KR101244764B1 - 척수 내 프리모관의 가시화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 척수 내에 존재하는 프리모관의 가시화 방법에 관한 것으로, 척수 내 프리모관의 가시화 방법은 척수 내에 시료를 주입하여 척수 내에 존재하는 프리모관을 염색하는 시료주입 단계; 를 포함하며, 그로 인해 척수 내에 존재하는 프리모관을 효과적으로 가시화하는 기술을 제공한다.
본 발명에 따른 척수 내 프리모관 가시화 방법은 시료 주입 과정 중에 발생할 수 있는 뇌의 손상을 방지하는 효과가 있으며, 실험과정이 종래의 방법보다 신속하고 간편하다.
또한, 척추관 주사를 통해 시료가 척수에 직접 주입되므로 척수 내에 존재하는 프리모관을 신속하게 염색하여 가시화할 수 있다는 장점이 있다.
아울러, 소량의 시료만으로도 척수 내에 존재하는 프리모관을 염색할 수 있다는 경제적인 효과가 있다.

Description

척수 내 프리모관의 가시화 방법{METHOD FOR VISUALIZATION OF PRIMO VASCULAR SYSTEM IN THE SPINAL CORD}

본 발명은 척수 내에 존재하는 프리모관의 가시화 방법에 관한 것이다.

1960년대 초에 평양의대의 김봉한 박사는 기존의 혈관, 림프관 및 신경계와 구별되는 새로운 순환계를 발견하였으며, 그 일부분이 혈관 안에 실 같은 구조물로 존재한다는 연구결과를 발표하였다.

김봉한 박사의 연구결과 발표 이후, 국내에서도 김봉한 박사의 연구를 재현하기 위하여 제3의 순환계인 프리모관(Primo vessel)에 대한 많은 연구가 진행되고 있다.

그 결과, 다양한 염료 및 실험방법을 통해 심혈관, 장기(臟器) 표면 및 림프관 내에 프리모관이 존재한다는 사실이 밝혀졌다. 또한, 그에 대한 후속연구로서, 신경조직 내에 존재하는 신경계 프리모관(Nerve primo vessel)을 가시화하기 위한 많은 연구가 수행되고 있다.

척수 내에 존재하는 신경계 프리모관을 발견하기 위해서, 종래에는 뇌실(Brain ventricle)에 염료를 주입하여 신경계 프리모관을 가시화하였다. 하지만, 종래의 실험방법은 뇌의 내부 공간에 존재하는 뇌실에 염료를 주입하기 위해 두개골을 천공(Craniotomy)하는 과정이 불가피했으며, 그 과정에서 뇌가 손상될 가능성이 존재했다.

또한, 염료를 주입하는 과정 중에 뇌의 다른 부위를 손상시키거나 그 밖의 우발상황이 발생할 우려가 있으므로 실험과정간 실험자의 많은 주의를 요했다.

한편, 뇌실에 특정염료를 주입하던 종래 기술은 뇌실과 인접한 신경계 프리모관을 신속하게 가시화하는 반면에, 뇌실에서부터 척수까지 염료가 도달하는데 일정 시간 이상 소요된다는 문제점이 있다. 따라서, 척수 내에 존재하는 프리모관은 뇌실 근처의 프리모관에 비해 상대적으로 오랜 시간이 경과된 후에 관찰할 수 있다는 단점이 있다.

아울러, 종래 기술은 척수 내의 프리모관을 염색하기 위해서 다량의 염료를 뇌실에 주입해야만 했고, 그 과정에서 필요 이상의 염료가 소모된다는 문제점이 있다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 척수 내에 존재하는 프리모관을 효과적으로 가시화하는 기술을 제공하는데 그 목적이 있다.

이러한 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 태양으로 척수 내 프리모관의 가시화 방법은 척수 내에 시료를 주입하여 척수 내에 존재하는 프리모관을 염색하는 시료주입 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 시료주입 단계는 척추관 주사(Intrathecal injection)를 통해 상기 척수 내에 상기 시료가 주입되는 것을 특징으로 한다.

상기 시료는 트립판 블루(Trypan blue)를 포함하는 것을 특징으로 한다.

척수 내 프리모관의 가시화 방법은 상기 시료주입 단계에서 척수 내로 시료 주입이 완료된 후에 척추궁절제술(Laminectomy)이 실시되는 척추궁절제 단계; 를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

한편, 척수 내 프리모관의 가시화 방법은 상기 척추궁절제 단계에서 척추궁절제술이 실시된 척수를 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 염색하는 염색 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명에 의하면, 척추관 주사를 통해 척수 내로 시료가 주입됨으로써 척수 내에 존재하는 프리모관이 염색되므로 뇌실에 직접 시료를 주입할 필요가 없다.

즉, 본 발명에 따른 척수 내 프리모관의 가시화 방법은 시료 주입 과정 중에 발생할 수 있는 뇌의 손상을 방지하는 효과가 있으며, 실험과정이 종래의 방법보다 신속하고 간편하다.

또한, 척추관 주사를 통해 시료가 척수에 직접 주입되므로 척수 내에 존재하는 프리모관을 신속하게 염색하여 가시화할 수 있다는 장점이 있다.

아울러, 소량의 시료만으로도 척수 내에 존재하는 프리모관을 염색할 수 있다는 경제적인 효과가 있다.

도1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 관찰된 프리모관의 실체 영상을 도시한 것이다.
도2는 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 관찰된 프리모관의 광학이미지를 도시한 것이다.
도3은 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 관찰된 프리모관의 광학이미지를 확대한 것이다.
도4는 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 관찰된 프리모관의 투과전자현미경 사진을 도시한 것이다.
도5는 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 척수 내 프리모관의 가시화 방법을 도시한 도해이다.
도6은 본 발명에 따른 척수 내 프리모관의 가시화 방법을 도시한 흐름도이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하여 더 구체적으로 설명하되, 이미 주지되어진 기술적 부분에 대해서는 설명의 간결함을 위해 생략하거나 압축하기로 한다.

본 발명에 따른 척수 내 프리모관의 가시화 방법에 대해서 도1 내지 도6에 도시된 도면을 참조하여 설명하되, 편의상 순서를 붙여 설명한다.

1. 시료주입 단계<S601>

본 단계에서는 인 시추(In situ) 및 인 비보(In vivo)로 시료를 주입함으로써, 실험동물의 척수 내에 존재하는 프리모관을 염색하는 과정이 이루어진다.

본 발명의 일실시예에서는 시료를 척수 내로 주입하는 방법으로서, 척추관 주사 방법을 사용하였다. 즉, 시린지(Syringe) 등의 주사수단을 통해 실험동물의 요추 사이에 바늘을 삽입하고, 바늘이 척수 내에 삽입된 것을 확인한 후에 시료를 척수 내로 주입한다.

본 발명의 일실시예에서는 5번 요추와 6번 요추의 사이에 바늘을 삽입하여 척수 내로 시료를 주입하였으나, 바늘이 삽입되는 위치는 실험자의 실험목적에 따라 달라질 수도 있다.

본 단계에서는 도5에 도시된 바와 같이, 척추관 주사용 시린지(100)의 바늘이 실험동물의 척수 내로 삽입되는 과정이 진행된다. 즉, 척추관 주사용 시린지(100)의 바늘이 피부조직(200), 극상인대(300), 극간인대(400), 황색인대(500), 경막외강(600), 경막(700) 및 지주막(800)을 거쳐 뇌척수액(900)에 도달하는 과정이 이루어진다. 이때, 실험자는 실험동물의 척수 내로 삽입되는 바늘의 위치를 확인하고, 바늘이 척수신경(1000)과 지주막(800) 사이에 존재하는 뇌척수액(900)에 도달되었다고 판단되면 시료를 뇌척수액(900) 내부로 주입하여 척수 내에 존재하는 프리모관을 염색한다.

한편, 척수 내에 삽입되는 시료로는 체내의 다른 조직에 비하여 프리모관을 선별적으로 염색할 수 있는 시료인 메틸렌 블루(Methylen blue), JGB(Janus green B) 및 알시안 블루(Alcian blue) 등을 사용할 수 있으나, 본 발명의 일실시예에서는 혈관이나 지방조직에 비해 상대적으로 프리모관에 잘 흡수됨으로써, 프리모관을 우선적으로 염색하는 시료인 트립판 블루를 선정하여 척수 내로 주입하였다.

2. 척추궁절제 단계<S602>

단계 S601에서 척수 내로 시료 주입이 완료되면, 척수를 둘러싼 척추궁의 일부를 제거하는 척추궁절제술을 수행함으로써, 척수를 외부에 노출시키는 과정이 진행된다.

3. 1차 관찰 단계<S603>

본 단계에서는 단계 S602에서 척추궁의 일부가 제거된 척수를 현미경으로 관찰하는 과정이 이루어진다. 즉, 도1에 도시된 바와 같이, 척수 내에 존재하는 프리모관이 트립판 블루에 의해 청색으로 염색된 것을 실체 현미경을 통해 관찰할 수 있다.

본 발명에 따른 척수 내 프리모관의 염색방법은 실험동물의 생명이 유지된 상태에서 척수 내 프리모관의 모습을 관찰할 수 있다는 장점이 있다.

4. 염색 단계<S604>

본 단계에서는 단계 S603에서 확인된 척수 내에 존재하는 프리모관의 일부를 표본으로 채취하고, 프리모관 내부의 핵을 염색하기 위해 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 염색을 실시한다.

5. 2차 관찰 단계<S605>

단계 S604에서 DAPI로 염색된 표본을 형광 현미경(Fluorescence light microscope)으로 관찰한다.

본 단계에서는 도2에 도시된 바와 같이, 척수 내에 존재하는 프리모관이 DAPI에 의해 염색되어 발현된 것을 형광 현미경을 통해 확인할 수 있다.

6. 3차 관찰 단계<S606>

본 단계에서는 척수 내에 존재하는 프리모관을 고배율로 관찰하기 위해 단계 S603에서 확인된 척수 내 프리모관 중 일부를 표본으로 채취한다. 또한, 세포의 구조를 잘 보존시키고 투과전자현미경(Transmission electron microscope) 관찰시 발생하는 전자 빔 노출에 대해 조직이 잘 보존되도록 표본에 대해 고정(Fixation) 과정을 실시한다. 그 후, 고정 과정이 완료된 표본에 한해 투과전자현미경을 사용하여 관찰을 실시한다.

본 발명의 일실시예에서는 채취된 프리모관의 표본이 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충액(Sodium-cacodylate buffer) 및 2.5 % 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde) 용액과 혼합되어 4 ℃에서 4시간 동안 고정되었다.

본 단계에서는 도4에 도시된 바와 같이, 척수 내에 존재하는 프리모관을 고배율로 관찰할 수 있다.

<실시예>

모든 실험은 의료연구 국제사회에 의해 만들어진 실험 동물 보호의 원칙 및 실험동물 자원기구에 의해 만들어지고 국립위생연구소에 의해 발표된 실험동물의 사용 및 보호에 관한 지침서를 준수하였다. 또한, 본 실험은 서울대학교 윤리 위원회의 승인을 받아 이루어졌다.

실험은 다음과 같은 순서로 진행되었다. 먼저, 쥐의 우측 뒷다리에 우레탄(1.5 g/kg)을 근육주사하여 쥐를 마취시켰다. 쥐의 깊은 마취 상태 하에서, 쥐의 5번 요추 및 6번 요추의 사이에 존재하는 척수에 인공 뇌척수액(Artificial cerebrospinal fluid)으로 0.2 %의 트립판 블루(Trypan blue) 용액을 조제한 염색액을 척추관 주사하였다.

트립판 블루를 척수에 주입한지 약 10분 내지 20분 경과 후에 척추궁절제술(Laminectomy)을 수행하였다. 척수가 노출된 후에 실체 현미경(SZX12, Olympus, Japan)으로 쥐의 지주막(Arachnoid matter) 하부에 존재하는 신경계 프리모관을 관찰하였다.

실체 현미경을 이용하여 프리모관을 관찰한 결과, 도1에 도시된 바와 같이 척수 내에 존재하는 프리모관이 청색으로 염색됨을 알 수 있다. 도1의 좌측 사진은 실체 현미경에 의해 관찰된 사진이며, 도1의 우측 사진은 트립판 블루에 의해 염색된 프리모관의 일부를 다시 고배율로 확대하여 촬영한 사진이다. 도1을 통해 프리모관이 척수의 길이 방향으로 길게 배치되어 있음을 확인할 수 있다.

아울러, 도3에 도시된 바와 같이, 트립판 블루에 의해 염색된 프리모관은 지주막(Arachnoid matter)과 인접해 있다는 것을 알 수 있다. 도3의 두 개의 화살표는 두 줄기로 구성된 프리모관을 나타내며, 두 개의 별표는 전술한 프리모관과 인접한 지주막을 표시한 것이다.

형광염색법에 의한 프리모관의 관찰을 위하여 신경계 프리모관 표본을 채취하고, 채취된 표본을 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 염색하였다. 그리고 형광 현미경(Fluorescence light microscope)을 이용하여 염색이 완료된 표본을 관찰하였다.

형광 현미경을 이용하여 프리모관을 관찰한 결과, 도2에 도시된 바와 같이 DAPI에 의해 염색된 프리모관이 발현된 것을 확인할 수 있다.

한편, 척수 내에 존재하는 프리모관을 고배율로 관찰하기 위해 투과전자현미경용 표본을 제작하였다. 먼저, 신경계 프리모관 표본을 채취한 후, 채취된 표본을 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충액(Sodium-cacodylate buffer) 및 2.5 % 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde) 용액과 혼합하고 4 ℃에서 4시간 동안 고정하였다. 그 후, 투과전자현미경(Transmission electron microscope)을 사용하여 고정된 표본을 관찰하였다.

투과전자현미경을 이용하여 프리모관을 관찰한 결과, 도4에 도시된 바와 같이, 고배율의 프리모관을 확인할 수 있다.

도4에 나타난 점선형태의 원은 프리모관 내에 존재하는 콜라겐 층(Collagen bundle)을 표시한 것이며, 다수의 작은 화살표는 프리모관 내에 존재하는 많은 미세입자(Microparticle)을 나타낸다. 또한, 두 개의 큰 화살표는 프리모관의 가장 바깥쪽 세포막을 표시한 것이다.

본 발명에 따른 척수 내 프리모관의 가시화 방법은 척추관 주사를 통해 시료가 주입됨으로써 척수 내에 존재하는 프리모관이 염색되므로 뇌실에 직접 시료를 주입할 필요가 없다. 즉, 본 발명에 따른 척수 내 프리모관 가시화 방법은 시료 주입 과정 중에 발생할 수 있는 뇌의 손상을 방지하는 효과가 있으며, 실험과정이 종래의 방법보다 신속하고 간편하다.

또한, 척추관 주사를 통해 시료가 척수에 직접 주입되므로 척수 내에 존재하는 프리모관을 신속하게 염색하여 가시화할 수 있다는 장점이 있다.

아울러, 소량의 시료만으로도 척수 내에 존재하는 프리모관을 염색할 수 있다는 경제적인 효과가 있다.

위에서 설명한 바와 같이 본 발명에 대한 구체적인 설명은 첨부된 도면을 참조한 실시예에 의해서 이루어졌지만, 상술한 실시예는 본 발명의 바람직한 예를 들어 설명하였을 뿐이기 때문에, 본 발명이 상기의 실시예에만 국한되는 것으로 이해되어져서는 아니 되며, 본 발명의 권리범위는 후술하는 청구범위 및 그 등가개념으로 이해되어져야 할 것이다.

100 : 척추관 주사용 시린지
200 : 피부조직
300 : 극상인대
400 : 극간인대
500 : 황색인대
600 : 경막외강
700 : 경막
800 : 지주막
900 : 뇌척수액
1000 : 척수신경

Claims (5)

1. 인간을 제외한 동물의 척수 내에 시료를 주입하여 상기 척수 내에 존재하는 프리모관을 염색하는 시료주입 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는
   척수 내 프리모관의 가시화 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 시료주입 단계는
   척추관 주사(Intrathecal injection)를 통해 상기 척수 내에 상기 시료가 주입되는 것을 특징으로 하는
   척수 내 프리모관의 가시화 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 시료는 트립판 블루(Trypan blue)를 포함하는 것을 특징으로 하는
   척수 내 프리모관의 가시화 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 시료주입 단계에서 척수 내로 시료 주입이 완료된 후에 척추궁절제술(Laminectomy)이 실시되는 척추궁절제 단계; 를 더 포함하는 것을 특징으로 하는
   척수 내 프리모관의 가시화 방법.
5. 제4항에 있어서,
   상기 척추궁절제 단계에서 척추궁절제술이 실시된 척수를 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 염색하는 염색 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는
   척수 내 프리모관의 가시화 방법.

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