할 수 있었다. 배양된 세포들을 2, 4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 존재 또는 부존재하에서, LPS으로 24 시간 동안 처리하여 웨스턴 블로팅 및 Aβ 수준 및 세크리타아제 활성을 측정하였으며, LPS으로 1 시간 처리하여 NF-κB DNA 활성 및 단백질의 상대 발현 측정을 하였으며, LPS으로 8 시간 처리하여 NF-κB 루시퍼라아제 활성 분석을 행하였다.

3. 세포생존능 분석

2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 세포독성은 WST-8 분석(Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan)을 사용하여 측정하였다. WST-8 [2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨, 모노소디엄염]은 디하이드로게나아제에 의해 환원되어 배양배지내에서 노란색 가용성 산물(포르마잔)을 생성한다. 생성된 포르마잔의 양은 살아있는 세포의 수와 직접적으로 비례한다. 간략히 설명하면, 웰당 1X10⁴ 세포를 96-웰 플레이트안으로 플레이팅하고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 배지를 새로 교환하였다. 이어서, 세포들을 다양한 농도의 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 존재 또는 부존재하에서 LPS(1 μg/ml) 와 함께 또는 LPS (1 μg /ml) 없이 추가적으로 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 10 μl의 WST-8 용액을 웰에 첨가하고, 1 시간 동안 다시 연속하여 배양하였다. 최종 색깔을 마이크로플레이트 흡광도 리더(SunriseTM, TECAN, Switzerland)을 사용하여 450nm에서 측정하였다.

4. 아질산염(nitrite) 분석

세포들을 96-웰 플레이트에 배양하고 다양한 농도의 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 존재 또는 부존재하에서 LPS(1 μg/ml) 와 함께 또는 LPS (1 μg /ml) 없이 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 상등액에 방출된 아질산염(nitrite)는 Griess 반응[32]에 의해 측정하였다. 각 50 μl의 배양된 상등액을 동일부피의 Griess 시약[0.1％ N-(1-나프틸)-에틸렌디아민, 5％ 인산내의 1％ 술파닐아미드]와 혼합한 후에 상온에서 10분간 인큐베이션하였다. 540 nm에서의 흡광도는 마이크로플레이트 흡광도 리더기내에서 측정하고, 알고 있는 농도의 아질산나트륨을 표준물질로 사용하였다.

5. ROS의 측정

ROS의 생성은 산화-민감성 형광 프로브인 2,7-디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA, Sigma Aldrich)에 의해 평가하였다. 세포내 H₂O₂ 또는 저분자량 과산화물은 2,7-디클로로플루오레세인 디아세테이트를 형광도가 높은 화합물인 디클로로플루오레세인(DCF)으로 산화시킬 수 있다. 성상세포를 6 웰 플레이트(5 X 10⁴)에 플레이팅하고, 서브컨플루언트 세포들을 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알(2.5 - 10 μg/mL)으로 30분간 처리하였다. 세포들을 트립신처리한 후에, 1 X 10⁴ 세포들을 검은색 96 웰 플레이트에 플레이팅하고, 10 μM의 DCFH-DA와 함께 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. DCF의 형광강도는 485nm의 여기 파장 및 538 nm의 방출파장하에서 마이크로플레이트-리더내에서 측정하였다.

6. PGE ₂ 의 측정

세포 배지 샘플내의 PGE₂을 제조자의 지시서에 따라 R&D Systems (Minneapolis, MN)으로부터 구입한 키트를 사용하여 분석하였다.

7. 웨스턴 블롯 분석

세포들을 단백질 추출용액(PRO-PREPTM, Intron Biotechnology, Korea)을 사용하여 균질화시키고 얼음상에서 40 분간 용해시켰다. 용해물들을 15,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 동일한 양의 단백질(40 μg)을 SDS/10％ 폴리아크릴아미드젤상에서 분리하고, PVDF 막(GE Water & Process technologies, Trevose, PA)으로 이전시켰다. 블롯은 TBST[Tris-Buffered Saline Tween-20: 10 mM Tris (pH 8.0)과, 0.05％ Tween-20을 포함하는 150 mM NaCl 용액]내의 5％(w/v) 비-지방 건조우유를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. TBST내에서 세척한 후에, 막을 특정 항체와 함께 상온에서 인큐베이션하였다. iNOS 및 COX-2에 대한 래빗 폴리클로날 항체(1:1,000 희석)(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), APP에 대한 래빗 폴리클로날 항체 (1:500 희석, ABR, Golden, CO, USA), BACE1에 대한 래빗 폴리클로날 항체 (1:500 희석, St. Louis, MO, USA), C99에 대한 래빗 폴리클로날 항체 (1:500 희석, St. Louis, MO, USA), p65과 IκB에 대한 래빗 폴리클로날 항체(1:500), 및 p50에 대한 마우스 모노클로날 항체(1:500)(Santa Cruz Biotechnology Inc. Santa Cruz, CA)를 사용하였다. 이이서, 블롯을 대응하는 컨쥬게이트된 항-래빗 또는 마우스 IgG-호오스래디쉬 퍼옥시다아제(Santa Cruz Biotechnology Inc. Santa Cruz, CA)와 함께 인큐베이션하였다. 면역반응성 단백질들을 ECL 웨스턴 블로팅 검출 시스템으로 검출하였다.

8. EMSA (Gel electromobility shift assay)

젤 시프트(gel shift) 분석은 제조자의 지시서에 따라 수행하였다(Promega, Madison, WI). 5 X 10⁶ 세포를 1X PBS으로 2회 세척하고, 1 ㎖의 PBS를 첨가하고 세포들을 긁어모아 차갑게 냉각시킨 에펜도르프 튜브안으로 회수하였다. 세포들을 13,000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 침전시키고, 상등액은 제거하였다. 세포들을 400 μl의 용액 A (10 mM HEPES, pH 7.9, 1.5 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 0.5 mM 디티오트레이톨, 0.2 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드)내에서 재현탁한 후, 강하게 볼텍싱하여, 얼음상에서 10분간 인큐베이션하고, 12,000 rpm에서 6 분간 원심분리하였다. 침전된 펠릿에 용액 C (용액 A + 420 mM KCl, 20％ 글리세롤)를 첨가하여 재현탁시키고, 20분간 얼음상에서 인큐베이션하였다. 세포들을 15,000rpm에서 15분간 원심분리하고, 생성된 핵 추출 상등액을 냉각시킨 에펜도르프 튜브로 회수하였다. 컨센서스(consensus) 올리고뉴클레오타이드는 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제 및 (γ-³²P) ATP를 사용하여 37℃에서 10 분간 말단 표지하였다. 젤 시프트 반응을 행하고 상온에서 10분간 인큐베이션한 후에, ³²P-표지한 올리고뉴클레오타이드 1 μl (50,000 내지 200,000 cpm)를 첨가하고, 상온에서 20분간 인큐베이션하였다. 이어서, 1 μl의 젤 로딩 완충액을 각 반응에 첨가하고, 6％ 비-변성 젤상에 로딩하고, 염색물질의 4/5가 젤 밖으로 빠져나올 때 까지 전기영동을 행하였다. 젤을 80℃에서 1시간 동안 건조시킨 후 -70℃에서 필름에 하룻밤 동안 노출시켰다.

9. NF-κB 루시퍼라아제의 트랜스펙션 및 이의 활성 측정

성상세포를 24-웰 플레이트당 1 X 10⁵ 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 24시간 배양하여 90％의 포화(confluency)에 도달한 후에, 제조자의 지시에 따라 플라스미드 및 lipofectAMINE PLUS in OPTI-MEN의 혼합물을 사용하여(Invitrogen, Carlsbad, CA), pNF-κB-Luc 플라스미드 (5 x NF-κB; Stratagene, CA)로 세포를 트랜스펙션시켰다. 루시퍼라아제 활성을 제조자의 지시서에 따라 루시퍼라아제 분석 키트(Promega)를 사용하여 측정하였다(WinGlow, Bad Wildbad, Germany).

10. 정량적 실시간 PCR

mRNA 정량분석을 위해, 총 RNA를 RNAqueous 키트를 사용하여 추출하고, High Capacity RNA-to-cDNA 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 1 μg의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 정량 실시간 PCR은 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) 내에서 GAPDH(Mm99999915_g1), IL-6(Mm00446190_m1), TNF-α (Mm00443258_m1), IL-1β(Mm00434228_m1)에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 수행하였다. 열사이클은 95℃에서 20초 후에, 95℃에서 30초 및 60℃에서 30초를 60사이클 수행하였다. 타겟 유전자에 대해 얻은 값을 GAPDH에 의한 값으로 평준화(normalize)하였고, 대조군 샘플에서의 발현과 비교하여 정량하였다. 상대적 정량을 계산하기 위해, 2-ΔΔCT 공식을 사용하였다: 이 공식에서 -ΔΔCT = (CT, 타겟-CT, GAPDH) 실험 샘플 - (CT, 타겟-CT, GAPDH) 대조군 샘플.

11. β- 및 γ- 세크리타아제 활성 분석

웨스턴 블로팅에서와 동일한 방법에 의해 준비한 시료에서 β- 및 γ-세크리타아제의 총활성은 상업적으로 시판되는 β-세크리타아제 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer)(BACE 1 FRET) 분석 키트 (PANVERA, Madison, USA)와 γ-세크리타아제 활성도 키트 (R&D systems, Wiesbaden, Germany)를 각각 사용하여 제조자의 지시서에 따라 측정하였다.

각각의 세포를 최종 단백질 농도가 1 mg/㎖이 되도록 차갑게 냉각시킨 1X 세포 추출 완충액내에서 용해시켰다. β-세크리타아제의 활성을 측정하기 위해, 10 ㎕의 용해물을 10 ㎕의 BACE1 기질(Rh-EVNLDAEFK-Quencher)과 혼합하고, 반응혼합물을 블랙 96-마이크로웰 플레이트에서 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응은 10㎕의 BACE1 정지 완충액(2.5 M 소디엄아세테이트)를 첨가하여 정지시켰다. 형광은 Felix 소프트웨어(BMG Labtechnologies, Offenburg, Germany)가 장착된 Fluostar galaxy fluorometer (545 nm에서 여기 및 590 nm에서 방출)를 사용하여 측정하였다. 효소활성은 형광증가와 선형적으로 상관관계에 있었고, 형광 단위로 표현하였다. 모든 대조군, 블랭크 및 샘플들은 3회 반복 수행하였다. γ-세크리타아제 활성을 측정하기 위해, 50 ㎕의 용해물을 50 ㎕의 반응완충액과 혼합하였다. 혼합물에 5 ㎕의 기질을 첨가한 후에, 37℃ 암실에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 리포토 분자 EDANS 및 DABCYL에 컨쥬게이트된 기질은 γ-세크리타아제에 의해 절단되어 형광시그널을 방출한다. 방출된 형광은 Felix 소프트웨어(BMG Labtechnologies, Offenburg, Germany)가 장착된 Fluostar galaxy fluorometer (355 nm에서 여기 및 510 nm에서 방출)를 사용하여 측정하였다. γ-세크리타아제 효소 활성의 수준은 증가된 형광의 세기와 비례하였으며, γ-세크리타아제 활성은 형광 단위로 표현하였다.

12. 형광 현미경

고정된 세포를 다음의 1차 항체, GFAP 및 Aβ_1-42에 대한 항체(블로킹 혈청내에서 1:100 희석; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)에 대해 상온에서 1 시간 동안 노출시켰다. 인큐베이션 후에, 세포들을 얼음으로 냉각시킨 PBS으로 세척하고, Alexa Fluor 488 또는 568와 컨쥬게이트된 항-래빗 또는 마우스 2차 항체(Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad, CA)와 함께 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 면역형광 이미지는 도립 형광현미경 Zeiss Axiovert 200 M (Carl Zeiss, Thornwood, NY)를 사용하여 얻었다.

13. Aβ 수준의 측정

단백질 분해 효소 억제자 4-(2-아미노에틸)-벤젠 술포닐 플루오라이드를 포함하는 단백질 추출 완충액을 사용하여 세포 용해물(웨스턴 블로팅에서 사용한 것과 동일한 것임)을 준비하였다. Aβ_1-42 수준은 특이적 ELISA(IBL, Immuno-Biological Co., Ltd., Japan)를 사용하여 측정하였다. 100 ㎕의 샘플을 미리 코팅한 플레이트에 첨가하고 4℃에서 밤샘 인큐베이션하였다. 미리 코팅한 플레이트의 각 웰을 세척 완충액으로 세척한 후에, 100 ㎕의 표지한 항체 용액을 가하고, 혼합물을 암조건하에서 4 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후에, 색원체(chromogen)을 가하고, 혼합물을 암조건하에서 상온에서 30 분간 인큐베이션하였다. 최종적으로, 정지 용액을 첨가한 후에 형성된 색깔을 마이크로플레이트 흡광도 리더(SunriseTM, TECAN, Switzerland)를 사용하여 450 nm에서 분석하였다.

14. 통계학적 평가

3 개의 독립적 실험을 3회 수행하여 평균ㅁS.E.으로 데이터를 표시하였다. 통계학적 분석은 일원 ANOVA 분석과 post hoc 비교로서 Dunnett 테스트를 수행하여 행하였다. P<0.05인 것을 통계학적 유의성을 갖는 것으로 간주 하였다.

실험결과

1. 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알은 성상세포에서 세포 생존능에 영향을 미치지 않았다

성상세포를 LPS의 부존재하에 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알과 함께 인큐베이션하였다. 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알은 낮은 농도(1, 5μM)에서는 세포의 생존능을 약간 증가시켰으며, 가장 높은 농도(10 μM)에서는 세포의 생존능을 약간 감소(< 20％)시켰다(도 2의 패널 A 참조). 성상세포를 LPS의 존재하에 2, 4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알과 함께 인큐베이션한 경우, 10 μM의 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알에 의해 세포 생존능이 약간 감소되었다(< 20％). 따라서, 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알에 의한 염증성 매개자에 대한 억제효과는 세포독성 효과와 관련되지 않았다(도 2의 패널 B 참조).

2. 성상세포에서 LPS에 의해 유도된 ROS, NO, TNF-α 및 IL-1β 생성에 대한 2,4- 비스 (p- 히드록시페닐 )-2- 부텐알의 영향

LPS-유도된 성상세포의 활성화에 대한 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 보호적 효과를 조사하기 위해, 배양한 성상세포를 LPS의 존재(1 μg/ml)하에서 2, 4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알로 처리하거나 또는 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알 없이 처리하였다. ROS 및 NO의 방출을 산화적스트레스 및 성상세포의 활성화 지표로서 측정하였고, TNF-α 및 IL-1β의 방출은 성상세포 활성화 지표로서 측정하였다. 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알 처리에 의해 LPS(1μg/ml)-유도 ROS 및 NO 생성이 감소한다는 것을 확인하였다(도 3의 패널 A 및 B 참조). 배양된 성상세포내에서의 TNF-α 및 IL-1β의 방출은 농도 의존적 방식으로 감소하였다(도 3의 패널 C 참조). 이와 같은 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알(5 μM)의 억제 효과는 공지된 항염증 화합물 인도메타신(2 μM)의 효과에 비슷한 정도의 효과이었다.

3. 성상세포에서 LPS-유도 iNOS 및 COX-2 발현에 대한 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2- 부텐알의 영향

대응하는 유전자 발현의 억제를 통한 성상세포 활성화 및 NO 생성에 미치는 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 억제 효과를 조사하기 위해, iNOS가 COX-2에 의해 조절될 수 있기 때문에 iNOS와 COX-2의 발현을 웨스턴 블로팅 분석을 통해 측정하였다. 세포들은 비자극 조건하에서 iNOS 및 COX-2 단백질 발현수준이 극도로 낮은 수준을 보였다. 그러나, iNOS 및 COX-2 단백질 발현은 24 시간 후에 LPS(1 μg/㎖)에 반응하여 현저하게 증가하였다. 성상세포 활성화 억제와 일치하게, 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알(1, 5, 10 μM)의 처리에 의해 성상세포에서 LPS 유도 iNOS 발현이 농도 의존적 방식으로 감소하였다(도 3의 패널 D 참조). 이러한 결과는 NO 생성에 미치는 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 억제 효과의 프로파일과 일치한다. 또한, 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알은 LPS-유도된 COX-2 발현에 대해서도 유사한 억제적 효과를 나타내었다(도 4의 패널 A).

4. 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알이 NF-κB DNA 결합 및 루시퍼라아제 활성에 미치는 영향

NF-κB는 염증과정의 발병에 기여하는 iNOS 및 COX-2의 발현을 조절한다. 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알이 LPS 유도 NF-κB 매개된 프로모터의 활성을 약화시킬 수 있는지를 조사하기 위해, 5개의 κB 시스-작용 요소의 조절하에 발현되는 루시퍼라아제 리포터 유전자를 사용하였다. 성상세포는 Invitrogen회사의 지시서에 따라 NF-κB 의존성 루시퍼라아제 발현 구조의 플라스미드를 일시적으로 트랜스펙션시키고, 세포를 8시간 동안 LPS(1 μg/㎖)로 처리하거나, LPS 및 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알로 공동 처리하였다. 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알로 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 루시퍼라아제 활성이 농도 의존적 방식으로 억제되었다(도 4의 패널 B 참조). 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알이 NF-κB DNA 결합 활성도 억제하는지를 조사하기 위해, 성상세포를 LPS 및 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알으로 60분간 공동으로 처리하였다. 상기 60분은 LPS 처리에 의해 NF-κB가 최고로 활성화되는 시간이다. 공동으로 처리된 세포로부터 핵 추출물을 제조하고, EMSA에 의해 NF-κB DNA 결합을 분석하였다. LPS는 강한 NF-κB 결합활성을 유도하였으나, 이러한 결합활성은 배양된 성상세포에서 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 공동처리에 의해 억제되었다(도 4의 패널 C 참조). LPS-유도 NF-κB에 대한 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 억제 작용의 메카니즘을 규명하기 위해, IκBα 뿐만 아니라 p50 및 p65의 핵 이동을 측정하였다. 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알은 성상세포에서 LPS에 의해 증가되는 p50 및 p65의 핵 이동을 농도 의존적 방식으로 차단하였다. 또한, 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알은 LPS-유도된 IκBα의 분해를 억제하였다(도 4의 패널 D 참조). 이러한 결과들은 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알이 p50 및 p65의 핵 내부로의 이동과 IκBα의 분해를 억제함으로써 LPS-유도된 NF-κB의 활성화를 억제한다는 것을 지시한다. NF-κB 활성 및 iNOS 및 COX-2 발현에 대한 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 이러한 억제 효과는 인도메타신(2 μM)의 효과와 유사한 수준이었다.

5. 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알은 아밀로이드 생성을 억제한다.

신경-염증이 아밀로이드 생성을 촉진할 수 있고, 소신경교세포(microglia) 및 성상세포가 신경-염증의 주요한 원천이기 때문에, 인 비트로에서 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알이 아밀로이드생성에 미치는 염증에 대한 영향을 조사하였다. 성상세포는 이들이 기능하는 환경에 대해 조절기능을 하면서 신경세포를 기계적으로 뿐만 아니라 대사적으로도 지지하고 있다. 신경-염증과 아밀로이드 생성과의 사이의 연관관계를 측정하기 위해, 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 항염증 효과에 의해 아밀로이드 생성 억제 효과도 나타나는지를 조사하였다. 도 5의 패널 A에서 나타나는 바와 같이, 세포는 자극을 받지 않은 조건하에서 APP, BACE(β-site APP cleavage enzyme) 및 C99 단백질은 낮은 수준으로 발현하였다. 반면에, BACE 및 C99 단백질의 발현은 LPS(1 μg/㎖)에 대한 반응 후 24 시간에서 증가하였다. 또한, 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알은 LPS-유도된 성상세포에서 배양배지로의 Aβ_1-42 의 분비를 감소시켰다(도 5의 패널 B 참조). 이들 단백질들의 발현 결과와 일치하게, Aβ 생성에서 율속효소인 β-세크리타아제의 활성화도 LPS에 의해 증가되었고, 이러한 LPS에 의한 증가는 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알에 의해 농도 의존적 방식으로 억제되었다(도 5의 패널 C 참조). 성상세포의 활성화는 β-세크리타아제의 활성화에 관련되어 있다. 따라서, 성상세포(GFAP 반응성 세포)의 활성화 및 Aβ 축적(Aβ_1-42 반응성 세포)이 LPS에 의해 동시적으로 증가하는 지를 조사하였고, 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알이 성상세포의 활성화를 감소시켜 결과적으로 Aβ-수준을 감소시키는지도 조사하였다. 이에 대해 보다 명확하게 확인하기 위해, 웨스턴 블로팅에 의해 검출되는 GFAP 및 Aβ_1-42에 대한 면역반응성 세포들의 공동국재화(colocalization)을 이중면역형광에 의해 측정하였다. 이러한 2가지 반응성 마커 세포들의 수는 LPS에 의해 증가하였으나, 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알을 처리한 결과 감소되었다(도 6 참조). 이 결과는 아밀로이드생성 경로가 신경-염증 자극에 의해 촉진될 수 있고, 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 항염증 활성에 의해 아밀로이드 생성이 억제되는 효과가 나타난다는 것을 제시하고 있다.

6. 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 STAT3 활성에 대한 영향

STAT3은 NF-κB와 공동작용하고, 유전자의 발현을 조절하여 염증 과정 뿐만 아니라 아밀로이드의 생성에도 기여한다. 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알이 LPS에 의해 유도되는 STAT3 활성화를 차단할 수 있는지를 조사하기 위해, 성상세포를 24시간 동안 LPS(1 μg/㎖)로 처리하거나 또는 LPS 및 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알로 공동처리하였다. 성상세포에서 LPS는 STAT3를 강하게 활성화(인산화)시켰으나, 이러한 STAT3의 활성화는 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알을 공동 처리하면 농도 의존적 방식으로 억제되었다(도 7의 패널 A 참조).

7. LPS 유도 신경염증 및 아밀로이드 생성에 대한 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 억제 활성에 STAT3 경로의 관련

STAT3 및 NF-κB에 의해 신경염증 및 아밀로이드 생성을 조절하는 메카니즘을 추가적으로 조사하기 위해, LPS에 의해 활성화된 성상세포에서 STAT3의 siRNA 및 약리학적 억제자를 사용하여, 신경염증 및 아밀로이드생성에서 STAT3 경로의 관련성을 조사하였다. 성상세포에서 LPS에 의해 유도되는 Aβ 생성 및 NF-κB 활성은 siRNA 및 STAT-3 특이적 억제 약물 AS490 (50 μM)에 의한 STAT3 발현의 하향조절에 의해 감소되었다(도 7의 패널 B 및 C 참조). 이러한 결과는 성상세포에서 STAT3가 신경염증 뿐만 아니라 염증에 의해 유도되는 Aβ생성에도 관여한다는 것을 암시한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (4)

1. (a) 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 치매의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 치매는 알츠하이머병 치매인 것을 특징으로 하는 치매의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
3. 2,4-비스(p-히드록시페닐)-2-부텐알을 유효성분으로 포함하는 치매의 개선용 기능성 식품 조성물.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 치매는 알츠하이머병 치매인 것을 특징으로 하는 치매의 개선용 기능성 식품 조성물.

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