KR101244433B1 - 포자 표면에 전시된 파이타아제 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포자 표면에 전시된 파이타아제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 바실러스 포자가 가지는 특성(예컨대, 열안정성, 내산성, 내화학성 및 장기간 보존성 등)을 이용하여 포자 표면에 파이타아제 효소를 고정시킴으로써, 펠렛팅 공정 작업시 발생되는 열안정성 문제로 인하여 파이타아제의 효소 활성이 실활되는 문제점을 해결할 수 있다. 또한, 본 발명은 항영양인자(phytic acid) 분해 및 생균활성 효과를 동시에 구현할 수 있는 장점이 있으며, 효소가 멀티머 (multimer)이거나 단백질 크기에 관계없이 표면에 손쉽게 고정화가 가능하고 포자의 표면을 리엔지니어링(reengineering)하여 고정화 효율을 증가시킬 수 있다.

바실러스, 포자, 표면, 파이타아제, 고정화

Description

포자 표면에 전시된 파이타아제 및 이의 제조방법{Spore Surface-Immobilized Phytase and Preparation Methods thereof}

본 발명은 포자 표면에 전시된 파이타아제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

생촉매의 안정화는 광범위한 이용에 있어서 매우 중요하다. 안정화를 위하여 고정화 및 제한적인 기술이 널리 사용되어 왔다. 효소에 대한 적합한 고정화 매트릭스를 선택하기 위하여, 다음과 같은 특징이 고려되어야 한다: 1) 효소 용적량(enzyme loading capacity), 2) 사용 안정성, 및 3) 기질/생산물 이동 제한^[1]. 효소가 합성 유기 폴리머, 바이오폴리머 또는 무기고체에 고정화되더라도, 앰버라이트(amberlite), PMMA (poly(methylmethacrylate)), 및 셀라이트(celite), Eupergit C와 같은 상업적으로 유용한 아크릴 레진^[2], 셀룰로즈(cellulose), 스타치(starch), 아가로즈(agarose) 및 키토산(chitosan)^[3]과 같은 불용성 바이오폴리머, 천연 또는 합성 하이드로젤(hydrogels) 또는 크라이요젤(cryogels), 알루미 나(alumina), 실리카, 제올라이트 및 다공성 실리카와 같은 다양한 무기고체와 같은 보다 효과적인 고정화 지지체 개발을 위한 기술 혁신은 여전히 과제로 남아있다. 효소의 고정화에 대한 새로운 접근법은 ‘기능성 폴리머(smart polymers)’에 효소를 공유결합(covalent attachment)을 시키는 것이며, 이러한 기능성 폴리머는 외부환경의 작은 변화에 대하여 놀라운 형태 변화를 일으킨다. 예를 들면, PA (penicillin amidase)는 활성 에스테르 그룹을 포함하는 NIPAM (N-isopropylacrylamide) 공중합체와 응축을 통하여 고정화되었다^[4]. 최근 새롭게 등장한 관점이 나노다공성(nanoporous) 실리카에 단일 효소 나노입자(single enzyme nanoparticles: SENs)를 결합시킨 것이다^[5]. 그러나, 이와 같은 혁신 기술 중 대부분은 고정화된 효소보다 실질적으로 값 비싼 외부 지지체를 이용한다^[6]. 이러한 고가의 캐리어 물질로 인한 고비용 때문에, 상업적 규모의 생체전환(biotransformation) 공정에 이용할 수 있는 저비용, 효율적이고 내구성 있는 고정화 매트릭스에 대한 실용성이 필요한 실정하다. 실리카-기반 과립화는 3001000 ㎛ 파티클 크기와 높은 효소 효율성을 갖는 과립을 수득할 수 있는 저가의 스몰 사이즈 실리카를 이용하는 고정화 기술이다^[7].

미생물 디스플레이는 효소가 고정화된 세포를 제조하기 위한 혁신적인 방법이다. 이러한 기술은 표면 타겟 효소를 디스플레이 모티브와 융합시켜 미생물 표면에 존재함으로써, 효소의 생산 및 정제를 용이하게 하고 고정화의 필요성을 제거 한 것이다^{[8, 9]}. 표면-디스플레이 효소는 자유 형태(free form)의 효소보다 안정하고, 포자 디스플레이 시스템에 대한 본 연구자들이 발표한 보고서에서 기술하였듯이, 고정화된 효소와 유사하게 작용한다^{[10, 11]}. 또한, 효모에서 알칼라인 포스파타제의 활성 및 고정화 포자는 반복된 효소 반응에서 안정하게 유지되었다^[12].

신규한 미생물 디스플레이 시스템 개발을 위하여 노력한 결과^[13], 본 연구자들은 고정화 메트릭스로서 바실러스 포자의 잠재성을 확인할 수 있었다. 박테리아 포자는 가장 저항성 있는 생명체이며, 이러한 저항성은 박테리아 포자 표면의 다층 구조 단백질에 기인한 것이다. 포자는 열, 용매 및 건조에 내성이 강하다^[14]. 이러한 특성은 고정화 메트릭스로 활용될 수 있다. 또한, 바실러스 포자의 표면은 소수성과 마이너스 전하를 나타내기 때문에^[15], 효소 흡착에 적합하다. 0.5-2 ㎛ 범위의 포자 크기는 높은 표면-부피 비율의 부수적인 장점을 가지고 있는 합성 레진^[3]의 전형적인 크기인 50-200 ㎛ 보다 작다. 바실러스 포자는 식품 및 동물 사료로서 생균제 미생물의 소스로 이용된다^{[18, 19]}. 바실러스 속은 생산물의 저장과 수송을 용이하게 하는 전달할 수 있는 안정성 가진 포자이다. 최근에는, 구강 백신 항원에 대한 전달체로 이용되는 유전적으로 변형된 바실러스 포자가 발표되었다^{[20, 21]}.

파이타아제는 파스테이트(inositol hexakisphosphate: phytate)의 가수분해, 무기형 포스페이트(inorganic phosphate) 방출 및 사료에 존재하는 파스테이트의 생물활성을 촉매 한다^[24-28]. 파이타아제 효소는 상기 동물들의 위장관(gastrointestinal tract)에서 파이타아제 활성이 매우 저조하기 때문에, 돼지, 가축(poultry) 및 인간과 같은 단위동물(simple-stomached animals)에 의한 음식물의 파이타아제-포스포러스(phytate-phosphorus) 활용을 개선할 수 있는 거대한 잠재성을 가지고 있다. 그러나, 이러한 파이타아제가 활성을 유지하기 위해서는 고온 내성이 요구되며, 사료 제조공정에서의 팰렛화(pelletization) 단계를 거치는 동안 상승된 온도에서 효소 활성을 유지할 수 있어야 한다^[27].

따라서, 본 연구자들은 포자에 고정화된 파이타아제를 이용하여 이와 같은 문제점을 해결하고자 한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 생균활성과 열안정성을 가지는 파이타아제 효소를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 포자(특히, 바실러스 포자) 표면에 파이타아제를 고정시킴으로써, 표자-표면 전시된 파이타아제가 사료 공정 중 펠렛팅 단계에서 발생하는 열안전성으로 인하여 발생하는 문제점을 극복하고, 포자의 내산성 및 내화학성으로 인하여 섭취 후 장관 내까지 이동하여 피틴산(phytic acid) 가수분해를 할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 포자 표면에 전시된 파이타아제(phytase)를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 포자-표면 전시된 파이타아제의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 포자 표면에 전시된 파이타아제(phytase)를 제공한다.

본 발명자들은 생균활성과 열안정성을 가지는 파이타아제 효소를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 포자(특히, 바실러스 포자) 표면에 파이타아제를 고정시킴으로써, 표자-표면 전시된 파이타아제가 사료 공정 중 펠렛팅 단계에서 발생하는 열안전성으로 인하여 발생하는 문제점을 극복하고, 포자의 내산성 및 내화학성으로 인하여 섭취 후 장관 내까지 이동하여 피틴산(phytic acid) 가수분해를 할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 파이타아제는 포자의 표면에 전시된다. 상기 포자는 파이타아제가 결합하는 객체(subject)로서, 파이타아제가 안정되게 포자와 결합하는 지지체로 작용한다.

포자는 포자가 다음과 같은 우수한 장점들을 가지고 있다(Driks, 1999): 1) 열에 대한 매우 안정하다; 2) 방사선에 대해 비교적 안정하다; 3) 독성에 대해 안정하다; 4) 산, 염기에 대해 매우 안정하다; 5) 리소자임에 안정하다; 6) 건조에 내성을 갖고 있다; 7) 유기용매에 대해 안정하다; 8)대사적 활성이 없다; 9) 용이하게 수 시간 안에 포자를 형성할 수 있다.

본 발명의 바람직직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 파이타아제가 전시되는 포자는 포자형성 그람음성 박테리아, 포자형성 그람양성 박테리아, 포자형성 방선균, 포자형성 효모 또는 포자형성 곰팡이에서 유래된 것이며, 보다 바람직하게는 믹소코커스를 포함하는 포자형성 그람음성 박테리아; 클로스트리디움 속, 페니바실러스 속과 바실러스 속을 포함하는 포자형성 그람양성 박테리아; 포자형성 방선 박테리아; 사카로마이세스 세레비시애, 칸디다 (Candida) 속과 한세눌라 속을 포함하 는 포자형성 효모; 포자형성 곰팡이 등으로부터 유래된 것이며, 보다 더 바람직하게는 포자형성 그람양성 박테리아, 보다 더욱 더 바람직하게는 바실러스 속 박테리아, 가장 바람직하게는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스로부터 유래된 것이다.

이러한 포자는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수득할 수 있다. 예를 들어, 바실러스의 포자는 레노그라핀 밀도구배(renografin gradients) 방법(참조: C. R. Harwood, et al., "Molecular Biological Methods for Bacillus." John Wiley & Sons, New York, p.416(1990))으로 얻을 수 있다. 본 발명에서 파이타아제와 결합할 수 있는 박테리아 및 효모는 당업계에 공지된 다양한 배양 방법을 통해 얻을 수 있다. 미생물의 배양 및 발효의 상세한 내용은 Kubitschek, H. E., Introduction to Research with Continuous Cultures. Englewood Cliffs, N.J.:Prentice-Hall, Inc., 1970; Mandelstam, J., et al., Biochemistry of Bacterial Growth, 3rd ed. Oxford:Blackwell, 1982; Meynell, G.G., et al., Theory and Practice in Experimental Bacteriology, 2nd ed. Cambridge: Cambridge University Press, 1970; Gerhardt, P., ed., Manual of Methods for General Bacteriology, Washington: Am. Soc. Microbiol, 1981에 개시되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 명세서에서 파이타아제와 결합하는 포자는, 바람직하게는 어떠한 유전공학적 및 화학적 처리가 되지 않은 포자를 의미한다.

본 발명에서 파이타아제의 표면 전시에 이용되는 포자는 열안정성, 내산성, 내화학성 및 장기간 보전성과 같은 특성을 가진다. 상기 포자의 특성 중 열안전 성은 파이타아제에 영향을 주어 사료 제조 공정 중 고온의 열처리(70-90℃)시 열로 인한 파이타아제의 효소 활성 억제를 가능하게 하고, 펠렛팅 공정에 적합한 파이타아제 제제로 활용할 수 있게 한다. 또한, 상기 포자의 내산성 및 내화학성은 동물의 소화기관 내 화학반응에 우수한 내성을 나타냄으로써 장관까지 효소 활성을 유지시킬 수 있으며, 상기 포자의 장기간 보전성으로 인하여 포자 표면에 전시된 파이타아제는 장기간 실온 보관에도 활성을 유지가 가능하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르며, 본 발명에서 상기 포자 표면에 전시되는 파이타아제는 E. coli로부터 유래된 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 파이타아제는 포자와 단순 혼합에 의해 포자의 표면에 결합되며, 보다 상세하게는 파이타아제와 포자 사이의 상호작용은 원칙적으로는 비공유결합, 보다 더 상세하게는 소수성결합을 통해 이루어진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 파이타아제와 포자와의 결합은 pH 2.0-5.0의 범위에서 효율적으로 결합하며, 보다 바람직하게는 pH 2.5-4.0의 범위에서 결합하고, 가장 바람직하게는 pH 2.7-3.5의 범위에서 강력하고 효율적으로 결합한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 포자 및 파이타아제(phytase)를 pH 2.5-4.0 및 0-70 mM 염의 농도 하에서 혼합하는 단계를 포함하는 포자-표면 전시된 파이타아제의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 명세서에서 용어 “염(salt)”은, 산의 음이온과 염기의 양이온이 만나 만들어진 화합물을 의미한다. 상기 염은, 바람직하게는 NaNO₃, NaCl, Na₂S, Na₂SO₄, Na₂CO₃, KNO₃, KCl, K₂S, K₂SO₄, K₂CO₃, NH₄NO₃, NH₄Cl, (NH₄)₂S, (NH₄)₂SO₄, (NH₄)₂CO₃, Mg(NO₃)₂, MgCl₂, MgS, MgSO₄, MgCO₃, Ba(NO₃)₂, BaCl₂, BaS, BaSO₄, BaCO₃, Ca(NO₃)₂, CaCl₂, CaS, CaSO₄, CaCO₃, Pb(NO₃)₂, PbCl₂, PbS, PbSO₄, PbCO₃, AgNO₃, AgCl, Ag₂S, Ag₂SO₄ 또는 Ag₂CO₃이며, 보다 바람직하게는 NaNO₃, NaCl, Na₂S, Na₂SO₄, Na₂CO₃, KNO₃, KCl, K₂S, K₂SO₄ 또는 K₂CO₃이고, 보다 더 바람직하게는 NaNO₃, NaCl, Na₂S, Na₂SO₄ 또는 Na₂CO₃이며, 가장 바람하게는 NaCl이다.

바람직하게는 상기 파이타아제와 포자와의 결합은 0-70 mM 염의 농도 하에서 실시되며, 보다 바람직하게는 30-60 mM 염의 농도 하에서 실시되고, 가장 바람직하게는 45-55 mM 염의 농도하에서 실시된다. 상기 45-55 mM 염의 농도는 파이타아제와 포자와의 결합하는데 매우 효율적이며 최적의 조건이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 파이타아제와 포자와의 결합은 pH 2.0-5.0의 범위에서 효율적으로 결합하며, 보다 바람직하게는 pH 2.5-4.0의 범위에서 결합하고, 가장 바람직하게는 pH 2.7-3.5의 범위에서 강력하고 효율적으로 결합한다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 포자-표면 전시된 파이타아제 제조 방법은 15-30℃의 온도 및 45-75시간, 가장 바람직하게는 20-27℃의 온 도 및 55-65시간 동안 실시하는 단계를 추가적으로 포함한다. 즉, 상기 20-27℃의 온도에서 55-65시간 동안 파이타아제와 포자를 단순 혼합한 경우 최적의 효율로 포자 표면에 타이파아제가 전시된다.

본 발명의 바람직직한 구현예에 따르면, 본 발명의 제조방법에서 파이타아제가 전시되는 포자는 포자형성 그람음성 박테리아, 포자형성 그람양성 박테리아, 포자형성 방선균, 포자형성 효모 또는 포자형성 곰팡이에서 유래된 것이며, 보다 바람직하게는 믹소코커스를 포함하는 포자형성 그람음성 박테리아; 클로스트리디움 속, 페니바실러스 속과 바실러스 속을 포함하는 포자형성 그람양성 박테리아; 포자형성 방선 박테리아; 사카로마이세스 세레비시애, 칸디다 (Candida) 속과 한세눌라 속을 포함하는 포자형성 효모; 포자형성 곰팡이 등으로부터 유래된 것이며, 보다 더 바람직하게는 포자형성 그람양성 박테리아, 보다 더욱 더 바람직하게는 바실러스 속 박테리아, 가장 바람직하게는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스로부터 유래된 것이다.

이러한 포자는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수득할 수 있다. 예를 들어, 바실러스의 포자는 레노그라핀 밀도구배(renografin gradients) 방법(참조: C. R. Harwood, et al., "Molecular Biological Methods for Bacillus." John Wiley & Sons, New York, p.416(1990))으로 얻을 수 있다. 본 발명에서 파이타아제와 결합할 수 있는 박테리아 및 효모는 당업계에 공지된 다양한 배양 방법을 통해 얻을 수 있다. 미생물의 배양 및 발효의 상세한 내용은 Kubitschek, H. E., Introduction to Research with Continuous Cultures. Englewood Cliffs, N.J.:Prentice-Hall, Inc., 1970; Mandelstam, J., et al., Biochemistry of Bacterial Growth, 3rd ed. Oxford:Blackwell, 1982; Meynell, G.G., et al., Theory and Practice in Experimental Bacteriology, 2nd ed. Cambridge: Cambridge University Press, 1970; Gerhardt, P., ed., Manual of Methods for General Bacteriology, Washington: Am. Soc. Microbiol, 1981에 개시되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르며, 본 발명의 제조방법에서 상기 포자 표면에 전시되는 파이타아제는 E. coli로부터 유래된 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 제조방법에서 상기 파이타아제는 포자와 단순 혼합에 의해 포자의 표면에 결합되며, 보다 상세하게는 파이타아제와 포자 사이의 상호작용은 원칙적으로는 비공유결합, 보다 더 상세하게는 소수성결합을 통해 이루어진다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 포자 표면에 전시된 파이타아제에 관한 것이다.

(ⅱ) 본 발명은 바실러스 포자가 가지는 특성(예컨대, 열안정성, 내산성, 내화학성 및 장기간 보존성 등)을 이용하여 포자 표면에 파이타아제 효소를 고정시킴으로써, 사료제조에서의 펠렛팅 공정 작업시 발생되는 열안정성 문제로 인하여 파이타아제의 효소 활성이 실활되는 문제점을 해결할 수 있다.

(ⅲ) 본 발명은 항영양인자(phytic acid) 분해 및 생균활성 효과를 동시에 구현할 수 있는 장점이 있다.

(ⅳ) 또한, 본 발명은 효소가 멀티머 (multimer)이거나 단백질 사이즈에 관계없이 표면에 손쉽게 고정화가 가능하고 포자의 표면을 리엔지니어링(reengineering)하여 고정화 효율을 증가시킬 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

다른 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) 부 또는 %, 고체/액체는 (중량/부피) 부 또는 %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) 부 또는 %이다.

실험 재료 및 방법

세포주 및 화합물

B. 서브틸리스(B. subtilis) KCTC 1021, B. 서브틸리스 DB104^[11], B. 서브틸 리스 168 및 B. 폴리퍼멘티쿠스(B. polyfermenticus) KCCM 10104^[29]를 포함한 바실러스 균주들을 이용하여 포자를 제조하였다. E. coli로부터 얻은 과립화된 파우더(GenoPhos) 형태인 파이타아제(Phytase, (AppA2))는 제노포커스사(대전, 대한민국)의 상업적 판매되는 제품이다. 모든 화합물은 분석용 등급이었으며, 시그마 케미컬사(Sigma Chemical Co, St. Louis, 미국) 및 머크사(Merck, Darmstadt, 독일)로부터 구입하였다.

효소 제조

10 g 과립화 파이타아제를 30 ㎖ 탈이온수에 용해시켰으며, 4℃에서 10분 동안 5,000 rpm으로 원심분리하여 불용성 성분들을 제거하였다. 단백질 농도와 파이타아제의 활성을 측정한 후, 파이타아제 용액을 고정화 실험(immobilization experiment)에 사용하였다.

포자 제조

B. 폴리퍼멘티쿠스 포자를 제조하기 위해 30℃에서 48시간 동안 3 ℓ의 GYS 브로스(GYS broth; 0.2 % (NH₄)₂SO₄, 0.2 % 효모추출액, 0.05 % K₂HPO₄)에서 성장시켰다. 총 포자를 4℃에서 30분 동안 10,000 g로 원심분리하여 수득하였다. 펠렛을 1 M KCl/0.5 M NaCl으로 세척한 다음, 탈염수에서 재현탁하였다. 가수분해를 억제시키기 위해 1 mM 프로테아제 억제제 PMSF(phenylmethanesulphonylfluoride)를 첨가하였다. 초음파 파쇄(5 분)를 이용하여 모세포로부터 내생포자(endospores)를 방출시켰다. 현미경으로 모세포의 완전한 용해를 관찰하였다. 그 다음 원심분리를 이용하여 포자를 회수하고 탈이온수로 세척하였다. 추가 실험을 위해 정제된 포자를 -20℃에 저장하였다. 포자의 건조 중량을 할로겐 모이스춰 에널라이저(Halogen Moisture Analyzer; Mettler-Toledo, Switzerland)를 사용하여 수분함량을 측정하였다.

파이타아제 활성 측정

파이타아제 활성을 측정하기위하여 변형된 엔젤렌(Engelen) 및 히프트(Heeft) 방법을 이용하였다^[30]. 0.2 ㎖의 효소 샘플(pH 5.0 250 mM 아세트산 버퍼, 0.05 % Triton X-100 및 0.05 % BSA로 희석)을 튜브로 옮긴 후, 5분 동안 워터 배스(water bath, 37℃)에서 인큐베이션 한 다음, 0.4 ㎖ 피틴산(phytic acid) 기질 용액(pH 5.0, 250 mM 아세트산 버퍼에 8.0 mM 소듐 파이테이트(sodium phytate)가 포함된 용액)을 반응 개시를 위해 첨가하였으며, 상기 반응은 37℃에서 30분 동안 실시하였다.

0.4 ㎖ 반응 정지 용액(10 % 암모늄 헵타몰리브데이트(ammonium heptamolybdate) 250 ㎖, 0.235 % 암모늄 바나데이트(ammonium vanadate) 250 ㎖ 및 65 % 니트르산(nitric acid) 165 ㎖)을 첨가하여 반응을 정지시킨 다음, 10분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 유리된 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 농 도를 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 3번의 블랭크 실험과 3회의 분석 실험을 실시하였다. 37℃ pH 5.0에서 소듐 파이테이트(sodium phytate)로부터 분당 1 무기형(inorganic) ortho-포스페이트를 유리시키는 효소의 양을 파이타아제 활성의 1 유닛(unit)으로 정하였다. 단백질 분석 키트(Bio-Rad)를 이용하여 단백질의 농도를 측정하였다.

포자상에 효소 고정

정제된 B. 폴리퍼멘티쿠스 포자 20 또는 100 mg 중 하나를 탈이온수로 2회 세척하였으며, 1 ㎖ 탈이온수로 재현탁한 다음, 실온에서 2시간 동안 50 mM 시트르산 버퍼(citric acid buffer, pH 3.0)에서 SLRM-2M 인텔리 믹서(Intelli mixer; SeouLin Bioscience Co. Ltd., 대한민국)를 5 rpm으로 교반하면서 파이타아제를 혼합하였다. 인큐베이션을 한 후, 원심분리(5,000 rpm, 10 분)를 이용하여 포자를 회수하고 탈이온수로 3회 세척한 후 효소 분석법에 사용하였다. 고정화 효율(immobilization efficiency)에 있어서 포자에 대한 효소 비율의 효과를 측정하기 위해, 실온에서 2시간 동안 각각 다른 농도(포자 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0, 2.0 및 3.0 mg/20 mg 포자)의 파이타아제를 첨가하면서 배치(batch) 고정화를 실시하였다. 그 다음, 혼합액을 원심분리하고, 탈이온수로 세척하여 비고정화된 효소를 제거하였다. 초기 혼합 상청액, 세척액 및 포자에서 파이타아제 활성 및 단백질 성분을 비교하였다.

또한 B. 서브틸리스 KCTC 1021 (ATCC 6633) 및 B. 서브틸리스 168 포자를 파 이타아제의 고정화를 위해 테스트하였다. 50 mM 시트르산 완충액(pH 3.0) 1.5 ㎖에서 20 mg 포자와 0.27 mg 파이타아제를 실온에서 20 rpm으로 천천히 혼합하였다.

활성 및 안정화를 위한 적정 pH 측정

37℃에서 다른 농도의 버퍼를 이용하여 적정 pH를 측정하였다:　pH 3.0-5.0인 50 mM 시트르산 완충액, pH 5.0-7.0인 50 mM MES 완충액, 및 pH 7.0-9.0인 50 mM Tris 완충액. 30 U/㎖의 활성을 나타내도록 포자에 고정화된 파이타아제 및 비고정화된 파이타아제를 각기 다른 pH에서 각각의 버퍼에 현탁시켰다. 4℃에서 5시간 동안 인큐베이션한 100 mM 버퍼에서 pH 안정화를 테스트하였다.

고정화 온도의 효과

다양한 고정화 시간(0-240 min) 및 고정 온도(4℃, 24℃ 및 40℃)에서 포자 표면에 파이타아제를 고정화시켰다. 5 rpm에서 믹서를 이용하여 50 mM 시트르산 완충액에서 20 mg의 포자를 0.5 mg의 파이타아제와 혼합하였다. 그 다음, 원심분리(5,000 rpm, 10 min)하여 포자를 수득한 후 회수된 포자를 효소 분석에 사용하였다.

온도 적정 및 열 안정성 측정

효소 반응 동안 적정 온도를 측정하기 위해 50 mM 아세트산 완충액(pH 5.0)에서 다양한 온도 (20-90℃)를 테스트하였다. 효소의 열 안정성을 측정하기 위하 여, 50 mM 아세트산 완충액(pH 5.0)에서 서로 다른 온도(60℃, 70℃, 80℃ 및 90℃)로 서멀 챌린지(thermal challenge)를 실시하였다. 그 즉시, 열-처리된 효소를 아이스(ice)에 올려놓았다. 선행 문헌에 따라^{[31, 32]}, 37℃ 및 pH 5.0에서 잔여 파이타아제 활성을 측정하였다. 단기 열 처리를 위하여, 효소 샘플의 일정양을 열 처리된 DNA 써모싸이클러(thermocycler)에서 0.2 ㎖ 씬-월드 튜브(PCR tubes)로 분주한 다음, 즉시 아이스에 방치하였다. 이러한 열처리를 최소 3회 실시하였다. 4℃와 실온(약 20±4℃)에서의 50 mM 아세테이트 완충액에서 자유 형태 및 포자에 고정화된 파이타아제로 포자에 고정화된 파이타아제의 저장 안정성을 테스트 하였다. 그리고 상청액을 주기적으로 회수하여 10분 동안 12,000 rpm으로 원심분리하였다. 포자-고정화된 파이타아제 활성과 단백질 농도를 비교하였다.

고정화 포자로부터 파이타아제 분리

2 ㎖의 탈이온수에 용해된 200 mg 파이타아제-고정화 포자를 초음파 처리하였다. 30분 동안 아이스에서 초음파처리(펄스 모드(pulse mode); 3 초 ON, 3 초 OFF)를 실시하였다. 그 즉시, 혼합액을 10분 동안 12,000 rpm에서 원심분리하고, 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다. 잔여 팰렛을 2 ㎖ 탈이온수로 12,000 rpm으로 원심분리하여 3회 세척하였다. 상층액을 회수한 다음 센트리콘-3 필터 유닛 (Millipore)으로 최종 용액을 농축하였다. SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)로 샘플을 분석하였다.

고정화된 포자로부터 파이타아제를 분리시키기 위해서 몇가지의 화학적 방법 사용하였다^{[33, 34]}. 상기 방법은 다음을 포함한다: 1) 1 M NaCl 탈이온수, 2) 10 %의 포름산(formic acid)이 포함된 45 % 아세토나이트릴(acetonitrile), 3) 30% 포름산이 포함된 30 % 아세토나이트릴, 4) 7.3 % SDS, 10 % 수크로스(sucrose), 5 % β-머캅토에탄올 및 100 mmol/L EDTA이 포함된 60 mmol/ℓ Tris-HCl (pH 8.0), 5) 8 M 우레아(urea), 50 mM DTT, 10 mM EDTA 및 1 % (w/v) SDS가 포함된 pH 8.0 50 mM Tris-HCl. 각각의 용액의 0.4 ㎖를 20 mg의 파이타아제-고정화된 포자에 첨가하였으며, 부유액을 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 10분 동안 12,000 rpm으로 부유액을 원심분리한 후 상청액을 회수하였다. 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 2 ㎖ 탈이온수를 잔여 펠렛에 첨가한 후 12,000 rpm으로 원심 분리하여 펠렛을 총 3회 세척하였다. 모든 상청액을 회수한 후, 센트리콘-3 필터 유닛 (Millipore)을 이용하여 최종 용액을 농축하였다. SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 샘플을 분석하였다.

실험 결과

포자 제조

바실러스 균종은 영양분이 부족한 상태에 노출되었을 때 내생포자를 생산한다. 상업적으로 유용한 프로바이오틱(probiotic) 비스판(Bispan)균인 B. 폴리퍼멘티쿠스를 본 연구에 이용하였다. 이 균주는 인간과 동물의 건강에 도움을 주는 살아있는 미생물 사료 보충재로 이용되어 왔다^{[18, 29]}. 본 연구에서는, 생균제(probiotic)로서 B. 폴리퍼멘티쿠스를 GYS 배지에서 성장시켰으며, 포자 형성과 배양 배지에 포자 방출을 최대로 하기 위하여 배양 시간을 48시간까지 연장하였다. GYS 배지에서 48 시간 배양한 후, 95 % 이상의 포자 형성 효율을 나타내었으며, 1.9 g 건조중량포자/ℓ 이상의 포자를 수득하였다. 원심분리를 이용하여 포자를 회수하였으며, 추가적으로 레노그라핀(renografin) 방법을 이용하여 정제하였다^[35]. B. 폴리퍼멘티쿠스 포자의 건조 중량은 수분 측정기를 사용하여 측정한 결과 0.201 mg/OD₆₀₀로 확인되었다. 파이타아제를 고정화시키기 위해 서포팅 매트릭스(supporting matrix)로서 정제된 포자를 사용하였다.

또한 다른 바실러스 포자를 고정 메트릭스로 시험하였다. 본 연구자들은 바실러스의 다양한 종으로부타 포자를 제조하였으며, 상기 기술된 방법에 따라 동일한 고정화 과정을 실시하였다. 고정화 효율은 바실러스 포자 종에 따라 결정하였다. B. 서브틸리스 KCTC 1021 (ATCC 6633)로부터 유래된 포자들은 13.3 ± 2.2 mg/g 포자가 고정화 될 수 있었으며, 반면에 B. 서브틸리스 168로부터 유래된 포자들은 8.1 ± 0.2 mg/g 포자가 고정화 되었다. 이러한 차이점은 서브틸리스의 종 및 계통 간 포자 크기 및 표면 특성(소수성과 같은)때문으로 나타났다. 이러한 결과는 다른 포자들이 서로 다른 최적의 조건을 가지고 있음을 나타내며 그 가능성에 대하여 현재 연구하고 있다.

포자상에서의 파이타아제 고정화 조건

몇 가지 당분해 효소가 포자 표면에서 발견되었으며, 이는 배양 정체기(stationary phase)에서 포자 형성 및/또는 라이시스(lysis) 동안 포자 코트에 부착하는 것으로 여겨진다^[36]. 포자 표면의 높은 소수성 때문에^[37], 소수성 단백질이 포자에 부착되었다고 예측되었다. 본 연구자들은 정제된 포자에 파이타아제를 고정화시키기 위하여 효소를 사용하여 포자와 혼합하려고 시도하였다. 포자 표면에 파이타아제의 흡수를 위한 최적의 조건을 찾기 위하여, 96-웰 플레이트에서 몇 가지 파라미터들을 테스트 하였다. 각 웰에서, 100 mM 완충액(pH 3.0-5.0인 50 mM 시트르산 완충액, pH 5.0-6.0인 50 mM MES 완충액)과 0, 25, 50, 75, 100, 및 150 mM NaCl 농도에서 3.0 내지 6.0 사이의 pH 범위를 포함하는 서로 다른 조건하에서 흡착 효율을 측정하였다. 파이타아제의 PI 값(4.5)을 기초로 하여 pH 범위를 선택하였다. 정제된 B. 폴리퍼멘티쿠스 포자에 파이타아제를 고정화하기 위한 최적의 조건은 낮은 pH 및 낮은 염의 농도였다(도 1). 정제된 포자에 흡착된 파이타아제의 양은 혼합액의 pH 및 염의 농도에 매우 민감하였다. E. coli 유래 파이타아제는 pH 3.0에서 포자에 강하게 부착되었으며, 이는 PI 값보다 낮았으며, 이러한 고정화 현상은 이온 교환 크로마토그래피 레진(ion exchange chromatographic resin)에 대한 단백질 부착과 유사하다.

또한 최적화된 조건을 통하여, 본 연구자들은 파이타아제에 대한 포자의 고정화 효율을 측정하였다. 표 1에 요약하였듯이, 포자에 대한 파이타아제 고정화 효율은 2 mg (4,150.1 U)의 파이타아제와 10 mg의 포자를 혼합하였을 때 66.3 %의 최대값에 도달하였다. 따라서, 13.3 mg 파이타아제가 1 g의 포자에 고정화될 수 있었다. 고정화된 효소의 양으로부터, 흡착된 파이타아제의 계산된 효소 활성이 28,251 U/g 포자임을 알 수 있었다. 그러나, 측정된 효소 활성은 18,075 U/g 포자 이었다. 계산된 데이터와 측정된 데이터 간에 차이는 형태적인 변화, 효소 활성 부위를 갖는 포자 표면 미세 환경의 간섭, 또는 흡착 할 때 효소 불활성의 다른 메커니즘들에 의한 것으로 예측된다.

a) 고정화율 = (파이타아제 총량-고정화 안된 파타아제량)/파이타아제 총량 x 100

고정화 효율에 있어서 효소 농도의 영향

포자의 최고 고정화 용적을 측정하기 위하여, 고정된 포자의 농도(20 mg)를 포함하는 5 ㎖ 버퍼 용액에 서로 다른 양의 파이타아제(0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0, 2.0 및 3.0 mg)를 첨가하였다. 도 2에 나타나 있듯이, 고정화된 파이타아제 및 활성은 1.0 mg/20 mg 포자에 도달할 때까지 비례적이었다. 포자에 고정화된 파이타아제의 최고 양은 28.2 ± 0.7 mg/g 포자였으며, 그 해당하는 활성은 41,120 ± 990.1 U/g 포자였다. 이와 같은 수치는 합성 고정화 레진(resin; 10-100 mg/g 레진)에 대한 수치와 유사하다^{[38, 39]}. 1.0 mg 이상의 파이타아제가 포자 용액에 첨가되었을 때, 상기 고정화된 포자의 활성은 약간 감소하였으며, 이것은 포자 표면 및/또는 구조 형성 변화에 있어 파이타아제의 부착이 다층으로 결합되기 때문으로 추측된다.

포자-고정화된 파이타아제의 생화학적 특성

pH의 효과

다양한 pH에서 30분 동안 인큐베이션한 후 포자-고정화된 파이타아제의 pH 의존성을 측정하였다. 자유-형태 및 포자-고정화 효소 제제를 위한 최적의 pH는 5.0이었다. 효소 안정성 역시 4℃와 다양한 pH 농도에서 2시간의 인큐베이션 후에 측정되었다. 두 파이타아제 제제의 안정성은 pH 5.0에서 가장 높았으며, 이러한 최적의 pH에서 포자 고정화가 가장 잘 이루어진다는 것을 의미한다.

온도의 영향

다양한 온도에서 30분 동안 인큐베이션한 후 자유-형태 및 포자-고정화된 파이타아제 제조의 온도 의존성을 측정하였다. 자유-형태 및 포자-고정화된 파이타아제에 대한 정확한 적정 온도는 60℃이었다(데이터 개시되지 않음).

고정화 온도의 영향

고정화 시간 및 온도에 대한 영향을 조사하였다. 포자에 대한 파이타아제의 고정화는 혼합 초기 단계에서 빠르게 발생하였다. 도 3a 및 3b에 나타나듯이, 이와 같은 조건하에서 60분 되는 때에 20,000-23,000 U/g (18-20 mg/g spore)에 도달하였다. 60분 후에, 포자에 대한 파이타아제의 부착은 더 이상 관찰되지 않았다. 이것은 파이타아제와 포자 표면 사이에 일정 수준의 친화성이 있음을 의미하며, 이는 합성 레진 및 단백질 간 친화도 사이의 흡착(결합) 메커니즘과 매우 유사한 것이다. 도 3c에 나타나 있듯이 포자에 대한 파이타아제의 고정화는 고정화 온도에 의해 유효적으로 영향을 받았다. 고정화가 24± 1℃에서 수행하였을 때 가장 높은 파이타아제 고정화 효율이 관찰되었다. 따라서, 최적의 고정화 시간 및 온도는 각각 60분 및 24± 1 ℃ 이상이라고 판단하였다.

포자에 고정화된 파이타아제의 열안정성

열안정성은 파아타아제의 상업적인 응용에 있어서 중요하고 유용한 특성으로 고려되어야 할 사항이다. 열적 불활성화 비율을 결정하기 위하여 60-90℃ pH 5.0 버퍼에서 자유-형성 및 포자에 고정화된 파아타아제를 인큐베이션하였다. 파이타아제의 포자-고정화의 효소 활성 반감기(t_1/2)는 비고정화된 파이타아제의 효소 활성보다 60℃에서 3.3배, 70℃에서 13.5배, 80℃에서 6.5배 및 90℃에서 3.7배 향상되었으며(표 2 및 도 4), 포자에 고정된 효소가 열에 대한 안정성이 있는 것으로 나타났다.

저장 안정성

또한, 파이타아제를 포자에 고정화 시킨 후 고정된 파이타아제의 저장 안정성은 자유 형태의 파이타아제보다 향상되었다. 고정화된 파이타아제를 4℃ 50 mM 아세테이트 버퍼 (pH 5.0)에 저장하였다. 15일째에는 자유 형태의 파이타아제 활성이 거의 나타내지 않은 반면, 고정화된 파이타아제에서는 20.8% 잔여 활성이 남아 있었다(나타내지 않음). 일반적으로, 용액에 포함된 효소는 저장 기간 동안 불안정하며 시간이 지남에 따라 활성이 감소될 것이다. 그러나, 고정화된 효소는 사용 중인 조건하에서 유리한 저장 안정성을 가진다.

포자-고정화된 파이타아제의 분리

파이타아제와 포자 표면과의 상호작용의 특성을 보다 정확하게 조사하기 위하여, 고염농도 (1 M NaCl), 유기 용매(아세트니트릴에 포함된 포름산), 화학 변성제 (SDS, β-머탑토에탄올 및 요소) 및 초음파처리와 같은 다양한 물리화학적 방법으로 포자의 표면으로부터 효소를 분리시켰다. 파이타아제를 물리적 힘으로 방출시킬 수 있는지를 확인하기 위하여 초음파처리를 하였으나, 파이타아제는 분리되지 않았다. 포자 표면은 높은 소수성과 음성적 정전기적 전하를 가지는 매우 질서 정연한 포자 코트 모노머들을 포함하고 있다. 파이타아제와 포자 표면과의 정전기적 연결을 끊기 위하여 처음에 고염농도를 이용하였다. 도 5에 나타내었듯이, 1 M NaCl로 파아타아제로 고정시킨 포자로부터 파이타아제를 추출하였으며, 정전기적 상호작용이 포자에 파이타아제의 결합에 기여하는 주요한 힘 중에 하나임을 알 수 있었다. 소수성 상호작용은 SDS, 요소 및 β-머캅도에탄올과 같은 소수성 용매 또는 단백질 변성제에 의해서 방해될 수 있다^{[32, 33]}. 예를 들면, 45% 아세토니트릴에 포함된 10% 포름산은 실리카상에 고정화된 서브틸리신 칼스버그(subtilisin carlsberg), CalB (Candida antarctica lipase B) 및 리포자임 RN IM (Lypozyme RN IM)을 매우 효과적으로 분리시킨다^[42]. 또한 포자에 고정화된 파이타아제의 경우, 소수성 용매는 파이타아제와 포자 표면 상호작용을 끊어, 용매액으로 파이타아제를 방출하였다. 이러한 방출의 결과는 파이타아제와 포자 사이의 상호 작용하는 힘이 소수성이라는 것을 의미한다. 파이타아제를 고정화시키는 포자로부터 파이타아제를 추출하는데 단백질 변성제의 콤비네이션을 이용하여, 소수성이 파이타아제와 포자 표면 사이에 상호작용하는 힘이라는 것을 알 수 있었다(도 6). 5 % β-머탑토에탄올과 SDS (7.3 %)은 포자 표면에 결합된 대부분의 다른 단백질을 분리시켰다. 요약하면, 소수성 유기 용매, 단백질 변성제 및 고염농도 모두 포자로부터 효소를 효과적으로 분리시켰으며, 이러한 결과는 효소가 소수성 및 정전기적 상호작용을 통하여 결합하고 있다는 것을 의미하였다. 이러한 결과들은 상기 상호작용이 포자와 파이타아제와의 분리와 상관없이 극한의 물리화학적 조건에 적용할 수 있을 정도로 강력하다는 것을 의미한다.

결론

본 연구자들은 바실러스 포자가 효소 파이타아제의 고정화에 신규한 매트릭스로 역할을 할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 특히, 식품 및 사료용 고정화 매트릭스로 사용하는 프로바이틱(생균활성 첨가제) B. 폴리퍼멘티쿠스를 이용하였다. 건조된 1 ㎎ 포자는 28.2 ± 0.7 ㎎까지 파이타아제를 흡수할 수 있었으며, 41,120 ±990.1 U/g 포자에서 효소 활성이 측정되었다. 파이타아제와 포자 표면과의 상호작용이 너무 타이트(tight)하여 포자로부터 파이타아제를 분리하기 위하여 카오트로픽(chaotropic) 물리 화학적 용매와 강력한 변성제가 요구되었다. 30분간의 초음파처리로는 파이타아제와 포자 표면과의 결합을 분리할 수 없었다.

포자에 고정화된 파이타아제는 자유 형태의 파이타아제보다 열안정성을 나타내었으며, 이러한 고정화된 파이타아제는 고온 사료 제조 공정에 있어 큰 장점을 가진다. 바실러스 포자는 쉽게 생산이 가능하며 고정화 공정이 간단하기 때문에 식품, 살료 및 의약 상업에 있어 폭 넓게 응용이 가능하다. 포자-고정화된 생촉매의 예비적인 예로서, 리파아제, 프로테아제 및 산화환원 효소를 포함하는 상업적인 효소가 포자-기반 안정화된 생촉매를 생산하기 위하여 이용되어 왔다. 또한, 다양한 타입의 바실러스 포자들은 효소에 대한 잠재적인 고정화 매트릭스로서 평가되며, 뛰어난 안정화 방법으로서 포자-기반 고정화 기술로 일반화 시킬 수 있다.

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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 멀티-웰 플레이트에서 측정된 파이타아제 고정화율에 있어 pH 및 염 농도의 영향을 나타낸 결과이다. (A) 각각 다른 pH (3.0, 4.0, 5.0, 및 6.0) 및 염(Nacl) 농도(0, 25, 50, 75, 100, 및 150 mM)의 멀티-웰 플레이트에서 파이타아제 반응을 나타낸 이미지; (B) 각각 다른 pH 및 염(Nacl)의 농도에서 포자-고정화된 파이타아제의 상대적 효소 활성을 나타낸 결과.

도 2는 파이다아제-포자 고정화 효율에 대한 결과이다. 포자(20 mg)에 다양한 파이타아제의 양((0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0, 2.0 및 3.0 mg)으로 고정화된 포자의 활성을 측정하였다. 상층액에 포함된 잔여 파이타아제 농도를 측정하여 고정화된 파이타아제의 양을 계산하였다.

도 3은 연속된 고정화 시간하에서 고정화 온도의 영향에 대한 결과이다. 20 mg 포자와 0.5 mg 파이타아제가 포함된 50 mM 시트르산 버퍼(pH 3.0)를 240분 동안 4℃, 24±1℃, 그리고 40℃에서 고정화를 실시하였다.

도 4는 자유 형태(open)의 파이타아제와 포자에 고정된(closed) 파이타아제의 열안정성을 비교한 결과이다. 각각 다른 온도(-●60, -■-70, -▲80 및 -◆90 ℃) 하에서의 인큐베이션을 통하여 잔여 파이타아제 활성을 측정하였다. 도면 안에 삽입된 것은 최초 30초에서 파이타아제의 상대적 활성을 나타낸 것이다.

도 5는 포자로부터 추출된 단백질을 SDS-PAGE로 나타낸 결과이다. 나타낸 결과는 각각의 다양한 추출 방법으로부터 수득된 단백질을 15 % SDS-PAGE을 이용하여 나타낸 것이다. 파이타아제-고정화된 포자에 0.4 ㎖ 추출액(extract solution)을 첨가하였으며, 상층물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다(참조:재료 및 방법). 고 염농도(1 M NaCl), 소수성 유기 용매(10 % formic acid in 45 % acetonitrile) 및 단백질 변성제(7.3 % SDS with 5 % β-머탑토에탄올 및 요소)를 이용하여 포자로부터 효소를 효과적으로 분리하였으며, 이것은 효소가 소수성과 정전기적 상호작용을 통하여 결합되었음을 나타낸 것이다. 초음파 처리하에서, 포자-고정화된 파이타아제는 분리되지 않았으며, 파이타아제와 포자 표면이 강력한 상호작용을 나타내었다. A와 B는 파이타아제가 고정화되지 않는 포자 및 파이타아제가 고정화된 포자를 각각 의미한다.

도 6은 본 발명의 포자 표면에 파이타아제(phytase)를 전시하는 방법에 대한 모식도이다.

Claims (11)

1. 포자(spore) 표면에 비공유적 결합을 통해 전시된 파이타아제(phytase).
2. 제 1 항에 있어서, 상기 포자는 포자형성 그람음성 박테리아, 포자형성 그람양성 박테리아, 포자형성 방선균, 포자형성 효모 또는 포자형성 곰팡이에서 유래된 것을 특징으로 하는 파이타아제.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 포자는 바실러스 속 박테리아로부터 유래된 것을 특징으로 하는 파이타아제.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 파이타아제는 E. coli로부터 유래된 것을 특징으로 하는 파이타아제.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 파이타아제는 포자와의 단순 혼합에 의해 포자의 표면에 비공유적으로 결합된 것을 특징으로 하는 파이타아제.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 결합은 pH 2.0-5.0의 범위에서 실시되는 것을 특징으로 하는 파이타아제.
7. 포자 및 파이타아제를 0-70 mM 염의 농도 하에서 pH 2.0-5.0 및 15-30℃에서 45-75시간 동안 혼합하는 단계를 포함하는 포자-표면 전시된 파이타아제의 제조방법.
8. 삭제
9. 제 7 항에 있어서, 상기 포자는 포자형성 그람음성 박테리아, 포자형성 그람양성 박테리아, 포자형성 방선균, 포자형성 효모 또는 포자형성 곰팡이에서 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 포자는 바실러스 속 박테리아로부터 유래된 것을 특 징으로 하는 방법.
11. 제 7 항에 있어서, 상기 파이타아제는 E. coli로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.

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