KR101230384B1

KR101230384B1 - 자성입자 및 외부자기장에 의한 세포 증식, 사멸 조절 방법

Info

Publication number: KR101230384B1
Application number: KR1020100098557A
Authority: KR
Inventors: 이정훈; 차미선; 신재하
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-10-11
Filing date: 2010-10-11
Publication date: 2013-02-07
Also published as: KR20120037046A

Abstract

본 발명은 자성나노입자 및 외부 자기장을 이용한 세포 성장-사멸 제어기술에 관한 것으로 보다 상세하게는 세포 내로 주입된 자성입자와 인가되는 자기장에 의하여 세포의 생존활성 및 성장을 도모 및 세포사멸의 제어기술에 관한 것이다.

Description

자성입자 및 외부자기장에 의한 세포 증식, 사멸 조절 방법 {Method for cell proliferation and apoptosis control with magnetic particle and magnetic field}

본 발명은 자성입자에 의한 세포 증식 및 사멸 조절방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포 내로 주입된 자성입자와 인가되는 자기장에 의하여 세포의 생존활성 및 성장을 도모할 수 있는 자성입자에 의한 세포 증식 및 사멸 조절방법에 관한 것이다

세포 성장-사멸의 가역적 제어 기술은 세포사멸 조절요법 개발을 위한 차세대 핵심기술이다. 최근의 연구결과 다양한 질병의 발병 원인이 근원적으로 세포사멸 신호전달 기구의 비정상적인 기능에 기인한다는 사실이 밝혀지고 있다. (DW Nicholson, From bench to clinic with apoptosis-based therapeutic agents, Nature 407(6805), 810-816, 2000).

비정상적인 세포 성장-사멸 신호전달 기구를 제어할 수 있는 Apoptosis-Modulating Therapy (AMT)가 새로운 질병 치료법으로 인식되어 세계적으로 활발한 연구개발이 진행되고 있다. AMT는 세포의 병리적 성장과 사멸현상을 세포사멸유도 요법 (Apoptotic therapy) 또는 세포사멸 억제요법 (Anti-apoptotic therapy)을 통하여 질병의 진행을 차단함은 물론 정상기능의 세포로 전환시켜 근원적으로 질병을 치료하는데 그 목적이 있다. AMT의 적용 질환은 백혈병을 비롯한 암과 치매, 파킨슨질환, AIDS, 노화현상 등의 각종 노인성 및 퇴행성 질환이다. 그러나, 현재까지 개발된 AMT기반 치료 약물은 세포사멸의 비가역적단계 (예: Caspase 의 활성화 단계)를 주 목적으로 하는 화학적 약물로서 이들 약물에 의해 세포사멸을 억제하더라도 병변세포가 정상적인 기능으로 회복할지는 의문시되고 있다.

현재 화학적 요법이 아닌 물리적 방법을 이용한 AMT의 시도는 거의 전무한 상태라고 할 수 있다. 다만 근래에 자기장을 이용하여 세포의 생장을 저해하는 일부 연구들이 시도되고 있다. 예를 들면, 대한민국 특허출원10-2009-0078310호는 시험관 내에서 배양된 암세포에 자기장을 처리하는 것을 포함하는 암세포의 성장 억제방법을 개시한다.

또한 Rosen 등은 GH3 세포에 외부 자기장을 인가함으로써 세포성장을 억제하는 기술을 개시한다(A D. Rosen et al., Effect of long therm exposure to 0.5 T static magnetic fields on growth and size of GH3 cells, Bioelectromagnetics 30, 114-119 (2009)).

하지만, 세포 내의 고유물질이 아닌 외부 물질 주입과 자기장 인가에 따라 세포성장 효과 및 세포사멸 제어를 유도하는 종래 기술은 아직 개시되지 못한 상황이다.

본 발명은 세포 내로 주입된 자성입자 및 외부 자기장에 따라 효과적으로 세포 증식을 향상시킬 수 있는, 세포증식 향상방법을 제공하는 한편 세포 내로 주입된 자성입자와 외부 자기장을 이용하여 세포사멸을 제어하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 자성입자가 주입된 세포에 자기장을 인가함으로써 세포증식을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 세포증식 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 세포증식 방법으로, 상기 방법은 박테리아 자성입자를 세포 내에 주입하여, 상기 세포를 감염시키는 단계; 및 박테리아 자성입자에 의하여 감염된 상기 세포에 대하여 외부 자기장을 인가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포증식 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 세포증식 방법으로, 상기 방법은 단일벽 탄소나노튜브를 세포 내에 주입하여 상기 세포를 단일벽 탄소나노튜브로 감염시키는 단계; 및 단일벽 탄소나노튜브로 감염된 상기 세포에 대하여 외부 자기장을 인가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포증식 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 박테리아 자성 입자는 코어의 자성입자; 및 상기 자성입자 표면을 덮는 리피드 막으로 이루어지며, 상기 단일벽 탄소나노튜브는 세포 주입 전 산처리된다. 또한, 자성입자가 주입된 세포에 100mT 이상의 정상자기장(static magnetic field)을 인가함으로써 세포증식이 촉진된다.

상기 또 다른 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 자성입자가 주입된 세포에 자기장을 인가함으로써 세포사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는 사멸 조절 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 자성나노입자 및 외부 자기장을 이용한 세포 성장-사멸 제어기술은 세포의 비정상적인 성장 및 사멸에 기인하는 질환들의 치료기술로 사용이 가능할 것이다. 특히 노화 및 퇴행성 질환들에 유용할 것이다.

또한 현재 사용되고 있는 화학적 약물치료제의 독성을 극복할 수 있는 대안이 될 것이며, 나아가 세포주기와 관련된 연구 등에도 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 BMP의 균일한 직경을 나타내는 사진이다.
도 2는 산 처리되지 않은 단일벽 탄소나노튜브((a))와 산 처리되어 기능화된 단일벽 탄소나노튜브((b))의 SEM 이미지이고, 도 3은 산 처리된 탄소나노튜브가 물에 잘 분산되며((c-1)), 자석막대의 접근에 따라 탄소나노튜브가 이동되는 현상을 나타내는 사진((c-2))이다.
도 4는 실시예 1의 BMP에 의하여 감염된 HeLa 세포(BMP-HeLa 세포)의 TEM 이미지이다.
도 5는 fSWNT에 의하여 감염된 fSWNT-NIH3T3 세포(하측 2개 이미지)와 fSWNT로 감염되지 않은 NIH3T3 세포의 TEM 이미지(상측 2개 이미지)이다.
도 7a 및 7b는 기능화된 단일벽탄소나노튜브이 세포독성을 비교, 설명하는 그래프이다.
도 8은 본 실험 예에 따라 세포에 외부 자기장을 인가하는 방식을 설명하는 모식도이다.
도 9는 MTS 어쎄이로부터 평가된 세포성장 결과 그래프이다.
도 10은 fSWNTs 감염세포의 외부자기장을 이용한 세포성장 조절 결과를 설명하는 그래프이다.
도 11은 BMP 감염세포의 세포사멸억제 효과(Anti-apoptotic effect)를 설명하는 그래프이다.

이하, 본 발명을 도면을 참조하여 상세하게 설명하고자 한다. 다음에 소개되는 실시 예들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 이하 설명된 실시 예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 그리고 도면들에 있어서, 구성요소의 폭, 길이, 두께 등은 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다.

본 발명은 자성입자를 세포 내 주입 후, 외부 자기장을 인가하는 경우, 종래 기술과 달리 세포의 성장이 촉진되고, 생존 활성이 증가하는 점에 착안한 것이다.

본 발명의 일 실시 예에서 상기 자성입자는 자성 입자 코어가 리피드 막에 둘러싸인 박테리아 자성입자 (Bacterial Magnetic Nanoparticles, 이하 BMP)이었으며, 본 발명은 자성 박테리아에 의하여 생성된 BMP가 우수한 생체적합성을 가지며, 리피드 이중막이 경계벽을 이루므로 수용액에서 잘 분산된다는 특징을 이용하였다. 하지만, 본 발명의 일 실시 예는 세포 내로의 주입 및 세포감염을 용이하게 하기 위하여 BMP를 자성입자로 사용하였으나, 통상의 자성입자도 사용가능하며, 본 발명의 범위는 이를 포함한다.

이를 위하여, 본 발명의 또 다른 일 실시 예는 BMP 대신 탄소나노튜브, 특히 단일벽 탄소나노튜브를 자성입자로 사용하였다. 이때 상기 탄소나노튜브는 산처리 됨으로써, 탄소나노튜브로부터의 세포 독성이 저감된 상태이다.

이하 각각의 실시 예를 통하여 본 발명에 따른 세포성장 방법을 보다 상세히 설명한다.

실시예 1

BMP 추출

본 발명의 일 실시예에서 BMP는 “마그네토솜”라 불리는 호기성 자성 박테리아(magnetospirillum magne-toticum AMB-1)로부터 추출되며, 형태, 크기는 도 1에 도시된 바와 같이 50 내지 100nm의 균일한 직경을 갖는다. BMP 추출방법을 이하 보다 상세히 설명한다.

먼저, 박테리아 자성 나노입자(BMP)는 자성 스피릴룸 성장 배지(MSGM)에서 4-5일간 27℃에서 혐기환경에서 배양된 마그네토스피릴룸(Magnetospirillum) sp. AMB-1으로부터 얻었다. 이후 배양된 AMB-1을 25분간 11300xg으로 원심분리하고, 30분간 초음파처리하여 용해시켰다. 다시 자성 나노입자는 네오디뮴철 붕소(NdFeB) 자석을 사용하여 수집하고, PBS로 5회 세척하고, 마지막으로 PBS에 분산시켰다. 수직된 자성 나노입자는 오토클레이브(121℃, 15분)에서 살균하였다. 이와 같이 박테리아로부터 추출된 BMP는 안정한 리피드막으로 둘러 쌓인 자성코어로 이루어진다. 이러한 특징으로 인하여, 비록 중심은 자성의 성질을 가짐에도 불구하고, BMP는 수용액에서의 안정한 분산특성을 나타내게 된다. 또한 다른 합성 입자와 달리 포유동물의 세포에 용이하게 흡수될 수 있다.

실시예 2

탄소나노튜브 제조

단일벽 탄소나노튜브(Single Walled Carbon Nanotube, SWNT, 일진상사, 한국)를 황산(95%) 및 질산(70%)의 혼합 용액으로 산처리하여, 정제하고, 기능화(functionalize)하였다. 0.22㎛ 밀리포어 테프론 멤브레인(JGWP 04700, Millipore, 미국)으로 진공 필터링한 후, 필터링된 물질이 중성이 될 때까지 탈이온수로 멤브레인을 세척하였다. 이후 얻어진 물질을 탈이온수에 분산시켜 밀도가 0.01mg/ml가 되게 하였다.

도 2는 산 처리되지 않은 단일벽 탄소나노튜브((a))와 산 처리되어 기능화된 단일벽 탄소나노튜브((b))의 SEM 이미지이고, 도 3은 산 처리된 탄소나노튜브가 물에 잘 분산되며((c-1)), 자석막대의 접근에 따라 탄소나노튜브가 이동되는 현상을 나타내는 사진((c-2))이다.

도 2 및 3을 참조하면, 본 발명에 따라 기능화된 단일벽 탄소나노튜브(fSWNT)는 우수한 수분산성과 자성을 가지는 것을 알 수 있다.

실험예 1

자성입자에 의한 세포감염( transfection )

실험예 1-1

BMP - HeLa 세포

본 발명에 따라 제조된 자성입자로 HeLa 세포를 감염시켰다. 도 4는 실시예 1의 BMP에 의하여 감염된 HeLa 세포(BMP-HeLa 세포)의 TEM 이미지이다. 상기 TEM 이미지는 BMP 처리 후 밤새 배양된 세포에 대하여 얻어진 이미지이다.

또한 ICP(inductive coupled plasma-atomic emission spectrometer, Shimadzu, Japan) 분석 결과는, 4μg이 10⁴ 세포에 첨가될 때, 1.6μg이 감염되는 사실을 증명하였다.

실험예 1-2

fSWNT - NIH3T3 세포

실시예 2에 따라 기능화된 단일벽 탄소나노튜브(fSWNT)로 NIH3T3 세포를 감염시켰다.

도 5는 fSWNT에 의하여 감염된 fSWNT-NIH3T3 세포(하측 2개 이미지)와 fSWNT로 감염되지 않은 NIH3T3 세포의 TEM 이미지(상측 2개 이미지)이다.

도 5를 참조하면, 본 발명에 따른 단일벽 탄소나노튜브, 특히 산처리됨으로써 기능화된 단일벽 탄소나노튜브는 세포 내부를 효과적으로 감염시키는 결과를 보여준다.

특히 기능화된 단일벽 탄소나노튜브는 사이토플라즘의 미토콘드리아에 특이적으로 집중되어 있는 것을 확인할 수 있다.

실험예 2

세포독성 평가

실험예 2-1

BMP 세포독성

BMP의 세포독성은 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포주를 이용하여 확인하였다.

세포 안정화를 위해 24시간 배양한 후 BMP를 10⁴ 세포당 2μg에서 15μg의 농도로 단계별로 첨가하여 MTS 어쎄이 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, Promega, 미국)을 사용하여, 490nm에서의 흡광도로 BMP의 세포독성을 분석하였다.

그 결과 72시간 동안 BMP 농도가 10⁴ 세포당 15μg이 될 때 까지는 BMP가 세포 생존활성(viability)에는 영향을 주지 아니하였다는 점을 알 수 있었다. (도 6). 결과적으로 본 발명에 사용된 BMP는 세포독성이 거의 없어 향후 의학적 재료로의 가능성이 매우 높다고 할 수 있다.

실험예 2-2

기능화된 단일벽 탄소나노튜브 세포독성

기능화된 단일벽탄소나노튜브의 세포독성은 NIH3T3 mouse fibroblast 세포 주를 사용하여 확인하였다.

10⁴ 세포당 0-100μg/ml의 농도로 단계별로 첨가하여 MTS 어쎄이(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, Promega, 미국)을 사용하여 490nm에서의 흡광도로 세포독성을 분석하였다.

일반적으로 단일벽 탄소나노튜브는 세포독성을 갖는 것으로 알려졌으나, 본 발명에 따라 처리된 탄소나노튜브는 매우 높은 수용해성을 가지면서, 동시에 100 μg/ml의 매우 높은 농도에서도 거의 세포독성을 나타내지 않았다. (도 7a)

산처리 후 fSWNT의 세포독성이 현저히 감소된 것을 산처리전의 SWNT(raw SWNTs)의 세포독성과 비교하였다. SWNT의 경우 물에 대한 수용해성이 거의 없으므로 나트륨콜레이트(Sodium Cholate, SC)라는 계면활성제를 이용하여 물에 분산시켰다. 나트륨콜레이트는 세포독성이 없는 것으로 이미 알려져 있는 물질로서 SWNT의 세포독성에 부가적인 영향은 미치지 않는다. fSWNT 및 나트륨콜레이트로 분산시킨 SWNT(Raw SWNTs/SC)를 NIH3T3 세포에 50ug/ml의 농도로 처리하고 72시간 동안 세포독성을 조사하였다.

도 7b를 참조하면 fSWNT가 처리된 세포 및 나트륨콜레이트(SC)로 처리된 세포의 경우 대조군과 같은 정도의 생존율을 나타내는 반면 SWNTs로 처리된 세포(Raw SWNTs/SC)의 경우 72시간 후 80% 정도의 생존율을 나타내었다. 이것은 산처리를 통해 합성된 fSWNTs의 경우 SWNTs에 비해 독성이 현저히 감소하였다는 것을 의미한다.

실험예 3

실험예 3-1

BMP 감염세포의 외부자기장을 이용한 세포성장 조절

본 실험에서는 BMP로 감염된 HeLa 세포의 외부 자기장 영향 하에서의 생존활성을 분석하였다. 대조군으로는 BMP에 감염되지 않은 HeLa 세포를 사용하였다.

도 8은 본 실험 예에 따라 세포에 외부 자기장을 인가하는 방식을 설명하는 모식도이다.

도 8을 참조하면, BMP에 의하여 감염된 HeLa 세포(BMP-HeLa)를 배양 플레이트에 접종하고, 세포 안정화를 위한 2-4시간 경과 후, 플레이트 아래에 자석을 위치시키며, 이로써 정상자기장(static magnetic field)를 감염세포에 인가하였다. 이후 실험 예 2-1에서 설명한 MTS 어쎄이 방법으로 세포 성장율을 검토하였다. MTS 어쎄이 데이터는 각 6개의 웰에서의 2 종류의 독립된 실험으로부터 얻어졌다.

도 9는 MTS 어쎄이로부터 평가된 세포성장 결과이다.

도 9를 참조하면, BMP가 감염된 HeLa 세포는 자기장이 인가가 되면, 대조군에 비하여 성장효과가 향상되는 것을 알 수 있다. 하지만, 자기장 인가가 없는 경우, BMP가 감염된 Hela 세포와 대조군 세포(즉, BMP 감염이 없는 HeLa 세포)는 동일한 성장속도를 나타낸다. 즉, 480mT의 자기장에서 BMP세포는 생존활성이 48시간에서 22% 정도 증가하였으며, 본 발명자는 반복된 실험을 통하여 유사한 결과-자기장 하에서의 증가된 생존활성 및 성장효과-를 얻었다. 이러한 결과는 종래의 일반적인 예측, 즉, 자기장 인가에 따라 세포성장이 억제되는 예측과는 모순되는 것으로, 이러한 결과는 결국 세포 내에 효과적으로 주입되어, 세포를 감염시킨 자성입자로부터 유도된 것으로 판단된다.

실험예 3-2

fSWNTs 감염세포의 외부자기장을 이용한 세포성장 조절

본 실험에서는 fSWNTs로 감염된 NIH3T3 mouse fibroblast 세포의 외부 자기장 영향 하에서의 생존활성을 분석하였다. 대조군으로는 fSWNTs에 감염되지 않은 NIH3T3 세포를 사용하였다.

NIH3T3 세포에 fSWNTs를 감염시킨 후 실험 예 3-1에서와 같은 방법으로 세포의 생장율을 검토하였다.

매우 약한 외부자기장(6mT)의 인가는 세포 내부의 미토콘드리아 활성을 증가시켜 세포의 생육활성을 증가시킨다는 보고가 있다(K. Yamashita, T. Ono, D. Saito, M. Saito, IEEE Tencon, 1998, 1158). 그러나 본 발명에 사용된 외부자기장의 세기는 100mT 이상(보다 정확하게는 400mT 이상인 480mT)으로, 종래에 보고된 내용에 비해 매우 강한 자기장을 인가하고 있으며, 도 10을 통해 알 수 있듯이 fSWNT로 감염되지 않은 세포에 대해 100mT 이상(480mT)의 외부 자기장을 인가할 경우 생장율의 증가는 극히 미미하였다. 반면 fSWNTs로 감염된 세포의 경우 200mT 이상의 강한 외부 자기장이 가해질 경우 대조군에 비해 24시간 만에 24%정도 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 종래의 일반적인 예측, 즉, 자기장 인가에 따라 세포성장이 억제되는 예측과는 모순되는 것으로, 이러한 결과는 결국 세포 내에 효과적으로 주입되어, 세포를 감염시킨 자성입자(fSWNTs)로부터 유도된 것으로 판단된다. 특히 세포 내로 감염된 fSWNTs의 경우 대부분이 미토콘드리아에 집적됨으로 인해(도 5 참조) 기존의 연구결과에서 제시한 바대로 자기장에 의한 미토콘드리아의 활성이 증가되는 현상이 fSWNTs로 인해 더욱 증가한 것이라고 할 수 있다.

실험예 4

BMP 감염세포의 세포사멸억제 효과( Anti - apoptotic effect )

본 실험에서는 BMP로 감염된 HeLa 세포의 외부 자기장 영향 하에서의 세포사멸억제 효과를 분석하였다. 대조군으로는 BMP에 감염되지 않은 HeLa 세포를 사용하였다.

먼저 BMP로 감염된 세포에 DNA에 반응하여 DNA사슬 사이 혹은 사슬 내에서 가교를 형성하여 DNA합성을 저해하여 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 약물로 알려진 시스플라틴(cisplatin)을 5μg/ml과 10μg/ml로 처리하고 24시간 배양한 후 세포의 생존율을 측정하였다.

도 11을 참조하면, BMP로 감염된 HeLa 세포에 외부자기장 (480mT)을 가한 경우 대조군에 비해 cisplatin에 반응하는 세포사멸율이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 10 μg/ml의 농도로 처리된 경우 약 20% 정도 세포 사멸 억제효과가 있는 것으로 확인되었다.

따라서 본 발명의 내용을 이용할 경우 사멸 사멸억제 효과를 통한 질병의 진행을 차단할 수 있으며, 특히 알츠하이머, 파킨슨질환, 노화현상 등의 퇴행성 질환 등의 치료에 활용도가 매우 높을 것으로 사료된다.

Claims

박테리아 자성입자(BMP)가 주입된 HeLa 세포에 자기장을 인가함으로써 세포사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는 세포 사멸 조절 방법.
제 1항에 있어서,
상기 자기장은 외부 자기장인 것을 특징으로 하는 세포 사멸 조절 방법.
제 1항에 있어서, 상기 박테리아 자성입자(BMP는,
상기 박테리아 자성 입자는 코어의 자성입자; 및
상기 자성입자 표면을 덮는 리피드 막으로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포 사멸 조절 방법.
제 1항에 있어서, 상기 박테리아 자성입자(BMP)는,
호기성 자성 박테리아인 마그네토솜(magnetospirillum magne-toticum AMB-1)으로부터 추출된 것을 특징으로 하는 세포 사멸 조절 방법.
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