KR101224637B1 - 갈렉틴-3, ＧＳＫ-3β 및 파신-1을 이용한 암 치료제 및 그의 스크리닝 방법 - Google Patents

갈렉틴-3, ＧＳＫ-3β 및 파신-1을 이용한 암 치료제 및 그의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 갈렉틴-3(갈렉틴-3) 및 파신(fascin-1)의 발현조절 또는 갈렉틴-3와 GSK-3β 결합을 방해하는 암 치료제 및 그의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

갈렉틴-3, ＧＳＫ-3β 및 파신-1을 이용한 암 치료제 및 그의 스크리닝 방법{Method for screening cancer therapeutic agent using Galectin-3, GSK-3β and fascin-1}
본 발명은 신규한 암치료제 및 그의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 갈렉틴-3(갈렉틴-3)에 의한 파신(fascin-1)의 발현조절 또는 갈렉틴-3와 GSK-3β 결합을 방해하는 암 치료제 및 그의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
암은 전 세계적으로 가장 많은 사망자를 내는 질병 중 하나로서, 발생 연령이 점차 낮아지며 평균수명의 연장에 따라 암 발생률 더욱 증가할 것으로 전망하고 있다. 미국 암 협회(ACS; American Cancer Society) 자료에 의하면 2007년 한 해 세계적으로 새롭게 암 진단을 받은 환자는 1,200만 명 이상이며 사망자는 760만 명으로 매일 약 2만 명씩 암으로 사망한 것으로 분석되었다.
우리나라의 경우 암(악성신생물) 사망자 수는 2002년 우리나라 총 사망자 246,515명 (조사망률 인구 10만명 당 512명) 가운데 25.5% (남성 사망자의 29.6%, 여성 사망자의 20.5%)인 62,887명으로 암으로 인한 사망(사망률 인구 10만명 당 130.7명)이 사망원인 1위를 차지하고 있다. 암 사망순위는 폐암, 위암, 간암, 대장암 및 췌장암 순으로, 이들 5대 암에 의한 사망이 전체 암 사망의 약 70%를 차지하고 있다. 또한 남성에 있어 주요 암 사망원인은 폐암, 위암, 간암 및 대장암 등으로 이들 4대 암에 의한 사망자 수(28,147명)가 전체 남성 암 사망자 수(40,177명)의 70%를 차지하고 있으며, 여성에 있어 주요 암 사망원인은 위암, 폐암, 간암, 대장암 및 췌장암 등으로 이들 5대 암에 의한 사망자 수(13,630명)가 전체 여성 암 사망자 수(22,710명)의 60%를 차지하고 있다.
상기 암 중 위암과 관련하여 1996년에서 2006년 위암 사망률의 추이를 분석한 결과, 지난 10년간 위암이 차지하는 암 사망률은 24%에서 16%로 점점 줄어들고 있으나 여전히 위암은 한국인의 대표적인 3대 암의 하나로서 이는 간과할 수는 없는 수치이다.
위암의 증상은 전혀 증상이 없는 경우에서부터 격심한 통증에 이르기까지 다양한 양상을 나타내고 있다. 또한 위암의 증상이, 어떤 특성을 가지는 것이 아니라일반적인 소화기 증상을 나타낸다는 것이다. 일반적으로 위암의 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며 있다고 하더라도 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람들이 이를 간과하기 쉬어 위암의 사망률을 높이는 원인이 되기도 한다.
또한, 현재까지의 진행되고 있는 위암의 최선의 치료는 수술로써 병소를 절제해 내는 것이며, 따라서 완치를 목표로 하는 치료로써는 외과적인 절제방법 밖에는 없다. 외과적인 절제방법에는 여러 가지 방법이 있겠으나 일단 완치를 목표로 하는 수술에서는 가능한 한 넓은 범위를 포함하여 절제하는 것이 원칙이나 수술 후 광범위한 절제로 인한 후유증을 고려하여 그 절제 범위를 정하기도 한다. 이때는 위뿐만 아니라 주위 임파선을 포함한 여러 장기도 포함하게 되므로 상당히 큰 수술이 되기 때문에 환자의 예후를 장담하기 어려울 수도 있다. 또한 위암이 다른 장기에 전이되었을 경우에는 근치수술이 불가능하며, 따라서 이때에는 항암제투여 등 다른 방법을 택하게 되는데 현재까지 시판되고 있는 항암제는 일시적인 증상의 완화나 절제술 후 재발의 억제와 생존기간을 연장하는데 일시적 효과는 있지만, 항암 제 투여에 따른 부작용 및 경제적 부담으로 환자에게 이중적 고통을 주기도 한다. 이에 새로운 암 치료제와 그의 개발 방법이 절실히 요구되고 있다.
위암의 진행과 관련하여 악성종양 및 양성종양으로 발전하는 단계에서 발현양이 달라지는 갈렉틴 단백질은 사람이나 동물의 생체 내에 존재하는 단백질분자로 탄수화물에 특이적으로 결합하는 물질 중 하나이다. 갈렉틴 단백질의 많은 생화학적, 분자생물학적 성상이 이미 밝혀져 있음에도 불구하고 아직 그 정확한 생체내의 기능에 대하여서는 논란이 있다. 갈렉틴-1으로 시작되는 갈렉틴 패밀리는 그 분자량이 14~36kDa인 모노머 혹은 다이머로써 갈렉틴 -1, -2, -3, -7, -8은 태아의 형성이나 세포의 성장, 부착, 종양화를 조절하는 것으로 알려져 있다. 갈렉틴들 중에는 갈렉틴 -1, -3, -8, 갈렉틴 -2, -4, -5 그리고 -7 처럼 특정 장기 또는 세포에 한정되어 있는 종류가 있다 (갈렉틴 -2는 간암세포에, 갈렉틴 -4는 소장 상피세포에, 갈렉틴 -5는 적혈구에, 갈렉틴 -7은 중층 편평상피의 각화세포층에 특이적으로 분포함).
갈렉틴 패밀리 중에서 가장 연구가 많이 된 갈렉틴-3은 CBP-35, Mac-2, εBP, RL-29, L-35 그리고 L-31등으로 불렸던 분자량 26,200~32,300 정도인 갈렉틴으로 세포의 성장, 분화, 악성화, 배아형성, IgE의 매개로 발생하는 사람에서의 과민반응에 관여하고 있고, 세포간 또는 세포-기질간 결합에도 중요 역할을 하고 있다. 또한 갈렉틴-3는 그 분포 범위가 넓어 각종 백혈구와 림프기관의 수지상세포, 랑게르한스 세포, 소장 점막과 신장 세뇨관의 상피세포 등에 분포하는 것으로 보고되어 있다. 특히 장상피 내에서 세포이 성장, 분화가 한창 일어나는 크립트(crypt)에서는 거의 나타나지 않다가 분화가 진행되면서 그 양이 증가하는 것으로 밝혀진 사실은 갈렉틴-3와 세포의 발생, 분화 단계간의 어떠한 기능 발현을 하고 있음을 나타내고 있다. 이러한 갈렉틴은 그 패밀리 구성원의 수도 계속 증가하여 현재 갈렉틴-9까지 보고되고 있다. 또한 갈렉틴은 세포외로 분비되는 단백질임에도 불구하고 발현과정 중에서 신호 서열 단백질을 지니지 않는 점에서 인터루킨-1이나 섬유아세포 성장 인자등과 공통점을 지니고 있다.
갈렉틴-3는 진핵세포에서의 일반적 가용성 단백질과는 달리 시그널 펩타이드가 없어도 세포 밖으로 분비되는 특징이 있다(Woo, H. J., Secretion of macrophage differentiation antigen, Mac-2, 15: 61-68, 1993). 갈렉틴의 기능을 분자 수준의 메카니즘을 분석하면 암이나 관절염과 같은 염증질환의 진단, 예방 치료법에 기초를 제공할 수 있을 것으로 기대되고 있으나, 갈렉틴-3의 발현이 악성 종양(carcinoma)과 관련이 있다는 연구결과는 보고된 바 있는 반면, 갈렉틴-3의 발현을 억제하여 암이나 염증질환을 치료하는 방법에 대한 연구결과는 보고된 바 없는 상황이다. 또한 갈렉틴-3의 메커니즘에 대한 연구가 전무한 실정이다.
이에 본 발명자들은 신규한 암 치료제를 개발하고 새로운 암치료제의 스크리닝 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 위암조직에서 위암 세포의 운동성을 감소시키고, 악성 종양 세포의 전이효과를 감소시키기 위한 효과적인 치료제로서 β-갈락토시드 결합 단백질로 인테그린 신호에 반응하여 위암세포의 운동성에 변화를 유발하는 갈렉틴-3 단백질의 발현을 감소시키거나 혹은 억제하여 위암세포의 형태 변형 억제, 파신-1 발현의 감소, 세포의 운동성 감소 및 악성 종양세포 전이를 감소시킴을 알아내었고 이러한 현상들이 갈렉틴-3와 GSK-3β와의 직접적인 상호작용에 의한 것임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 a) 암세포에 암 치료용 후보물질을 처리하는 단계; b) 상기 후보물질이 처리된 암세포에서 GSK-3β (glycogen synthetase kinase-3β)의 인산화 및 파신-1 (Fascin-1)의 발현 수준을 확인하는 단계; 및 c) GSK-3β의 인산화 및 파신-1의 발현 수준을 대조구와 비교하는 단계를 포함하는, 암치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 갈렉틴-3 및 GSK-3β의 결합을 억제하는 물질을 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은 a) 암세포에 암 치료용 후보물질을 처리하는 단계; b) 상기 후보물질이 처리된 암세포에서 GSK-3β (glycogen synthetase kinase-3β)의 인산화 및 파신-1 (Fascin-1)의 발현 수준을 확인하는 단계; 및 c) GSK-3β의 인산화 및 파신-1의 발현 수준을 대조구와 비교하는 단계를 포함하는, 암치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 스크리닝 방법은 암세포의 암치료용 후보물질을 처리했을때 대조구와 비교하여 GSK-3β 인산화가 감소하고, 및 파신-1의 발현이 감소하면 후보물질을 암치료제라고 판단할 수 있으며, 대조구와 비교했을 때 GSK-3β 인산화가 동일하거나 증가, 또는 파신-1의 발현이 동일하거나 증가하면 후보물질을 암치료제가 아니라고 판단할 수 있다. 바람직한 일 실시태양으로 상기 암치료제의 스크리닝 방법은 갈렉틴-3(갈렉틴-3)의 발현 또는 GSK-3β의 발현 수준을 대조구와 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 때 대조구와 비교하여 갈렉틴-3의 발현이 감소하거나, GSK-3β의 발현이 감소하면 처리한 후보물질을 암치료제라고 판단할 수 있으며, 대조구와 비교했을 때 갈렉틴-3의 발현이 동일 또는 증가하거나 GSK-3β의 발현이 동일 또는 증가하면 처리한 후보물질을 암치료제가 아니라고 판단할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 암치료용 후보물질인 파신-1의 siRNA를 이용하여 억제한 경우 위암 세포의 운동성, 침윤이 감소하는 것을 확인하였으며(도 2), 96번째 아미노산이 돌연변이된 갈렉틴-3을 처리한 경우, GSK-3β의 인산화 정도가 돌연변이된 갈렉틴-3에 영향을 받지 않아 GSK-3β의 인산화가 감소되며(도 6), 이는 결국 파신-1의 발현을 감소시켜 위암세포의 전이를 억제할 수 있음을 확인하였다. 따라서 갈렉틴-3와 GSK-3β 결합을 방해하거나, 갈렉틴-3, 또는 파신-1의 발현을 감소 또는 GSK-3β의 인산화를 감소시키는 물질을 암치료제로 스크리닝할 수 있음을 확인하였다. 또한, 이런 암치료제가 갈렉틴-3와 GSK-3β의 결합에 영향을 미치는지 여부는 GSK-3β의 인산화 수준으로 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "GSK-3β(Glyco-gensynthase kinsase 3 - β)"란 세린/쓰레오닌 단백질 키나아제로 세포 기질내에서 세린 및 아미노산에 인산을 첨가하는 역할을 하는 단백질이다. 상기 GSK-3에 의한 특정 단백질의 인산화는 당합성 및 NFAT의 경로에서는 기질에 의해 인산화가 억제되기도 하는 특징을 가진다. 동물의 GSK-3은 GSK-3α 및 GSK-3β에 의해 암호화되어 있다. GSK-3 단백질은 PI 3-키나아제의 작용을 억제하여 세포의 사멸과 관련된 기능에 중요한 조절자 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, "파신-1 (Fascin-1)"이란 분자량 55kDa의 구형 단백질로 F-액틴에 의해 세포내에서 구조화되어 있고, 생물간의 상동성이 가장 잘 보존된 단백질 중 하나이다. 척추동물에서는 파신-1, 파신-2 및 파신-3의 세개의 유전적 암호에 의해 암호화된 유전자로 구성되어 있으며, 신경계 발달 과정에서 중배엽 유래의 단백질로 파신-1은 중간엽 조직 및 신경계에서 광범위하게 발현되고, 파신-2는 망막의 광수용체 세포에서 발현되며, 파신-3은 고환 특이적으로 발현되는 단백질이다.
액틴 교차 연결 단백질로서 파신은 두 개의 액틴 결합 부위를 가지고 있으며, 액틴과의 결합 활성은 단백질 키나아제 Cα(PKCα)에 의해 39번 세린 위치가 인산화되는 경우에 저해되는 것으로 알려져 있다. 생체내에서 세린의 인산화에 대한 기작은 정확하게 알려져 있지 않으나, 파신과 F-액틴과의 관계는 세포외 기질의 조건에 의해 조절되는 것으로 확인되었다. 상기와 같은 조절의 분자적 기초는 트롬보스폰딘-1(thrombospondin-1) 및 파이브로넥틴(fibronectin)에 의한 것으로 보고되었으며, PKCα 및 GTPase의 활성상태에 의존적인 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어 "갈렉틴(galectin)"이란 베타-갈락토시드 결합 단백질 렉틴 패밀리에 속하는 31kDa의 단백질로서, 탄수화물 인지 결합 도메인을 공유하는 구조로 이루어진 것이 특징이며, 이들의 수와 구조에 따라 proto, chimera, tandem repeat 유형으로 분류된다. 현재까지 갈렉틴 단백질은 총 14종이 발견되었으며, 이들은 배아발생, 세포부착, 세포증식, 세포자연사, mRNA 스플라이싱 등 생물학적 기능에 주로 관계한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "갈렉틴-3"란 갈렉틴 단백질의 독특한 키메라 유형으로서 정상적으로 대식세포, 호산구, 중성구, 비만세포 외에도 소화기, 호흡기 및 신장의 상피세포에서도 발현된다. 갈렉틴-3 단백질은 위암종, 췌장암종, 갑상선암종, 대장암종 등에서는 과발현되지만, 유방암종이나 난소암종에서는 발현이 감소하는 특징이 있으며, 종양조직에서 갈렉틴-3 단백질의 발현이 예후에 미치는 영향도 종양의 유형에 따라 다양한 것으로 보고되었다.
갈렉틴-3 단백질의 기능은 다양하게 알려져 있으며, 세포 내에서는 주로 세포질에 존재하지만 핵과 간질에도 존재하는 것으로 알려져 있다. 갈렉틴-3은 bcl-2와 구조적으로 유사하며, bcl-2 패밀리는 아니지만, 두 단백질 모두 N 말단에 프로린, 글리신, 알라닌이 풍부하며, C 말단에 아스파라진-트립토판-글리신-아르기닌 모티프를 공유한다. 상기 모티프는 '항-사멸 모티프'라고 불리며 Bcl-2의 BH-1 영역에 존재한다. 이는 갈렉틴-3이 bcl-2의 기능을 대신하거나 모방함으로써 미토콘드리아에서 시토크롬 C의 분비를 억제하여 세포사멸을 억제하는 역할을 하는 것을 의미한다. 또한 갈렉틴-3은 사이클린과 사이클린 억제제를 변조하여, 세포분열이 G1 후기에 멈추게 함으로써 세포 사멸을 억제하는 역할을 한다. 간질에 존재하는 갈렉틴-3의 경우 다양한 방법으로 종양세포를 제거하는데 관여하는 NK 세포와 T 림프구의 자연사를 유도하여 종양세포의 생존에 간접적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 따라서 갈렉틴-3의 발현은 종양의 예후에 나쁜 영향을 미치게 되는데 이는 정상세포의 경우 갈렉틴이 주로 핵에서 발현되나, 암종으로 진행할수록 세포질에 발현되는 비율이 높은 것과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 갈렉틴의 발현 및 하위 유전자들에 대한 발현기작에 대해 알려진 바가 없다. 본 발명의 일구현예에 따르면 갈렉틴-3의 발현이 높아진 위암종에서 siRNA를 이용하여 갈렉틴-3의 발현을 억제한 후 암세포의 형태 변화, 파신-1 발현양의 감소, 종양세포의 운동성 감소 및 악성 종양 세포 전이효과의 감소를 확인한 결과, 갈렉틴-3의 발현이 억제되는 경우 상기 단백질이 과발현된 군과 비교하여, 액틴 번들링 단백질인 파신-1의 발현양이 감소하며, 핵내의 GSK-3β 및 β-카테닌의 발현양도 감소하는 것을 확인하였다. 또한 GSK-3β 인산화도 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 암세포에 암치료용 후보물질을 처리하면 파신-1 발현감소, GSK-3β의 인산화가 감소되는 것을 알 수 있으며, 갈렉틴-3, β-카테닌, GSK-3β 발현 또한 감소하는 것을 알 수 있다.
본 발명에서 용어, "대조군"이란 암치료용 후보물질을 투여하지 않은 개체 또는 세포를 말하며, 암치료용 후보 물질을 처리한 암세포와 GSK-3β 인산화, 파신-1 발현, 갈렉틴-3 발현, β-카테닌 , GSK-3β발현 수준을 비교하기 위해 사용된다. 또한 본 발명에서 용어, "후보물질"이란 암치료 활성을 테스트 할 약제를 의미하며, GSK-3β 인산화, 파신-1 발현, 갈렉틴-3 발현, β-카테닌, GSK-3β 발현 수준을 직접 또는 간접적으로 변화시킴으로써 암을 치료할 수 있는 능력을 측정하는 대상으로서, 예컨대 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오타이드 및 광범위한 화합물 등 임의 분자를 포함한다. 이런 후보 물질은 또한 천연 물질 뿐 아니라 합성 물질을 모두 포함한다.
본 발명에서 용어, "암 치료제"란 암세포를 파괴하는 기작을 갖는 약물 또는 화학제제를 말하며, 대부분의 암 치료제는 세포에 다발성 손상을 일으키고, 세포를 더 이상 복제되지 않도록 하는 작용을 하며, 바람직하게는 본 발명의 암 치료제는 암의 전이, 이동성을 억제하는 역할을 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 위암의 전이를 억제할 수 있다.
암치료제의 종류를 작용기작에 따라 분류하면 알킬화제제, 항대사물질, 식물성 알킬화 제제, 항생제, 질산요소제, 효소, 스테로이드 제제 및 면역요법제로 분류할 수 있다. 구체적으로 알킬화제제는 DNA 합성을 방해하는 기작으로 암세포의 증식을 억제하여 항암활성을 나타내며, 세포주기에 특히 민감한 특징을 가지고 있다. 알킬화제제의 경우 암세포의 G1기에서 S기로의 이행을 억제하는 역할을 한다. 또한 암치료제의 기작 중 하나인 항대사물질은 세포가 합성하는 자연적인 생성물과 매우 근접하나 자연적인 산물을 아니며 세포를 복제하지만 세포 고유의 기능을 파괴하는 작용을 하는 물질로, 상기 물질은 세포주기의 S단계에만 작용하는 것으로 알려져 있다. 식물성 알킬화제제의 경우는 세포의 유사분열을 방해하여 암세포의 증식을 억제하며, 항생제는 DNA 합성을 억제하여 암세포의 증식을 억제하므로 세포 분열의 모든 단계에서 영향을 미칠 수 있다. 질산요소제의 경우 뇌혈관 장막을 통과하는 특성을 가지고 있어서, 뇌 종양 치료를 제외하고는 아동에게서는 널리 사용되지 않는 특징이 있다.
바람직하게 본 발명의 암치료제는 상기 물질을 투여하는 경우 종양 의심개체 및 종양 양성개체인 대조군과 비교하여 갈렉틴-3의 발현 수준이 감소되거나, GSK-3β의 인산화 정도가 대조구와 비교하여 감소되는 경우 이를 종양 치료제로 사용가능하며, 상기 물질의 종류로는 항체, 화합물, 바이러스, 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 다양한 종류를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 암치료제는 GSK-3β의 인산화를 인식하는 물질일 수 있으며, 또는 갈렉틴-3 및 GSK-3β의 결합을 저해하는 물질을 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"는 생체의 면역계에서 혈액이나 림프를 순환하면서 외부 물질인 항원이 침입한 경우 이에 반응하는 물질을 말하며, 림프조직에서 형성되는 글로불린계 단백질로 면역글로불린이라고도 불린다. 항체는 B세포가 생산해서 체액으로 흘려보내는 단백질로 항원과 특이적으로 결합하며, 하나의 항체 분자에는 두 개의 중사슬(heavy chain)과 두 개의 경사슬(light chain)이 있으며, 각각의 중사슬과 경사슬은 그의 N-터미널 말단에 가변영역을 갖고 있다. 각각의 가변영역은 3개의 상보성 결정부위(Complementarity determining region: CDR)와 4개의 구조형성부위(framework regions: FRs)로 구성되는데, 상보성 결정 부위들은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, 가변영역의 구조형성 부위들로 유지되는 비교적 짧은 펩티드 서열로 존재한다.
바람직하게 본 발명의 항체는 갈렉틴-3과 상호작용하는 GSK-3β의 인산화를 인지하는 항체로, 상기 항체에 의해 갈렉틴-3 및 GSK-3β의 상호작용이 저해되고, 궁극적으로 이들과 상호작용하는 파신-1 의 발현이 저해되는 효과를 나타낸다.
본 발명의 용어, "siRNA"란 이중가닥의 RNA가 다이서에 의해 절단되어 생성되는 21-25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 단백질 발현을 억제하는 것을 말한다. siRNA에 의해 상보적인 염기서열을 갖는 mRNA 분해가 유발되는지 혹은 번역 억제가 유도되는지 여부는, 해당하는 21-25개의 뉴클레오티드 RNA와 mRNA 간의 상보성 정도에 따라 결정된다. 바람직하게 본 발명에서는 종양 의심개체 혹은 종양 양성개체에서 GSK-3β의 인산화를 인식하는 항체를 사용하여 GSK-3β의 인산화가 감소하는 경우 TCF-4의 활성이 감소하며, β-카테닌의 발현이 감소하여 결과적으로 파신-1의 발현을 유도하는 복합체 분자들의 발현 감소로 파신-1의 발현양이 감소하며 종양세포의 이동성이 감소하는 것을 확인할 수 있다. 또한 본 발명에서 사용한 암치료제인 핵산은 갈렉틴-3의 전사를 억제하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 siRNA로, 상기 단편의 상보성 부분을 이용하여 종양세포의 증식, 분화 및 이동성에 직접적으로 관여하는 파신-1 발현에 관여하는 복합체들의 효과를 억제하는 방법으로 종양 세포의 증식, 분화 및 이동성을 억제하는 기작을 한다.
암세포에서 GSK-3β의 인산화 및 파신-1의 발현수준을 확인하는 방법은 본 발명의 갈렉틴-3 및 GSK-3β결합 저해 항체 및 상기 항체가 가지는 상보성 영역에 특이적으로 결합하는 항원간에 항원-항체 반응을 통하여 달성될 수 있는데, 본 발명에서 용어 "항원-항체 결합"이란 종양 의심 개체 및 종양 양성 개체가 가지는 갈렉틴-3 또는 GSK-3β와 이에 특이적인 항원 결합물을 의미하고, 항원-항체 결합 반응의 확인은 검출라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ ,[RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
또한, 종양세포의 증식, 분화 및 운동성에 관여하는 파신-1 유전자의 발현 수준 확인은 파신-1 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계는, 상기 기술한 바와 같이 당업계에서 이용되는 통상의 발현 수준 측정 방법이 제한없이 사용될 수 있으며, 그 예로 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법 등이 있다.
또한 본 발명의 상기 갈렉틴-3의 발현 또는 GSK-3β 인산화 정도의 확인은 갈렉틴-3 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준, GSK-3β의 단백질의 인산화 정도를 상기에서 설명한 바와 같이 측정하여 수행할 수 있다.
암 또는 종양을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질은 후보 물질이라고도 하며, 직접 또는 간접적으로 암 또는 종양을 호전 또는 개선시킬 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한되지 않으며, 화합물, 유전자 또는 단백질 등의 모든 치료가능 예상물질을 포함한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 상기 후보 물질의 투여 전후의 갈렉틴-3의 발현 수준, GSK-3β의 인산화 및 파신-1의 발현 수준을 확인하는 한편, 상기 발현수준이 후보 물질 투여 전에 비해 감소된 경우, 해당 후보 물질을 암 또는 종양에 대한 예상 치료제로서 결정 할 수 있다. 본 발명의 구현예에 따르면 소간섭 RNA(small interfering (si) RNA) 및 렌티-바이러스 구조체를 사용하여 인간 위암 세포주에서 갈렉틴-3 발현을 억제한 후 위암 세포의 운동성에 관여하는 단백질인 파신-1 단백질의 발현양이 감소하는 것을 확인하였고, 액틴 번들링 단백질인 파신-1의 발현감소는 위암세포의 운동성 및 전이를 억제하여 암을 치료하는 효과를 나타냄을 확인하였다.
다른 하나의 양태로서 본 발명은 갈렉틴-3 및 GSK-3β의 결합을 억제하는 물질을 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 기술한 바와 같이, 본 발명자들은 갈렉틴-3가 GSK-3β와 결합하여 직접 상호작용하고, β-카테닌 및 TCF-4 사이의 상호 작용을 증가시켜 파신-1의 발현을 증가시킴으로써, 종국적으로 암세포의 이동, 즉 암의 전이를 증진시킨다는 것을 최초로 규명하였다. 나아가, 본 발명자들은 갈렉틴-3의 92번 세린 및 96번 세린이 GSK-3β와 직접 상호작용하는 모티프임을 규명하였다(도 8 및 도 10). 따라서, 갈렉틴-3 및 GSK-3β의 결합을 억제함으로써 암전이를 저해하여 암을 치료할 수 있으며, 당업자는 갈렉틴-3 및 GSK-3β가 결합하는 부위를 표적으로 하여 갈렉틴-3 및 GSK-3β의 결합을 억제하는 siRNA, 안티센스올리고뉴클레오티드, 압타머 또는 항체를 당업계의 기술에 따라 용이하게 디자인하여 암치료제로 사용할 수 있다.
바람직한 일 실시태양으로 갈렉틴-3 및 GSK-3β의 결합을 억제하는 물질은 상기 결합을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등을 제한 없이 포함하나, 그 예로 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 또는 항체일 수 있다. 바람직하게는 상기 갈렉틴-3 및 GSK-3β의 결합을 억제하는 물질은 서열번호 21로 표시되는 갈렉틴-3를 코딩하는 아미노산 서열의 92번째 아미노산 내지 96번째 아미노산을 표적으로 포함할 수 있으며, 이는 GSK-3β와 갈렉틴-3가 결합하는 모티프로서 본 발명자들에 의해 최초로 규명되었다(도 10). 상기 결합 모티프는 “SGQPS(세린, 글라이신, 글루타민, 프롤린, 세린)"모티프로 표시될 수 있다. 바람직하게 상기 갈렉틴-3 및 GSK-3β의 결합을 억제하는 물질은 서열번호 21의 92번째 아미노산 내지 96번째 아미노산을 코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 또는 벡터일 수 있다. 상기 "siRNA", "안티센스”, “올리고뉴클레오티드”, “항체”, “핵산을 포함하는 바이러스 또는 벡터“ 등은 상기에서 전술한 바와 같으며, 본 발명자들에 의해 갈렉틴-3와 GSK-3β의 결합 모티프가 최초로 규명되었기 때문에 이를 표적으로 한 억제물질은 당업자가 공지의 분자생물학 기법 등을 이용하여 제조할 수 있음은 자명하다.
본 발명에서 용어, “압타머”란 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드로서, 20~60뉴클레오티드 정도의 크기이며, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가지며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 압타머는, 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 압타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 압타머는 또한, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다.
본 발명의 암 치료제 스크리닝 방법을 이용하면 갈렉틴-3 및 파신-1의 발현을 조절하여 종양 세포의 운동성을 조절하는 역할을 하는 암치료제를 스크리닝 할수 있으며, 갈렉틴-3 및 파신-1의 작용을 억제하거나 분해를 촉진하여 갈렉틴-3 관련 질병을 억제함으로써 종양을 치료할 수 있으며, 바람직하게는 위암의 치료를 위한 광범위한 치료제를 스크리닝 할 수 있다.
본 발명의 암치료제를 이용하면 갈렉틴-3 및 GSK-3β의 결합을 억제함으로써 암 전이를 저해하여 암을 치료할 수 있어 암 환자의 생존률을 높이는데 큰 기여를 할 수 있다.
본 발명의 단순한 변형 또는 변경은 모두 당해 분야의 통상적인 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
도 1은 인간 위암 세포에서 파신-1 발현에 대한 갈렉틴-3 사일런스의 효과를 나타낸다. (A) 두 가지 다른 농도(5, 10 nM)로 스크램블 siRNA (scRNA) 또는 갈렉틴-3 siRNA로 트랜스펙션한 후의 인간 위암 MKN-28 세포에서 갈렉틴-3 및 파신-1의 mRNA 및 단백질 발현 수준을 나타낸 것이다. 48시간 동안 트랜스펙션 및 세포 수확 후 전체 RNA 및 단백질을 확보한 후, RT-PCR 및 웨스턴 블랏으로 분석하였다. β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. (B) scRNA 또는 갈렉틴-3 siRNA로 트랜스펙션된 MKN-28 세포의 면역세포화학 분석. DAPI (파란색), 항-파신-1 FITC (녹색) 및 항-F-액틴 텍사스 레드(빨간색)는 공초점 현미경으로 확인하였다. 그림 안의 막대기는 10 ㎛를 나타낸다. (C-D) 갈렉틴-3 유전자가 사일런스된 세포의 이동을 나타내는 히스토그램이다. 세포 이동 검사의 결과를 (C)에 나타내고 통계적 유의도를 수치로 나타냈다. (p<0.0005) 세포 사진에 주어져 있다(D). (E) pcDNA3.1/NT-GFP-갈렉틴-3 및 pcDNA3.1/NT-GFP 의 벡터 대조군으로 트랜스펙션 후 웨스턴 블랏으로 결정된 SNU-638 세포에서 갈렉틴-3 및 파신-1의 발현 수준을 알아보았다. b-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 2는 인간 위암 세포의 운동성에 대한 파신-1 사일런스의 효과를 나타낸다. (A) scRNA 또는 파신-1 siRNA로 트랜스펙션된 MKN-28 세포에서의 파신-1 단백질 발현 수준을 나타낸 것이다. b-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. (B) scRNA 또는 파신-1 siRNA로 트랜스펙션된 MKN-28 세포의 면역세포화학 분석 결과이다. DAPI (파란색), 항-파신-1 FITC (녹색) 및 항-F-액틴 텍사스 레드(빨간색)는 공초점 현미경으로 검출하였다. 그림 내의 막대기는 10 ㎛를 나타낸다. (C) 파신-1 유전자가 사일런스된 MKN-28 세포의 이동. 이동 결과를 측정하여 히스토그램으로 나타낸 후 통계적 분석을 수행했다 (p<0.0004). (D-E) (D) 콜로니 형성 검사 (E) 전이 검사 및 (F) 트랜스펙션된 갈렉틴-3 및 파신-1 siRNA를 사용하여 MKN-28 세포의 창상 치유 검사를 실시하였다. 콜로니 형성 검사 및 전이 검사의 결과는 히스토그램으로 나타냈고 통계적 분석을 수행했다(P<0.0005). 세포 이동은 현미경으로 관찰하였다.
도 3은 갈렉틴-3의 과발현시켜 파신-1의 발현을 증가시키고 이를 통해 인간 위암 세포의 이동성이 증가됨을 나타내는 도이다. (A) LacZ 또는 갈렉틴-3을 포함하는 렌티-바이러스로 감염한 후 음성 대조군인 파신-1 siRNA 또는 스크램블 RNA로 트랜스펙션한 SNU-638 세포에서 갈렉틴-3 및 파신-1의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 검출하였다. b-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. (B-C) 상기의 세포를 사용하여 세포 이동 검사(B) 및 전이 검사(C)를 실시한 히스토그램이다(P<0.0005).
도 4는 갈렉틴-3과 β-카테닌 및 TCF-4의 상호작용 및 인간 위암 세포에서 갈렉틴-3 사일런스 후 TCF-4의 DNA 결합 활성의 감소를 나타내는 도이다. (A) 위암 세포에서 갈렉틴-3은 GSK-3β, β-카테닌 및 TCF-4와 상호작용한다. 면역침전법을 실시한 후, 웨스턴 블랏을 사용하여 갈렉틴-3, GSK-3β, β-카테닌 및 TCF-4를 각각 감지하였다. 전체 세포 용해물을 양성 대조군으로 사용하였다. (B) 갈렉틴-3 발현이 없을 경우, GSK-3β, β-카테닌 및 TCF-4의 상호작용. MKN-28 세포에 scRNA 또는 갈렉틴-3 siRNA를 트랜스펙션한 후, 면역침전법을 실시하였고, 웨스턴 블랏을 사용하여 GSK-3β, β-카테닌 및 TCF-4을 검출하였다. 전체 세포 용해물을 양성 대조군으로 사용하였다. (C) 염색질 면역침전법을 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 실시하였다. 인풋 레인에 있는 전체 게놈믹 DNA를 PCR 반응을 위한 대조군으로 사용하였다. (D) lacZ 및 갈렉틴-3 과발현 세포에서 TCF4의 루시퍼라제 활성. 루시퍼라제 정량 검사는 실시예에 기술된 바와 같이 실시하였다. SP1 공통서열의 구조체를 음성 대조군으로 사용하였다. (E) 갈렉틴-3 siRNA 처리 유무하에서 MKN-28 세포의 핵 및 세포질 분획에서 갈렉틴-3, 인산화된 GSK-3β, GSK-3β, β-카테닌 및 TCF-4의 단백질 수준을 측정하였다. 라민 A/C를 핵 분획의 대조군으로 사용하였다.
도 5는 인간 위암 세포에서 β-카테닌 및 GSK-3β의 핵 존재 및 안정성에 대한 갈렉틴-3 사일런스의 효과를 나타내는 도이다. (A-B) (A) 항-갈렉틴-3 FITC(녹색) 및 항- GSK-3β cy5(빨간색)를 사용, (B) 항-β-카테닌 FITC (녹색) 및 항-갈렉틴-3 cy5 (빨간색)를 사용하여 공초점 현미경으로 갈렉틴-3 유전자가 사일런스된 세포에서 GSK-3β 및 β-카테닌 면역세포화학 분석에 의한 세포내 위치 확인. DAPI는 핵(파란색)을 나타내고 막대기는 10 ㎛를 나타낸다.
도 6은 LacZ,갈렉틴-3 (gal-3; 야생형) 및 96번 세린이 변이된 갈렉틴-3 (gal-3; S96A)을 포함하는 렌티-바이러스로 감염된 인간 위암 세포 SNU-638에서 파신-1 발현에 대한 갈렉틴-3 돌연변이의 효과를 나타내는 도이다. (A) 웨스턴 블랏을 통한 갈렉틴-3, 파신-1, 인산화된 GSK-3β[pS6], GSK-3β 및 β-카테닌의 발현 수준. β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. (B) 상기 세포에서 TCF4의 루시퍼라제 활성. SP1 공통서열의 구조체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 7은 위암 환자에서 갈렉틴-3, β-카테닌, 및 파신-1 발현 수준 사이의 임상학적 관계를 나타내는 도이다. (A) RT-PCR을 통한 위암 환자에서 갈렉틴-3 및 파신-1의 mRNA 수준. 20명의 각 암 환자로부터 악성 종양 조직 및 정상 조직을 입수하였고 PCR을 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 실시하였다. GAPDH를 노멀라이제이션 대조군으로 사용하였다. (B-C) 위암 조직에서 갈렉틴-3, β-카테닌, 및 파신-1의 발현은 H&E를 사용한 면역조직화학 염색(밤색)을 한 후 형광 현미경으로 검출하였다. 배율: (B) x200; (C) x400.
도 8은 파신-1을 상승 조절하는 갈렉틴-3 매개에 의한 세포 이동 강화에 대한 도식적 모델을 나타낸다. 갈렉틴-3은 GSK-3β와 직접 상호작용하고 갈렉틴-3, GSK-3β 및 β-카테닌/TCF-4 복합체는 세포질에서 핵으로 이동한다. 이 복합체는 파신-1 프로모터에 결합하여 파신-1 발현을 증가시킨다. 따라서 세포의 이동성이 강화된다.
도 9는 10개의 위암 세포주에서 갈렉틴-3 및 파신-1의 mRNAs 및 단백질의 발현수준을 나타내는 도이다. RT-PCR 및 웨스턴블랏을 통해 분석하였고, 노멀라이제이션 대조군으로 β-액틴을 사용하였다.
도 10은 갈렉틴-3 및 파신-1 프로모터에 대한 TCF-4 결합 부위의 아미노산 서열을 나타내는 도이다. (A) NLS (핵 위치 서열)을 지닌 갈렉틴-3에서 96번 세린을 GSK-3β의 키나아제 기질 모티프로 보여주는 서열. (B) 파신-1 프로모터와 TCF-4 결합부위 사이의 상호작용의 도식적 모델을 나타낸다. NF-kB, CREB, and TCF-4 와 같은 전사인자 결합 부위를 포함하는 파신-1 프로모터를 나타낸다(위), -989에서 -1190까지의 TCF-4 결합 부위(-1089 ~ -1096)를 검출하고자 ChIP 정량법의 프라이머를 제조하였다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 제시한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시되는 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험방법 및 준비
<1-1> 세포배양 및 트랜스펙션
인간 위암 세포주를 한국 세포주 은행에서 구입하였고, 5% 소태아혈청(FBS)과 1% 항생제를 포함하는 RPMI 1640에서 배양하였다. 갈렉틴-3(갈렉틴-3) 및 파신-1(fascin-1) siRNA(갈렉틴-3 siRNA 5'-AUAUGAAGCACUGGUGAGGUCUAUG-3', 서열번호 1; 및 파신-1 siRNA 5'-UCCAGCAAGAAUGCCAGCUGCU ACU-3', 서열번호 2를 인비트로젠(Invitrogen)에서 구입하였고, 시약 제조사의 지시에 따라 리포펙타민(Lipofectamine) RNAiMAX 시약(Invitrogen)을 사용하여 세포에 일시적으로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 2 일 후 세포들을 얻는다.
<1-2> RNA 분리 및 역전사 중합효소 연쇄반응
국립 암 센터 내의 병원으로부터 얻은 위암환자의 종양 및 정상 위 조직으로부터 전체 RNA를 분리하였다. 제조사의 지시에 따라 트리졸(TRIzol)　 시약(Invitrogen)을 사용하여 RNA 분리를 실시하였다. 역전사 PCR 시스템(Promega)을 사용하였고, FSCN1에 대한 프라이머로 5'-ACCTGTCTGCCAATCAGGAC-3'(서열번호 3) 및 5'-CCCATTCTTCTTGGAGGTCA-3'(서열번호 4), LGAL3에 대한 프라이머로 5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3'(서열번호 5) 및 5'-ATGTCACCAGAAATTCC CAGTT-3'(서열번호 6), βactin에 대한 프라이머로 5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3'(서열번호 7)및 5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3'(서열번호 8) 및 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)에 대한 프라이머로 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3'(서열번호 9) and 5'-ACTTGATTTTGGAGGGAT CT-3'(서열번호 10)를 사용하였다. PCR은 Ex-taq (TaKaRa) 방법을 사용하여 실시하였다.
<1-3> 웨스턴블랏 분석 및 면역침전법
웨스턴블랏 분석 및 면역침전법에 사용하기 위한 세포 용해물 추출을 프로테아제 저해제 칵테일을 포함하는 RIPA 완충용액으로 실시하였다. 면역블랏팅을 항-갈락틴-3, 항-파신-1, 항-GSK-3β, 항-TCF-4(Santa-Cruz), 항-GSK-3β[pS6] (biosourse), 항-β카테닌, 및 항-라민 A/C (Cell-Signaling), 및 항-β-액틴(Sigma)를 이용하여 수행하였다. 면역침전법은 항-갈락틴-3 및 항-β카테닌으로 코팅된 A/G 아가로스 비드로 수행하였다. 항-갈락틴-3, 항-β카테닌, 항-GSK-3β 및 항-TCF-4를 사용하여 웨스턴블랏 분석으로 단백질을 검출하였다. 생쥐/토끼 IgG를 음성 대조군으로 사용하였다.
<1-4> 갈락틴-3 발현 렌티-바이러스 벡터 제조 및 감염
인간의 전체 갈렉틴-3 유전자를 발현하는 pcDNA3.1-NT-GFP-gal3를 5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCT-3'(서열번호 13)및 5'-TTATATCATGGTATATGAAGCACTGGT-3'(서열번호 14)을 사용하여 PCR을 통해 증폭하였다. 상기에서 얻은 PCR 절편을 TA클로닝 방법(Invitrogen)을 사용하여 pcDNA3.1-NT-GFP 벡터로 클로닝하였다. 렌티바이러스 벡터 pLL3.7 (Addgene Inc)의 상기 조작을 통해 렌티바이러스 벡터는 LacZ, 야생형 gal-3, 및 gal-3 S96A를 과발현하였다. pLL3.7을 하기 9 BamH1/Xho1 제한효소 부위를 갖는 인간의 전체 야생형 gal-3 프라이머를 이용한 PCR 증폭으로 제조하였다; 5'-GGATCCATGGCAGACAATTTTTCGCTC-3'(서열번호 15)및 5'- TCGAGTTATATCATGGTATAT GAAGC-3'(서열번호 16). 갈렉틴-3 S96A는 2 개의 절편을 생성하는데, 첫째 절편 프라이머는 5'-GGATCCATGGCAGACAATTTTTCGCTC-3'(서열번호 17)및 5'-GACAGCCAGCAGCCACCGGAGCCTCACCTGCCACT-3'(서열번호 18)이고, 두 번째 절편 프라이머는 5'-TCCGGTGGCTGCTGGCTGTCCAGAAGATGGGTAGGC-3'(서열번호 19)및 5'-CTCGAGTTATATCATGG TATATGAAGC-3'(서열번호 20)였다. 이들 2개의 절편을 BamH1/Xho1 효소를 사용하여 하나의 절편으로 결합하였다. 293FT세포에 pLL 3.7와 공동 트랜스펙션하는 VSVG, RSV-REV 및 PMDLg/pPRE 세 개의 플라스미드를 사용하여 렌티바이러스 입자를 생성하였다. 293FT세포를 리포페타민 2000 트랜스펙션 시약을 사용하여 제조자의 지시에 따라 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 2일 후에, 293FT세포가 배양된 배지를 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 여과하였다. lacZ, 야생형gal-3 및 gal-3 S96A 유전자의 렌티바이러스 감염을 SNU-638 세포의 배지에서 수행하였다.
<1-5> 면역세포화학 및 면역조직화학
챔버슬라이드에서 배양된 세포를 고정하고 5% BSA(PBS에 준비)로 블로킹하였다. 그 후 PBS에 1:200로 희석한 1차 항체인 항-갈락틴-3, 항-파신-1, 항-GSK-3β, 항-β-카테닌 항체와 반응시켰다. 상기의 세포를 FITC, Cy5 (zymed) 또는 텍사스 레드(Texas Red)-X 팔로이딘(phalloidin) (Invitrogen)로 표지된 2차 항체와 결합시켰다. 이 시료를 DAPI 함유 마운트 배지에 처리한 후 공초점 현미경(Carl-Zeiss)으로 분석하였다. 위암 환자 조직의 갈락틴-3, β-카테닌, 및 파신-1에 대한 면역조직화학법은 Vectastain　 ABC 키트 및 DAB 기질 키트(substrate kit)를 사용하여 수행하였다(Vector laboratories).
<1-6> 트랜스필터 이동, 창상 치유, 침윤 분석
24-웰 트랜스웰(Transwell)에 8.0-㎛ 크기의 구멍 삽입체를 가지고 트랜스필터 이동 및 침윤 분석(invasion assay)을 수행하였다. 이 검사를 위해, MKN-28 및 SNU638 세포를 하루동안 siRNA로 트랜스펙션하였다. 세포 이동 분석을 위해 그 후 이들 세포를 수득하여 0.5 mg/ml 콜라겐 타입 l (BD bioscience)로 코팅된 필터를 지닌 트랜스웰의 상층 챔버에 첨가하였다. 1/15로 희석된 마트리겔(matrigel; BD bioscience)로 코팅된 필터를 사용하여 침윤 분석을 수행하였으며, 한 웰당 세포의 밀도는 2 X 104 세포수였다. 10% FBS 및 1% 항생제를 포함하는 RPMI 1640 배지를 하층 챔버에 첨가한 후 세포를 20시간 동안 배양하였다. 세포 이동 및 침윤세포를 H&E 염색 후 정량화하였다. 각 실험을 3번 반복하여 평균값을 계산하였다. 창상 치유 검사법을 공개된 프로토콜에 따라 수행하였다(Liang CC, Park AY, Guan JL. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc 2007;2:329-33).
<1-7> 염색질 면역 침전 분석
ChIP 분석 키트(Upstate)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 염색질 면역 침전 분석을 수행하였다. 항-TCF4, 항-β카테닌, 항-갈락틴-3, 토끼 IgG를 사용하여 복합체를 포함하는 DNA를 면역침전하였다. 파신-1 프로모터 결합 부위를 갖는 프라이머인 파신-1 프로모터 (-1321) 5`-AATGTCCAGGAAAAGCCTCA-3`(서열번호 11) 및 (-1061) 5`-CCCAATTTCATGGGACTCTG-3'(서열번호 12)를 준비한 후, PCR을 실시하였다.
<1-8> 루시퍼라제 분석
본 발명자는 8개의 TCF4 공통서열 조절하에 있는 TCF4 루시퍼라제 리포터 플라스미드 및 음성대조군으로 3개의 SP1 공통서열과 같은 SP1 플라스미드를 사용하였다. TCF4 전사 활성에 대한 갈렉틴-3의 효과를 알아보고자, 렌티바이러스를 사용하여 LacZ, 야생형 갈렉틴-3, 및 갈렉틴-3 S96A 유전자가 감염된 SNU638 세포주와 같은 안정화된 세포주를 제조하였다. SNU638와 더불어 이들 세포주를 리포펙타민 2000시약을 사용하여 1㎍ TCF4 공통서열 플라스미드 및 1㎍ SP1 플라스미드로 트랜스펙션하였다. 30 내지 40 시간 후, 상기 세포를 수득하여 루시퍼라제 정량 시스템(Promega)으로 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
<1-9> 반고형 한천 증식 분석(Soft agar growth assay)
0.5% 한천 및 5% FBS를 포함하는 0.5mL RPMI 1640를 24-웰 플레이트에 깔았다. 이 하층이 굳은 후에, 갈렉틴-3 및 파신-1 siRNA(웰당 1.25 X 104)로 감염된 세포를 0.3% 한천 및 5% FBS를 포함하는 0.25mL RPMI 1640 상층에 도포하였다. 3주 후에 현미경으로 콜로니 수를 계산하였다. 모든 실험은 3회 반복 실시하였다.
실험예 1: 갈렉틴-3의 사일런스는 세포 이동을 감소시키고 인간 위암 세포의 형태를 변화시켰다.
본 발명자는 RT-PCR 및 웨스턴 블랏을 사용하여 10개의 위암 세포주에서 갈렉틴-3 및 파신-1의 발현 수준을 확인하였다(도 9). 갈렉틴-3의 발현은 10개의 세포주들 중 8개에서 높았고 파신-1의 발현은 6개의 세포주에서 높았다. 파신-1에 대한 갈렉틴-3의 효과를 알아보고자, 본 발명자는 갈렉틴-3 및 파신-1을 강력하게 발현하는 MKN-28 세포에서 갈렉틴-3의 siRNA를 사용하여 갈렉틴-3 유전자를 사일런스하였다. siRNA에 의한 갈렉틴-3 사일런스는 갈렉틴-3 및 파신-1의 mRNA 및 단백질의 발현 수준을 감소시켰다(도 1A). 파신-1에 의해 묶여 배열되어 있는 F-액틴은 세포-세포간의 접촉 부위 및 트랜스펙션 안된 또는 스크램블 siRNA(음성 대조군)로 트랜스펙션된 MKN-28 세포의 돌출된 가장자리에서 발견되었다(도 1B). 그러나, 파신-1 발현은 세포질에서 감소하였고, 갈렉틴-3가 사일런스된 세포에서 세포-세포간의 접촉 부위에만 F-액틴이 나타났다. 더욱이 이들 세포는 원형 모양으로 되어 어떤 돌출 부위도 갖지 않았다.
암 세포 이동성에 대한 갈렉틴-3의 사일런스 효과를 확인하고자 세포 이동 분석을 실시하여 세포 수를 측정하고(도 1C) 현미경으로 촬영하였다(도 1D). 갈렉틴-3가 사일런스된 세포는 더 이상 운동성을 갖지 않았고 이동한 세포의 전체 수가 거의 절반 가량 감소하였다.
본 발명자는 또한 갈렉틴-3 플라스미드를 SNU-638 세포에 트랜스펙션하였다. 상기 세포는 갈렉틴-3를 발현하지 않았고 오직 파신-1만 약하게 발현하였다(도 9). 이와 대조적으로, 갈렉틴-3 과발현 세포에서는 파신-1 발현이 증가하였다(도 1E).
실험예 2: 갈렉틴-3은 파신-1 발현을 상승 조절하여 인간 위암 세포의 운동성을 증진시킨다.
본 발명자는 파신-1 발현의 감소가 암세포 운동성을 감소시키는지를 조사하기 위해서 파신-1 siRNA를 사용하였다. 파신-1 siRNA는 MKN-28 세포에서 파신-1 발현을 감소시켰고, 파신-1 유전자가 사일런스된 세포의 운동성을 감소시켰다(도 2B). 파신-1 유전자가 사일런스된 세포의 형태는 돌출부위가 없는 원형 모양으로 변했고, 갈렉틴-3 유전자가 사일런스된 세포의 경우와 같이 F-액틴은 오직 세포-세포간의 접촉 부위에서만 나타났다(도 2C). 본 발명자는 세포 이동 뿐만 아니라 세포 침윤, 콜로니 형성 및 창상 치유에 대한 갈렉틴-3 또는 파신-1 유전자의 사일런스 효과도 조사하였다(도 2D-F). 예상과 같이, 갈렉틴-3 또는 파신-1 유전자의 사일런스는 상기의 모든 현상을 현저하게 감소시켰다.
그 다음 본 발명자는 갈렉틴-3가 파신-1 발현을 통해서 세포 운동성 및 침윤를 조절하는지를 조사하였다. 갈렉틴-3를 포함하는 렌티바이러스 구조체를 제조하여 SNU638 세포에 감염시킨 후, 파신-1 siRNA를 사용하여 이들 세포에서 파신-1 발현을 감소시켰다(도 3). 갈렉틴-3 과발현 세포는 파신-1 단백질 발현을 증가시켰으며, 이것은 파신-1 siRNA에 의해 감소되었다(도 3A). 본 발명자는 또한 이들 세포에서 세포 이동 및 침윤 분석도 실시하였다. 도 3B와 같이, 갈렉틴-3 과발현 세포는 세포 이동을 증가시켰고, 파신-1 사일런스는 갈렉틴-3 과발현에 의한 상기 세포의 증가된 이동을 현저하게 감소시켰다. 갈렉틴-3 과발현에 의한 세포 침윤에 대한 파신-1 사일런스의 저해 효과도 또한 검출되었으나(도 3C), 이들 저해 효과는 세포 이동에서 더 컸다. 이러한 결과는 갈렉틴-3이 파신-1 발현을 통해서 위암 세포 이동성을 증진시킨다는 것을 시사하는 결과이다.
실험예 3: 갈렉틴-3 사일런스는 β-카테닌 및 TCF-4간의 상호작용을 저해하고 TCF-4의 DNA 결합 활성을 감소시킨다.
갈렉틴-3가 어떠한 기작으로 파신-1 발현을 조절하는지를 확인하기 위해서, 본 발명자는 파신-1 프로모터 부위를 조사하였고(도 10A), NF-kB, TCF-4 및 CREB와 같은 몇 가지 종류의 전사 인자 결합 도메인이 존재하였다. 파신-1 발현이 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로를 통해 조절되고 대장암 세포에서 갈렉틴-3이 β-카테닌과 상호작용한다는 것이 알려져 있다. 위암에서도 이러한 상호작용을 확인하기 위해서, 항-갈렉틴-3 또는 항-β-카테닌 항체를 사용한 면역침전 후, 웨스턴 블랏으로 갈렉틴-3, GSK-3β, β-카테닌 및 TCF-4를 검출하였다(도 4A). 그 결과 갈렉틴-3는 하기의 분자 모두와 상호작용함을 나타냈다: GSK-3β, β-카테닌 및 TCF-4. 그러나 갈렉틴-3 사일런스는 β-카테닌 및 TCF-4사이의 상호작용을 감소시켰으며 이것은 TCF-4의 DNA 결합 활성 손실을 의미한다(도 4B). 갈렉틴-3 발현이 없을 경우 GSK-3β 및 β-카테닌사이의 상호작용은 약화되었다.
이에, 본 발명자는 갈렉틴-3 유무 하에서 β-카테닌 및 TCF-4의 DNA 결합 활성을 ChIP 검사를 사용하여 조사하였다(도 3C). 갈렉틴-3 존재 하에서는 파신-1 프로모터 부위에 β- 카테닌 및 TCF-4가 결합하지만, 갈렉틴-3이 없을 경우에는 이들은 자신의 결합 활성이 손실되는 결과를 보였다. 본 발명자는 갈렉틴-3에 의한 TCF-4의 전사 활성을 또한 분석하였다(도 4D). 루시퍼라제 프로모터에 TCF-4 결합 모티프를 포함하는 유전자를 LacZ 또는 갈렉틴-3 과발현 SNU-638 세포에 트랜스펙션시킨 결과, 갈렉틴-3 과발현 세포에서 TCF-4의 전사 활성은 현저하게 증가하였다. 이러한 결과는 갈렉틴-3이 β-카테닌 및 TCF-4 사이의 상호작용을 증진시키고 TCF-4의 파신-1 전사 개시를 위한 DNA 결합 친화성을 강화시킨다는 것을 시사하는 것이다.
실험예 4: 갈렉틴-3 사일런스는 β-카테닌의 핵 존재 및 안정성을 감소시킨다.
본 발명자는 갈렉틴-3 사일런스 후, 웨스턴 블랏(도 4E) 및 면역세포화학법(도 5A 및 B)을 사용하여 GSK-3β, β-카테닌 및 TCF-4의 발현 수준 및 위치 분포를 결정하였다. 대조군 세포의 경우 세포질과 핵에서 갈렉틴-3는 GSK-3β 및 β-카테닌/TCF-4와 같은 지역에 위치하고 있다. 그러나, 갈렉틴-3이 결여된 세포의 경우 인산화된 GSK-3β 및 β-카테닌의 수준이 핵 및 세포질에서 모두 감소하였다(도 4E). 흥미롭게도 GSK-3β가 세포질 및 핵 모두에서 갈렉틴-3 및 β-카테닌과 같이 위치하였다. 이와 대조적으로 갈렉틴-3가 결여될 경우, GSK-3β는 오직 세포질에서만 검출되었고 β-카테닌은 핵 또는 세포질 어디에서도 검출검출되지 않았다(도 5A 및 B). 이러한 결과는 갈렉틴-3은 GSK-3β 및 β-카테닌과 결합하여 핵으로 이동하며, 갈렉틴-3이 결여될 경우 GSK-3β는 β-카테닌과 함께 세포질에 존재하여 β-카테닌을 인산화하고 분해하는 작용을 한다는 것을 시사하는 결과이다.
실험예 5: 인간 위암 세포에서 96번째 아미노산 위치에서 돌연변이된 갈렉틴-3는 파신-1의 발현을 유도하지 않는다.
갈렉틴-3이 GSK-3β와의 상호작용을 통해 β-카테닌/TCF-4의 DNA 결합 활성을 조절한다는 것을 보다 상세히 증명하기 위해서, 본 발명자는 96번째 아미노산 위치에서 돌연변이시킨(세린을 알라닌으로 치환) 갈렉틴-3 유전자를 지닌 렌티바이러스 구조체를 제조하여 SNU638 세포에 감염시켰다(도 6A). 갈렉틴-3의 92번 세린 및 96번 세린이 GSK-3β와 결합한다고 예상되었다(도 10A). 갈렉틴-3은 야생형 및 돌연변이(S96A)된 렌티-바이러스 구조체로 감염된 세포 모두에서 검출되었다(도 6A). 흥미롭게도, 파신-1 발현은 야생형 갈렉틴-3으로 감염된 세포에서만 검출되었으나, 돌연변이된 갈렉틴-3로 감염된 세포에서는 검출되지 않았다. GSK-3β 인산화 증가와 β-카테닌의 발현 또한 야생형에서 검출되었으나, 돌연변이형에서는 검출되지 않았다. 본 발명자는 또한 S96A로 돌연변이시킨 갈렉틴-3 과발현 세포에서의 TCF4 전사 활성을 TOP 플래쉬 분석으로 결정하였다(도 6B). 야생형 갈렉틴-3 과발현 세포에서 TCF4 전사 활성은 증가하였다. 그러나, S96A로 돌연변이된 갈렉틴-3 과발현 세포에서는 보다 낮은 TCF4 전사 활성을 검출하였다.
이러한 결과는 갈렉틴-3과 GSK-3β 사이의 상호작용이 β-카테닌의 안정성 및 파신-1의 발현을 조절한다는 것을 강력하게 뒷받침하는 결과이다.
실험예 6: 위암 환자에서 갈렉틴-3, β-카테닌, 및 파신-1 발현 수준 사이의 임상학적 관계
먼저 본 발명자는 국립 암 센터 20명의 위암 환자에서 갈렉틴-3 및 파신-1 발현 수준을 결정하였다. 상기의 환자로부터 정상 및 암 조직의 전체 RNA를 준비하여 RT-PCR을 수행하였다(도 7A). 정량은 이미지 분석기를 사용하여 실시하였다(표 1).
그 결과 갈렉틴-3 및 파신-1 발현 수준은 정상 조직보다 암 조직에서 더 높았다. 갈렉틴-3 및 파신-1 발현이 각각 73.7% (14/19) 및 66.7% (12/18) 증가하였다. 더욱이, 갈렉틴-3 양성 환자의 71.4%가 또한 파신-1에 대해서도 양성을 나타냈다. 2명의 환자만이 갈렉틴-3 결여의 경우 파신-1 발현을 나타냈다. 그러나 상기 환자들 대다수가 전이가 없는 위암 초기 단계에서 진단되었기 때문에 본 발명자는 전이 프로파일 및 상기 유전자의 양성 반응 사이에서 어떠한 연관성을 밝힐 수 없었다.
Expression Ratio Percentage
갈렉틴-3 14/19 73.7
Fascin-1 in galactin-3 12/18 66.7
Fascin-1 in galactin-3 expression 10/14 71.4
면역조직화학 염색 결과는 위암 조직에서 갈렉틴-3 및 β-카테닌의 과발현 및 공동국지화(co-localization)를 나타냈다(도 7B). 이들은 세포질 및 핵 모두에 위치하고 있다(도 7C). 파신-1도 또한 같은 지역에서 발현되지만, 주로 세포막에서 발현된다(도 7C). 이들 결과는 위암 환자에서 파신-1 발현이 갈렉틴-3 및 β-카테닌과 상당히 연관되어 있음을 제시한다.
<110> National Cancer Research Center <120> Method for screening cancer therapeutic agent using Galectin-3, GSK-3beta and fascin-1 <130> PA100102KR <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for Galectin-3 <400> 1 auaugaagca cuggugaggu cuaug 25 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for fascin-1 <400> 2 uccagcaaga augccagcug cu 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for FSCN1 <400> 3 acctgtctgc caatcaggac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for FSCN1 <400> 4 cccattcttc ttggaggtca 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for LGAL3 <400> 5 atggcagaca atttttcgct cc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for LGAL3 <400> 6 atgtcaccag aaattcccag tt 22 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for beta-actin <400> 7 agcctcgcct ttgccga 17 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for beta-actin <400> 8 ctggtgcctg gggcg 15 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 9 ggctgctttt aactctggta 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 10 acttgatttt ggagggatct 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for fascin-1 promoter <400> 11 aatgtccagg aaaagcctca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for fascin-1 promoter <400> 12 cccaatttca tgggactctg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer pcDNA3.1-NT-GFP-gal3 for Gal-3 expression gene <400> 13 atggcagaca atttttcgct 20 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer pcDNA3.1-NT-GFP-gal3 for Gal-3 expression gene <400> 14 ttatatcatg gtatatgaag cactggt 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for human galectin-3 gene <400> 15 ggatccatgg cagacaattt ttcgctc 27 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for human galectin-3 gene <400> 16 tcgagttata tcatggtata tgaagc 26 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Galectin-3 S96A 1 <400> 17 ggatccatgg cagacaattt ttcgctc 27 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Galectin-3 S96A 1 <400> 18 gacagccagc agccaccgga gcctcacctg ccact 35 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Galectin-3 S96A 2 <400> 19 tccggtggct gctggctgtc cagaagatgg gtaggc 36 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Galectin-3 S96A 2 <400> 20 ctcgagttat atcatggtat atgaagc 27 <210> 21 <211> 250 <212> PRT <213> Human <220> <221> BINDING <222> (92)..(96) <223> Amino acid sequence for galectin-3 <400> 21 Met Ala Asp Asn Phe Ser Leu His Asp Ala Leu Ser Gly Ser Gly Asn 1 5 10 15 Pro Asn Pro Gln Gly Trp Pro Gly Ala Trp Gly Asn Gln Pro Ala Gly 20 25 30 Ala Gly Gly Tyr Pro Gly Ala Ser Tyr Pro Gly Ala Tyr Pro Gly Gln 35 40 45 Ala Pro Pro Gly Ala Tyr Pro Gly Gln Ala Pro Pro Gly Ala Tyr Pro 50 55 60 Gly Ala Pro Gly Ala Tyr Pro Gly Ala Pro Ala Pro Gly Val Tyr Pro 65 70 75 80 Gly Pro Pro Ser Gly Pro Gly Ala Tyr Pro Ser Ser Gly Gln Pro Ser 85 90 95 Ala Thr Gly Ala Tyr Pro Ala Thr Gly Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Gly 100 105 110 Pro Leu Ile Val Pro Tyr Asn Leu Pro Leu Pro Gly Gly Val Val Pro 115 120 125 Arg Met Leu Ile Thr Ile Leu Gly Thr Val Lys Pro Asn Ala Asn Arg 130 135 140 Ile Ala Leu Asp Phe Gln Arg Gly Asn Asp Val Ala Phe His Phe Asn 145 150 155 160 Pro Arg Phe Asn Glu Asn Asn Arg Arg Val Ile Val Cys Asn Thr Lys 165 170 175 Leu Asp Asn Asn Trp Gly Arg Glu Glu Arg Gln Ser Val Phe Pro Phe 180 185 190 Glu Ser Gly Lys Pro Phe Lys Ile Gln Val Leu Val Glu Pro Asp His 195 200 205 Phe Lys Val Ala Val Asn Asp Ala His Leu Leu Gln Tyr Asn His Arg 210 215 220 Val Lys Lys Leu Asn Glu Ile Ser Lys Leu Gly Ile Ser Gly Asp Ile 225 230 235 240 Asp Leu Thr Ser Ala Ser Tyr Thr Met Ile 245 250

Claims (14)

  1. a) 암세포에 암 치료용 후보물질을 처리하는 단계;
    b) 상기 후보물질이 처리된 암세포에서 GSK-3β (glycogen synthetase kinase-3β) 및 갈렉틴-3 (galectin-3)의 상호 결합 여부를 확인하는 단계; 및
    c) GSK-3β 및 갈렉틴-3의 상호 결합 여부를 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조구와 비교하는 단계를 포함하는, 암치료제의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서, 후보물질을 처리했을 때 대조구와 비교하여 GSK-3β 및 갈렉틴-3의 상호 결합이 억제되면 암치료제라고 판단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 갈렉틴-3의 발현, 파신-1 (Fascin-1)의 발현, GSK-3β의 인산화, 또는 GSK-3β의 발현 수준을 대조구와 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 대조구와 비교하여 갈렉틴-3, 파신-1, 또는 GSK-3β의 발현이 감소하거나, GSK-3β의 인산화가 감소하면 암치료제라고 판단하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 암치료제는 항체, 화합물, 바이러스, 핵산, 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 암치료제는 GSK-3β의 인산화를 인식하는 물질인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계는 서열번호 21로 표시되는 갈렉틴-3의 92번째 아미노산 내지 96번째 아미노산에서 GSK-3β과 결합하는지 여부를 확인하는 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA인 방법.
  9. 제3항에 있어서, 상기 GSK-3β의 인산화 수준은 항원-항체 결합 반응으로 확인하는 것인 방법.
  10. 제3항에 있어서, 상기 파신-1 (Fascin-1)의 발현 수준은 파신-1 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 확인하는 것인 방법.
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