KR101217769B1 - A Composiotion as Anti-inflammatory Medicine and a Composition for an Anti-cancer Medicine - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항염증제 조성물 및 항암제 조성물을 개시한다. 구체적으로 본 발명은 홍해삼 추출물을 이용한 항염증제 조성물 및 항암제 조성물을 개시한다.The present invention discloses anti-inflammatory and anticancer compositions. Specifically, the present invention discloses an anti-inflammatory composition and an anticancer composition using red sea ginseng extract.
Description
본 발명은 항염증제 조성물 및 항암제 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 해삼 추출물을 이용한 항염증제 조성물 및 항암제 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to anti-inflammatory agent compositions and anti-cancer agent compositions. Specifically, the present invention relates to an anti-inflammatory composition and an anticancer composition using sea cucumber extract.
염증은 외부의 물리?화학적 자극, 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 생체의 방어 반응이다. Inflammation is the body's defense against external infections such as physical and chemical stimuli, bacteria, fungi, viruses, and allergens.
염증 반응은 선천성 면역 반응의 일부이며, 다른 동물에서처럼 인간의 선천성 면역 반응은 대식세포가 병원체에 특이적으로 존재하는 세포 표면의 패턴을 통해 비자기(non-self)로 인식하고 공격함으로써 시작된다. 염증 반응 시에는 염증 부위에 혈장이 축적되어 세균이 분비한 독성을 희석시키며, 혈류가 증가하고, 홍반, 통증, 부종, 발열 등의 증상이 수반되게 된다.The inflammatory response is part of the innate immune response, and as in other animals, the innate immune response of humans begins by recognizing and attacking macrophages as non-self through a pattern of cell surfaces that are specific to the pathogen. During the inflammation reaction, plasma accumulates on the inflamed area, diluting the toxicities secreted by the bacteria, increasing the blood flow, and accompanied by symptoms such as erythema, pain, edema, and fever.
이러한 염증 반응에는 다양한 생화학적 현상이 관여하는데, 특히 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)와 다양한 프로스타글란딘(prostaglandins, PG)의 생합성과 관련되는 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase, COX)가 염증 반응의 중요한 매개체로 알려져 있다. These inflammatory reactions involve a variety of biochemical phenomena, particularly cyclooxygenase (COX), which is associated with the biosynthesis of nitric oxide synthase (NOS) and various prostaglandins (PG). It is known as an important medium.
NOS는 세 가지 이성질체가 존재하는데, 칼슘이나 카모듈린 의존성인 eNOS(내피성 NOS)와 nNOS(신경성 NOS), 그리고 LPS(lipopolysaccharide)와 같은 세균의 내독소나 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12과 같은 여러 염증성 사이토카인에 의해 유도되는 iNOS(유도성 NOS)가 있으며, L-아르기닌(L-arginine)으로부터 산화질소(NO)를 생성한다.There are three isomers of NOS: endotoxin of bacteria such as calcium or camodanol-dependent eNOS (endothelial NOS), nNOS (neurogenic NOS), and lipopolysaccharide (IL-1β, TNF-α, IL There are iNOS (inducible NOS) induced by various inflammatory cytokines such as IL-6, IL-8 and IL-12 and produce NO from L-arginine.
eNOS나 nNOS에 의해 생성되는 NO는 혈압 조절 작용, 신경 전달 작용, 학습, 기억 등과 관련된 다양한 생리 반응을 수행함으로써 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하지만, iNOS에 의해 생성되는 NO는 관절염, 패혈증, 조직이식거부반응, 자가면역질환, 신경세포의 사멸 등 다양한 염증성 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다(Moncade S. et al, Pharmacol. Rev., 1991, 43, 109; Nature Medicine, 2001, 7, 1138; Mu, M. M., J. Endotoxic Res. 7, p341, 2001).NO produced by eNOS or nNOS plays an important role in maintenance of homeostasis by performing various physiological responses related to blood pressure control, neurotransmission, learning, memory, etc. However, NO produced by iNOS is associated with arthritis, sepsis, (Moncade S. et al, Pharmacol. Rev., 1991, 43, 109, Nature Medicine, 2001, 7, 1138; Mu, S., et al., Immunoprecipitation, , MM, J. Endotoxic Res. 7, p341, 2001).
COX 효소는 COX의 기능과 함께 하이드로퍼옥시다제(hydroperoxidase, HOX) 활성을 가지고 아라키돈산으로부터 중간체인 PGG2와 PGH2를 합성하며, 이들 화합물로 PGE2, PGF2, PGD2, 프로스타시클린 및 트롬복신A2(thromboxane A2, TxA2)를 만든다. COX의 기능 중 PGH 합성효소의 기능은 PGE2의 합성을 통해 통증과 염증 반응에 관여한다. The COX enzyme synthesizes PGG 2 and PGH 2 from arachidonic acid with hydroperoxidase (HOX) activity together with the function of COX. These compounds include PGE 2 , PGF 2 , PGD 2 , prostacyclin and create a duplex thromboxane a 2 (thromboxane A2, TxA2) . Among the functions of COX, the function of PGH synthase is involved in the pain and inflammation reaction through synthesis of PGE 2 .
COX에는 두 가지 아형이 있고 COX-1은 대부분의 조직에 항시 발현되는데 비해, COX-2는 염증성 사이토카인에 의해 신속히 발현이 유도되어 염증 반응에서 중요한 역할을 한다. There are two subtypes of COX and COX-1 is always expressed in most tissues, whereas COX-2 is rapidly induced by inflammatory cytokines and plays an important role in the inflammatory response.
따라서 염증성 사이토카인 생성 억제제, PGE2의 생성 억제제, iNOX 억제제 및/또는 COX-2 억제제는 염증성 질환 치료제로서 활용될 수 있다.Thus, inflammatory cytokine production inhibitors, PGE 2 production inhibitors, iNOX inhibitors and / or COX-2 inhibitors can be utilized as therapeutic agents for inflammatory diseases.
한편 암이란 일반적으로 인체 조직을 이루고 있는 세포의 주기에 이상이 생겨 세포가 정상적으로 분화하지 않고 성장을 조절할 수 없이 커진 것 중 악성인 것을 말한다. On the other hand, cancer generally refers to the malignant one of the abnormalities in the cycle of the cells constituting the human tissue, the cells do not differentiate normally and grow without control of growth.
최근에는 암에 의한 사망자의 수가 늘어나면서, 암이 사망원인의 대표적인 질병으로써 사람들에게 두려움을 주고 있다. 그 결과 암을 치료하기 위한 투여 약물이나 방법은, 날로 발전을 거듭하고 있으나, 암을 치료하는 결정적인 투여 약물이나 방법은 아직 확립되어 있지 않으므로, 암을 예방하고, 암의 발생을 억제하는 것이 가장 중요하다.Recently, as the number of deaths from cancer increases, cancer is fearing people as a representative cause of death. As a result, the administration drugs and methods for treating cancer are evolving day by day, but since the crucial administration drugs and methods for treating cancer are not yet established, it is most important to prevent cancer and suppress the occurrence of cancer. Do.
암은 개시(initiation), 촉진(promotion) 및 진행(progression)의 세 단계를 거쳐 발생하는데, 환경이나 음식물 속에 포함된 발암 물질에 의해 세포 돌연변이가 일어나고 이러한 세포들이 발암 물질의 계속적인 자극을 받으면서 비정상적인 증식을 계속하여 암 조직을 형성하는 것으로 알려져 있다.Cancer occurs through three stages: initiation, promotion, and progression. Cellular mutations are caused by carcinogens in the environment or food, and these cells are abnormal as they are continuously stimulated by carcinogens. It is known to continue to proliferate to form cancer tissue.
암을 치료하기 위한 항암제의 연구 방법에는 암세포에 대한 직접적인 세포 독성 물질을 탐색하는 방법, 생체의 면역 능력을 조절하는 물질을 탐색하는 방법, 암세포의 전이를 억제하는 물질을 탐색하는 방법, 최근에 주목되고 있는 혈관신생을 억제하는 물질을 탐색하는 방법 등이 있다. Research methods for anticancer drugs for treating cancer include a method of searching for direct cytotoxic substances on cancer cells, a method of controlling substances that regulate the immune ability of the living body, a method of searching for substances that inhibit the metastasis of cancer cells, and the like. There is a method of searching for a substance that suppresses angiogenesis.
현재 사용되고 있는 항암제들은 효소 제제나 백신 등의 생물학적 제제, 화학 합성 의약품, 천연물 유래의 의약품 등으로 크게 구분할 수 있는데, 이 중 효소, 백신 등의 생물학적 제제는 실용 단계에 있는 상태는 아니며, 화학 합성 의약품은 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고(Gillman., et al., Maxwell Macmillan. , 18, pp 1202, 1986), 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타나기 때문에 암 치료시 문제점으로 지적되고 있다(Chung., et al., J. Wonkwang Medical Sci. , 3 , pp 13-34, 1987).Currently used anticancer drugs can be broadly divided into biological preparations such as enzyme preparations and vaccines, chemical synthesis medicines, and natural products. Among them, biological preparations such as enzymes and vaccines are not in a practical stage. Pharmacological effects vary depending on the type of cancer (Gillman., Et al., Maxwell Macmillan., 18, pp 1202, 1986), and it is pointed out as a problem in treating cancer because of various side effects due to toxicity (Chung). , et al., J. Wonkwang Medical Sci., 3, pp 13-34, 1987).
근래에는 세포 배양 기술이 급격히 발달함에 따라 각종 세포를 배양한 후, 여러 독성 물질을 투여함으로써 이들의 세포 독성에 대한 기전을 세포 수준에서 규명하려는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 항암제의 부작용을 최소화하고 치료 효과를 높이기 위하여 천연물을 이용한 항암제의 개발이 지속적으로 시도되고 있다.Recently, with the rapid development of cell culture technology, studies have been actively conducted to investigate the mechanism of cytotoxicity at the cellular level by culturing various cells and administering various toxic substances, and minimizing and treating side effects of anticancer drugs. In order to enhance the effect, the development of anticancer drugs using natural products has been continuously tried.
본 발명은 천연물로서 홍해삼 추출물의 항염증 활성 및 항암 활성을 개시한다.The present invention discloses the anti-inflammatory and anticancer activity of red sea ginseng extract as a natural product.
본 발명의 목적은 항염증제 조성물을 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to provide an anti-inflammatory composition.
본 발명의 다른 목적은 항암제 조성물을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide an anticancer agent composition.
본 발명의 기타의 목적이나 구체적인 양태 등은 이하에서 제시될 것이다.Other objects, specific embodiments, and the like of the present invention will be presented below.
일 측면에 있어서, 본 발명은 항염증제 조성물에 관한 것이다.In one aspect, the invention relates to an anti-inflammatory composition.
아래의 실시예 및 실험예에서 확인되듯이, 본 발명자들은 홍해삼(Stichopus japonicus, Orange)을 80% 에탄올로 추출하고, 그 에탄올 추출물을 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획하고 그 추출물과 분획물의 NO(Nitric Oxide) 생성 억제 활성, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성 억제 활성, PGE2 생성 억제 활성, iNOS 생성 억제 활성, 및 COX-2 생성 억제 활성을 살펴보았는데, 위 추출물 및 분획물 모두 활성의 정도에는 차이가 있었지만 대체로 위 활성들을 가짐을 확인할 수 있었다. As confirmed in the following Examples and Experimental Examples, the inventors of the Red Sea Ginseng ( Stichopus japonicus, Orange) was extracted with 80% ethanol, and the ethanol extract was fractionated with hexane, dichloromethane, ethyl acetate, butanol and water, and the extract and fractions inhibited NO (Nitric Oxide) production, TNF-α, an inflammatory cytokine. , IL-6 and IL-1β production inhibitory activity, PGE 2 production inhibitory activity, iNOS production inhibitory activity, and COX-2 production inhibitory activity was examined. I could confirm that I had a hearing.
본 발명의 항염증제 조성물은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로서, 본 발명의 항염증제 조성물은 홍해삼 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.The anti-inflammatory composition of the present invention is provided based on the results of these experiments, and the anti-inflammatory composition of the present invention is characterized by including red sea ginseng extract as an active ingredient.
본 명세서에서 "홍해삼"은 학명이 Stichopus japonicus Orange인 해삼을 가리킨다. 구체적으로는, 체색(體色)이 적색에 황갈색 또는 암적갈색의 반문이 있고 복부는 적색이며, 폴리씨낭(Polian vesicle)이 가늘고 길며 선단이 뾰족하고, 수축성이 심해서 체형이 구형 비슷하며, 알에 두께 25㎛ 내외의 젤라틴 피물을 가진 해삼으로 정의될 수 있다. In the present specification, "red sea ginseng" is the scientific name Stichopus japonicus Points to sea cucumber that is orange. Specifically, the body color is red to yellowish brown or dark reddish brown, the abdomen is red, the poly vesicle is thin and long, the tip is sharp, and the contraction is severe, so the body is similar in shape to a sphere. It can be defined as sea cucumbers having a gelatinous body of about 25㎛ thickness.
또 본 명세서에서, "항염증"이란 아래에서 정의되는 염증성 질환의 개선 활성으로서 정의된다. In addition, in this specification, "anti-inflammatory" is defined as the improvement activity of an inflammatory disease defined below.
또 본 명세서에서, "염증성 질환"이란 외부의 물리?화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 어떠한 상태로서 정의될 있다. 이러한 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티즘성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다.In addition, in the present specification, an "inflammatory disease" may be defined as any condition specified as a local or systemic biological defense response against external physical and chemical stimuli or infection of an external infectious agent such as bacteria, fungi, viruses, and various allergens. This reaction is enzyme secretion (e.g., iNOS, COX-2, etc.) activation, release of inflammatory mediators (e. G., NO, TNF-α, IL -6, IL-1β,
또 본 명세서에서, "개선"이란 염증성 질환이 가지는 병리적 증상의 개선, 및 그러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 포함하는 의미이다.In addition, in this specification, "improvement" is meant to include the improvement of the pathological symptoms of an inflammatory disease, and the inhibition / delay of the onset of such pathological symptoms.
또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.In addition, the term "active ingredient" as used herein means a component that can exhibit the desired activity alone or in combination with a carrier that is not active itself.
또 본 명세서에서 "홍해삼 추출물"은 추출 대상으로 홍해삼을 사용하고 추출 용매로서 물, 부탄올, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올 등을 포함한 탄소수 1 내지 5의 알콜, 아세톤, 에틸아세테이트, 에테르, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 벤젠, n-헥산을 포함한 탄소수 5 내지 10의 n-알칸, 또는 이들이 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물을 의미하며, 그 추출물을 극성에 차이가 있는 상기 두 가지 이상의 용매로 분획하여 얻어진 분획물을 포함한다. In addition, in the present specification, "red sea ginseng extract" uses red sea ginseng as an extraction target and alcohols having 1 to 5 carbon atoms including acetone, isopropanol, ethanol, methanol, acetone, ethyl acetate, ether, methylene chloride, chloroform, Benzene, n-alkanes having 5 to 10 carbon atoms including n-hexane, or extracts obtained using these mixed solvents, including fractions obtained by fractionating the extract with two or more solvents having different polarities. .
상기 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 에테르, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 벤젠, 및 n-헥산 순으로 극성이 낮아진다. The solvent is lower in polarity in order of water, methanol, ethanol, isopropanol, butanol, acetone, ethyl acetate, ether, methylene chloride, chloroform, benzene, and n-hexane.
따라서 극성에 차이가 있는 두 가지 이상의 용매를 사용하여 얻어진 분획물로서는, 예컨대 어떠한 추출물을 물과 헥산으로 분획하여 얻어진 물층의 분획물과 헥산층의 분획물, 어떠한 추출물을 물과 메틸렌클로라이드로 분획하여 얻어진 물층과 메틸렌클로라이디층의 분획물 등을 예시할 수 있다.Thus, fractions obtained using two or more solvents having different polarities include, for example, a fraction of the water layer obtained by fractionating an extract with water and hexane, a fraction of the hexane layer, and an aqueous layer obtained by fractionating an extract with water and methylene chloride. ���capsule of the methylene chloride layer can be exemplified.
상기 홍해삼 추출물은 바람직하게는 아래의 실시예가 보여주듯이, 비극성이거나 극성이 약한 용매로 추출되거나 비극성 방향으로 분획된 분획물을 의미한다. 그것은 아래의 실시예 및 실험예가 미지의 지표물질 즉 항염증 활성을 나타내는 지표물질이 비극성일 것임을 예측케하기 때문이다. The red sea ginseng extract preferably means a fraction extracted in a non-polar or weak polar solvent or fractionated in a non-polar direction, as shown in the following examples. This is because the following Examples and Experimental Examples predict that an unknown indicator, that is, an indicator showing anti-inflammatory activity, will be nonpolar.
비극성이거나 극성이 약한 용매로 추출된 것으로서는 알콜, 알콜과 물의 혼합용매(알콜 함량이 물보다 많은 혼합 용매), n-알칸, 메틸렌클로라이드, 또는 에틸아세테트로 추출된 것을 들 수 있다. 비극성 방향으로 분획된 분획물은 극성이 다른 두 개의 용매로 분획할 때, 극성이 약한 층의 용매층의 분획물을 의미하는데, 예컨대 알콜 추출물을 물과 헥산으로 분획할 때는 헥산층의 분획물을 의미하며, 또 알콜 추출물을 알콜과 헥산으로 분획할 때에도 헥산층의 분획물을 의미하며, 또 알콜 추출물을 물과 메틸렌클로라이드로 분획할 때는 메틸렌클로라이트층의 분획물을 의미한다. Examples of the non-polar or weakly polar solvents include alcohols, mixed solvents of alcohol and water (mixed solvents having more alcohol than water), n-alkane, methylene chloride, or ethyl acetate. The fraction fractionated in the non-polar direction refers to the fraction of the solvent layer of the weakly polarized layer when fractionated with two solvents of different polarity, for example, the fraction of the hexane layer when fractionating the alcohol extract into water and hexane, In addition, when the alcohol extract is fractionated into alcohol and hexane, it means a fraction of the hexane layer, and when the alcohol extract is fractionated into water and methylene chloride, it means a fraction of the methylene chlorite layer.
가장 바람직하게는 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되듯이 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 추출물(바람직하게는 80% 에탄올)로서 용매를 제거하여 얻어진 고형상의 추출물과 그 추출물을 물과 헥산으로 분획하였을 때 얻어지는 헥산층의 분획물, 물과 에틸아세테이트로 분획하였을 때 얻어지는 에틸아세테이트층의 분획물 또는 물과 메틸렌클로라이트로 분획하였을 때 얻어지는 메틸렌클로라이드층의 분획물을 의미한다.Most preferably, the solid extract obtained by removing the solvent as water, ethanol or a mixed solvent extract thereof (preferably 80% ethanol) and the extract thereof as water and hexane, as confirmed in the following Examples and Experimental Examples The fraction of the hexane layer obtained by fractionation, the fraction of the ethyl acetate layer obtained when fractionated with water and ethyl acetate, or the fraction of the methylene chloride layer obtained when fractionated with water and methylenechlorite.
당업자는 그의 통상의 능력 범위 내에서 극성의 강약, 극성 용매와 비극성 용매를 확인?판별할 수 있다. 본 명세서에서 극성 용매 및 비극성 용매의 의미, 그리고 극성이 강한 용매 및 극성이 약한 용매의 의미는 당업계의 통상적인 의미를 따른다.Those skilled in the art can identify and determine polar strengths, polar solvents and nonpolar solvents within their usual capabilities. As used herein, the meanings of the polar solvent and the nonpolar solvent, and the strong polar solvent and the weak polar solvent, are in accordance with conventional meanings in the art.
한편 추출 용매를 사용하여 상기 추출물을 얻을 때 열수, 가온, 냉침, 초음파 방사, 교반, 이들을 혼합한 방법 등의 임의의 방법이 사용될 수 있다. 실제 본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예로 개시하지는 않았지만 헥산으로 추출할 때 가온하여 추출한 경우나 초음파를 방사하여 추출한 경우에도 모두 항염증 활성을 가짐을 확인한 바 있다.Meanwhile, when the extract is obtained using an extraction solvent, any method such as hot water, warming, cooling, ultrasonic spinning, stirring, or a method of mixing them may be used. Indeed, the inventors of the present invention did not disclose the following examples and experimental examples, but when extracted with hexane extracted when heated or extracted by the irradiation of ultrasonic waves, both had anti-inflammatory activity.
본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 홍해삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 iNOS 억제제 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to an iNOS inhibitor composition comprising red sea ginseng extract as an active ingredient.
전술하였지만, iNOS의 억제는 NO의 생성을 억제시켜 염증성 질환의 개선을 가져올 수 있다. As mentioned above, inhibition of iNOS can inhibit the production of NO leading to improvement of inflammatory disease.
본 발명의 아래의 실시예는 홍해삼 추출물이 NO의 생성을 억제하고 iNOS 유전자 및 단백질 수준에서의 발현을 억제함으로 보여주고 있으며, iNOS의 발현을 유도하는 것으로 알려진 사이토카인의 생성을 억제함을 보여주고 있다.The following examples of the present invention show that red sea ginseng extract inhibits the production of NO and inhibits the expression at the iNOS gene and protein levels, and inhibits the production of cytokines known to induce the expression of iNOS. have.
본 명세서에서, "iNOS 억제"의 의미는 iNOS 유전자의 발현 억제 및 iNOS 생성 억제를 포함하는 의미이며, 중간 기작이 어떻든 NO의 생성의 억제 및/또는 감소를 포함하는 의미이다.As used herein, "iNOS inhibition" is meant to include inhibition of expression of iNOS gene and inhibition of iNOS production, and meaning including inhibition and / or reduction of NO production whatever the intermediate mechanism.
본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 추출물을 유효성분으로 포함하는 COX-2 억제제 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a COX-2 inhibitor composition comprising the extract as described above as an active ingredient.
전술하였지만, COX의 억제도 PGE2의 생성을 억제시켜 염증성 질환의 개선을 가져올 수 있다. As mentioned above, inhibition of COX may also inhibit the production of PGE 2 resulting in improvement of inflammatory diseases.
본 발명의 아래의 실시예는 홍해삼 추출물이 PGE2의 생성을 억제하고 COX-2 유전자 및 단백질 수준에서의 발현을 억제함으로 보여주고 있으며, COX-2의 발현을 유도하는 것으로 알려진 사이토카인의 생성을 억제함을 보여주고 있다.The following examples of the present invention show that red sea ginseng extract inhibits the production of PGE 2 and inhibits the expression at the COX-2 gene and protein levels, and inhibits the production of cytokines known to induce the expression of COX-2. It is showing suppression.
본 명세서에서, "COX-2 억제"의 의미는 COX-2 유전자의 발현 억제 및 COX-2 생성 억제를 포함하는 의미이며, 중간 기작이 어떻든 PGE2의 생성의 억제 및/또는 감소를 포함하는 의미이다.As used herein, the term "COX-2 inhibition" is meant to include inhibition of expression of COX-2 gene and inhibition of COX-2 production, and meaning including inhibition and / or reduction of the production of PGE 2 whatever the intermediate mechanism. to be.
한편 다른 측면에 있어서, 본 발명은 홍해삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다.Meanwhile, in another aspect, the present invention relates to an anticancer agent composition comprising red sea ginseng extract as an active ingredient.
아래의 실시예 및 실험예는 홍해삼의 80% 에탄올 추출물 및 그 메틸렌클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 그리고 물 분획물 모두 혈액암 세포주인 HL-60 세포주 및 대장암 세포주인 HT-29 세포주의 증식 억제 활성을 가지고 있음을 보여준다.The following Examples and Experimental Examples show that the 80% ethanol extract of red sea ginseng and its methylene chloride fraction, ethyl acetate fraction, butanol fraction and water fraction all inhibited the proliferation of HL-60 cell line and HT-29 cell line, the colorectal cancer cell line. It shows that it has activity.
본 명세서에서 "항암"이란 혈액암 또는 대장암의 개선 활성으로서 정의되며, "개선"이란 혈액암 또는 대장암이 가지는 병리적 증상의 개선, 및 그러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 포함하는 의미이다.As used herein, "anticancer" is defined as the improving activity of hematologic or colorectal cancer, and "improvement" is meant to include the improvement of the pathological symptoms of hematologic or colorectal cancer, and the inhibition / delay of the onset of such pathological symptoms. to be.
기타 유효성분의 의미, 홍해삼의 의미, 그 추출물 등의 의미와 관련하여서는 전술한 바가 그대로 유효하다.With respect to the meaning of other active ingredients, the meaning of red sea ginseng, the extract and the like, the above-mentioned bar is valid as it is.
한편 본 발명의 조성물(즉 염증성 질환 개선제 조성물, iNOS 억제제 조성물, COX-2 억제제 조성물 및 항암제 조성물을 말함; 이하 같음)은 그 유효성분인 홍해삼 추출물을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 염증성 질환 또는 혈액암/대장암의 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. Meanwhile, the composition of the present invention (ie, inflammatory disease improving agent composition, iNOS inhibitor composition, COX-2 inhibitor composition, and anticancer composition; refers to the following) is intended to treat red sea ginseng extract, which is an active ingredient, according to the use, formulation, and formulation purpose. It may be included in any amount (an effective amount) as long as it can exhibit an improving activity of inflammatory disease or hematological cancer / colon cancer, and a conventional effective amount is within the range of 0.001% to 15% by weight based on the total weight of the composition Will be decided.
여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게서, 염증성 질환 또는 혈액암/대장암의 개선, 치료, 또는 이러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.The term “effective amount” herein refers to an amount of an effective ingredient that can induce improvement, treatment, or suppression / delay of the development of an inflammatory disease or hematologic or colorectal cancer in a mammal, preferably a human, to which it is applied. . Such effective amounts can be determined experimentally within the ordinary skill of those skilled in the art.
본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.Subjects to which the compositions of the invention can be applied (prescribed) are mammals and humans, in particular humans.
본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.The composition of the present invention can be used as a pharmaceutical composition in a specific embodiment.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효물질인 홍해삼 추출물을 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention includes oral dosage forms (tablets, suspensions, granules, emulsions, capsules, syrups, etc.), parenteral formulations (sterile), in addition to the active substance red sea ginseng extract, including pharmaceutically acceptable carriers, excipients, etc. Aqueous or oily suspensions for injection), topical formulations (solutions, creams, ointments, gels, lotions, patches) and the like.
상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다 의미이다.As used herein, "pharmaceutically acceptable" means that the subject of application (prescription) does not have more toxicity (adequately low toxicity) to which the subject of application (prescription) is adaptable without inhibiting the activity of the active ingredient.
약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등) 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.Examples of pharmaceutically acceptable carriers include lactose, glucose, sucrose, starch (such as corn starch, potato starch, etc.), cellulose, derivatives thereof (such as sodium carboxymethyl cellulose, ethylcellulose, etc.) malt, gelatin, talc, solids Lubricants (e.g. stearic acid, magnesium stearate, etc.), calcium sulfate, vegetable oils (e.g. peanut oil, cottonseed oil, sesame oil, olive oil, etc.), polyols (e.g. propylene glycol, glycerin, etc.), alginic acid, emulsifiers (e.g. TWEENS), wetting agents (e.g. Sodium lauryl sulfate), colorants, flavoring agents, tableting agents, stabilizers, antioxidants, preservatives, water, saline, phosphate buffer solutions and the like. The carrier may be selected from one or more of suitable pharmaceutical formulations according to the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention.
부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 들 수 있다.Excipients may be selected and used according to the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention, for example, when the pharmaceutical composition of the present invention is prepared with an aqueous suspending agent, suitable excipients are sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, hydropropylmethylcellulose And suspending agents and dispersing agents such as sodium alginate and polyvinylpyrrolidone. Suitable excipients when prepared from injection solutions include Ringer's solution, isotonic sodium chloride, and the like.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 경우에 따라서는 국소적으로 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and in some cases, can be administered topically.
본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다. The daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is usually 0.001 to 150 mg / kg body weight, and may be administered once or several times. However, since the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is determined in view of various related factors such as route of administration, age, sex, weight, and patient's severity of the patient, the dose is limited in any aspect to the scope of the present invention Should not be understood to be.
본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 이용될 수 있다.The composition of the present invention may be used as a food composition in another specific embodiment.
본 발명의 식품 조성물은 껌류, 비타민 복합제, 건강 보조식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등으로 제조될 수 있다.The food composition of the present invention may be prepared from gums, vitamin complexes, dietary supplements, special nutritional supplements, functional drinks, and the like.
본 발명의 식품 조성물에는 유효성분인 홍해삼 추출물이 포함되는 것 이외에, 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 감미제, 사과, 레몬, 감귤 등의 과일이나 녹차잎, 둥굴레, 대잎 등의 차류에서 얻어진 풍미제, 카테킨, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤 등의 생리활성 성분, 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물 등의 미네랄 등이 또한 첨가될 수 있으며, 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.In addition to the red sea ginseng extract as an active ingredient in the food composition of the present invention, sweeteners such as corn syrup solids, honey, sucrose, fructose, lactose, maltose, fruits such as apples, lemons, citrus fruits, green tea leaves, round stalks, Flavoring agents obtained from teas such as jujube leaves, bioactive components such as catechin, retinol, ascorbic acid and tocopherol, minerals such as calcium, magnesium, chromium, cobalt, copper and fluoride may also be added, and other food additives. This may be added.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 항염증제 조성물과 항암제 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 항염증제 조성물 및 항암제 조성물은 약제학적 조성물 및/또는 식품 조성물로 활용될 수 있다. As described above, the present invention can provide an anti-inflammatory composition and an anticancer composition. The anti-inflammatory and anticancer compositions of the present invention can be utilized as pharmaceutical compositions and / or food compositions.
도 1은 홍해삼 추출물이 50㎍/㎖ 농도에 세포 독성을 나타내지 않음과 NO 생성을 억제함을 보여주는 결과이다.
도 2 내지 도 4는 홍해삼 추출물이 염증성 사이토카인의 생성을 억제함을 보여주는 결과이다.
도 5는 홍해삼 추출물이 PGE2의 생성을 억제함을 보여주는 결과이다.
도 6 및 도 7은 홍해삼 추출물이 유전자 수준 및 단백질 수준에서 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제함을 보여주는 결과이다.
도 8은 홍해삼 추출물이 혈액암 및 대장암 세포주의 증식 억제 효과를 보여주는 결과이다.1 is a result showing that the red sea ginseng extract does not show cytotoxicity and inhibits NO production at a concentration of 50 µg / ml.
2 to 4 show that red sea ginseng extract inhibits the production of inflammatory cytokines.
5 is a result showing that the red sea ginseng extract inhibits the production of PGE 2 .
6 and 7 show that red sea ginseng extract inhibits the expression of iNOS and COX-2 at the gene and protein levels.
8 is a result showing the red sea ginseng extract inhibiting the proliferation of hematologic and colon cancer cell lines.
이하 본 발명은 참조예, 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described with reference to reference examples, examples and experimental examples. However, the scope of the present invention is not limited by these examples and experimental examples.
<< 참조예Reference Example > > 홍해삼Red Sea Ginseng 분말 제조 Powder manufacturing
제주도 해안가 일대에 자생하고 있는 홍해삼(Stichopus japonicus, Orange)을 2007년 3월경에 채집하여 증류수로 2~3회 수세한 뒤 물기를 제거하여 동결건조 후 마쇄기로 분쇄하여 하기 추출용 시료로 사용하였다.
The red sea ginseng ( Stichopus japonicus , Orange) growing on the coast of Jeju Island was collected in March 2007, washed with distilled water two or three times, dried, lyophilized and crushed with a mill.
<< 실시예Example > > 홍해삼Red Sea Ginseng 추출물 및 Extract and 분획물의Fraction 제조 Produce
에탄올 추출물 및 순차적 분획물의 제조는 80% 에탄올(EtOH) 및 분획용 헥산(n-hexane), 디클로로메탄(CH2Cl2), 에틸아세테이트(EtOAc) 그리고 부탄올(BuOH)을 사용하여 용매의 극성을 이용한 순차적 추출법을 사용하였다. 즉 분말 건조된 시료에 80% 에탄올로 추출한 후 여과하여 얻어진 추출액을 감압 농축하여 동결건조기로 완전 건조시켰다. 상기 얻어진 에탄올 추출물에 10배량의 증류수와 동량의 헥산을 첨가하여 분획한 후 감압?농축하여 헥산 분획물을 얻었다. 동일한 방법으로 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 그리고 물 층을 분획하여 각각의 순차 분획물을 얻었다. Ethanol extracts and sequential fractions were prepared using 80% ethanol (EtOH) and fractional hexane (n-hexane), dichloromethane (CH 2 Cl 2 ), ethyl acetate (EtOAc) and butanol (BuOH). The sequential extraction method used was used. That is, the extract obtained by extraction with 80% ethanol to the powder dried sample was concentrated under reduced pressure and completely dried with a lyophilizer. 10 times the amount of distilled water and the same amount of hexane was added to the obtained ethanol extract, and the resultant was concentrated under reduced pressure and concentrated to obtain a hexane fraction. Dichloromethane, ethyl acetate, butanol and water layers were fractionated in the same manner to obtain respective sequential fractions.
<< 실험예Experimental Example > > 홍해삼Red Sea Ginseng 추출물의 기능성 평가 Functional Evaluation of Extracts
<실험예 1> 홍해삼 추출물의 항염 활성 평가 Experimental Example 1 Evaluation of Anti- inflammatory Activity of Red Sea Ginseng Extract
<실험예 1-1> 세포 및 시약 Experimental Example 1-1 Cells and Reagents
마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포는 KCLB(Korean Cell Line Bank)로부터 분양받아 100 units/mL penicillin-streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 3~4일 간격으로 계대 배양하면서 실험을 수행하였다. Lipopolysaccharide (LPS. E. coli serotype 0111:B4)는 Sigma로부터 구입하여 실험에 사용하였다.RAW264.7 cells, a mouse macrophage line, were distributed from Korean Cell Line Bank (KCLB) at 37 ° C and 5% CO 2 using DMEM medium containing 100 units / mL penicillin-streptomycin and 10% fetal bovine serum (FBS). Experiments were performed while subcultured at intervals of 3-4 days in a thermostat. Lipopolysaccharide (LPS. E. coli serotype 0111: B4) was purchased from Sigma and used in the experiment.
<실험예 1-2> 세포 독성 평가( LDH assay ) Experimental Example 1-2 Cytotoxicity Evaluation ( LDH assay )
RAW264.7 세포(1.5×105cells/mL)를 DMEM 배지에 상기 추출물 시료(50㎍/㎖)와 LPS(1㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양 한 후 배양 배지를 얻어 3,000rpm에서 5분간 원심분리 하였다. LDH(lactate dehydrogenase) assay는 non-radioactive cytotoxicity assay kit(Promega)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심 분리하여 얻은 배양 배지 50㎕와 reconstituted substrate mix를 50㎕를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50㎕의 stop solution을 넣은 후 microplate reader(Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군(LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포 독성을 평가하였다.RAW264.7 cells (1.5 × 10 5 cells / mL) were incubated in DMEM medium simultaneously with the extract sample (50 μg / mL) and LPS (1 μg / mL) for 24 hours to obtain a culture medium at 3,000 rpm. Centrifuge for 5 minutes. The lactate dehydrogenase (LDH) assay was measured using a non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega), and 50 µl of the culture medium and 50 µl of the reconstituted substrate mix obtained by centrifugation in a 96 well plate were reacted for 30 minutes at room temperature. After 50 μl of stop solution was added, the absorbance was measured at 490 nm using a microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA). Average absorbance values were obtained for each sample group, and cytotoxicity was evaluated by comparing with the absorbance values of the control group (LDH control, 1: 5000).
결과를 <도 1>에 나타내었다. <도 1>의 결과를 참조하여 보면 추출물의 시료는 50㎍/㎖ 농도에 거의 세포 독성을 나타내지 않았음을 알 수 있다.The results are shown in FIG. 1. Referring to the results of FIG. 1, it can be seen that the sample of the extract showed little cytotoxicity at a concentration of 50 μg / ml.
<실험예 1-3> NO 생성 억제 활성 평가 Experimental Example 1-3 Evaluation of NO Production Inhibition Activity
RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.0 X 05 cell/ml로 조절한 후 48 well plate에 접종하고, 상기 추출물 시료 50㎍/㎖과 LPS(1㎍/㎖)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2 - 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100㎕와 Griess시약[1% (w/v) sulfanilamide, 0.1%(w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid] 100㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 530nm에서 흡광도를 측정하였는데 이는 세포배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하였으며 생성된 NO의 양은 sodium nitrite(NaNO2)를 standard로 비교하였다. RAW 264.7 cells were adjusted to 1.0
결과를 <도 1>에 나타내었다. <도 1>를 참조하여 보면, LPS의 단독 처리군의 경우는 NO가 과량 생성되는 것을 알 수 있으나 상기 추출물의 시료를 동시에 처리한 처리군의 경우는 대체로 NO 생성이 감소함을 알 수 있다. 추출물의 시료 중 특히 헥산 분획물, 메틸렌클로라이드 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 경우가 NO 생성 억제 효과가 뛰어났다.The results are shown in FIG. 1. Referring to FIG. 1, it can be seen that NO is excessively generated in the LPS treatment group alone, but in the case of the treatment group treated with the sample of the extract at the same time, NO production is generally reduced. In particular, the hexane fraction, the methylene chloride fraction and the ethyl acetate fraction in the extract samples were excellent in inhibiting NO production.
<실험예 1-4> TNF -α 와 IL -1β 그리고 IL -6 생성 억제 활성 평가 Experimental Example 1-4 Evaluation of Inhibitory Activity of TNF- α, IL- 1β, and IL- 6 Production
TNF-α와 IL-1β 그리고 IL-6 정량은 murine macrophage cell line인 RAW264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5 × 105 cells/mL로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5 % CO2 항온기에서 18시간 전배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 50㎍/㎖로 조제된 시험물질 50㎕와 450㎕의 LPS(1㎍/㎖)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 전배양과 동일 조건에서 배양하였다. 6시간 후 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min)하여 상층액을 얻었다(이 상층액을 TNF-α 및 IL-6을 정량에 이용).TNF-α, IL-1β, and IL-6 were quantified by adjusting RAW264.7 cells, which are murine macrophage cell lines, to 1.5 × 10 5 cells / mL using DMEM medium, inoculated into 24 well plates, and 5% CO 2 18 hours pre-incubation in the thermostat. Thereafter, the medium was removed, and 50 μl / mL of the test substance prepared at 50 μl and fresh medium containing 450 μl of LPS (1 μg / mL) were simultaneously treated and cultured under the same conditions as the preculture. After 6 hours, the culture medium was centrifuged (12,000 rpm, 3 min) to obtain a supernatant (TNF-α and IL-6 were used for quantification).
IL-1β의 정량을 위하여 시험 약물을 처리하고 6시간 배양 후 150 mM염화나트륨(NaCl), 50 mM 트리스 염산(Tris HCl)(pH 7.6), 1.0 mM PMSF, 그리고 0.25 % 노니뎃(Nonidet) P-40을 포함하는 1 ㎖의 lysis buffer를 이용하여 4 ℃에서 10 분 방치 후, 원심분리(12,000 rpm에서 2 분)하여 상층액을 얻었다. 모든 시료는 정량 전까지 -20 ℃ 이하에 보관하였다.Treatment of test drug for quantification of IL-1β and incubation for 6 hours followed by 150 mM sodium chloride (NaCl), 50 mM Tris HCl (pH 7.6), 1.0 mM PMSF, and 0.25% Nonidet P- After leaving for 10 minutes at 4 ℃ using 1 ml lysis buffer containing 40, centrifugation (2 minutes at 12,000 rpm) to obtain a supernatant. All samples were stored below -20 ° C until quantification.
염증성 사이토카인의 정량은 mouse ELISA kit(R & D Systems, Inc.)를 이용하여 정량하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r2 값은 0.99 이상이었다. Inflammatory cytokines were quantified using a mouse ELISA kit (R & D Systems, Inc.) and the r 2 value of the standard curve for the standard was 0.99 or more.
결과를 <도 2> 내지 <도 4>에 나타내었다. LPS 단독 처리군에 대해 추출물의 시료를 함께 처리한 경우 대체로 염증성 사이토카인의 생성이 억제됨을 알 수 있다. 추출물의 시료 중 80% 에탄올 추출물, 헥산 분획물, 메틸렌클로라이드 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 경우가 염증성 사이토카인의 생성 억제 효과가 뛰어났다.The results are shown in FIGS. 2 to 4. When treated with the sample of the extract for the LPS alone treatment group it can be seen that the production of inflammatory cytokines are generally suppressed. In the extract samples, 80% ethanol extract, hexane fraction, methylene chloride fraction and ethyl acetate fraction were excellent in inhibiting the production of inflammatory cytokines.
<실험예 1-5> Prostaglandin E 2 ( PGE 2 ) 생성 평가 Experimental Example 1-5 Prostaglandin Evaluation of E 2 ( PGE 2 ) Formation
RAW264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5×105cells/mL로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO2항온기에서 18시간 전 배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 50㎍/㎖ 추출물 시료 50㎕와 450㎕의 LPS(1㎍/㎖)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 전배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 prostaglandin E2(PGE2)를 측정하기 위해 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min)하여 상층액을 얻었다. PGE2의 측정은 PGE2 ELISA kit(R & D Systems, Inc.)를 이용하여 정량하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.RAW264.7 cells were adjusted to 1.5 × 10 5 cells / mL using DMEM medium, and then inoculated in a 24 well plate, and cultured 18 hours before in a 5% CO 2 incubator. Thereafter, the medium was removed, and 50 μl / ml extract sample and 50 μl LPS (1 μg / ml) were simultaneously treated with new medium and cultured under the same conditions as the preculture. After 24 hours, the supernatant was obtained by centrifugation (12,000 rpm, 3 min) of the culture medium to measure prostaglandin E 2 (PGE 2 ). PGE 2 measurement is PGE 2 It was quantified using an ELISA kit (R & D Systems, Inc.) and the r 2 value of the standard curve for the standard was 0.99 or more.
결과를 <도 5>에 나타내었다. <도 5>는 추출물의 시료가 대체로 PGE2의 생성을 억제함을 보여준다. 추출물의 시료 중 80% 에탄올 추출물, 헥산 분획물, 메틸렌클로라이드 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 경우가 PGE2의 생성 억제 효과가 뛰어났다.The results are shown in FIG. 5. 5 shows that samples of extracts generally inhibit the production of PGE 2 . The 80% ethanol extract, hexane fraction, methylene chloride fraction and ethyl acetate fraction in the sample of the extract were excellent in inhibiting the production of PGE 2 .
<실험예 1-6> iNOS 및 COX 발현 억제 활성 평가 Experimental Example 1-6 Evaluation of iNOS and COX Expression Inhibitory Activity
RAW264.7 세포(1.0×106 cells/mL)를 18 시간 전 배양하고 상기 추출물 시료 (50㎍/)와 LPS(1㎍/)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 TRI-reagent(MRC)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. Incubate RAW264.7 cells (1.0 × 10 6 cells / mL) 18 hours ago and incubate for 24 hours with co-treatment of the extract sample (50㎍ /) and LPS (1㎍ /), followed by TRI-reagent (MRC). Total RNA was isolated.
세포에 TRI-reagent를 첨가하여 균질화한 후, 클로로포름을 첨가하여 원심 분리(15000 rpm, 15분)시켰다. 상층액에 동량의 이소프로판올을 첨가하여 원심 분리(12000 rpm, 8분)시켜 RNA를 침전시키고 75%의 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 에탄올을 첨가하여 원심 분리(10000 rpm, 5 분)시킨 후, 건조시켜 DEPC가 처리된 증류수에 녹였다. 260 ㎚에서 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였고, 260 ㎚에서의 흡광도와 280 ㎚에서의 흡광도 비율이 1.7~1.9 범위 내의 값을 갖는 RNA를 실험에 사용하였다. 모든 실험은 RNase-free 조건하에서 이루어졌다.The cells were homogenized by addition of TRI-reagent, and then centrifuged (15000 rpm, 15 minutes) by addition of chloroform. Equivalent amount of isopropanol was added to the supernatant and centrifuged (12000 rpm, 8 minutes) to precipitate RNA, and 75% DEPC (diethyl pyrocarbonate) treated ethanol was added and centrifuged (10000 rpm, 5 minutes), followed by drying. DEPC was dissolved in the treated distilled water. RNA was quantified by measuring absorbance at 260 nm, and RNA having a value within the range of 1.7-1.9 absorbance at 260 nm and absorbance at 280 nm was used in the experiment. All experiments were done under RNase-free conditions.
1μg의 total RNA를 oligo(dT)18 primer, dNTP(0.5 μM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 M-MuLV reverse transcriptase(2 U)로 70℃ 5분, 25℃ 5분, 37℃ 60분, 그리고 70℃에서 10분 heating 시킴으로서 반응을 중지시켰다. Polymerase chain reaction(PCR)은 합성된 cDNA로부터 각각의 primer을 증폭시키기 위하여 2 ㎕ cDNA, 4 μM의 5′과 3′ primer(서열은 아래의 <표 1> 참조), 10x buffer(10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1 % Triton X-100), 250 μM dNTP, 25 mM MgCl2, 1 unit Taq polymerase(Promega, USA)를 섞고 distilled water로 전체를 25 ㎕로 맞춘 다음 Perkin-Elmer Thermal Cycler를 이용하여 실시하였다. 이때 PCR 조건은 94℃/20 초, 55?62℃/30 초, 72℃/40 초, 30 cycle이며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.2% agarose gel에서 전기영동을 실시하고 ethidium bromide로 염색하여 특정 band를 확인하였다.
1 μg of total RNA was mixed with oligo (dT) 18 primer, dNTP (0.5 μM), 1 unit RNase inhibitor and M-MuLV reverse transcriptase (2 U) at 70 ° C for 5 minutes, 25 ° C for 5 minutes, 37 ° C for 60 minutes, and 70 The reaction was stopped by heating at 10 ° C. for 10 minutes. Polymerase chain reaction (PCR) was performed using 2 μl cDNA, 4 μM 5 ′ and 3 ′ primers (see Table 1 below), 10x buffer (10 mM Tris-) to amplify each primer from the synthesized cDNA. HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250 μM dNTP, 25 mM MgCl 2 , 1 unit Taq polymerase (Promega, USA), mix to 25 μl with distilled water and then Perkin-Elmer The thermal cycler was used. At this time, PCR conditions were 94 ℃ / 20 seconds, 55 ~ 62 ℃ / 30 seconds, 72 ℃ / 40 seconds, 30 cycles, and the product produced by PCR was subjected to electrophoresis on 1.2% agarose gel and stained with ethidium bromide. I identified a specific band.
iNOS
COX-2
β-Actin
결과를 <도 6>에 나타내었다. <도 6>의 결과는 상기 각 추출물의 시료가 대체로 유전자 수준에서 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제함을 보여준다.The results are shown in FIG. 6. The results in FIG. 6 show that samples of each extract generally inhibited the expression of iNOS and COX-2 at the gene level.
이처럼 유전자 수준에서 상기 추출물의 시료가 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제함을 확인하고 단백질 수준에서도 상기 추출물의 시료가 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하는가를 웨스턴블럿을 통해 확인하였다.As such, it was confirmed that the sample of the extract inhibits the expression of iNOS and COX-2 at the gene level, and it was confirmed whether the sample of the extract inhibits the expression of iNOS and COX-2 at the protein level through Western blotting.
상기에서 세포배양이 끝난 후 세포를 수집하여 2 ~ 3 회 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척 후 1 ㎖의 lysis buffer을 첨가, 30 분~1 시간 동안 lysis 시킨 후 12,000 rpm에서 20 분간 원심하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 BSA(Bovine serum albumin)을 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하여 정량하였다. 30 ~ 50 ㎍의 lysate를 8 ~ 12 % mini gel SDS-PAGE(Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)로 변성 분리하여, 이를 PVDF membrane (BIO-RAD)에 200 mA로 2시간 동안 transfer하였다. 그리고 Membrane의 blocking은 5 % skim milk가 함유된 TTBS (TBS + 0.1% Tween 20) 용액에서 상온에서 2시간 동안 실시하였다. iNOS의 생성 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS (1: 1000) (Santa-Cruz)을 COX-2의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2 (1: 1000) (Cell Signaling)을 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3 회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP (Horse Radish Peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG (Amersham Co.)를 1 : 5000으로 희석하여 상온에서 30 분간 반응시킨 후, TTBS로 3 회 세정하여 ECL 기질(Amersham Co.)과 1 ~ 3분 간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.After the cell culture, the cells were collected and washed 2 or 3 times with PBS (Phosphate Buffered Saline), followed by adding 1 ml of lysis buffer, lysis for 30 minutes to 1 hour, and centrifugation at 12,000 rpm for 20 minutes. Etc. were removed. Protein concentration was quantified using the Bio-Rad Protein Assay Kit by standardizing BSA (Bovine serum albumin). 30-50 μg of lysate was denatured by 8-12% mini gel SDS-PAGE (Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) and transferred to PVDF membrane (BIO-RAD) at 200 mA for 2 hours. Membrane blocking was performed for 2 hours at room temperature in TTBS (TBS + 0.1% Tween 20) solution containing 5% skim milk. Anti-mouse iNOS (1: 1000) (Santa-Cruz) was used as an antibody to examine the production amount of iNOS. Anti-mouse COX-2 (1: 1000) was used as an antibody to examine the expression level of COX-2. (Cell Signaling) was diluted in TTBS solution, reacted at room temperature for 2 hours, and washed three times with TTBS. As a secondary antibody, anti-mouse IgG (Amersham Co.) conjugated with HRP (Horse Radish Peroxidase) was diluted to 1: 5000, reacted at room temperature for 30 minutes, washed three times with TTBS, and then washed with ECL substrate (Amersham Co. ), And then reacted for 1 to 3 minutes to the X-ray film.
결과를 <도 7>에 나타내었다. <도 7>의 결과는 <도 6>의 결과와 비슷하게 상기 추출물의 시료가 대체로 단백질 수준에서 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제함을 보여준다.The results are shown in FIG. 7. The results of FIG. 7 show that samples of the extracts generally inhibit the expression of iNOS and COX-2 at the protein level, similar to the results of FIG. 6.
<실험예 2> 홍해삼 추출물의 항암 활성 평가 Experimental Example 2 Evaluation of Anticancer Activity of Red Sea Ginseng Extract
급성 전골수성 백혈병 환자에서 유래한 세포주인 HL-60(혈액암) 및 고형암 세포주인 HT-29(대장암)를 한국세포주은행(KCLB)으로부터 분양받아 100 units/mL의 penicillin-streptomycin(GIBCO, Grand Island, NY, USA)과 10%의 fetal bovine serum(FBS; GIBCO, Grand Island, NY, USA)이 함유된 RPMI 1640 배지(GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3~4일에 한 번씩 시행하였다. Cell lines derived from patients with acute promyeloid leukemia (HL-60) and solid cancer cell lines HT-29 (colon cancer) were distributed from Korea Cell Line Bank (KCLB) and 100 units / mL penicillin-streptomycin (GIBCO, Grand) Island, NY, USA) and 37 ° C., 5% CO using RPMI 1640 medium (GIBCO, Grand Island, NY, USA) containing 10% fetal bovine serum (FBS; GIBCO, Grand Island, NY, USA) Culture was carried out in two thermostats, subculture was carried out once every 3 to 4 days.
상기 추출물 시료의 사람 암세포에 대한 증식억제 효과는 MTT assay법(Carmichael 등, 1987)을 이용하여 알아보았다. 각 세포(2.0?5.0×104/mL)를 96 well plate의 각 well에 넣고, 상기 각 추출물의 시료(100㎍/㎖)를 첨가하고 3 일간 배양한 다음, 3-(4,5-dimethylthiazol)-2, 5- diphenyltetrazolium bromide(MTT; Sigma, St. Louis, MO, USA) 100μg을 첨가하고 4시간 동안 더 배양하였다. Plate를 1,000 rpm에서 10 분간 원심분리하고 조심스럽게 배지를 제거한 다음, dimethylsulfoxide(DMSO; Sigma, St. Louis, MO, USA) 150 ㎕를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 formazan 침전물을 용해시킨 후 microplate reader(Bio-TEK instrumenis. Inc., Winooski Vermont, WI, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군(추출물의 시료를 첨가하지 아니한 경우)의 흡광도 값과 비교하여 세포 증식억제 정도를 조사하였다.The proliferation inhibitory effect on the human cancer cells of the extract sample was examined using MTT assay (Carmichael et al., 1987). Put each cell (2.0 ~ 5.0 × 10 4 / mL) in each well of a 96 well plate, add a sample of each extract (100㎍ / ㎖) and incubated for 3 days, then 3- (4,5-
결과를 <도 8>에 나타내었다. <도 8>를 참조하여 보면, 상기 추출물의 시료는 혈액암과 대장암 세포주에 대해서 모두 그 증식 억제 효과를 가지고 있음을 알 수 있다.The results are shown in FIG. 8. Referring to Figure 8, it can be seen that the sample of the extract has a proliferation inhibitory effect on both the blood cancer and colorectal cancer cell lines.
통계분석Statistical analysis
모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 각 항목에 따라 평균치 ± 표준편차 (SD)를 구하여 신뢰수준 95% 및 99%(p<0.05, p<0.01)에서 통계적 유의차를 평가하였다.
All experiments were repeated three times or more, and the experimental results were evaluated for statistical significance differences at 95% and 99% confidence levels (p <0.05, p <0.01) by obtaining the mean ± standard deviation (SD) for each item. .
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