KR101230781B1 - ＥＬＡＶＬ4 유전자에 대한 ｓｉＲＮＡ를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 방사선 저항성 세포주인 사람 폐암 세포주 A549로부터 발굴된 방사선 피폭 측정용 바이오마커 및 이의 의학적 용도에 관한 것으로, 상기 바이오마커는 방사선 저항성 세포주인 사람 폐암 세포주 A549에서 방사선 조사 후 발현량이 크게 변화되는 FBXL6, PPP3CA, MOCS1, ELAVL4, TMPRSS7, ID1, ZNF239, CDCA7 및 DEAF1로 이루어진 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질로서, 이들을 방사선 피폭 바이오마커로서 활용할 수 있고, 또한 이들을 타겟으로 하여 방사선 민감성을 높이는 약물을 개발하여 방사선 치료 효과를 한층 증진시킬 수 있다.

Description

ＥＬＡＶＬ4 유전자에 대한 ｓｉＲＮＡ를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물{Composition for enhancing radiation sensitivity comprising siRNA of ELAVL4 gene}
본 발명은 ELAVL4 유전자에 대한 siRNA를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물에 관한 것이다.
암의 치료법은 수술, 방사선 치료법 및 화학요법으로 크게 나눌 수 있다. 상기 치료법으로 50% 정도의 완치율을 나타내는데, 현재 암 환자 중 국내의 경우 약 35%, 미국의 경우 약 50% 정도가 방사선 치료를 받고 있으며, 국내에서 방사선 치료를 받는 암환자의 수가 매년 증가하고 있는 추세여서 암치료에 있어 방사선 치료의 중요성 또한 증가하고 있다.
방사선 치료는 현재 다양한 종류의 암에 필수적인 치료 방법으로 알려져 있으나, 암세포의 방사선 내성 획득, 고선량 방사선 치료시 정상 조직의 손상 등이 치료의 효율을 떨어뜨려 방사선 치료의 문제점으로 대두되어 왔다.
따라서, 이러한 방사선 치료의 효율을 증대시키기 위한 증진제에 관한 연구들이 계속 진행되고 있는 실정이며, 다양한 체내 2차 신호전달물질들을 자극하는 세포사멸촉진제나 암세포 특이 수용체를 자극하여 세포사멸을 일으키는 물질, 세포주기 교란물질, 전사인자 억제물질 등을 대상으로 하여 연구를 하고 있다.
현재 항암제로 알려진 탁솔(Taxol)과 5-FU(5-fluorouracil) 등이 방사선치료시 병용투여를 통하여 방사선 치료 효율을 증진시키는 것으로 알려져 있다.
그러나, 상기와 같이 방사선치료 효과를 증진시키기 위해 사용되는 항암제들을 방사선 치료와 병용할 때, 항암제의 독성이 방사선 치료시 나타나는 부작용, 즉, 방사선 치료부위의 염증, 위장장애, 오심, 구토, 설사 등과 복합적으로 나타날 수 있기 때문에 사용에 제한이 있다는 단점이 있다.
방사선 치료의 효과를 최대화시켜 다양한 암 질환을 효과적으로 치료하기 위해서 상기 문제점이 해결되어 부작용이 최소화된 방사선 민감제의 개발이 요구되며, 또한 방사선 피폭 또는 조사 시에 발현량이 변화되는 유전자를 발굴하여 방사선 피폭에 의한 세포손상을 확인할 수 있다.
이에, 본 발명자는 방사선 피폭 또는 조사 시에 발현량이 변화되는 유전자를 발굴하던 연구를 하던 중, 방사선 저항성 세포주인 사람 폐암 세포주 A549로부터 발굴된 특정 유전자들이 방사선 피폭에 따라 발현량이 변화하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 방사선 저항성 세포주인 사람 폐암 세포주 A549로부터 발굴된 특정 유전자들 또는 그 발현 단백질을 포함하는 방사선 피폭 측정용 바이오마커 및 이를 이용한 키트를 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 방사선 저항성 세포주인 사람 폐암 세포주 A549로부터 발굴된 특정 유전자들 또는 그 발현 단백질 중 어느 하나의 억제제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 방사선 피폭 측정용 바이오마커인 유전자 또는 그 발현 단백질을 이용한 방사선 민감성 증진용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 FBXL6 (GenBank accession ID: NM_024555), PPP3CA (GenBank accession ID: BC025714), MOCS1 (GenBank accession ID: NM_005942), ELAVL4 (GenBank accession ID: AY033995), TMPRSS7 (GenBank accession ID: AK131211), ID1 (GenBank accession ID: NM_181353), ZNF239 (GenBank accession ID: NM_005674), CDCA7 (GenBank accession ID: BC027966) 및 DEAF1 (GenBank accession ID: NM_021008)로 이루어진 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하는 방사선 피폭 측정용 바이오마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 FBXL6 (GenBank accession ID: NM_024555), PPP3CA (GenBank accession ID: BC025714), MOCS1 (GenBank accession ID: NM_005942), ELAVL4 (GenBank accession ID: AY033995), TMPRSS7 (GenBank accession ID: AK131211), ID1 (GenBank accession ID: NM_181353), ZNF239 (GenBank accession ID: NM_005674), CDCA7 (GenBank accession ID: BC027966) 및 DEAF1 (GenBank accession ID: NM_021008)로 이루어진 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하는 방사선 피폭 측정용 키트를 제공한다.
상기 유전자로는 바람직하게는 ELAVL4, TMPRRS7, PPP3CA, CDCA7 및 ZNF239로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 보다 바람직하게는 ELAVL4이다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 방사선 저항성 세포주인 사람 폐암 세포주 A549에서 방사선 조사 후 발현량이 증가 또는 감소하는 ELAVL4, TMPRRS7, PPP3CA, CDCA7, ZNF239는 그 발현량이 방사선에 의해 크게 변화하고, 그 중에서도 ELAVL4는 방사선에 의해 발현량이 증가하고 그들로 인해 방사선에 대한 저항성을 갖게 하는데 중요한 역할을 하는 것으로 확인하였다. 이러한 결과로부터 ELAVL4, TMPRSS7, CDCA7, ZNF239는 방사선 피폭 바이오마커로서 활용할 수 있으며, ELAVL4는 발현량을 조절하는 타겟 유전자로 하여 방사선 민감성을 높이는 약물을 개발할 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 포함하거나, 상기 유전자에 상보적인 프로브를 포함하거나, 상기 유전자에 의해 코딩되는 그 발현 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 FBXL6 (GenBank accession ID: NM_024555), PPP3CA (GenBank accession ID: BC025714), MOCS1 (GenBank accession ID: NM_005942), ELAVL4 (GenBank accession ID: AY033995), TMPRSS7 (GenBank accession ID: AK131211), ID1 (GenBank accession ID: NM_181353), ZNF239 (GenBank accession ID: NM_005674), CDCA7 (GenBank accession ID: BC027966) 및 DEAF1 (GenBank accession ID: NM_021008)로 이루어진 군에서 선택된 유전자 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하는 방사선 피폭 측정용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에서 "측정"은 폐암세포 또는 골육종세포 등과 같은 암세포에서 방사선 피폭 또는 조사 정도를 확인하는 것이다. 하나의 양태로서, 본 발명은 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플로부터 상기 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하고, 이를 정상대조군 샘플의 발현 수준과 비교하여 방사선 피폭 또는 조사 정도를 확인할 수 있다.
본 발명에서 "mRNA 발현 수준 측정"이란 방사선 피폭 또는 조사 정도를 확인하기 위하여 생물학적 샘플에서 상기 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), 노던 블롯팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상대조군에서의 mRNA 발현량과 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 상기 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현양의 변화를 판단하여 방사선 피폭 또는 조사 정도를 판단할 수 있다. mRNA 발현 수준 측정은 바람직하게는, 상기 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 RT-PCR법을 이용할 수 있다. RT-PCR은 P. Seeburg(Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986, Pt 1:669-677)에 의해 RNA를 분석하는데 도입된 방법으로, mRNA를 역전사하여 얻어진 cDNA를 PCR로 증폭하여 분석한다. 이때 증폭 단계에서 상기 유전자에 특이적으로 제조된 프라이머 쌍을 사용하며, RT-PCR 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 상기 유전자의 mRNA 발현 여부와 발현 수준을 확인할 수 있고 이를 정상대조군과 비교함으로써, 방사선 피폭 또는 조사 정도를 간편하게 판단할 수 있다.
본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로, 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오타이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 상기 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산일 수 있고, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 한, 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 방사선 피폭 정도를 확인하기 위하여 생물학적 샘플에서의 상기 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법을 이용할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있고, 상기 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 방사선 피폭 또는 조사 정도를 확인할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 이용할 수 있다. 샘플에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동을 하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로오즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 상기 단백질의 양을 확인하여, 방사선 피폭 또는 조사 정도를 확인할 수 있다.
상기 검출 방법은 정상대조군에서의 상기 단백질의 발현양과 생물학적 샘플에서의 상기 단백질의 발현양을 조사하는 방법으로 이루어질 수 있고, mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함하며, 상기 단백질에 대한 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명의 항체는 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 단클론 항체 또는 다클론 항체로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을 이용하여 당 분야에 공지된 효소 면역측정법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역 측정법(radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 폴리아크릴 겔상의 웨스턴 블롯팅 또는 면역 블롯팅 등의 방법에 의해 생물학적 샘플 중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 진단할 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 상기 유전자를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 FBXL6 (GenBank accession ID: NM_024555), PPP3CA (GenBank accession ID: BC025714), MOCS1 (GenBank accession ID: NM_005942), ELAVL4 (GenBank accession ID: AY033995), TMPRSS7 (GenBank accession ID: AK131211), ID1 (GenBank accession ID: NM_181353), ZNF239 (GenBank accession ID: NM_005674), CDCA7 (GenBank accession ID: BC027966) 및 DEAF1 (GenBank accession ID: NM_021008)로 이루어진 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질의 억제제 중 하나 또는 둘 이상을 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공한다.
상기 억제제는 암세포의 방사선에 대한 민감도를 증진시킬 수 있으며, 상기 암세포는 폐암세포 또는 골육종세포 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 억제제로는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 또한 상기 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩타이드 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
일실시예로서, 본 발명의 안티센스 핵산을 세포 내로 도입시켜 암세포의 방사선 민감성을 증진시킬 수 있는데, 여기서 "도입"은 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 "방사선 민감성 증진"이란 방사선을 이용한 질병 치료에 있어서, 방사선에 대한 세포의 민감성을 증진시키는 것을 의미한다. 이를 통해 방사선 치료 효율을 상승시킬 수 있는데, 특히, 암치료시 병행처리되면 암세포의 방사선 민감성이 증진되어 암세포의 살상 효과 및 증식 억제효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.
본 발명에서 "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있으며, 투여의 용이성과 투여량의 균일화를 위해 단위 투여 형태로 제형화할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥 내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
상기 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
또한, 상기 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
또한, 본 발명은 FBXL6 (GenBank accession ID: NM_024555), PPP3CA (GenBank accession ID: BC025714), MOCS1 (GenBank accession ID: NM_005942), ELAVL4 (GenBank accession ID: AY033995), TMPRSS7 (GenBank accession ID: AK131211), ID1 (GenBank accession ID: NM_181353), ZNF239 (GenBank accession ID: NM_005674), CDCA7 (GenBank accession ID: BC027966) 및 DEAF1 (GenBank accession ID: NM_021008)로 이루어진 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질의 억제제 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물을 사용하여 암세포의 방사선 민감성을 증진시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암치료를 위한 방사선 요법을 제공한다.
본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 예를 들어 안티센스 핵산 분자의 바이러스성 또는 비바이러스성 기술에 의한 운반을 포함한다. 본 발명의 조성물이 암세포 내로 도입되면, 상기 유전자 또는 그 발현 단백질의 발현 수준을 낮추거나 활성을 저해함으로써, 방사선 민감성을 증진시키게 된다.
본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한, 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 해당 조직에 국소 투여한다.
본 발명의 암치료를 위한 방사선 요법은 본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 치료적 유효량은 방사선에 대해 암세포 내의 종양의 민감성을 효과적으로 증진시키는 양을 의미한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 및 조사되는 방사선량을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 방사선 민감성 증진용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 또한, 경우에 따라, 본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물과 함께 공지의 항암제를 병용 투여하여 방사선 치료 효과를 포함한 항암 효과를 증대시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; 상기 생물학적 샘플로부터 FBXL6 (GenBank accession ID: NM_024555), PPP3CA (GenBank accession ID: BC025714), MOCS1 (GenBank accession ID: NM_005942), ELAVL4 (GenBank accession ID: AY033995), TMPRSS7 (GenBank accession ID: AK131211), ID1 (GenBank accession ID: NM_181353), ZNF239 (GenBank accession ID: NM_005674), CDCA7 (GenBank accession ID: BC027966) 및 DEAF1 (GenBank accession ID: NM_021008)로 이루어진 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계; 및 상기 발현 수준을 임의의 화합물을 처리하지 않은 정상대조군에서의 상기 유전자 또는 그 발현 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 암세포에서 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 화합물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 방사선 저항성 세포주인 사람 폐암 세포주 A549에서 방사선 조사 후 발현량이 크게 변화되는 ELAVL4, TMPRRS7, PPP3CA, CDCA7, ZNF239 등의 유전자 또는 그 발현 단백질을 방사선 피폭 바이오마커로서 활용할 수 있으며, 또한, 이러한 유전자 또는 그 발현 단백질을 타겟으로 하여 방사선 민감성을 높이는 약물을 개발하여 방사선 치료 효과를 한층 증진시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 발굴된 총 유전자의 계층별 클러스터링을 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 발굴된 총 유전자 중 발현양상이 달라진 유전자들의 기능별 분류를 도식화한 것이고,
도 3은 본 발명의 일실시예 따른 마이크로어레이 데이터를 재확인 하고자 수행한 RT-PCR(a) 및 실시간 PCR(b) 분석 결과를 나타낸 것이고,
도 4는 특정 유전자의 넉아웃 후 방사선 조사의 영향을 실시간 PCR로 확인한 것이고,
도 5는 특정 유전자의 넉아웃 후 방사선 조사의 영향을 집락형성 분석으로 확인한 것이고,
도 6은 특정 유전자의 넉아웃 후 방사선 조사의 영향을 MTT 분석으로 확인한 것이고,
도 7은 특정 유전자의 넉아웃 후 방사선 조사의 영향을 FACS 분석으로 확인한 것이다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 세포주 및 방사선 조사
사람 폐암세포주인 A549 세포는 RPMI 1640 미디어에 10% FBS와 100 units/ml의 페니실린, 10 ㎍/ml의 스트렙토마이신을 첨가하여 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 방사선 조사는 감마선을 조사하였고 이것은 137Cs γ-선 소스 (Atomic Energy of Canada, Ltd, Canada)를 사용하였다.
< 실시예 2> 마이크로어레이 분석을 통한 방사선 피폭 진단용 유전자 발굴
1. RNA 추출
제조자의 지침에 따라 상기 세포주가 분주된 플레이트에 TRIzol (Invitrogen life Technologies, Shanghai, China) 첨가 후, 클로로포름을 첨가하여 RNA를 추출하였다. 샘플을 15 내지 20초 동안 진탕하고, 실온에서 2-3분 동안 배양한 후, 콜드 이소프로판올을 처리하여 수층을 분리하고 콜드 70% 에탄올로 세정하였다. RNA 펠렛을 공기 건조하여 디에틸 피로카보네이트(DEPC)-처리된 물에서 재현탁하고, 아가로즈겔 분석과 분광광도적 정량 분석을 위해 소량의 시료를 채취하였다.
2. 마이크로어레이 분석
앞서 준비된 각각의 총 RNA (10㎍)을 역전사효소, SuperScrip ll (Invitrogen, Carlsbad, California)을 이용한 역전사반응을 통해 시아닌(Cy5) 접합 dCTP (Amersharm, Piscataway, NJ)로 표지하였다. 에탄올 침강법을 이용하여 표지된 cDNA를 농축하였다. 상기 표지 cDNA를 Roche NimbleGen Human whole genome 12-plex array (Roche NimbleGen, Inc., WI) 상에 놓고, NimbleGen H12 mixer (Roche NimbleGen, Inc., WI)로 덮었다. 상기 슬라이드를 이용하여 42℃ MAUI 시스템 (Biomicro systems, Inc. UT)에서 12시간 동안 혼성화 반응을 수행하였다. 혼성화된 슬라이드를 실온에서 2X SSC, 0.1 % SDS에서 2분, 1 X SSC에서 3분, 그후 0.2 X SSC에서 2분 동안 세정하였다. 얻어진 슬라이드를 3,000rpm에서 20초 동안 원심분리하여 건조하였다.
3. 데이터 분석
상기 어레이를 Roche NimbleGen Inc.에 제출하였다. 칩 당 각 게놈의 12개의 복제물이 포함되었다. 평균 3개의 다른 60-베이스 올리고뉴클레오티드 (60-mer 탐침)가 게놈의 각 유전자로 나타났다. 표적 게놈에서 모든 다른 60-mer 탐침과 비교하여 적어도 3개의 미스매치를 가지는 각 탐침을 선별하였다. 대조군 체크(혼성화)는 on-chip 대조군 올리고뉴클레오티드를 포함한 각 어레이에서 수행되었다. 상기 어레이는 관련 소프트웨어를 갖는 Axon GenePix 4000B 스캐너를 이용하여 분석하였다. 유전자 발현 수준은 NimbeScan Version 2.4 (Roche NimbleGen, Inc., WI)를 이용하여 산출하였다. 각 유전자에 관한 상대적인 신호강도는 Robust Multi-Array Average algorithm을 이용하여 산출하였다. 각 데이터는 NimbeScan Version 2.4 (Roche NimbleGen, Inc., WI)를 이용한 중위수 다듬기 표준화법(median polish normalization method)을 근거로 처리하였다. 이렇게 표준화되고 로그 변환된 강도값은 GeneSpring GX 10 (Agilent technologies, CA)을 이용하여 분석하였다. 상향 조절된 유전자로서 대조군의 적어도 200% 이상으로 존재하는 유전자와, 하향 조절된 유전자로서 대조군의 50% 이하로 존재하는 유전자를 측정하기 위하여 배수 변화 필터를 포함하였다.
그 결과, 도 1과 같은 총 유전자의 계층별 클러스터링이 나타났으며, 방사선 조사 전후 발현 양상이 달라진 총 2637개의 유전자 중 1330개 유전자의 발현이 증가되었고, 1307개 유전자가 발현이 감소되었다. 또한, 방사선 조사 전후 발현 양상이 달라진 총 2637개의 유전자를 기능별로 분류해 본 결과 도 2와 같이 신호전달에 관여하는 유전자 21%, 전달에 관여하는 유전자 19%, 전사에 관여하는 유전자 15%, 면역반응에 관여하는 유전자 7% 등을 나타내는 것을 확인되었다.
이렇게 발현 양상이 달라지는 많은 유전자 중에서 암세포의 방사선 치료의 효율을 감소하게 하는 주원인인 세포의 분화와 암화를 촉진하는 유전자를 표 1과 같이 선별하였다.
유전자명 유전자 설명 GenBank accession ID
1 FBXL6 F-box and leucine-rich repeat protein 6 NM_024555
2 PPP3CA protein phosphatase 3 (formerly 2B), catalytic subunit, alpha isoformcarcineurin BC025714
3 MOCS1 Molybdenum cofactor synthesis 1 NM_005942
4 ELAVL4 ELAV (embryonic lethal, abnormal vision, Drosophila)-like 4 AY033995
5 TMPRSS7 transmembrane protease, serine 7 AK131211
6 ID1 Inhibitor of DNA binding 1 NM_181353
7 ZNF239 Zinc Finger protein 239 NM_005674
8 CDCA7 cell division cycle associated 7 BC027966
9 DEAF1 deformed epidermal autoregulatory factor 1 NM_021008
< 실시예 3> RT - PCR 및 실시간 PCR 을 통한 유전자 발현양 분석
앞선 실시예에 따른 마이크로어레이 데이터를 재확인 하고자 RT-PCR 및 실시간 PCR을 수행하였다.
1. RT - PCR 분석
뽑아놓은 RNA을 정량해서 2㎍의 RNA에 올리고 dT, dNTP를 넣고 65℃에서 5분간 가열하고 얼음에 꽂아 식혔다. 여기에 5X First strand buffer (invitrogen superscript II kit), 0.1M DTT, RNase 억제제를 넣고 42℃에 2분 가열 후, 1㎕의 superscript II를 넣고 42℃에서 1시간 방치한 뒤, 70℃에서 15분을 가열하여 반응을 종료시켜 cDNA를 합성하였다. 이렇게 합성한 cDNA를 가지고 각각의 프라이머에 맞는 어닐링 온도를 잡아 PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 3a와 같이 A549 세포에서 방사선에 의해서 FBXL6, PPP3CA, MOCS1, ELAVL4, TMPRSS7, ID1, ZNF239, CDCA7 그리고 DEAF가 증가됨을 RT-PCR로 확인할 수 있었다.
2. 실시간 PCR 분석
총 RNA를 뽑은 후 100ng의 RNA를 One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time, takara)를 이용하여 혼합물을 만든 뒤, DNA engine2. OPTICON (MJ Research)를 이용하여 실시간 정량 역전사중합효소 PCR을 수행하였다. 이때 사용된 프라이머 시퀀스는 하기 표 2와 같다.
순서 유전자명 실시간 PCR 프라이머 시퀀스
1 FBXL6 Forward: CTCCGGGACGAGGGGTGGCT
Reverse: AGGGGCTGCCCTCCTTGGCT
2 PPP3CA Forward: CTGCCTTCCCCTGGCTGCCC
Reverse: GGGCTTCGTGGGCTCGGAGT
3 MOCS1 Forward: CTGGCCCGGCTACTGCCCCA
Reverse: GCGCACATCCAGGGGGAGGC
4 ELAVL4 Forward: GGGCTGAATGGCCAGAAGCCCAG
Reverse: GGGGAGAACCTGGGGGAACAAGC
5 TMPRSS7 Forward: TGGCTGGGGGCGAAGACACGA
Reverse: TGGTCGTCCACATCCATGTCCCCA
6 ID1 Forward: CGCCTGCCTGCCCTGCTGGA
Reverse: CATGCCGCCTCGGCCGTCAG
7 ZNF239 Forward: TGCACATCCACCAGCGAGTCCA
Reverse: TGCGAAGATCCGAGCTCTGGCTGA
8 CDCA7 Forward: TGCCCAGAAGCCGTCGCTCCA
Reverse: AGGCGGGCAATGCCAGTTCGG
9 DEAF1 Forward: CCCCTCTGGCTCCCGGCCAA
Reverse: CACTGCAAGGGTCGGCCCGC
그 결과, 도 3b와 같이 A549 세포에서 방사선에 의해서 FBXL6, PPP3CA, MOCS1, ELAVL4, TMPRSS7, ID1, ZNF239, CDCA7 그리고 DEAF가 증가됨을 실시간 PCR로 확인할 수 있었다.
< 실시예 4> 유전자 넉다운 후 방사선 조사에 따른 세포의 영향 분석
1. siRNA 형질감염
siRNA는 바이오니아에서 구입하여 사용하였다. 세포를 분주하여 siRNA를 150nM의 농도로 리포펙타민 2000 (invitrogen)을 이용하여 형질감염 시켰다. 형질감염 후 72 시간 이후 RNA 양이 50% 미만으로 감소하는 것을 확인 후 실험에 사용하였다.
2. 실시간 PCR 분석
RNA를 추출한 뒤, One Step SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit (takara, Osaka, Japan)와 DNA Engine2.OPTICON (MJ Reserch, MA, USA)를 이용하여 수행하였다. 각각의 유전자의 발현은 GAPDH로 정량을 하였다. 이때, 사용된 프라이머는 표 2와 같고, 실시간 PCR 조건은 다음과 같다. 즉, 제1단계(역전사 공정)를 hold, 42℃에서 5분, 95℃에서 10초의 반응조건으로 수행하였고, 제2단계(PCR 반응 공정)을 95℃에서 5초, 60℃에서 30초의 반응조건으로 40회 반복 수행하였으며, 제3단계(해리 공정)를 수행하였다.
그 결과, 도 4와 같이 ELAVL4를 넉다운 시키면 방사선에 의한 민감도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 TMPRSS7의 경우에는 방사선에 의해 발현양은 크게 증가하지만 넉다운시킨 경우 방사선에 의한 민감도에는 큰 영향을 주지는 않았다.
3. 집락형성 분석
형질감염 후 60mm 디쉬에 세포를 100, 200, 500, 1000, 2000 개를 분주한 뒤 0, 1, 2, 3, 4 Gy의 방사선을 조사한 뒤 14일 뒤, 75% 메탄올과 25% 아세트산, 0.4% 트립판블루로 고정 및 염색을 시켜 콜로니 개수를 카운팅 하였다.
그 결과, 도 5와 같이 ELAVL4를 넉다운 시키면 방사선에 의한 민감도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 TMPRSS7의 경우에는 방사선에 의해 발현양은 크게 증가하지만 넉다운시킨 경우 방사선에 의한 민감도에는 큰 영향을 주지는 않았다.
4. 세포 생존율 분석 ( MTT 분석)
ELAVL4와 TMPRSS7을 각각 siRNA로 넉다운 시키고 10Gy의 방사선을 조사한 것(오른쪽) 과 하지 않은 것(왼쪽)의 분화정도를 MTT 분석을 통해 측정하였다. 세포를 24well plate에 분주하고 방사선을 조사한 것과 조사하지 않은 두 군으로 나누고, 방사선 조사 후 24, 48, 72 시간에 각각 MTT 분석을 수행하였다. 5mg/ml의 MTT를 각 well에 넣어주고 1시간을 37℃에서 배양하였고 배양배지를 제거한 뒤, 300㎕의 DMSO를 넣었다. 그 후 마이크로플레이트를 이용하여 595nm 파장에서 값을 관찰하였다.
그 결과, 도 6과 같이 ELAV와 TMPRSS7은 모두 넉다운 시키는 것만으로도 분화 정도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 방사선 조사 후에는 분화 정도가 현격하게 더 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 ELAVL4와 TMPRSS7 모두 암세포의 분화에 밀접한 관계를 하고 있는 것을 알 수 있고 이들의 발현을 조절할 때 암세포의 분화 속도를 조절할 수 있을 것으로 사료된다.
5. 세포사멸 분석 ( FACS 분석)
ELAVL4와 TMPRSS7의 siRNA 처리 후, 방사선 조사 전후의 세포사멸 정도를 FACS 분석을 통해 평가하였다. 즉, 방사선을 조사한 뒤, 72시간 동안 놔두었다. 세포는 차가운 PBS로 두 번 씻어내고 트립신 처리하여 떼어냈다. 세포사멸(apoptosis)을 관찰하기 위해서 FITC Annexin V Apoptosis Detection kit I (BD Biosciences,CA, USA)를 이용하여 PI와 Annexin V로 15분간 어두운 상온에서 염색하였다. 형광은 flow cytometer로 측정하고 데이터는 CellQuest 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
그 결과, 도 7과 같이 ELAVL4 유전자의 넉다운 시 방사선에 의한 세포사멸의 정도가 더 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (3)

  1. ELAVL4 (GenBank accession ID: AY033995) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 폐암세포의 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 것을 특징으로 하는 방사선 민감성 증진용 조성물.
  3. 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; 상기 생물학적 샘플로부터 ELAVL4 (GenBank accession ID: AY033995) 유전자 또는 그 발현 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계; 및 상기 발현 수준을 임의의 화합물을 처리하지 않은 정상대조군에서의 상기 유전자 또는 그 발현 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 암세포에서 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 화합물 스크리닝 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030095821A (ko) * 2002-06-14 2003-12-24 한국원자력연구소 방사선 피폭 측정용 유전자, 이를 이용한 방사선 피폭측정방법, 및 이를 함유한 ｄｎａ칩

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Song et al. Lentivirus-mediated siRNA targeting SAE1 induces cell cycle arrest and apoptosis in colon cancer cell RKO

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