KR101243472B1 - 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 이용한 생화학물질의 분석방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 이용한 생화학물질의 분석방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 화학발광 분석칩을 상용 형광분광광도계 내부에 장착하고 외부에서 상기 화학발광 분석칩에 생화학 물질 시료, 분광분석 시약 및 산화제를 주입하여 화학발광 반응을 유도한 후 외부로 방출되는 화학발광 세기를 형광분광광도계로 측정함으로써 극미량의 생화학물질을 빠르고 정확하게 분석하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 이용한 생화학물질의 분석방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 화학발광 분석칩을 상용 형광분광광도계 내부에 장착하고 외부에서 상기 화학발광 분석칩에 생화학 물질 시료, 분광분석 시약 및 산화제를 주입하여 화학발광 반응을 유도한 후 외부로 방출되는 화학발광 세기를 형광분광광도계로 측정함으로써 극미량의 생화학물질을 빠르고 정확하게 분석하는 방법에 관한 것이다.
생화학물질을 분석하기 위한 방법으로 전기신호의 측정을 통하여 분석을 수행하는 전기화학적인 방법과 형광이나 화학발광 등과 같이 빛을 측정하여 분석을 수행하는 분광분석 방법 등이 일반적으로 사용된다. 이 중에서 빛을 사용하여 분석을 수행하는 분광분석 방법의 경우에 분석 감도가 우수하기 때문에 극미량의 생화학물질의 분석에 많이 사용되는 분석방법이다. 형광을 이용한 분석을 하기 위해서는 외부에서 분석 시료 용액에 빛을 조사해 준 후에 그 빛의 조사 경로의 직각인 각도에서 형광을 검출하여 분석을 수행한다. 그러나 화학발광을 사용한 분석의 경우에 외부에서 시료 용액에 빛을 조사해주지 않고 시료 용액 내부에서 화학반응에 의해서 발생되는 자체 발광으로 인해 방출되는 빛의 세기를 검출함으로써 분석 대상 시료의 농도를 분석한다. 이와 같이 화학발광을 이용한 분석은 형광을 이용한 분석에 비해서 잡음신호가 현저히 낮기 때문에 상대적으로 높은 신호 세기를 얻을 수 있어 특히 극미량의 생화학물질의 분석에 유용하다.
발광(lumonescence)이란 말은 1888년 독일 과학자 Eilhardt Wiedemann이 처음 만든 말로서 일반적으로 뜨거운 물체로부터 나오는 백열광에 반대되는 말인 냉광(cold light)을 일컫는다. 발광을 일으키는 들뜸 방식에 따라서 생체발광(bioluminescence), 화학발광(chemiluminescence), 전기발광(electroluminescence), 형광(fluorescence), 인광(phosphorescence), 방사선발광(radioluminescence), 열발광(thermoluminescence) 등으로 나누는데, 그 중에서도 형광은 같거나 더 큰 에너지를 가지는 복사선에 노출되어서 전자기 복사선을 방출하는 현상을 말한다. 지난 수십 년 동안 이 형광 현상을 이용한 형광분광법이 금속 이온들이나 유기화합물의 정량에 많이 사용되었다. 일반적으로 형광분광법으로 측정할 수 있는 물질들은 흡수분광법으로도 측정이 가능하지만 형광분광법은 흡수분광법보다 감도가 높고 선택성이 크다.
화학발광이란 화학반응에 의하여 들뜬상태에 도달한 분자로부터 발생하는 발광을 일컫는다. 화학발광 시약으로는 루미놀(luminol) 및 루미놀 유도체, 디옥세탄(dioxetane), 로핀(lophine), 루시제닌(lucigenin), 아크리디늄(acridinium) 염, 인돌(indole) 유도체, 쮜프 염기(Schiff base), 옥살레이트(oxalate), 디페노일퍼옥시드(diphenoylperoxide), 루테늄화합물(Ru(bpy)3 2+) 등이 있다. 최근에는 루테늄화합물(Ru(bpy)3 2+)과 아미노산의 화학발광 반응을 이용한 아미노산의 분석에 관한 연구도 여러 연구그룹에서 수행하고 있다. 화학발광법은 측정장치가 비교적 간단하고, 분석감도가 흡수분광법이나 형광법에 비해 우수한 장점이 있다.
루미놀(luminol, 5-amino-2,3-dihydrophthal-azine-1,4-dione)과 과산화수소(H2O2)의 화학발광반응은 촉매가 존재할 때에 하기와 같이 진행된다.
상기 반응에서 촉매작용을 하거나 반응을 억제하는 화학종의 농도가 이 반응에서 발생하는 화학발광 세기와 선형적인 관계를 가지면 이들 화학종들을 정량할 수 있다. 루미놀의 산화반응은 염기성 하에서 진행되는 반면에, 퍼옥살레이트(peroxyoxalate)는 중성에서 화학발광 반응을 진행시킬 수 있다. 퍼옥살레이트(peroxyoxalate)와 과산화수소(H2O2)의 반응은 하기와 같이 진행하여 화학발광을 나타낸다.
상기와 같은 화학발광을 이용한 생화학물질의 분석을 수행할 수 있는 다양한 종류의 상용 형광분광광도계가 시판되고 있으며 일상적인 생화학물질의 극미량 분석을 위해서 사용되고 있다. 일반적으로 상용 형광분광광도계의 암실 챔버에 한 변의 길이가 1 cm인 정사각형의 분석 시료 셀(cell)을 장착시키고 이 분석 시료 셀에 분석 대상 시료와 분광분석 시약 및 산화제를 주입한 후에 암실 챔버의 두껑을 닫고 상용 형광분광광도계의 조작을 통하여 빛을 검출함으로써 분석 대상 시료의 농도를 정량한다.
소량의 생화학물질을 빠르고 정확하게 분석하기 위한 수단으로 최근에 랩온어칩(lab-on-a-chip)이나 마이크로 플루이딕 칩(microfluidic chip) 등의 소형화된 분석칩을 사용하는 분석기술의 개발이 활발하게 연구개발되고 있다. 상기 랩온어칩이나 마이크로 플루이딕 칩을 기반으로 한 생화학물질의 분석에 있어서 분석을 수행하는 과정에 분석칩의 마이크로 채널이나 마이크로 챔버 내의 극미량의 시료 용액을 대상으로 분석을 수행해야하는 어려움이 있다. 따라서 분석칩 내부의 극미량의 시료용액을 대상으로 분석을 수행할 수 있는 고감도의 검출기를 사용하는 것이 필요하다.
극미량의 생화학물질을 효율적으로 분석하기 위해서 상용 형광분광광도계에 장착하여 분석을 수행하는 화학발광 분석칩을 제조하고 이 화학발광 분석칩에 분석대상이 되는 생화학물질과 분광분석시약 및 산화제를 주입함으로써 발생하는 화학발광의 세기를 상용 형광분광광도계의 고감도 검출기를 사용하여 검출함으로써 극미량의 생화학물질을 빠르고 정확하게 분석하기 위한 기술의 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 연구하던 중 화학발광 분석칩을 상용 형광분광광도계 내부에 장착하고 외부에서 상기 화학발광 분석칩에 생화학 물질 시료, 분광분석 시약 및 산화제를 주입하여 화학발광 반응을 유도한 후 외부로 방출되는 화학발광 세기를 형광분광광도계로 측정함으로써 극미량의 생화학물질을 빠르고 정확하게 분석할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 화학발광 분석칩을 상용 형광분광광도계에 장착하여 생화학물질의 분석을 수행함으로써, 소량의 생화학물질을 빠르게 분석할 수 있는 화학발광 분석칩의 장점과 상용 형광분광광도계의 고감도 분석의 장점을 결합하여 보다 더 효율적으로 소량의 생화학물질을 빠르고 정확하게 분석할 수 있는 생화학물질의 분석방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 이용한 생화학 물질의 분석방법을 제공한다.
1) 화학발광 분석칩을 형광분광광도계 내부에 장착하는 단계;
2) 상기 형광분광광도계 외부에 연결된 시린지 펌프를 사용하여 상기 화학발광 분석칩에 생화학 물질 시료, 분광분석 시약 및 산화제를 주입하는 단계; 및
3) 외부로 방출되는 화학발광 세기를 형광분광광도계로 측정하는 단계.
상기 단계 1은, 화학발광 분석칩을 형광분광광도계 내부에 장착하는 단계로서, 분광분석 시약과 산화제의 화학반응에 의해 방출되는 화학발광의 세기를 검출하기 위하여 화학발광 분석칩을 먼저 형광분광광도계 내부에 장착하는 단계이다.
본 발명에서, 상기 화학발광 분석칩은 형광분광광도계 내부에 수직으로 장착하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 용어 "화학발광 분석칩"은 분광분석 시약과 산화제의 화학발광 반응을 유도하여 분석 대상 물질을 검출하는 분석칩을 의미한다.
상기 화학발광 분석칩은 분석칩 본체; 상기 분석칩 본체 상부의 전방에 형성되는 분석 대상 시료 주입을 위한 시료 주입구, 분광분석 시약 주입을 위한 분광분석 시약 주입구 및 산화제 주입을 위한 산화제 주입구로 이루어진 유체 주입부; 상기 분석칩 본체 상부의 후방에 형성되는 유체 배출구; 상기 유체 주입부와 유체 배출구를 연통하여 상기 분석칩 본체 내부에 형성되는 마이크로채널; 및 상기 마이크로채널의 일부 구간으로서 상기 유체 주입부와 유체 배출구의 사이에 배치되는 마이크로챔버를 구비한다.
상기 화학발광 분석칩은 분광분석 시약 및 산화제과 함께 분석대상이 되는 시료를 유체 주입부를 통해 주입하고 이들의 반응을 통해 발생하는 빛의 흡수 또는 방출의 세기를 측정하는 과정을 통해 상기 분석 대상이 되는 시료의 존재 여부 및/또는 양을 분석하기 위해 이용될 수 있다.
상기 화학발광 분석칩 본체는 빛의 흡수 또는 방출의 세기를 측정하는 과정에 의해 분석을 행하는 분석칩의 본체로서 분석 대상이 되는 생화학물질과 분광분석 시약에 의한 빛의 흡수 또는 방출에 영향을 미치지 않는 재료로 제조된 것으로서, 근자외선 영역 또는 가시광선 파장영역에서 빛을 흡수하지 않거나 흡수하는 양이 매우 적은 재료로 제조된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 화학발광 분석칩 본체는 유리, 석영, 폴리카보네이트(polycarbonate) 폴리머(polymer), polydimethylsiloxane 등의 실리콘계 폴리머, 폴리프로필렌(polypropylene) 등의 올레핀계 폴리머 등의 재료를 사용하여 제조된 것일 수 있다.
바람직하기로, 상기 산화제 주입구는 시료 주입구와 분광분석 시약 주입구보다 후방에 위치한다. 이는 분석 대상 시료 주입을 위한 시료 주입구와 분광분석 시약 주입을 위한 분광분석 시약 주입구를 통해 각각 주입된 분석 대상 시료와 분광분석 시약이, 마이크로채널을 통해 후방에 배치된 산화제 주입을 위한 산화제 주입구에 도달하기 전에 상기 마이크로채널 내에서 미리 충분히 혼합된 후에 상기 산화제 주입구에 도달하여 산화제가 도입됨으로써 분석의 효율을 증대시킬 수 있기 때문이다.
상기 마이크로채널은 단면이 원형 또는 다각형인 것으로서, 원형의 지름 또는 다각형의 한 변의 길이가 30 내지 800 마이크로미터 크기의 범위인 것을 사용할 수 있다.
상기 마이크로챔버는 단면이 원형 또는 다각형으로 형성되어 있으며, 원형의 지름 또는 다각형의 한 변의 길이가 30 내지 800 마이크로미터 크기의 범위인 것을 사용할 수 있다.
상기 화학발광 분석칩은 상기 분석칩 본체의 후면에 배치되는 기판을 추가로 구비할 수 있다.
상기 기판은 유리, 폴리머, 금속 등의 재질로 된 것으로서, 편평한 형태인 것이 바람직하며, 상기 분석칩 본체보다 넓이가 크고 상기 분석칩 본체와의 접합부 접착이 용이한 재료를 사용할 수 있다.
본 발명에서 형광분광광도계로는 일반적인 상용 형광분광광도계를 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "상용 형광분광광도계"는 빛의 세기를 측정하여 분석물질의 존재 여부와 농도를 측정하기 위한 목적으로 제조하여 판매하고 있는 형광분광광도계 상용 제품을 의미하는 것으로서 빛의 세기를 파장에 따라서 측정하거나 시간에 따라서 측정하는 기능을 하는 상용 제품을 사용할 수 있다.
바람직하기로, 본 발명에서 상기 화학발광 분석칩은 형광분광광도계 내부의 암실 챔버에 수직으로 장착할 수 있다.
상기 단계 2는, 상기 형광분광광도계 외부에 연결된 시린지 펌프를 사용하여 상기 화학발광 분석칩에 생화학 물질 시료, 분광분석 시약 및 산화제를 주입하는 단계로서, 화학발광 분석칩에 시료, 분광분석 시약 및 산화제를 주입하여 화학발광 반응을 유도하는 단계이다.
본 발명에서 생화학물질은 화학발광 분석칩을 사용한 분석과정의 분석대상 물질로서 분광분석시약과 산화제의 반응으로 인해서 발생하는 화학발광의 세기를 증가 또는 감소 시키는 물질이며 상기 화학발광 세기의 증가 또는 감소의 정도를 검출함으로써 상기 생화학물질의 존재 여부와 농도를 분석할 수 있다.
상기 분광분석 시약에 촉매로서 금속이온을 추가로 첨가함으로써 화학발광 세기를 더욱 증가시켜 분석의 정확도 및 민감도를 향상시킬 수 있다. 상기 금속이온으로는 구리이온, 코발트이온 또는 철이온 등을 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 금속이온은 Cu2 +, Co2 +, Fe3 + 또는 Fe2 +를 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 분광분석 시약은 상기 화학발광 분석칩 내에서 화학반응에 의해서 빛을 방출하는 기능을 하는 시약으로서 루미놀(luminol)과 루미놀 유도체, 디옥세탄(dioxetane), 로핀(lophine), 루시제닌(lucigenin), 아크리디늄(acridinium)염, 인돌(indole) 유도체, 옥살레이트(oxalate), 루테늄화합물(Ru(bpy)3 2+) 등을 사용할 수 있다. 상기 분광분석 시약은 다양한 pH 범위의 완충용액에 적정농도로 용해시켜서 사용할 수 있다.
상기 산화제는 상기 분광분석시약의 산화반응을 진행시킴으로써 화학발광을 일으키는 물질로서 과산화수소(H2O2) 또는 시안화철(Fe(CN)6) 등을 사용할 수 있다. 상기 산화제는 특정 pH의 완충용액에 특정 농도로 제조하여 사용할 수 있다.
상기 단계 3은, 외부로 방출되는 화학발광 세기를 형광분광광도계로 측정하는 단계로서, 생화학 물질의 존재 여부 및/또는 농도를 분석하기 위하여 화학발광 시약의 산화 반응에 의해서 외부로 방출되는 화학발광 세기를 형광분광광도계로 측정하는 단계이다.
본 발명에 따른 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 사용한 생화학물질 분석방법은 화학발광 분석칩을 형광분광광도계에 장착하여 생화학물질을 분석하는 것으로서, 상기 화학발광 분석칩 내에서 분광분석시약과 산화제의 화학반응에 의해 방출되는 화학발광의 세기를 상기 형광분광광도계를 사용하여 검출함으로써 상기 생화학물질의 존재 여부 또는 농도를 분석할 수 있다.
상기 분석대상이 되는 생화학물질이 상기 분광분석 시약의 빛을 방출하는 반응을 촉진함으로써 빛의 방출 세기를 증가시키거나, 상기 분광분석 시약의 빛을 방출하는 반응을 방해함으로써 빛의 방출 세기를 감소시키는 것을 사용하여 상기 분석대상이 되는 생화학물질의 존재여부와 농도를 분석할 수 있다.
본 발명에서, 상기 화학발광 분석칩과 형광분광광도계를 이용하여 분석가능한 생화학 물질로는 항산화제, 아미노산 또는 당 등이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항산화제는 생체 내에서 발생하는 활성산소를 제거하는 기능을 하거나 용액 내에서의 산화반응을 억제하는 기능을 하는 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase) 등과 같은 항산화 효소, 비타민 C와 E 등의 비타민, 플라보노이드(flavonoids) 등과 같은 피토화합물(phyto-chemical) 등이다.
상기 당은 글루코스 또는 수크로스를 예로 들 수 있다.
이하, 본 발명을 첨부된 도면에 의거하여 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 상용 형광분광광도계(10)에 장착한 화학발광 분석칩(20)을 사용한 생화학물질 분석을 위한 실험 장치 셋업을 나타내는 모식도이다.
도 1에서 (가)는 상용 형광분광광도계(10)의 암실 챔버(11) 내에 장착한 화학발광 분석칩(20)과 연결된 실험장치 구조도를 나타내며 (나)는 화학발광 분석칩(20)의 구조를 나타낸다.
도 1의 (가)에서 상용 형광분광광도계(10)는 암실 챔버(11), 빛 검출 슬릿(12), 단색화장치(monochromator)(13), 광증배관(photomultiplier tube)(14) 등으로 구성되어 있으며 상용 형광분광광도계(10)로부터 얻은 광학신호는 컴퓨터 본체(50)로 전달되어 모니터(51)에 분광분석 스펙트럼(60)의 형태로 분석결과를 표시한다.
상기 암실 챔버(11) 내부에 화학발광 분석칩(20)을 장착하여 사용할 수 있으며 외부에 설치되는 시린지 펌프(30)를 사용하여 상기 화학발광 분석칩(20)에 분석 대상이 되는 시료와 분광분석시약 및 산화제 용액을 주입할 수 있다. 이때 상기 화학발광 분석칩(20)은 암실 챔버(11) 내부에 수직으로 장착되는 것이 바람직하다. 상기와 같이 화학발광 분석칩(20)을 수직으로 장착하여 분석함으로써 상용 형광분광광도계의 암실챔버 내부에 장착하기 쉬울 뿐만 아니라 상용 형광분광광도계의 빛 검출 슬릿(12)의 위치와 화학발광 분석칩(20)의 마이크로 채널이나 마이크로 챔버의 위치가 잘 대응되어서 결과적으로 높은 분광분석 스펙트럼(60)을 용이하게 얻을 수 있는 장점이 있다.
상기 화학발광 분석칩(20)은 분석칩 본체(21) 내에 시료 주입구(22), 분광분석 시약 주입구(23) 및 산화제 주입구(24)로 이루어진 유체 주입부, 및 유체 배출구(29)를 구비하고 있으며, 시료 주입구(22)와 분광분석 시약 주입구(23)가 전방에 위치하고 중간에 산화제 주입구(24)가 위치하며 후방에 유체 배출구(29)가 위치한다. 상기 유체 주입부 및 상기 유체 배출구(29) 사이에 이들을 연통하여 상기 분석칩 본체 내부에 형성되는 마이크로채널(25)을 가지며 상기 중간에 위치한 산화제 주입구(24)와 상기 유체 배출구(29) 사이에 상기 마이크로채널(25)의 일부 구간으로서 마이크로 챔버(27)를 가진다.
상기 화학발광 분석칩(20)을 상기 상용 형광분광광도계(10)의 상기 암실 챔버(11)에 수직으로 장착한 후에 상기 암실 챔버(11)의 두껑을 닫고 외부에 설치된 상기 시린지 펌프(30)를 사용하여 시료 주입 시린지(31)를 사용하여 상기 시료 용액을 시료 주입 튜브(32)를 통하여 상기 화학발광 분석칩(20)의 상기 시료 주입구(22)로 일정한 속도로 주입한다. 또한 상기 시린지 펌프(30)를 사용하여 분광분석시약 주입 시린지(33)를 사용하여 상기 분광분석시약을 분광분석 시약 주입 튜브(34)를 통하여 상기 화학발광 분석칩(20)의 상기 분광분석시약 주입구(23)로 일정한 속도로 주입한다. 또한 상기 시린지 펌프(30)를 사용하여 상기 산화제 주입 시린지(35)를 사용하여 산화제 주입 튜브(36)를 통하여 상기 화학발광 분석칩(20)의 상기 산화제 주입구(24)로 일정한 속도로 주입한다. 상기 마이크로 채널(25)에서 주입된 상기 시료 용액과 상기 분광분석시약 및 상기 산화제가 반응하여 화학발광을 방출하게 되는데 이때 방출되는 빛은 빛 검출 슬릿(12)을 통하여 상기 단색화장치(13)를 거쳐서 상기 광증배관(14)에서 빛의 세기가 증폭된다. 이 증폭된 빛 신호는 상기 컴퓨터 본체(50)로 들어가고 상기 모니터(51)에 분광분석 스펙트럼(60)의 형태로 표시한다. 이와 같은 과정에 의해 표시된 상기 분광분석 스펙트럼(60)을 통하여 상기 분석 대상 시료의 양을 정량할 수 있다.
도 2는 본 발명에서 실제 제조한 (가) 화학발광 분석칩의 사진, (나) 시린지 펌프와 연결된 화학발광 분석칩을 장착한 형광분광광도계 사진, (다) 형광분광광도계의 암실 챔버 내부의 화학발광 분석칩을 보여주는 사진, (라) 암실 챔버 내부에 장착된 화학발광 분석칩을 나타내는 사진이다.
상기 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화학발광 분석칩을 상용 형광분광광도계에 장착한 후에 분석대상 물질로 에녹사신을 사용하고 분광분석시약으로는 루미놀을 사용하며 산화제로는 과산화수소 또는 시안화철을 사용하여 이들을 상기 화학발광 분석칩에 주입함으로써 발생하는 화학발광의 세기를 고감도 검출 기능을 갖는 상용 형광분광광도계로 검출하여 분석한 결과를 도 3 내지 도 5에 나타내었다.
이상에서 설명한 본 발명에 따른 상용 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 사용한 생화학물질 분석방법은 화학발광 분석칩을 상용 형광분광광도계의 암실 챔버에 장착하여 생화학물질의 분석을 수행함으로써, 소량의 생화학물질을 빠르게 분석할 수 있는 화학발광 분석칩의 장점과 상용 형광분광광도계가 갖고 있는 고감도 분석의 장점을 결합하여 소량의 생화학물질을 빠르고 정확하게 분석할 수 있다.
본 발명에 따른 상용 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 사용한 생화학물질 분석방법은 화학발광 분석칩을 분석 대상이 되는 생화학물질에 따라서 다양한 크기와 형태로 제조한 화학발광 분석칩을 상용 형광분광광도계의 암실 챔버에 쉽게 장착시켜서 분석을 수행하고 분석 후에 쉽게 탈착시킬 수 있다.
본 발명에 따른 상용 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 사용한 생화학물질 분석방법은 화학발광 분석칩을 상용 형광분광광도계에 장착하여 생화학물질의 분석을 수행하기 때문에 화학발광 분석칩의 마이크로 챔버로부터 발생되는 미세한 화학발광 세기도 고감도로 검출할 수 있으며 검출한 결과의 데이터 처리가 용이하고 상용 형광분광광도계가 갖는 장점인 높은 정밀도로 재현성있는 결과를 얻기가 용이하여 극미량의 생화학물질의 분석에 유용하다.
본 발명에 따른 상용 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 사용한 생화학물질 분석방법은 화학발광 분석칩의 마이크로 챔버에서 분광분석 시약과 산화제의 화학반응 및 이에 영향을 미치는 생화학물질의 작용에 의해서 발생하는 자체 발광인 화학발광의 빛의 세기를 상용 형광분광광도계를 사용하여 검출함으로써 생화학물질을 분석하는 것이기 때문에 장치의 셋팅이 간단하고 단순한 조작만으로도 고감도의 생화학물질 분석 결과를 빠르게 얻을 수 있다.
도 1은 본 발명의 상용 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 사용한 생화학물질 분석을 위한 실험 장치 셋업을 나타내는 모식도이다. 이때 (가)는 상용 형광분광광도계의 암실 챔버 내에 장착한 화학발광 분석칩과 연결된 실험장치 구조도를 나타내며 (나)는 화학발광 분석칩의 구조를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 실제 제조한 (가) 화학발광 분석칩의 사진, (나) 시린지 펌프(syringe pump)와 연결된 화학발광 분석칩을 장착한 형광분광광도계 사진, (다) 형광분광광도계의 암실 챔버 내부의 화학발광 분석칩을 보여주는 사진, (라) 암실 챔버 내부에 장착된 화학발광 분석칩을 나타내는 사진이다.
도 3은 상용 형광분광광도계에 제조한 화학발광 분석칩을 장착한 후에 상기 화학발과 분석칩에 화학발광 시약인 루미놀(luminol)과 산화제인 과산화수소(H2O2)를 주입하여 얻은 화학발광 세기(1), 루미놀-과산화수소 반응에 구리이온(Cu2 +) 촉매를 주입한 경우의 화학발광 세기(2), 및 루미놀-과산화수소-구리이온 촉매 시스템에 분석물인 에녹사신(enoxacin)을 주입한 경우의 증가된 화학발광 세기(3)를 나타낸다.
도 4는 상용 형광분광광도계에 화학발광 분석칩을 장착한 후에 상기 화학발광 분석칩에 주입한 루미놀과 시안화철(Fe(CN)6)의 반응에 의한 화학발광 세기(1)와 루미놀-시안화철에 분석물질인 에녹사신(enoxacin)을 주입한 경우의 증가된 화학발광 세기(2)를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 화학발광 분석칩을 상용 형광분광광도계에 장착한 후에 상기 화학발광 분석칩에 주입한 루미놀-시안화철에 분석물질인 에녹사신(enoxacin)을 다양한 농도로 주입한 경우 에녹사신 농도에 따른 화학발광 세기를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 실제 제조한 (가) 화학발광 분석칩의 사진, (나) 시린지 펌프(syringe pump)와 연결된 화학발광 분석칩을 장착한 형광분광광도계 사진, (다) 형광분광광도계의 암실 챔버 내부의 화학발광 분석칩을 보여주는 사진, (라) 암실 챔버 내부에 장착된 화학발광 분석칩을 나타내는 사진이다.
도 3은 상용 형광분광광도계에 제조한 화학발광 분석칩을 장착한 후에 상기 화학발과 분석칩에 화학발광 시약인 루미놀(luminol)과 산화제인 과산화수소(H2O2)를 주입하여 얻은 화학발광 세기(1), 루미놀-과산화수소 반응에 구리이온(Cu2 +) 촉매를 주입한 경우의 화학발광 세기(2), 및 루미놀-과산화수소-구리이온 촉매 시스템에 분석물인 에녹사신(enoxacin)을 주입한 경우의 증가된 화학발광 세기(3)를 나타낸다.
도 4는 상용 형광분광광도계에 화학발광 분석칩을 장착한 후에 상기 화학발광 분석칩에 주입한 루미놀과 시안화철(Fe(CN)6)의 반응에 의한 화학발광 세기(1)와 루미놀-시안화철에 분석물질인 에녹사신(enoxacin)을 주입한 경우의 증가된 화학발광 세기(2)를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 화학발광 분석칩을 상용 형광분광광도계에 장착한 후에 상기 화학발광 분석칩에 주입한 루미놀-시안화철에 분석물질인 에녹사신(enoxacin)을 다양한 농도로 주입한 경우 에녹사신 농도에 따른 화학발광 세기를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
1: 생화학 물질 첨가 여부에 따른 본 발명 화학발광
분석칩
및 형광분광광도계를 이용한
루미놀과
과산화수소의 산화반응에 의한 화학발광 세기 변화
도 1에 도시된 바와 같이 상용 형광분광광도계 내에 화학발광 분석칩을 장착하고 시료인 생화학 물질의 첨가 여부에 따른 본 발명 화학발광 분석칩 및 형광분광광도계를 이용한 루미놀과 과산화수소의 산화반응에 의한 화학발광 세기 변화를 조사하였다. 본 실시예에서 시료인 생화학 물질로는 항균제의 일종인 에녹사신(enoxacin)을 사용하였다.
화학발광 세기는 상기 화학발광 분석칩을 상용 형광분광광도계 내에 장착하고 상기 화학발광 분석칩에 시료인 에녹사신, 화학발광 시약인 루미놀(luminol) 및 산화제인 과산화수소(H2O2)를 주입한 후 측정하였다. 선택적으로 상기 화학발광 시약에 구리이온(Cu2 +) 촉매를 추가로 주입하였다.
이때 실험조건으로 루미놀(luminol) 시약의 농도는 KCl-NaOH 완충용액에 용해시켜 1 mM로 조절하였고, 과산화수소(H2O2) 농도는 0.1 M로 하였으며, 에녹사신(ENX) 농도는 0.1 mM로 하였고, pH는 12.8로 하였으며, 구리이온의 농도는 0.1 mM로 하였고, 유체의 흐름 속도는 30 ml/h로 하였다.
상기 분석 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 (1)은 루미놀(luminol)과 산화제인 과산화수소(H2O2)만을 주입한 경우의 화학발광 세기이고, (2)는 루미놀-과산화수소 반응에 구리이온(Cu2 +) 촉매가 주입되었을 경우의 화학발광 세기를 나타내며, (3)은 루미놀-과산화수소-구리이온촉매 시스템에 시료인 에녹사신(enoxacin)이 주입되었을 경우의 증가된 화학발광 세기를 나타낸다.
도 3을 통해, 루미놀-과산화수소의 반응에 구리이온이 촉매작용을 함으로써 증가된 화학발광 세기(2)가 얻어진 것을 볼 수 있다. 또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 분석 대상 물질인 에녹사신이 주입되었을 경우에 화학발광 세기가 더욱 증가하는 것을 볼 수 있다. 이를 통해, 화학발광 분석칩과 형광분광광도계를 조합하여 이용할 경우 소량의 생화학물질이라도 빠르고 더욱 정확하게 분석하는 것이 가능함을 확인할 수 있다.
실시예
2: 생화학 물질 첨가 여부에 따른 본 발명 화학발광
분석칩
및 형광분광광도계를 이용한
루미놀과
시안화철의
산화반응에 의한 화학발광 세기 변화
도 1에 도시된 바와 같이 상용 형광분광광도계 내에 화학발광 분석칩을 장착하고 시료인 생화학 물질의 첨가 여부에 따른 본 발명 화학발광 분석칩 및 형광분광광도계를 이용한 루미놀과 시안화철의 산화반응에 의한 화학발광 세기 변화를 조사하였다. 본 실시예에서 시료인 생화학 물질로는 항균제의 일종인 에녹사신(enoxacin)을 사용하였다.
화학발광 세기는 상기 화학발광 분석칩을 상용 형광분광광도계 내에 장착하고 상기 화학발광 분석칩에 시료인 에녹사신, 화학발광 시약인 루미놀(luminol) 및 산화제인 시안화철(Fe(CN)6)를 주입한 후 측정하였다.
이때 실험조건으로 루미놀(luminol) 시약의 농도는 KCl-NaOH 완충용액에 용해시켜 1 mM로 조절하였고, 시안화철 농도는 0.1 mM로 하였으며, 에녹사신(ENX) 농도는 0.1 mM로 하였고, pH는 12.8로 하였으며, 유체의 흐름 속도는 30 ml/h로 하였다.
상기 분석 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 (1)은 루미놀과 시안화철(Fe(CN)6)의 반응에 의한 화학발광 세기를 나타내고, (2)는 루미놀-시안화철에 시료인 에녹사신(enoxacin)을 주입한 경우 증가된 화학발광 세기를 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 분석 대상 물질인 에녹사신이 주입되었을 경우에 화학발광 세기가 루미놀-시안화철만 주입되었을 때보다 2배 이상 증가한 것을 볼 수 있다.
실시예
3: 생화학 물질의 농도에 따른 본 발명 화학발광
분석칩
및 형광분광광도계를 이용한
루미놀과
시안화철의
산화반응에 의한 화학발광 세기 변화
도 1에 도시된 바와 같이 상용 형광분광광도계 내에 화학발광 분석칩을 장착하고 시료인 생화학 물질의 농도에 따른 본 발명 화학발광 분석칩 및 형광분광광도계를 이용한 루미놀과 시안화철의 산화반응에 의한 화학발광 세기 변화를 조사하였다. 본 실시예에서 시료인 생화학 물질로는 항균제의 일종인 에녹사신(enoxacin)을 사용하였다.
화학발광 세기는 상기 화학발광 분석칩을 상용 형광분광광도계 내에 장착하고 상기 화학발광 분석칩에 시료인 에녹사신을 각각 다른 농도로 주입하고, 화학발광 시약인 루미놀(luminol)과 산화제인 시안화철(Fe(CN)6)를 주입한 후 측정하였다.
이때 실험조건으로 루미놀(luminol) 시약의 농도는 KCl-NaOH 완충용액에 용해시켜 1 mM로 조절하였고, 시안화철 농도는 0.1 mM로 하였으며, pH는 12.8로 하였고, 유체의 흐름 속도는 30 ml/h로 하였다. 한편, 에녹사신의 농도는 0.1×10-6 M, 0.5×10-6 M, 1×10-6 M, 5×10-6 M, 10×10-6 M, 50×10-6 M 및 100×10-6 M로 각각 다르게 하였다.
상기 분석 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서, (1)은 에녹사신의 농도가 0.1×10-6 M인 경우, (2)는 0.5×10-6 M인 경우, (3)은 1×10-6 M인 경우, (4)는 5×10-6 M인 경우, (5)는 10×10-6 M인 경우, (6)은 50×10-6 M인 경우, (7)은 100×10-6 M인 경우이다.
도 5의 결과에서 볼 수 있는 것처럼, 분석 대상 물질인 에녹사신의 농도가 증가할수록 단계적으로 화학발광 세기가 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서, 분석대상 물질의 농도가 증가함에 따라 증가하는 화학발광 세기를 검출하는 것을 사용하여 분석대상 물질을 정량할 수 있음을 알 수 있다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니한다. 즉, 본 발명에 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 첨부된 특허청구범위의 사상 및 범주를 일탈함이 없이 본 발명에 대한 다수의 변경 및 수정이 가능하며, 그러한 모든 적절한 변경 및 수정의 균등물들도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주되어야 할 것이다.
Claims (11)
- 화학발광 분석칩을 형광분광광도계 내부에 장착하는 단계;
상기 형광분광광도계 외부에 연결된 시린지 펌프를 사용하여 상기 화학발광 분석칩에 생화학 물질 시료, 분광분석 시약 및 산화제를 주입하는 단계; 및
외부로 방출되는 화학발광 세기를 형광분광광도계로 측정하는 단계를 포함하는, 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 이용한 생화학 물질의 분석방법으로서,
상기 화학발광 분석칩은 분석칩 본체; 상기 분석칩 본체 상부의 전방에 형성되는 분석 대상 시료 주입을 위한 시료 주입구, 분광분석 시약 주입을 위한 분광분석 시약 주입구 및 산화제 주입을 위한 산화제 주입구로 이루어진 유체 주입부; 상기 분석칩 본체 상부의 후방에 형성되는 유체 배출구; 상기 유체 주입부와 유체 배출구를 연통하여 상기 분석칩 본체 내부에 형성되는 마이크로채널; 및 상기 마이크로채널의 일부 구간으로서 상기 유체 주입부와 유체 배출구의 사이에 배치되는 마이크로챔버를 구비하며,
상기 산화제 주입구는 시료 주입구와 분광분석 시약 주입구보다 후방에 위치하는, 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 이용한 생화학 물질의 분석방법.
- 제1항에 있어서, 상기 화학발광 분석칩은 형광분광광도계 내부에 수직으로 장착하는 것을 특징으로 하는, 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 이용한 생화학 물질의 분석방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 분광분석 시약에 촉매로서 금속이온을 추가로 첨가하는, 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 이용한 생화학 물질의 분석방법.
- 제5항에 있어서, 상기 추가로 첨가된 금속이온은 구리이온, 코발트이온 또는 철이온인, 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 이용한 생화학 물질의 분석방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생화학 물질은 항산화제, 아미노산 또는 당인, 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 이용한 생화학 물질의 분석방법.
- 제7항에 있어서, 상기 항산화제는 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 비타민 C, 비타민 E 또는 플라보노이드인, 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 이용한 생화학 물질의 분석방법.
- 제7항에 있어서, 상기 당은 글루코스 또는 수크로스인, 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 이용한 생화학 물질의 분석방법.
- 제1항에 있어서, 상기 분광분석 시약은 루미놀, 루미놀 유도체, 디옥세탄, 로핀, 루시제닌, 아크리디늄염, 인돌 유도체, 옥살레이트 또는 루테늄 화합물인, 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 이용한 생화학 물질의 분석방법.
- 제1항에 있어서, 상기 산화제는 과산화수소 또는 시안화철인, 형광분광광도계에 장착한 화학발광 분석칩을 이용한 생화학 물질의 분석방법.
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