KR101235265B1 - Novel Pseudoalteromonas sp. and Agarase Produced by the Same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 슈도알테로모나스 속 미생물 및 그가 분비하는 아가레이즈에 관한 것이다.
본 발명의 미생물이 생산하는 아가레이즈는 매우 우수한 염 안정성을 가질 뿐만 아니라, 전처리 없이도 우뭇가사리를 직접 분해할 수 있으므로 우뭇가사리를 기질로 직접 활용하는 당화 기술을 제공한다.The present invention relates to a novel pseudoalteromonas genus microorganism and the agarase secreted by it.
The agarase produced by the microorganism of the present invention not only has very excellent salt stability, but also directly decomposes woodworms without pretreatment, thereby providing a saccharification technique that utilizes woodworms directly as a substrate.
Description
본 발명은 신규한 슈도알테로모나스 속 미생물 및 그가 분비하는 아가레이즈에 관한 것이다.The present invention relates to a novel pseudoalteromonas genus microorganism and the agarase secreted by it.
보다 구체적으로 본 발명은 고염 환경에서 우뭇가사리를 직접 분해할 수 있는 아가레이즈를 생산하는 신규한 슈도알테로모나스 속 미생물 및 그가 분비하는 아가레이즈에 관한 것이다.
More specifically, the present invention relates to a novel Pseudo-Altermonas genus microorganism that produces agarase capable of directly decomposing locus in high salt environment and the agarase secreted by it.
바이오에너지란 생명체의 유기물인 바이오매스로부터 공정을 통해 얻어내는 재생 가능한 에너지를 일컫는다. 친환경적이고 경제성 있는 바이오에너지의 생산에 있어 관건이 되는 단계는 바이오에너지의 원료인 바이오매스의 확보와 당화기술 개발 단계이다. 친환경적이고 경제적인 바이오매스 및 그 전처리 기술 개발을 위해 여러 가지 관점에서 접근이 시도되고 있으며, 최근에는 제3세대 바이오매스라고 불리는 해조류를 바이오매스로 활용하기 위해 많은 연구개발이 이뤄지고 있다.Bioenergy refers to renewable energy obtained through processes from biomass, which is organic matter of life. The key step in the production of eco-friendly and economical bioenergy is securing biomass, which is a raw material of bioenergy, and developing saccharification technology. In order to develop eco-friendly and economical biomass and its pretreatment technology, various approaches have been tried. Recently, many researches and developments have been made to utilize algae called third generation biomass as biomass.
우뭇가사리란, 해양 홍조류의 일종으로서, 건조중량의 대부분이 탄수화물 성분으로 이뤄져 있기 때문에 최근, 특별히 국내에서 바이오에너지 생산을 위한 바이오매스 원료로서 주목받고 있다. 우뭇가사리의 약 60%는 갈락토오스 형태의 단당류가 결합되어 형성된 아가(agar)로 이뤄져 있기 때문에, 우뭇가사리를 바이오에너지 생산을 위한 바이오매스로 활용하기 위해서는 아가를 전 처리하여 단당류를 확보하는 기술개발이 필수적이다. Locust is a kind of marine red algae, and since most of its dry weight is composed of carbohydrates, it has recently attracted attention as a biomass raw material for producing bioenergy. Since about 60% of the barley is composed of agar formed by combining monosaccharides in the form of galactose, it is essential to develop a technology to secure monosaccharides by pretreating agar to use it as a biomass for bioenergy production. .
현재까지 해조류를 당화하는 기술은 기술개발의 초기 단계에 있다고 할 수 있으며, 1,2세대 바이오매스와 마찬가지로 크게 화학적 전처리 방법과 생물학적 전처리방법의 관점에서 연구개발이 이뤄지고 있다. 화학적 전처리 방법의 경우, 그 공법이 간단하고 생물학적 전처리 방법에 비해 비교적 많은 기술 개발이 이뤄져 왔다는 장점이 있으나, 전처리 산물 제어가 어려우며, 당화 공정에서 독성 부산물이 다량 발생하여 추가적인 윤리환경적인 문제를 야기한다는 단점이 있다. 생물학적 전처리 방법의 경우, 주로 생명체가 생산하는 효소를 활용하는 관점에서 연구가 이뤄지고 있으며, 화학적 전처리 과정에서 발생하는 독성 부산물을 생성하지 않으며, 효소의 기질 특이적으로 반응한다는 것과 보다 각 효소의 최종산물이 명확하다는 점에서, 많은 잠재력을 갖고 있다. So far, the technology for saccharifying algae is in the early stages of technology development. Like the first and second generation biomass, research and development is being conducted in terms of chemical pretreatment and biological pretreatment. The chemical pretreatment method has the advantage that the process is simple and relatively more technical development has been achieved than the biological pretreatment method, but it is difficult to control the pretreatment product, and the toxic by-products are generated in the saccharification process, causing further ethical and environmental problems. There are disadvantages. In the case of biological pretreatment methods, research is being conducted mainly in terms of utilizing enzymes produced by living organisms, and does not generate toxic by-products generated during chemical pretreatment, reacts specifically with the substrate of the enzyme, and the final product of each enzyme. In this clear, it has a lot of potential.
아가를 분해하는 아가레이즈의 경우, 전통적으로는 바이오에너지 생산을 위한 바이오매스 확보의 측면에서 주목받기보다는 유전 공학에서 이용되는 아가로즈 겔 분해나, 올리고사카라이드를 생산하여 항산화제, 식품 첨가제, 화장품 첨가제 등을 생산하기 위한 관점에서 주목받아 왔다. 근래에는 바이오에너지 생산을 위한 바이오매스 전처리의 관점에서 주목받기 시작하였으나, 현재까지 그 기술은 아가로즈 혹은 아가의 분해에 국한되어있거나, 실제 상용화 가능한 공법개발의 측면에서는 개발정도가 미미한 실정이다. 아가로즈나 아가를 효소 반응의 기질로 이용하는 경우, 우선적으로 우뭇가사리로부터 아가로즈나 아가를 생산하는 전처리 과정이 선행되어야 하기 때문에, 우뭇가사리를 직접 그 기질로 활용하는 경우에 비해 경제성이 떨어진다고 할 수 있다. 이에 본 발명에서는 우뭇가사리를 올리고사카라이드 생산을 위한 기질로 직접 활용하는 당화 기술을 개발하고자 노력하였다.
In the case of agarase that decomposes agar, it is traditionally attracting attention from the viewpoint of securing biomass for bioenergy production. Attention has been paid in terms of producing additives and the like. In recent years, attention has been drawn from the viewpoint of biomass pretreatment for bioenergy production, but until now, the technology is limited to the decomposition of agarose or agar, or the development of commercially available methods is insignificant. In the case of using agarose or agar as a substrate for the enzymatic reaction, the pretreatment process of producing agarose or agar from the wood must first be performed, and thus, it is less economical than using the wood starch as the substrate. Therefore, in the present invention, efforts have been made to develop a glycosylation technology that utilizes the locust as a substrate for oligosaccharide production.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
본 발명자들은 전처리 과정 없이 우뭇가사리를 기질로 직접 활용하는 당화 기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였고 그 결과 고염 환경에서도 우뭇가사리를 직접 분해할 수 있는 아가레이즈를 생산하는 신규한 슈도알테로모나스 속 미생물을 동정해냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors earnestly researched to develop a saccharification technique that directly utilizes woodworm as a substrate without pretreatment. As a result, a novel Pseudo-Altermonas genus microorganism is produced that produces agarase that can directly degrade woodworm in high salt environments. By this, the present invention has been completed.
따라서 본 발명의 목적은 아가레이즈를 생산하는 신규한 슈도알테로모나스 속 미생물을 제공하는 데 있다.It is therefore an object of the present invention to provide a novel Pseudo-Altermonas microorganism which produces agarase.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물이 생산하는 아가레이즈를 제공하는 데 있다. Another object of the present invention to provide an agarase produced by the microorganism.
본 발명의 또 다른 목적은 전처리 없이 우뭇가사리를 직접 당화화는 방법을 제공하는 데 있다.
It is another object of the present invention to provide a method for directly saccharifying a starfish without pretreatment.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 아가레이즈(agarase)를 생산하는 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1(Pseudoalteromonas sp . JYBCL 1) KCCM11139P을 제공한다.
According to one aspect of the invention there is provided the pseudo Alteromonas J. wayibi CL producing an agarase (agarase) 1 (Pseudoalteromonas sp . JYBCL 1 ) provides KCCM11139P.
본 발명자들은 전처리 과정 없이 우뭇가사리를 기질로 직접 활용하는 당화 기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였고 그 결과 고염 환경에서도 우뭇가사리를 직접 분해할 수 있는 아가레이즈를 생산하는 신규한 슈도알테로모나스 속 미생물을 동정해냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors earnestly researched to develop a saccharification technique that directly utilizes woodworm as a substrate without pretreatment. As a result, a novel Pseudo-Altermonas genus microorganism is produced that produces agarase that can directly degrade woodworm in high salt environments. By this, the present invention has been completed.
본 발명의 아가레이즈 생성 미생물 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1은 우뭇가사리를 먹이로 삼는 소라의 내장에서 새롭게 분리해낸 것이다. 본 발명자들은 상기 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1을 기탁기관인 한국미생물보존센터에 2010년 11월 30일자로 기탁하고 기탁번호 KCCM11139P을 부여받았다. The agarase-producing microorganism Pseudo-Altermonas J. YB. C. 1 of the present invention is newly isolated from the intestine of a conch that feeds on woodworms. The present inventors deposited the Pseudo-Altermonas J. YB. C 1 to the Korea Microorganism Conservation Center, which is a depository institution, on November 30, 2010, and received the accession number KCCM11139P.
본 발명의 신규한 미생물의 16s rRNA의 염기서열은 서열목록 제1서열로 표시되며, 본 발명의 미생물은 그 계통상 슈도알테로모나스 속에 속한다.The base sequence of the 16s rRNA of the novel microorganism of the present invention is represented by SEQ ID NO: 1, and the microorganism of the present invention belongs to the genus Pseudoaltermonas.
본 발명의 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1이 생산하는 아가레이즈는 우뭇가사리를 그 기질로 하기 때문에, 전처리 과정 없이 우뭇가사리를 직접 분해할 수 있는 것을 그 특징으로 한다. 기존에 알려진 아가레이즈의 경우, 아가로즈나 아가를 효소 반응의 기질로 이용하기 때문에 우뭇가사리로부터 아가로즈나 아가를 생산하는 전처리 과정이 필수적이지만, 본 발명의 미생물이 생산하는 아가레이즈는 우뭇가사리를 아가로즈 또는 아가로 변환시키는 전처리 없이 이를 직접 분해하므로 경제적이다.The agarase produced by Pseudo-Altermonas J.W.B.CL 1 of the present invention is characterized by being able to directly decompose loaves without pretreatment, since the locus is a substrate. In the case of known agarases, agarose or agar is used as a substrate for the enzymatic reaction, and thus, pretreatment for producing agarose or agar from locus is essential, but the agarase produced by the microorganism of the present invention is agarose. Alternatively, it is economical because it is directly decomposed without the pretreatment to convert to agar.
본 명세서에서 사용되는 용어 “우뭇가사리”는 우뭇가사리과에 속하는 홍조류의 해조류로 학명은 Gelidium amansii이며 바닷말의 일종으로 한천의 주원료로 이용되는 바닷말들을 가리킨다. As used herein, the term "woom sari" is a seaweed of red algae belonging to the family of worms, the scientific name is Gelidium amansii and refers to sea horses used as the main raw material of agar as a kind of sea horse .
용어 "아가(agar)"란 한천이란 홍조류의 세포벽 구성성분인 점질성의 난소화성 복합다당류를 의미한다. 아가는 아가로스(agarose)와 아가로펙틴(agaropectin)으로 구성되며, 주로 약 70%의 아가로스와 약 30%의 아가로펙틴으로 구성되어 있다.The term "agar" refers to a viscous, indigestible complex polysaccharide that is a cell wall component of red algae. Agar consists of agarose and agaropectin, and is mainly composed of about 70% agarose and about 30% agalopectin.
본 발명의 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1는 기존에 알려진 다른 아가레이즈보다 현저하게 우수한 이온 안정성을 가지는 아가레이즈를 생산한다. 따라서, 상기 미생물이 생산한 아가레이즈는 고염 환경에서도 우수한 효소활성을 나타낸다.The Pseudo-Altermonas JYBCI 1 of the present invention produces an agarase having an ion stability significantly superior to other known agarases. Therefore, the agarase produced by the microorganism shows excellent enzymatic activity even in a high salt environment.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1이 생산하는 아가레이즈는 염화나트륨 농도 2000 mM에서의 효소활성이 염화나트륨 농도 0 mM에서의 효소활성의 70% 내지 100%이다.In one embodiment of the present invention, the agarase produced by Pseudo-Altermonas J.W.B.CL 1 of the present invention has an enzyme activity at a sodium chloride concentration of 2000 mM of 70% to 100% of an enzyme activity at a sodium chloride concentration of 0 mM.
다른 구현예에서, 상기 아가레이즈는 염화나트륨 농도 4000 mM에서의 효소활성이 염화나트륨 농도 0 mM에서의 효소활성의 50% 내지 80%이다.
In another embodiment, the agarase has an enzymatic activity at sodium chloride concentration of 4000 mM of 50% to 80% of enzymatic activity at sodium chloride concentration of 0 mM.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 염화나트륨 농도 2000 mM에서의 효소활성이 염화나트륨 농도 0 mM에서의 효소활성의 70% 내지 100%인 것을 특징으로 하는 아가레이즈를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides agarase, characterized in that the enzyme activity at sodium chloride concentration of 2000 mM is 70% to 100% of the enzyme activity at sodium chloride concentration of 0 mM.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 염화나트륨 농도 4000 mM에서의 효소활성이 염화나트륨 농도 0 mM에서의 효소활성의 50% 내지 80%인 것을 특징으로 하는 아가레이즈를 제공한다.According to another aspect of the invention, the present invention provides agarase, characterized in that the enzyme activity at
본 발명의 고염환경에서 우수한 안정성을 갖는 아가레이즈는 상술한 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1이 생산하는 효소이기 때문에, 상기 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.Since the agarase having excellent stability in the high salt environment of the present invention is an enzyme produced by the above-mentioned Pseudo-Altermonas J.W.B.C.L.1, the common contents in the relationship with the Pseudo-Alteronas. In order to avoid complexity, the description thereof is omitted.
일 구현예에서, 상기 아가레이즈는 우뭇가사리를 직접 그 기질로 한다. 우뭇가사리는 바다에서 유래한 것으로서 다량의 염을 함유하고 있지만, 본 발명의 아가레이즈가 고염환경에서도 높은 효소활성을 나타내므로 염을 완전히 제거하는 전처리 공정이 필요 없어 더욱 경제적이다.
In one embodiment, the agarase is directly based on the locus. Buttfish is derived from the sea and contains a large amount of salt, but since the agarase of the present invention shows high enzymatic activity even in a high salt environment, it is more economical because it does not need a pretreatment step for completely removing the salt.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 우뭇가사리를 취득하는 단계; 및 (b) 상기 취득한 우뭇가사리에 제 6 항의 아가레이즈를 처리하는 단계를 포함하는 우뭇가사리를 당화화는 방법을 제공한다.According to another aspect of the invention, the present invention comprises the steps of (a) obtaining a starfish; And (b) treating the agarase of claim 6 to the obtained woodfish.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 우뭇가사리를 취득하는 단계; 및 (b) 상기 취득한 우뭇가사리를 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1로 처리하는 단계를 포함하는 우뭇가사리를 당화화는 방법을 제공한다.According to another aspect of the invention, the present invention comprises the steps of (a) obtaining a starfish; And (b) providing a method for saccharifying a saccharin comprising the step of treating the obtained saccharin with Pseudo-Altermonas J. YB CI of any one of claims 1 to 5.
아가로즈나 아가를 효소 반응의 기질로 이용하는 경우, 우선적으로 우뭇가사리로부터 아가로즈나 아가를 생산하는 전처리 과정이 선행되어야 하지만, 본 발명의 방법에 따르는 경우 우뭇가사리를 올리고사카라이드 생산을 위한 기질로 직접 활용하기 때문에 해조류를 고효율로 당화할 수 있다.In the case of using agarose or agar as a substrate for the enzymatic reaction, a pretreatment process for producing agarose or agar from locus must be preceded. However, according to the method of the present invention, the locus is used as a substrate for oligosaccharide production. Therefore, algae can be saccharified with high efficiency.
본 발명의 일 구현예에서, 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1이 생산하는 아가레이즈로 우뭇가사리를 처리한 후 사용한 아가레이즈를 정제하여 재사용할 수 있으며 이 경우 더욱 효율적이고 경제적인 일련의 당화기술 체계를 확립할 수 있다.
In one embodiment of the present invention, the agarase is treated with Agarase produced by Pseudo-Altermonas J.W.B.C.L.1, and the used agarase can be purified and reused, in which case a series of more efficient and economical glycosylation systems are employed. It can be established.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(ⅰ) 본 발명은 신규한 슈도알테로모나스 속 미생물 및 그가 분비하는 아가레이즈를 제공한다. (Iii) The present invention provides novel Pseudo-Altermonas microorganisms and agarases secreted by them.
(ⅱ) 본 발명의 미생물이 생산하는 아가레이즈는 매우 우수한 염 안정성을 가질 뿐만 아니라, 전처리 없이도 우뭇가사리를 직접 분해할 수 있으므로 우뭇가사리를 기질로 직접 활용하는 당화 기술을 제공한다.
(Ii) The agarase produced by the microorganism of the present invention not only has a very good salt stability, but also can directly decompose woodworms without pretreatment, thereby providing a saccharification technique that utilizes woodworms directly as a substrate.
도 1은 분리 미생물의 콜로니 군집 형태 및 루골 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 분리 미생물의 생장에 염화나트륨이 미치는 영향을 보여주는 배양곡선이다(■; NaCl 5g/l에서의 생장곡선, ●; NaCl 15g/l에서의 생장곡선, ▲; NaCl 25g/l에서의 생장곡선).
도 3은 본 발명의 분리 미생물의 상동성 비교분석을 위하여 작성한 계통수를 나타낸다.
도 4는 분리 미생물의 아가 분해능을 확인하기 위한 균의 생장과 배지 내 점도를 측정한 결과이다(■; 대조군 점도, ●; 실험군 점도, ▲; 대조군 흡광도 ▼; 실험군 흡광도).
도 5는 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1이 분비하는 아가레이즈의 온도 최적화 실험결과를 나타낸다.
도 6은 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1이 분비하는 아가레이즈의 pH 최적화 실험결과를 나타낸다.
도 7은 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1이 분비하는 아가레이즈의 NaCl 농도가 증가함에 따른 상대적 활성도의 감소를 나타낸 그래프이다.
도 8은 기존에 알려진 아가레이즈의 NaCl 농도가 증가함에 따른 상대적 활성도의 감소를 나타낸 그래프이다.
도 9는 아가레이즈 추출물 SDS PAGE 전기영동을 시행하였고, 따로 제작한 아가 겔에 상기 전기영동 겔을 덮어 반응시킨 후 루골용액으로 염색하여 확인한 아가레이즈 밴드이다.Figure 1 shows the colony colony form and golgol staining results of the isolated microorganisms.
2 is a culture curve showing the effect of sodium chloride on the growth of isolated microorganisms (■; growth curve in NaCl 5g / l, ●; growth curve in NaCl 15g / l, ▲; growth curve in NaCl 25g / l ).
Figure 3 shows the phylogenetic tree prepared for the comparative analysis of homology of the isolated microorganism of the present invention.
Figure 4 is the result of measuring the growth of the bacteria and the viscosity in the medium to confirm the agar resolution of the isolated microorganisms (■; control viscosity, ●; experimental group viscosity, ▲; control absorbance ▼; experimental group absorbance).
FIG. 5 shows the results of a temperature optimization experiment of agarase secreted by Pseudo-Altermonas J.W.B.CL1.
FIG. 6 shows the results of pH optimization experiments of agarase secreted by Pseudo-Altermonas J.Y.B.CL1.
Figure 7 is a graph showing the decrease in relative activity as the NaCl concentration of agarase secreted by Pseudo-Altermonas J. Y. B. CL 1 increases.
8 is a graph showing a decrease in relative activity with increasing NaCl concentration of the known agarase.
9 is agarase extract SDS PAGE electrophoresis was performed by covering the electrophoretic gel on the aga gel prepared separately, and then reacted with arugel solution stained agarase band.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory only and are not to be construed as limiting the scope of the present invention. It will be self-evident.
실시예Example
본 발명에서는, 우뭇가사리를 먹이로 삼는 소라의 내장에서 아가레이즈를 분비하는 미생물을 찾고자 노력하였다. 아가 분해능을 갖는 미생물을 선별하기 위해, 두 가지의 선별 조건을 이용하였다. 첫째로 고체 아가 배지 상에 미생물이 형성하는 콜로니 주변에 침식 작용이 일어났는가를 확인하였고, 둘째로는 루골용액으로 고체배지를 염색하여 아가 분해가 일어났는가를 확인하였다. In the present invention, an effort was made to find a microorganism that secretes agarase in the intestine of a conch that feeds on the larvae. In order to select microorganisms having agar resolution, two selection conditions were used. First, it was confirmed whether erosion occurred around the colonies formed by the microorganisms on the solid agar medium. Second, the agar decomposition was confirmed by staining the solid medium with a rugial solution.
배양 배지 내에 아가가 분해되어 존재하는 환원당과 효소 활성도 측정에서 생성되는 환원당, 보다 정확하게는 증가된 환원말단기의 양을 정량적으로 측정하기 위해 DNS 방법을 이용하였다. DNS 시약은 2M NaOH 50 ㎖에 0.25 g의 3,5-디니트로살리실산과 75 g의 소듐 포타슘 타트레이트(sodium potassium tartrate)를 녹이고 부피가 250 ㎖이 되도록 물로 희석하여 제조하였다. 환원당생성량은 200 ㎕의 시료와 900 ㎕의 DNS 시약을 혼합하고, 10분간 99℃에서 반응시킨 후에, 상온으로 식히고 자외선/가시광선 흡광장치(UV/Vis spectrophotometer)로 546 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 검량선은 갈락토오스를 이용하여 작성하였다.The DNS method was used to quantitatively determine the amount of reducing sugars present in the culture medium and the reducing sugars produced in the determination of enzyme activity, and more precisely, the reduced terminal groups. DNS reagent was prepared by dissolving 0.25 g of 3,5-dinitrosalicylic acid and 75 g of sodium potassium tartrate in 50 ml of 2M NaOH and diluting with water to a volume of 250 ml. The amount of reducing sugar produced was mixed with 200 μl of sample and 900 μl of DNS reagent, reacted at 99 ° C. for 10 minutes, cooled to room temperature, and absorbed at 546 nm using an UV / Vis spectrophotometer. It was. The calibration curve was prepared using galactose.
아가레이즈의 활성 측정 실험을 위해서는, 0.25%의 아가로즈를 20mM Tris-cl 버퍼에 녹인 것을 기질 용액으로 하고 아래에서 기술할 실시예 5의 과정에서 확보한 아가레이즈 추출물을 효소액으로 사용하여 둘을 4:1의 비율로 혼합하고, 120 rpm으로 반응시켜 주었다.
For experiments measuring the activity of agarase, 0.25% agarose dissolved in 20mM Tris-cl buffer was used as a substrate solution, and the agarase extract obtained in the procedure of Example 5 to be described below was used as an enzyme solution. The mixture was mixed at a ratio of 1 and allowed to react at 120 rpm.
<< 실시예Example 1> 1> 신규한New 아가레이즈Agarase 분비 해양 미생물의 분리 Isolation of Secretory Marine Microorganisms
서울 노량진 수산시장에서 구입한 소라의 내장을 처리하여 접종 시료액으로 사용하였다. 접종 배지는 4일정도의 간격으로 4차에 걸쳐 계대 배양해 주었고, 하기 표 1과 같은 조성으로 배양 배지를 제조하였다. The intestines of Sora, which were purchased from Noryangjin Fish Market in Seoul, were treated and used as inoculum sample solution. Inoculation medium was subcultured four times at intervals of about 4 days, to prepare a culture medium with the composition shown in Table 1 below.
질소원으로 사용된 이스트 추출물(yeast extract)에는 여러 가지 영양분이 많이 함유되어 있기 때문에, 보다 선별적으로 아가 분해균주를 선별하기 위해, 3차 배양부터는 이스트 추출물을 첨가하지 않았다. Since yeast extract used as a nitrogen source contains many nutrients, yeast extract was not added from the tertiary culture in order to select agar decomposition strains more selectively.
4차에 걸친 계대 배양 후에, NaCl 5 g/l, (NH4)2SO4 1 g/l, K2HPO4 2 g/l로 희석 용액을 만들고 10-4, 10-5 배수로 희석하여 1차 계대배양 배지와 동일한 고체배지(아가만 18 g/l)에 도말해주었다. 고체 배지 배양 결과, 콜로니 주변에 뚜렷한 침식을 보이는 미생물이 발견되었고, 이를 순수 분리하여, 루골용액으로 확인한 결과 아가레이즈를 체외로 분비하는 것을 확인할 수 있었다. 분리 미생물의 콜로니 군집 형태 및 루골 염색 결과를 도 1에 나타내었다.After 4 passages, NaCl 5 g / l, (NH 4 ) 2 SO 4 1 g / l, K 2 HPO 4 Diluted solutions were prepared at 2 g / l and diluted in multiples of 10 −4 and 10 −5 and spread on the same solid medium (18 g / l only) as the primary passage medium. As a result of the culture of the solid medium, microorganisms showing distinct erosion were found around the colonies, and purely separated, and confirmed by the Lugol solution, it was confirmed that the agarase was secreted in vitro. Colony colony form and golgol staining results of the isolated microorganisms are shown in FIG.
<< 실시예Example 2> 분리 미생물의 2> Separation of Microorganisms 생리적생화학적Physiological Biochemical 특성 characteristic
분리 미생물의 생리적, 생화학적 특성을 조사하였다. 분리 미생물의 생리적, 생화학적 특성 조사를 위해서는, bioMerieux사의 API 20NE, API ZYM 키트를 사용하였다. 이때 시료액은 멸균된 식염수와 해수용액의 두 가지 경우로 제조하였다. 분리 미생물의 생리적, 생화학적 특성은 하기 표 2에 나타내었다.The physiological and biochemical characteristics of the isolated microorganisms were investigated. To investigate the physiological and biochemical properties of the isolated microorganisms, API 20NE and API ZYM kits of bioMerieux were used. The sample solution was prepared in two cases, sterile saline solution and seawater solution. Physiological and biochemical properties of the isolated microorganisms are shown in Table 2 below.
전형적실험(
동화실험(
효소활성(Enzyme activity
APIAPI
zymzym
))
분리 미생물의 경우, 몇 가지 효소의 활성이 식염수보다 해수에서 높게 나타났고, 이는 염화나트륨이 효소의 활성에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. For isolated microorganisms, the activity of some enzymes was higher in seawater than in saline, suggesting that sodium chloride could affect the activity of the enzyme.
또한 분리 미생물의 생장에 염화나트륨이 미치는 영향을 확인하기 위해, 1차 계대배양 배지에서 염화나트륨의 농도를 15 g/l, 25 g/l로 조절하여 배양실험을 수행하였고 그 배양곡선을 도 2에 나타내었다.
In addition, in order to confirm the effect of sodium chloride on the growth of isolated microorganisms, the culture experiment was performed by adjusting the concentration of sodium chloride to 15 g / l, 25 g / l in the primary passage culture medium, the culture curve is shown in Figure 2 It was.
<실시예 3> 분리 미생물의 동정Example 3 Identification of Isolated Microorganisms
분리 미생물의 정확한 동정을 위해, 16s rRNA 동정을 시행하였다. 분리 미생물의 염색체 DNA를 추출한 후, 중합효소 증폭법(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 16s rRNA 단편을 증폭하였고 이의 염기서열을 결정하여 이를 서열목록 제1서열에 나타내었다. 상기 16s rRNA 염기서열을 미국 생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 BLASTN 프로그램을 이용하여 GenBank의 데이터베이스와 비교하였다. 그 결과 상기 16s rRNA 염기서열과 100% 동일한 염기서열을 갖는 기존의 미생물은 존재하지 않았는바 본 발명의 분리 미생물은 신종으로 판명되었다.For accurate identification of isolated microorganisms, 16s rRNA identification was performed. After extracting the chromosomal DNA of the isolated microorganism, 16s rRNA fragment was amplified by polymerase chain reaction (PCR), and its nucleotide sequence was determined and shown in the first sequence list. The 16s rRNA sequences were compared to GenBank's database using the BLASTN program of the National Center for Biotechnology Information (NCBI). As a result, there was no existing microorganism having a
상동성 비교분석은 ClastalW와 Mega 4 프로그램을 이용하여 시행하였고 작성한 계통수를 도 3에 나타내었다. 분리 미생물은 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas)속에 속하는 것으로 동정되었으며, 최종적으로 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1(Pseudoalteromonas sp. JYBCL 1)으로 명명하여 이를 기탁기관 한국미생물보존센터에 2010년 11월 30일자로 기탁하고 기탁번호 KCCM11139P을 부여받았다.
Homology comparative analysis was performed using ClastalW and
<실시예 4> 분리 미생물의 아가 분해능 확인Example 4 Determination of Agar Resolution of Isolated Microorganisms
슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1의 아가 분해능을 확인하기 위해 추가적인 배양 실험을 수행하였다. 배양배지는 1차 계대배양 배지와 동일하게(아가의 양만 2 g/l) 제조하였고 균의 생장과 배지 내 점도를 측정하여 도 4에 나타내었다. 배양 후 시간이 지남에 따라, 배지 내 점도가 줄어드는 것을 육안으로도 확인할 수 있었으며, 실제 점도 측정 결과도 균이 생장함에 따라 배지 내 점도가 줄어드는 것으로 확인되었다.
Further culture experiments were performed to confirm the agar resolution of Pseudo-Altermonas J.Y.B.CL1. The culture medium was prepared in the same manner as the primary passage medium (only 2 g / l of agar), and the growth of bacteria and the viscosity in the medium were measured and shown in FIG. 4. Over time after incubation, the viscosity in the medium was confirmed by the naked eye, and the actual viscosity measurement results were confirmed that the viscosity in the medium decreases as the bacteria grow.
<실시예 5> 당화를 위한 아가레이즈 추출물 확보 Example 5 Securing Agarase Extract for Saccharification
슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1의 경우, 아가레이즈를 체외로 분비하는 것이 확인되었기에, 하기 방법으로 아가레이즈 추출물을 확보하였다. 균주를 배양한 후, 12시간이 되었을 때 4℃에서 7000 g의 가속도로 30분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액을 모은 뒤 (NH4)2SO4를 70% (g/㎖)가 되도록 첨가하며 녹여주었다. 그 후, 4℃에서 14500 g의 가속도로 30분간 원심분리하고 상등액은 버린 뒤에 단백질 침전물을 20 mM Tris-cl 버퍼(pH 8)로 재부유시켜 아가레이즈 추출물을 확보하였다. 또한 필요시에는 동일한 버퍼에서 투석하여 정제하였다.
In the case of Pseudo-Altermonas J. YBCI 1, it was confirmed that the secretion of agarase in vitro, thereby securing the agarase extract by the following method. After incubating the strain, the cells were centrifuged for 30 minutes at an acceleration of 7000 g at 4 ° C. after 12 hours. After centrifugation, the supernatant was collected and dissolved (NH 4 ) 2 SO 4 to 70% (g / mL). Thereafter, the mixture was centrifuged for 30 minutes at an acceleration of 14500 g at 4 ° C., and the supernatant was discarded and the protein precipitate was resuspended in 20 mM Tris-cl buffer (pH 8) to obtain an agarase extract. If necessary, it was purified by dialysis in the same buffer.
<실시예 6> 당화를 위한 아가레이즈 활성 최적화Example 6 Agarase Activity Optimization for Glycation
슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1이 분비하는 아가레이즈의 활성 최적화를 위해 온도와 pH 최적화 실험을 수행하였다. 온도 최적화 실험은 15, 25, 35, 45 및 55℃의 다섯 가지 온도에서, 하룻동안 반응 시킨 후 반응액 내에 생성된 환원당의 양을 측정함으로써 수행하였다. pH 최적화 실험은 pH 4, 5, 6, 7, 8 및 9의 여섯 가지 pH에서, 하루 동안 반응시킨 후 반응액 내에 생성된 환원당의 양을 측정함으로써 수행하였으며 그 결과를 상대적 활성도로써 각각 도 5 및 도 6에 나타내었다.
Temperature and pH optimization experiments were performed to optimize the activity of Agarase secreted by Pseudo-Altermonas J.Y.B.CL1. Temperature optimization experiments were carried out by measuring the amount of reducing sugars formed in the reaction solution after one day of reaction at five temperatures of 15, 25, 35, 45 and 55 ℃. pH optimization experiments were performed by measuring the amount of reducing sugars produced in the reaction solution after six days of reaction at six different pHs of
<< 실시예Example 7> 7> 아가레이즈의Agarase 구조적 안정도 측정 Structural Stability Measurement
슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1이 분비하는 아가레이즈의 3차원 단백질 구조가 이온적 스트레스에 얼마나 안정적인가를 측정하기 위한 실험을 문헌(Hiroshi Xavier Chiura et al., Purification and Characterisation of a Novel Agarase Secreted by a Marine Bacterium, Pseudoalteromonas sp. Strain CKT1, Microbes and Environments 15(1):11-22(2000))에 기재된 방법에 따라 수행하였다. An experiment was conducted to determine how stable the three-dimensional protein structure of Agarase secreted by Pseudo-Altermonas J.Y.B.C.I.I. (Hiroshi Xavier Chiura et al., Purification and Characterization of a Novel Agarase Secreted by a Marine Bacterium, Pseudoalteromonas sp.Strain CKT1, Microbes and Environments 15 (1): 11-22 (2000)).
아가로즈 기질 용액에 염화나트륨을 농도별로 첨가하여, 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1이 분비하는 아가레이즈의 NaCl 농도가 증가함에 따른 상대적 활성도의 감소를 측정하여 도 7에 나타내었다. 또한, 문헌(Hiroshi Xavier Chiura et al., Purification and Characterisation of a Novel Agarase Secreted by a Marine Bacterium, Pseudoalteromonas sp. Strain CKT1, Microbes and Environments 15(1):11-22(2000))에 기재된 종래 아가레이즈의 NaCl 농도가 증가함에 따른 상대적 활성도의 감소는 도 8에 나타내었다.Sodium chloride was added to the agarose substrate solution by concentration, and the relative activity decrease as the NaCl concentration of the agarase secreted by Pseudo-Altermonas J.Y.B.C.I. 1 was measured and shown in FIG. 7. See also Hiroshi Xavier Chiura et al., Purification and Characterization of a Novel Agarase Secreted by a Marine Bacterium, Pseudoalteromonas sp.Strain CKT1, Microbes and Environments The decrease in relative activity as the NaCl concentration of the conventional agarase described in 15 (1): 11-22 (2000)) is shown in FIG. 8.
도 7 및 8을 비교해보면, 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1이 분비하는 아가레이즈가 기존에 알려진 다른 아가레이즈보다 현저하게 우수한 이온 안정성을 가짐을 확인할 수 있다.
Comparing FIGS. 7 and 8, it can be seen that the agarase secreted by Pseudo-Altermonas J.W.B.C.L. 1 has significantly superior ion stability than other known agarases.
<< 실시예Example 8> 8> 아가레이즈의Agarase 확인 Confirm
체외분비 단백질 중 아가레이즈의 존재 여부를 확인하기 위해 지모그람(zymogram) 분석을 실시하였다. 실시예 5에서 확보한 아가레이즈 추출물로 에스디에스페이지 전기영동을 시행하였고, 따로 제작한 아가 겔에 전기영동 겔을 덮어 반응시킨 후 루골용액으로 염색하여 아가레이즈 밴드를 확인하여 도 9에 나타내었다.
Zymogram analysis was performed to confirm the presence of agarase in the secreted protein. SDS electrophoresis was performed with the agarase extract obtained in Example 5, and the agar gel was prepared by reacting with an electrophoretic gel, and then stained with lugol solution to confirm the agarase band.
<< 실시예Example 9> 9> 아가레이즈를Agarase 이용한 우뭇가사리의 직접 Direct use of woodworm 당화Glycation
확보한 아가레이즈 추출물로 우뭇가사리를 직접 당화하기 위한 실험을 실시하였다. 아가, 우뭇가사리 마쇄가루를 각 0.25%(w/v)로 함유하는 완충용액에 아가레이즈 추출물을 첨가하여 두 가지 기질의 환원당 생성농도와 아가를 기질로 사용하였을 경우에 생성된 환원당의 양을 100%로 하였을 때의 두 기질의 상대적 활성도를 아래의 표 3에 나타내었다. Experiments were performed to directly saccharin the locus with the obtained agarase extract. Agarase extract was added to a buffer containing 0.25% (w / v) of agar and fine ash powder, respectively. Relative activity of the two substrates in the following is shown in Table 3 below.
실험결과 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1이 분비하는 아가레이즈는 기존에 알려진 다른 아가레이즈와는 달리 우뭇가사리로부터 아가로즈나 아가를 생산하는 전처리 과정없이 우뭇가사리를 직접 그 기질로 활용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
As a result, it was confirmed that agarase secreted by Pseudo-Altermonas J.W.B.Ciel 1 can be directly used as a substrate without pretreatment to produce agarose or agar from woodworms, unlike other known agarases. .
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Yonsei University <120> Novel Pseudoalteromonas sp. and Agarase Produced by the Same <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 947 <212> DNA <213> Pseudoalteromonas sp. JYBCL 1, 16s rRNA <400> 1 ggtacgtcct cccgagggtt agactatcta cttctggagc aacccactcc catggtgtga 60 cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgt cattctgata cgcgattact 120 agcgattccg acttcatgga gtcgagttgc agactccaat ccggactacg acgcacttta 180 agtgattcgc ttaccttcgc aggttcgcag cactctgtat gcgccattgt agcacgtgtg 240 tagccctaca cgtaagggcc atgatgactt gacgtcgtcc ccaccttcct ccggtttatc 300 accggcagtc tccttagagt tctcagcatt acctgctagc aactaaggat aggggttgcg 360 ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac aacacgagct gacgacagcc atgcagcacc 420 tgtatcagag ttcccgaagg caccaaacca tctctggtaa gttctctgta tgtcaagtgt 480 aggtaaggtt cttcgcgttg catcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540 ccgtcaattc atttgagttt taaccttgcg gccgtactcc ccaggcggtc tacttaatgc 600 gttagctttg aaaaacagaa ccgaggctcc gagcttctag tagacatcgt ttacggcgtg 660 gactaccggg gtatctaatc ccgtttgctc cccacgcttt cgtacatgag cgtcagtgtt 720 gacccaggtg gctgccttcg ccatcggtat tccttcagat ctctacgcat ttcaccgcta 780 cacctgaaat tctaccaccc tctatcacac tctagtttgc cagttcgaaa tgcagttccc 840 aggttgagcc cggggctttc acatctcgct taacaaaccg cctgcgtacg ctttacgccc 900 agtaatttcc gattaacgct cgcaccctcc gtattaccgc ggctgct 947 <110> Industry-University Cooperation Foundation Yonsei University <120> Novel Pseudoalteromonas sp. and Agarase Produced by the Same <160> 1 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 947 <212> DNA Pseudoalteromonas sp. JYBCL 1, 16s rRNA <400> 1 ggtacgtcct cccgagggtt agactatcta cttctggagc aacccactcc catggtgtga 60 cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgt cattctgata cgcgattact 120 agcgattccg acttcatgga gtcgagttgc agactccaat ccggactacg acgcacttta 180 agtgattcgc ttaccttcgc aggttcgcag cactctgtat gcgccattgt agcacgtgtg 240 tagccctaca cgtaagggcc atgatgactt gacgtcgtcc ccaccttcct ccggtttatc 300 accggcagtc tccttagagt tctcagcatt acctgctagc aactaaggat aggggttgcg 360 ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac aacacgagct gacgacagcc atgcagcacc 420 tgtatcagag ttcccgaagg caccaaacca tctctggtaa gttctctgta tgtcaagtgt 480 aggtaaggtt cttcgcgttg catcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540 ccgtcaattc atttgagttt taaccttgcg gccgtactcc ccaggcggtc tacttaatgc 600 gttagctttg aaaaacagaa ccgaggctcc gagcttctag tagacatcgt ttacggcgtg 660 gactaccggg gtatctaatc ccgtttgctc cccacgcttt cgtacatgag cgtcagtgtt 720 gacccaggtg gctgccttcg ccatcggtat tccttcagat ctctacgcat ttcaccgcta 780 cacctgaaat tctaccaccc tctatcacac tctagtttgc cagttcgaaa tgcagttccc 840 aggttgagcc cggggctttc acatctcgct taacaaaccg cctgcgtacg ctttacgccc 900 agtaatttcc gattaacgct cgcaccctcc gtattaccgc ggctgct 947
Claims (11)
Pseudoalteromonas sp. JYBCL 1 ) KCCM11139P, which produces agarase (Agarase) directly as a substrate and the nucleotide sequence of 16S rRNA is represented by SEQ ID NO: 1 .
The method of claim 1, wherein the agarase is Pseudo-Altermonas J. YB CI, characterized in that the enzyme activity at sodium chloride concentration of 2000 mM is 70% to 80% of the enzyme activity at sodium chloride concentration of 0 mM.
The method of claim 1, wherein the agarase is Pseudo-Altermonas J. YB CI, characterized in that the enzyme activity at sodium chloride concentration of 4000 mM is 50% to 60% of the enzyme activity at sodium chloride concentration of 0 mM.
(a) 우뭇가사리를 취득하는 단계; 및
(b) 상기 취득한 우뭇가사리를 제 1 항의 슈도알테로모나스 제이와이비씨엘 1로 처리하는 단계. The method of saccharifying a starfish includes the following steps:
(a) obtaining a starfish; And
(b) treating the obtained wormwood with Pseudo-Altermonas J. YBCL 1 of claim 1.
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Microbes and Environments, Vol.15, pp.11-22(2000.) * |
Microbes and Environments, Vol.15, pp.11-22(2000.)* |
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X091 | Application refused [patent] | ||
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