KR101219572B1 - Bacillus amyloliquefaciens B4-4 oligotrophic strain having enzymatic and antibiotic activities - Google Patents

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Abstract

본 발명은 시금장으로부터 분리된 뛰어난 효소 활성 및 항균 활성을 갖는 신규의 저영양 세균인 바실러스 아밀로리큐파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) B4-4 균주에 관한 것이다. 본 발명의 저영양(oligotrophic) 균주는 셀룰라아제, 아밀라아제, 프로테아제 및 자일라나아제와 같은 각종 발효 효소의 생산, 및 식중독균 및 대장균에 대한 항균성을 동시에 가지므로, 발효 식품의 제조에 유용하다.The present invention relates to a Bacillus amyloliquefaciens B4-4 strain, which is a novel low-nutrition bacterium having excellent enzymatic and antimicrobial activity isolated from spinach . The oligotrophic strains of the present invention are useful for the production of fermented foods because they have the production of various fermenting enzymes such as cellulase, amylase, protease and xylanase, and antimicrobial activity against food poisoning bacteria and E. coli.

발효식품, 시금장, 효소활성, 항균작용, 식중독균, 저영양 세균 Fermented Food, Spinach, Enzyme Activity, Antibacterial Activity, Food Poisoning Bacteria, Low Nutrition Bacteria

Description

효소 활성 및 항균 활성을 갖는 저영양 바실러스 아밀로리큐파시엔스 Ｂ4-4 균주{Bacillus amyloliquefaciens B4-4 oligotrophic strain having enzymatic and antibiotic activities}Low nutrient Bacillus amyloliquefaciens B4-4 oligotrophic strain having enzymatic and antibiotic activities

본 발명은 시금장으로부터 분리된 뛰어난 효소 활성 및 항균 활성을 갖는 신규의 저영양 균주에 관한 것으로서, 상세하게는 셀룰라아제(cellulase), 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease) 및 자일라나아제(xylanase)와 같은 각종 발효 효소의 생산 및 식중독균 및 대장균에 대한 항균성을 동시에 가지므로, 발효 식품의 제조에 유용한 저영양 바실러스 아밀로리큐파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) B4-4 균주에 관한 것이다.The present invention relates to a novel low-nutrition strain having excellent enzymatic and antimicrobial activity isolated from spinach, and more specifically, cellulase, amylase, protease and xylanase and xylanase. Since it has the same production of various fermentation enzymes and antimicrobial activity against food poisoning bacteria and E. coli at the same time, it relates to a low-nutrition Bacillus amyloliquefaciens B4-4 strain useful for the production of fermented food.

농식품부의 3대 전략 및 주요 정책과제 중 전통발효식품의 과학화 및 산업화가 포함되어 있으나 체계적인 연구가 미흡한 실정으로 전통발효식품인 김치, 고추장, 된장, 간장, 젓갈류 등 전통 발효식품을 중심으로 맛의 고급화, 품질 균일화, 보존기간 연장을 위한 국내 전통 우수 발효미생물의 개발 및 보존관리에 대한 체계적인 연구가 시급한 실정이다. 특히 지구상 생체중량의 60%를 미생물이 차지하고 있으나 단지 1% 정도만이 분리되거나 배양되고 있어 최근 이들 난배양 미생물이 갖고 있는 무한한 기능을 활용하기 위한 기술개발의 필요성이 대두되고 있다.Among the three strategies and major policy tasks of the Ministry of Agriculture and Food Affairs, it includes the scientific and industrialization of traditional fermented foods, but the systematic research is insufficient. There is an urgent need for systematic researches on the development and preservation management of traditional fermented microorganisms in Korea for quality improvement, quality uniformity and extension of preservation period. In particular, 60% of the earth's biomass is occupied by microorganisms, but only about 1% is being isolated or cultured, and thus, the development of technology for utilizing the infinite functions of these cultured microorganisms has recently emerged.

본 발명의 목적은 각종 효소 활성 및 광범위한 항균 활성을 동시에 가지는 신규의 저영양 균주인 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a novel low nutrient strain Bacillus amyloliquefaciens B4-4 having various enzyme activities and a wide range of antimicrobial activities.

본 발명은 시금장으로부터 분리 및 동정된, 현저한 효소 활성 및 항균 활성을 갖는 저영양 세균인 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주를 제공한다.The present invention provides a Bacillus amyloliquefaciens B4-4 strain which is a low nutrient bacterium having significant enzymatic and antimicrobial activity, isolated and identified from the assay.

본 발명에 따른 상기 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주는 발효 관련 효소로서 셀룰라아제, 아밀라아제, 프로테아제 및 자일라나아제를 생산하고, 칸디다(Candida), 리스테리아(Listeria), 살모넬라(salmonella), 스태필로코커스(Staphilococcus), 바실러스 시리우스(Bacillus cereus)와 같은 식중독균 및 대장균(E.coli)에 대하여 항균력을 갖는 것을 특징으로 한다.To the Bacillus amyl liqueur according to the invention Pacific Enschede B4-4 strain is a fermentation-related enzyme producing cellulase, amylase, protease, and xylene Rana Ajay, Candida (Candida), Listeria monocytogenes (Listeria), Salmonella (sa lmonella), Stability Such as Staphilococcus, Bacillus cereus It is characterized by having antimicrobial activity against food poisoning bacteria and E. coli ( E. coli ).

또한, 상기 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주는 인체에 해로운 용혈력이 없어 식품에 안전하게 사용될 수 있다.In addition, the Bacillus amyloliquefaciens B4-4 strain does not have a hemolytic force harmful to the human body can be used safely in food.

본 발명자들은 전통 발효식품 중 하나인 경북 영천 지방의 속성장인 시금장으로부터 저영양 배지를 이용해 분리 동정하여, 효소 활성 및 항균 활성을 동시에 가지며, 당생성 능력이 있는 상기의 신규 저영양 균주를 분리 동정하였다.The present inventors are isolated and identified using a low nutrition medium from Sijangjang, a fast-growing plant in Gyeongbuk, Yeongcheon, one of the traditional fermented foods, and has the enzyme and antimicrobial activity at the same time. It was.

본 발명자들은 상기 신규의 균주를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2009년 11월 4일자로 기탁번호 KACC 91503P로 기탁하였다.The present inventors deposited the novel strain under the accession number KACC 91503P as of November 4, 2009, at the National Institute of Agricultural Science.

상기 균주는, 저영양 균주라는 특성으로 인하여, 통상의 고농도 배지를 이용한 방법으로는 그 분리가 불가능하지만, 분리 후 증식은 통상의 배양 방법을 이용할 수 있다.Due to the characteristics of the low nutrient strain, the strain cannot be separated by a method using a conventional high concentration medium, but the growth after separation can use a conventional culture method.

본 발명의 신규한 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주는 탁월한 셀룰라아제, 아밀라아제, 프로테아제 및 자일라나아제 효소 생성 능력 및 칸디다, 리스테리아, 살모넬라, 스태필로코커스, 바실러스 시리우스 등의 식중독균 및 대장균에 광범위한 항균 능력, 및 당 생성능과 같이 복합적인 기능을 갖는 균주로서, 강한 효소 활성 및 발효 중 오염 가능한 잡균 및 식중독균의 억제가 가능하여, 발효 관련 효소 생산, 발효식품의 제조 및 발효식품의 품질 고급화에 유용할 수 있다.The novel Bacillus amyloliquefaciens B4-4 strain of the present invention has excellent cellulase, amylase, protease and xylanase enzyme producing ability and Candida, Listeria, Salmonella, Staphylococcus, Bacillus sirius Such as Food poisoning bacteria and E. coli has a wide range of antibacterial and complex functions, such as sugar production ability, it is possible to suppress the enzymatic and food poisoning bacteria contaminated during strong fermentation activity, fermentation-related enzyme production, fermented food production and fermented food quality May be useful for advanced

실시예Example

본 실시예는 본 발명의 신규한 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주의 분리, 분류 및 동정, 항균 스펙트럼 분석, 항균활성 검정에 대해 설명한다.This example describes the isolation, classification and identification of the novel Bacillus amyloliquefaciens B4-4 strain of the present invention, antimicrobial spectrum analysis, and antimicrobial activity assay.

본 발명에 따른, 효소와 당 및 항균물질을 생산하는 균주를 분리하기 위하 여, 경북 영천 지역의 속성장인 시금장의 시료를 폴리에틸렌 비닐 백에 채취하여 실험실로 운반하였다. 효모 추출물 0.5g; 프로테오스 펩톤(proteose peptone) 3번 0.5g; 카스아미노산(casamino acids) 0.5 g; 덱스트로오스 0.5g; 가용성 전분 0.5g; 프루브산 나트륨(sodium pyruvate) 0.3g; 인산수소칼륨(dipotassium phosphate) 0.3g; 황산마그네슘(magnesium sulfate) 0.05g; 증류수 1000㎖로 구성되고, pH 7.0~7.2로 조정된 저영양세균 분리 배지인 R2A를, 증류수를 이용하여 각각 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 배로 희석하여 사용하였다.In order to isolate the strains producing enzymes, sugars and antibacterial substances according to the present invention, samples of the spinach, which are fast-growing plants in Yeongcheon, Gyeongbuk, were collected in a polyethylene vinyl bag and transported to a laboratory. 0.5 g of yeast extract; 0.5 g 3 of proteose peptone; 0.5 g of casamino acids; 0.5 g of dextrose; 0.5 g of soluble starch; 0.3 g sodium pyruvate; 0.3 g of potassium hydrogen phosphate; 0.05 g of magnesium sulfate; R2A, a low nutrient bacterial separation medium composed of 1000 ml of distilled water and adjusted to pH 7.0-7.2, was diluted by 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 times using distilled water, respectively.

상기 시금장 시료로부터의 수득된 다양한 저영양 세균들을 상기 R2A 평판 배지에서 배양한 후, 자라나는 균주들에 대하여 효소 활성과 당 생성력 및 식중독균에 대한 항균력을 측정하였다.After cultivating various low-nutrition bacteria obtained from the sample from the R2A plate medium, the enzyme activity, sugar production capacity and food poisoning bacteria were observed for the growing strains. Antimicrobial activity was measured.

그 중 셀룰라아제, 아밀라아제, 프로테아제 및 자일라나아제 효소 생성능을 갖고, 칸디다, 리스테리아, 살모넬라, 스태필로코커스, 바실러스 시리우스 등의 식중독균 및 대장균의 생육을 저지시키는 능력을 가진 저영양 균주를 선발하였다.Among them, cellulase, amylase, protease and xylanase enzyme-producing ability, Candida, Listeria, Salmonella, Staphylococcus, Bacillus sirius Such as Low nutrient strains with the ability to inhibit the growth of food poisoning bacteria and Escherichia coli were selected.

상기 선발된 저영양 균주의 속명을 확인하고자 16S rDNA를 분리하여 염기서열을 확인하였다. 그 결과, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 아밀로리큐파시엔스와 99% 상동성을 가지고 있으며, 다른 종들과의 유연관계 분석 (도 5)에서도 바실러스 아밀로리큐파시엔스와 매우 밀접한 관계를 나타내었다. 이에 따라, 상기 효소 활성 및 항균 활성에 대해 선발된 저영양 균주를 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4로 명명하였으며, 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2009 년 11월 4일자로 기탁번호 KACC 91503P로 기탁하였다.In order to confirm the genus name of the selected low-nutrition strain, 16S rDNA was isolated to confirm the nucleotide sequence. As a result, it has 99% homology with Bacillus subtilis and Bacillus amylolycufaciens , and also shows a very close relationship with Bacillus amylolytica faciens in the analysis of the soft relationship with other species (Fig. 5). Indicated. Accordingly, the low-nutritional strains selected for the enzyme activity and the antimicrobial activity were Bacillus amyloliquefaciens. It was named B4-4 and deposited with the National Agricultural Science Institute Agricultural Genetic Resources Center on November 4, 2009 under accession number KACC 91503P.

상기 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특징을 조사하였으며, 여기에서 바실러스 아밀로리큐파시엔스 표준 균주인 KACC 12067 및 토양에서 분리한 바실러스 아밀로리큐파시엔스 #717 균주를 이용하였다.Bacillus amylolyticupensis The morphological, physiological and biochemical characteristics of the B4-4 strain were investigated, and the bacillus amylolycufaciens standard strain, KACC 12067, and the Bacillus amylolytica faciens # 717 strain isolated from soil were used.

상기 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주의 형태를 광학현미경으로 관찰하였으며, 이를 도 1에 나타내었다. 도 1에서와 같이, 상기 선발된 균주는 표준 균주인 KACC 12067과 같은 전형적인 바실러스속 형태의 간균으로, 그람 양성이며 당을 생성하는 저영양 세균으로 28℃가 최적 성장 온도임을 알아내었다.Bacillus amylolyticupensis The shape of the B4-4 strain was observed under an optical microscope, which is shown in FIG. 1. As shown in Figure 1, the selected strain is a bacillus of a typical Bacillus type, such as the standard strain KACC 12067, Gram-positive, low-trophic bacteria that produce sugar was found to be the optimum growth temperature of 28 ℃.

미생물 동정 키트인 API20NE 키트를 이용하여, 상기 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주의 생리학적 특징을 조사하여, 표준 균주인 KACC 12067 균주와 토양에서 분리한 #717 균주와 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.By using the API20NE kit which is a microorganism identification kit, the Bacillus amyloliquefaciens The physiological characteristics of the B4-4 strain were examined and compared with the standard strain, KACC 12067 strain and # 717 strain isolated from the soil, and the results are shown in Table 1 below.

특징Characteristic 표준균주 KACC 12067Standard strain KACC 12067 #717# 717 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4Bacillus amyloliquefaciens B4-4 포자낭포자 부품(sporangium bulging)Sporangium bulging -- -- -- 포자 형태Spore form 타원형Oval 타원형Oval 타원형Oval 포자 위치Spore location 말단부(subterminal)Subterminal 말단부Distal end 말단부Distal end 세포들의 사슬(chains of cells)Chains of cells ++ -- -- 라이신 디카르복시라아제
(lysine decarboxylase)Lysine decarboxylase
(lysine decarboxylase) -- -- -- 오르니틴 디카르복시라아제
(ornithine decarboxylase)Ornithine decarboxylase
(ornithine decarboxylase) -- -- -- 시트레이트 이용(citrate utilization)Citrate utilization -- -- -- H2S 생성H 2 S generation -- -- -- 트립토판 디아미나아제
(tryptophane deaminase)Tryptophan deaminase
(tryptophane deaminase) -- -- -- 질산염 환원(nitrate reduction)Nitrate reduction -- ++ ++ 인돌(indole) 생성Indole generation -- -- -- 글루코오스 발효Glucose fermentation -- -- -- 아르기닌 디하이드로라아제(arginine dihydrolase)Arginine dihydrolase -- -- -- 우레아제(urease)Urease -- -- -- 에스큘린 가수분해(esculin hydrolysis)Esculin hydrolysis ++ ++ ++ 젤라티나아제(gelatinase)Gelatinase ++ ++ ++ 6-갈락토시다아제(6-galactosidase) (PNPG)6-galactosidase (PNPG) -- -- -- D-글루코오스 동화(assimilation)D-glucose assimilation ++ ++ ++ L-아라비노오스 동화L-Arabinose Fairy Tale -- ++ ++ D-만노오스 동화D-Mannose Fairy Tale ++ ++ ++ D-만니톨 동화D-Mannitol Fairy Tale ++ ++ ++ N-아세틸-글루코사민 동화N-acetyl-glucosamine assimilation ++ ++ ++ D-말토오스 동화D-maltose fairy tale ++ ++ ++ 글루코네이트 동화Gluconate assimilation ww ++ ++ 카프레이트 동화Caprate Fairy Tale -- -- -- 아디페이트 동화Adipate fairy tale -- -- -- 말레이트 동화Malate fairy tale ++ ++ ++ 시트레이트 동화Citrate Fairy Tale -- ++ ++ 페닐-아세테이트 동화Phenyl-acetate assimilation -- -- --

상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 토양에서 분리한 #717 균주와는 생리적인 특성이 일치하나, 표준 균주인 KACC 12067 균주와는 차이가 있다.As can be seen in Table 1, the physiological characteristics are consistent with the # 717 strain isolated from the soil, but is different from the standard strain KACC 12067 strain.

또한, 상기 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주의 효소 활성, 항균 활성 및 당 생성능을 조사하고, 이를 표준 균주인 KACC 12067 균주와 토양에서 분리한 #717 균주와 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 2 및 도 2, 3 및 4 에 나타내었다.In addition, the Bacillus amyloliquefaciens Enzyme activity, antimicrobial activity and sugar producing ability of B4-4 strain were investigated and compared with the standard strain KACC 12067 strain and # 717 strain isolated from soil, and the results are shown in Table 2 and FIGS. 2, 3 and 4 below. Indicated.

효소활성Enzyme activity 항균활성Antimicrobial activity 당
생성
능Party
produce
Twill 균 주Strain 셀룰라아제Cellulase 아밀라아제Amylase 프로테아제Protease 자일라나아제Xylanase 칸디다Candida 리스테리아Listeria 살모넬라Salmonella 스태필로코커스Staphylococcus 바실러스Bacillus 대장균Escherichia coli B4-4B4-4 ++++++ ++++++++ ++++++ ++++ ++ ++ ++++ ++++ ++ ++ ++++ #717# 717 -- ++++ ++++ -- ++ -- ++++ ++++ -- ++ ++++ KACC 12067KACC 12067 ++++ ++ ++++ -- -- -- -- -- -- -- --

상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 표준 균주인 KACC 12067은 효소 활성은 어느 정도 있었으나 항균 활성은 전혀 없었으며, 토양에서 분리한 #717 균주는 효소 활성 및 항균 활성이 부분적으로 있으며, 본 발명의 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주는 효소 활성이 뛰어나고, 광범위한 항균 활성을 갖는다는 사실을 확인하였다.As can be seen in Table 2, the standard strain KACC 12067 had some degree of enzymatic activity but no antimicrobial activity, and the # 717 strain isolated from the soil had partial enzymatic activity and antimicrobial activity. Bacillus amylolyticupens The B4-4 strain was confirmed to have excellent enzymatic activity and broad antibacterial activity.

상기 시금장 시료로부터의 수득된 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주를 5%의 양 혈액이 첨가된 R2A 평판 배지에서 배양한 후, 바실러스 아밀로리큐파시엔스 #717 및 용혈력이 있는 것으로 알려진 SJ5-17 바실러스 균주와 비교하여 용혈작용을 비교하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주의 경우 용혈작용을 나타내지 않는다는 사실을 확인하였다.Bacillus amyloliquefaciens B4-4 strain obtained from the sample was incubated in R2A plate medium with 5% sheep blood, and then Bacillus amylolytica faciens # 717 and known to be hemolytic. Hemolysis was compared with SJ5-17 Bacillus strains. As a result, as shown in Figure 6, it was confirmed that the Bacillus amyloliquefaciens B4-4 strain does not exhibit a hemolytic action.

도 1은 본 발명의 저영양 세균 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주를, 표준 균주인 KACC 12607 및 토양에서 분리한 바실러스 아밀로리큐파시엔스 #717 균주와 형태적 차이를 비교한 현미경 사진이다.1 is a bacterium Bacillus amyloliquefaciens of the present invention B4-4 strain is a micrograph comparing the morphological differences with the standard strain KACC 12607 and the Bacillus amyloliquefaciens # 717 strain isolated from the soil.

도 2는 본 발명의 저영양 세균 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주의 효소활성을, 표준 균주인 KACC 12607 및 토양에서 분리한 바실러스 아밀로리큐파시엔스 #717 균주와 비교 검정한 결과를 보여주는 사진으로, 여기에서, 검은색은 아밀라아제, 붉은색은 셀룰라아제, 회색은 프로테아제이다.Figure 2 is a low nutritional bacterium Bacillus amyloliquefaciens of the present invention Enzymatic activity of B4-4 strains was isolated from the standard strain KACC 12607 and from Bacillus amyloliquefaciens. Photo showing the results of the comparative test with the # 717 strain, where black is amylase, red is cellulase, and gray is protease.

도 3은 본 발명의 저영양 세균 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주의 항균활성을, 표준 균주인 KACC 12607 및 토양에서 분리한 바실러스 아밀로리큐파시엔스 #717 균주와 비교 검정한 결과를 보여주는 사진이다.Figure 3 is a low nutritional bacterium Bacillus amyloliquefaciens of the present invention The antimicrobial activity of B4-4 strains was isolated from the standard strain KACC 12607 and from Bacillus amyloliquefaciens. The photograph shows the result of the comparison test with # 717 strain.

도 4는 본 발명의 저영양 세균 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주를, 표준 균주인 KACC 12607 및 토양에서 분리한 바실러스 아밀로리큐파시엔스 #717 균주와 당 생성 배지에서 형태적 특징을 비교 검정한 사진이다.Figure 4 is a low nutrient bacterial Bacillus amyloliquefaciens of the present invention B4-4 strain isolated from standard strain KACC 12607 and soil Bacillus amyloliquefaciens This is a photograph comparing the morphological characteristics of # 717 strain and sugar producing medium.

도 5는 본 발명의 저영양 세균 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주를 rDNA 염기 서열 분석에 의하여 계통학적으로 분류한 분류도이다.5 is a bacterium Bacillus amyloliquefaciens of the present invention It is a taxonomy classified B4-4 strain by rDNA sequencing.

도 6은 본 발명의 저영양 세균 바실러스 아밀로리큐파시엔스 B4-4 균주의 용혈력이 없음을, 참조로서 토양에서 분리한 바실러스 아밀로리큐파시엔스 #717 및 용혈력이 있는 것으로 알려진 SJ5-17 바실러스 균주와 비교 검정한 결과를 보여주는 사진이다.Figure 6 shows that there is no hemolytic force of the low nutrient bacterium Bacillus amyloliquefaciens B4-4 strain of the present invention, Bacillus amyloliquefaciens # 717 isolated from the soil and SJ5-17 known to have a hemolytic force The photograph shows the result of the comparison test with Bacillus strain.

Claims (2)

셀룰라아제, 아밀라아제, 프로테아제 및 자일라나아제를 생산하고, 칸디다, 리스테리아, 살모넬라, 스태필로코커스 및 바실러스 시리우스 식중독균 및 대장균에 대하여 항균력을 갖고, 용혈력이 없는 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리큐파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) KACC 91503P.Cellulase, amylase, produces protease, and xylene Rana Ajay, Candida, Listeria, Salmonella, Staphylococcus and Bacillus Sirius have antibacterial activity against sikjungdokgyun and E. coli, Bacillus amyl as liqueur Pacific Enschede (Bacillus, it characterized in that there is no haemolysis force amyloliquefaciens ) KACC 91503P. 삭제delete
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