KR101211326B1

KR101211326B1 - 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴을 이용한 식품 보존용 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101211326B1
Application number: KR1020100084343A
Authority: KR
Inventors: 김진수; 김형준; 황삼도; 박권현; 신준호; 이지선; 허민수; 윤민석
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2010-08-30
Filing date: 2010-08-30
Publication date: 2012-12-11
Also published as: KR20120020625A

Abstract

본 발명은 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴을 이용한 식품 보존용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명은 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴을 효소 가수분해시킨 가수분해물을 포함하는 식품 보존용 조성물을 제공한다. 또한 우럭 껍질로부터 젤라틴을 추출하는 단계; 및 상기 추출한 젤라틴을 효소 가수분해시키는 단계를 포함하는 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴을 이용한 식품 보존용 조성물의 제조방법 및 상기 방법을 이용한 식품 저장방법을 제공한다. 본 발명에 따른 식품 보존용 조성물 또는 식품 코팅용 필름은 항산화 효과가 우수하여 수산물 등의 저장안정성을 높여주며, 노화 및 고혈압 억제 등의 건강기능성을 갖는다.

Description

우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴을 이용한 식품 보존용 조성물 및 이의 제조방법{COMPOSITION FOR PRESERVING FOOD USING GELATIN EXTRACTED FROM ROCKFISH SKIN AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}

본 발명은 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴을 이용한 식품 보존용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 젤라틴은 효소 가수분해물 또는 이의 한외여과(ultrafiltration) 분획물의 형태로 이용될 수 있다. 또한 본 발명은 상기 식품 보존용 조성물을 이용하여 식품을 저장하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 소비자들이 섭취하고 있는 대부분의 식품은 시간이 경과하면 이들 성분이 산화되어 산패(酸敗)라는 변질현상을 가져오는데 이렇게 변질된 식품을 섭취할 경우, 소비자의 건강을 위협할 수 있다.

식품이 산화되는 경우로는 다양한 원인들이 작용할 수 있는데, 대표적으로 지방산화는 식용유지나 지방질 성분이 공기 중의 산소와 화학적으로 반응하는 산화반응에 의해 냄새나 맛의 변화에 기인되는 산패를 말한다. 이러한 지방산화는 자동산화, 광산화, 가열산화 및 감마선 조사에 의한 산화 등이 포함된다. 또한, 자동산화는 유지에 열이 가해지지 않은 상태에서 자연발생적으로 공기 중의 산소를 흡수함으로써 일어나는 것으로 활성작용기(라디칼)의 연쇄반응으로 물리적 및 화학적 변화가 초래되어 산패가 일어나는 가장 일반적인 산화를 말하며, 광산화는 식용유지나 지방질 성분에 클로로필, 마이요글로빈, 헤모글로빈 및 이들의 산화생성물들이 미량 함유된 상황에서 각종 광선에 노출되어 일어나는 산화를 말하는 것으로서, 공기 중의 산소분자를 활성이 강한 일중항 산소분자로 만들어 일중항 산소에 의해 일어나는 산화반응이다.

한편, 육류 및 어류 등을 포함하는 각종 가공식품의 경우, 특히 식품들의 저장수명을 연장하기 위해 건조된 상태로 유통시키거나 살균방법 및 효소작용 억제방법 등 다양한 종류의 방법으로 저장성을 개선하려는 노력들이 시도되고 있으며, 그 중의 하나로서 자외선을 비롯한 감마선의 조사도 시도되어 왔으나 조사된 식품이 급속한 품질저하를 가져와 그 사용이나 응용 연구들이 거의 중단 또는 포기상태에 이르고 있다.

또한, 식품의 산화 방지를 위해 프로필 갈레이트(propyl gallate), BHA (butylated hydroxyanisole) 및 BHT(butylated hydroxytoluene) 와 같은 합성 항산화제가 식품의 제조 또는 포장단계에서 첨가되어 사용되고 있는데 이는 천연 항산화제에 비해 가격이 저렴하고 손쉽게 구할 수 있기 때문에 인체에 해롭다는 문제점이 있음에도 불구하고 여전히 사용되고 있다.

따라서 식품의 산화를 효과적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라 체내에도 안정한 새로운 천연 유래의 식품 항산화제가 필요한 실정이다.

이에 최근에는 전통적인 방법들로 추출한 해양 동물 및 가축의 피부 젤라틴의 가수분해 산물들로부터 분리한 기능성 펩티드들을 식품의 보존제로 사용하려는 연구가 진행되고 있다.

한편, 젤라틴(gelatin)은 프로테아제(protease) 처리에 의해 생물학적으로 활성적인 펩티드들로 변형될 수 있으며, 그 산물들은 일반적으로 angiotensin I converting enzyme의 저해제 및 지질과산화(lipid peroxidation)에 대한 항산화제(antioxidants)로 작용한다. 이와 함께 젤라틴은 졸 및 겔화하는 열가역적 특성이 있어 식품용, 의약품용, 화장품용 및 공업용과 같이 다양한 산업에서 많이 이용되고 있고, 최근에는 열가역적 특성을 요하지 않는 젤라틴 가수분해물의 건강 기능성을 고려한 이용까지 대두되고 있다. 하지만, 젤라틴 이용의 대부분이 광우병, 돼지독감 및 조류독감 등의 우려가 있는 가축 부산물로부터 추출되고 있어 건강에 관심이 있는 소비자들의 경우 가축 껍질 유래 젤라틴의 이용을 꺼려하고 있어 젤라틴의 새로운 추출소재의 개발이 요구되고 있다.

하지만 어류 젤라틴은 가축에서 유래된 젤라틴과 유사한 레올리지적(rheological) 특성들을 만족시키기가 쉽지 않다. 만약 어류 젤라틴이 높은 레올리지적 특성들을 필요로 하는 일반적인 식품, 화장품, 의약품 및 기타의 제품들로 제공되려면, 화학적 및 효소학적 방법들에 의해 변형되어야 하며, 이에 따라 안전성이나 비용면에서 문제가 야기될 것이다. 따라서 어류 젤라틴을 효과적인 이용하려는 방법이 개발된다면 각종 산업 분야에 유용하게 응용될 수 있을 것이다.

한편, 우럭은 국내에서 횟감 소재로 즐겨 이용되고 있고, 이로 인하여 콜라겐과 같은 유용성분이 많이 함유되어 있는 우럭껍질 등의 부산물이 다량 양산되고 있다. 하지만, 대부분의 어류 젤라틴과 같이 우럭 젤라틴의 경우도 열가역적 물리적 특성이 낮아 대부분이 사료와 같이 비효율적으로 이용되고 있거나 직접 폐기되고 있어 이를 유용하게 사용하려는 방법의 개발이 절실한 실정이다.

본 발명의 목적은 우럭 껍질의 젤라틴을 이용하여 기능성을 나타내는 식품 보존용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴을 이용한 식품 보존용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴을 이용한 식품 저장방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴 가공물을 포함하는 식품 보존용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가공물은 상기 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴을 효소 가수분해시킨 가수분해 산물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가수분해 산물은 상기 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴을 효소 가수분해시킨 뒤 막(membrane)으로 걸러낸 분획물일 수 있다.

또한, 본 발명은,

우럭 껍질로부터 젤라틴을 추출하는 단계; 및

상기 추출한 젤라틴을 효소 가수분해하는 단계를 포함하는, 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴을 포함하는 식품 보존용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가수분해물을 2종 이상의 막(membrane)으로 걸러내어 막 분획물을 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 젤라틴을 추출하는 단계는 100-110℃의 추출온도에서 65-75분간 고온가압추출 방식으로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 효소 가수분해는 서로 다른 두 종류 이상의 효소들을 동시에 또는 연속적으로 반응시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 효소는 알칼라제(Alcalase), 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase) 및 프로타멕스(Protamex)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 막 분획물을 분리하는 단계는 상기 가수분해물을 10~15 kDa 및 5~8 kDa 막에 순차적으로 한외여과(ultrafiltration)시킨 뒤 5~8 kDa 막을 통과하지 못한 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 수득한 막 분획물을 포함하는 식품 코팅용 필름을 제조하는 단계; 및 상기 필름으로 저장하고자 하는 식품을 코팅 처리하는 단계를 포함하는 식품의 저장방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식품은 멸치, 새우, 오징어, 뱅어, 명태 및 조개로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 멸치, 새우, 오징어, 뱅어, 명태 또는 조개는 코팅 처리 전 끓인 후, 찬 공기로 건조시키는 예비 건조 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 식품 보존용 조성물 또는 식품 코팅용 필름은 항산화 효과가 우수하여 멸치와 같이 수분함량이 높아 부패가 진행되기 쉬운 수산물 등의 저장안정성을 높여주며, 아울러 젤라틴 효소분해물 자체가 갖는 기능성으로 인해 노화 억제 및 고혈압 억제 등의 효과를 예상할 수 있다. 한편 우럭껍질은 횟감 제조 중 부산물로 대량 양산되기 때문에 그 입수가 용이하고 환경적으로도 자원을 재활용할 수 있는 장점이 있어 식품산업 및 수산물 관련 산업에서 그 활용가치가 높다.

도 1은 4 종류의 상용화된 효소들 중 하나로 1-6시간 동안 처리한 FRSGH의 가수분해율을 나타낸 것이다. A; 60℃에서 알칼라아제로 분해된 젤라틴 가수분해물 (0-6.0 hr), F; 50℃에서 플라보자임으로 분해된 젤라틴 가수분해물, P; 50℃에서 프로타멕스로 분해된 젤라틴 가수분해물, N, 40℃에서 뉴트라아제로 분해된 젤라틴 가수분해물. (같은 심볼의 다른 문자들은 p<0.05의 유의적 차이를 나타낸다.)
도 2는 우럭 껍질 젤라틴 및 그것의 1차 및 2차 젤라틴 가수분해물의 분자량 분포 프로파일을 나타낸다. ¹⁾FRSGH : 알칼라아제로 1시간 동안 분해된 1차 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물, SRSGH : 알칼라아제로 1시간 및 플라보자임으로 2시간 동안 연속적으로 분해된 2차 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물. G-HTHP : 106.6℃ 에서 68.8분간 추출된 젤라틴. (Standards : alcohol dehydrogenase (150 kDa), bovine serum albumin (66 kDa), carbonic anhydrase (29 kDa), Cytochrome C (12.4 kDa), aprotinin (6.5 kDa))
도 3은 다른 시간 간격(1.0-6.0 hr) 동안 두 개의 프로테아제들로 연속적으로 배양된 SRSGH의 가수분해율을 나타낸다. A→F; 알칼라아제로 1시간 및 플라보자임으로 2시간 동안 연속적으로 처리한 젤라틴 가수분해물, A→P; 알칼라아제로 1시간 및 프로타멕스로 2시간 동안 연속적으로 처리한 젤라틴 가수분해물, A→N; 알칼라아제로 1시간 및 뉴트라아제로 2시간 동안 연속적으로 처리한 젤라틴 가수분해물. (같은 심볼의 다른 문자들은 p<0.05의 유의적 차이를 나타낸다.)
도 4는 우럭 껍질 젤라틴 및 그것의 1차 및 2차 젤라틴 가수분해물의 분자량 분포 프로파일이다. ¹⁾FRSGH : 알칼라아제로 1시간 동안 분해된 1차 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물, SRSGH : 알칼라아제로 1시간 및 플라보자임으로 2시간 동안 연속적으로 분해된 2차 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물. G-HTHP : 106.6℃ 에서 68.8분간 추출된 젤라틴.(Standards : alcohol dehydrogenase (150 kDa), bovine serum albumin (66 kDa), carbonic anhydrase (29 kDa), Cytochrome C (12.4 kDa), aprotinin (6.5 kDa))
도 5는 UF 막을 거친 SRSGH의 상층물 및 투과물의 항산화 활성을 보여준다. 대조군은 항산화 활성 실험에서 상층물 또는 투과물이 첨가되지 않은 것으로 정의된다. Ⅰ, >30kDa 분획(fraction); Ⅱ, 30~10kDa 분획; Ⅲ, 10~5kDa 분획; Ⅳ, 5~1kDa 분획; Ⅴ, <1kDa 분획. PF = (가수분해물 또는 투과물을 넣은 콩기름의 IP/증류수를 넣은 콩기름(대조군)의 IP)×100
도 6은 FRSGH, SRSGH 및 SRSGH-Ⅲ 의 Angiotensin I converting enzyme (ACE)²⁾ 저해 활성(IC₅₀)³⁾을 나타낸다. ¹⁾FRSGH : 알칼라아제로 1시간 동안 처리한 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물, SRSGH : 알칼라아제로 1시간 및 플라보자임으로 2시간 동안 연속적으로 처리한 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물, SRSGH-Ⅲ : 10 kDa 막을 통과하였으나 5 kDa 막을 통과하지 못한 투과물들. ²⁾15 uL 의 각각의 가수분해물로 ACE 저해를 측정하였다. ³⁾IC₅₀ 값은 ACE 저해 활성의 50% 를 저해하는데 필요로 하는 저해물질의 농도로 정의된다.
도 7은 SRSGH 및 SRSGH-Ⅲ의 라디칼(DPPH 라디칼, 과산화물 라디칼, 하이드록실 라디칼, 알킬 라디칼) 소거 활성(RSA)을 보여준다. SRSGH : 알칼라아제로 1시간 및 플라보자임으로 2시간 동안 연속적으로 처리한 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물, SRSGH-Ⅲ : 10 kDa 막을 통과하였으나 5 kDa 막을 통과하지 못한 투과물들.
도 8은 SRSGH 및 SRSGH-Ⅲ의 라디칼(DPPH 라디칼, 과산화물 라디칼, 하이드록실 라디칼, 알킬 라디칼) 소거 크로마토그램을 보여준다. SRSGH : 알칼라아제로 1시간 및 플라보자임으로 2시간 동안 연속적으로 분해된 2차 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물, SRSGH-Ⅲ : 10 kDa 막을 통과하였으나 5 kDa 막을 통과하지 못한 투과물들.
도 9는 우럭 껍질 젤라틴 및 그것의 1차 및 2차 젤라틴 가수분해물들의 분자량 분포 프로파일들을 보여준다. ¹⁾FRSGH : 알칼라아제로 1시간 동안 분해된 1차 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물, SRSGH : 알칼라아제로 1시간 및 플라보자임으로 2시간 동안 연속적으로 분해된 2차 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물, G-HTHP : 106.6℃ 에서 68.8분간 추출된 젤라틴. (Standards : alcohol dehydrogenase (150 kDa), bovine serum albumin (66 kDa), carbonic anhydrase (29 kDa), Cytochrome C (12.4 kDa), aprotinin (6.5 kDa))
도 10은 RSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅된 마른 멸치의 POV 및 수득률을 비교한 것이다. ¹⁾Coated : RSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅된 마른(boiled-dried) 멸치, Uncoated : 필름 무코팅 마른 멸치. (수치들은 평균±표준편차로 나타냈다.)
도 11은 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름을 코팅된 마른 멸치의 갈변 지수이다. ¹⁾Coated boiled-dried anchovy : RSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅된 마른 (boiled-dried) 멸치, Uncoated : 필름 무코팅 마른 멸치.
도 12는 실온 저장 기간 동안 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치의 수분 함량을 나타낸다. ¹⁾Coated : 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치, Uncoated : 필름 무코팅 마른 멸치. (막대의 다른 문자들은 P<0.05 이다.)
도 13은 실온 저장 기간 동안 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치의 volatile basic nitrogen (VBN)의 변화를 나타낸다. ¹⁾Coated : 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치, Uncoated : 필름 무코팅 마른 멸치. (막대의 다른 문자들은 P<0.05 이다.)
도 14는 실온 저장 기간 동안 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치의 peroxide value (POV)의 변화를 나타낸다. ¹⁾Coated : 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치, Uncoated : 필름 무코팅 마른 멸치. (막대의 다른 문자들은 P<0.05 이다.)
도 15는 실온 저장 기간 동안 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치의 TBA 값의 변화를 나타낸다. ¹⁾Coated : 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치, Uncoated : 필름 무코팅 마른 멸치. (막대의 다른 문자들은 P<0.05 이다.)
도 16은 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치의 Angiotensin-I converting enzyme (ACE) 저해 활성 (IC₅₀) 을 나타낸다. ¹⁾Coated : 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치, Uncoated : 필름 무코팅 마른 멸치.
도 17은 저장 기간 동안의 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치의 갈변 지수의 변화를 나타낸다. ¹⁾Coated : 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치, Uncoated : 필름 무코팅 마른 멸치.(막대의 다른 문자들은 P<0.05인 것임)

본 발명에서는 우럭껍질을 산업소재와 같이 보다 효율적으로 이용할 목적으로 우럭껍질로부터 추출한 젤라틴을 이용한 식품 보존용 조성물 및 상기 조성물의 제조방법을 제공함에 그 특징이 있다.

먼저 본 발명자들은 식품을 안정적으로 오랜기간 보존 및 저장할 수 있는 식품 보존용 조성물을 위해 어류껍질로부터 젤라틴을 고수율로 수득하였다. 이를 위해 본 발명에서는 반응표면분석법 (RSM)을 이용하여 고온가압 하에서 우럭껍질로부터 젤라틴을 추출하였고, 최적의 추출을 위한 최적조건을 규명하였다(표 1 및 표 2 참조). 특히 최적조건을 위한 독립변수로는 알칼리 농도(CaOH_2,M), 추출시간 및 추출온도(℃)일 수 있고, 종속변수로는 수율(%)과 젤라틴의 순도(%)일 수 있다.

본 발명에서 RSM에 의한 우럭껍질로부터 젤라틴의 최적 추출조건은 알칼리 농도의 경우 0.5~1.5M, 바람직하게는 1.0~1.3 M일 수 있고, 추출온도 및 시간은 100~110℃ 및 65~75분 일 수 있으며, 바람직하게는 105~107℃ 및 67~70분일 수 있다(표 3 참조).

상기와 같이 규명된 최적화 조건하에서 제조되어진 젤라틴의 수율 및 순도는 예측치의 경우, 각각 19.1% 및 87.8%이었고, 실측치가 각각 18.9% 및 87.5%으로 예측치와 실측치 간에 유의적인 차이가 없었다(표 4 참조).

따라서 이와 같은 본 발명의 추출방법은 전통적인 방식(즉, 알칼리 농도 1.11M, 추출온도 60℃, 추출시간 120분)에 비해 젤라틴의 수율이 약 54%나 개선되었으며, 투과도는 차이가 없었다(표 5 참조). 그러므로 이와 같은 결과를 통해 본 발명에 따른 고온가압 추출법은 물리적 특성을 요하지 않는 건강 기능성 개선 소재로 이용하고자 하는 경우 아주 적절한 방법임을 알 수 있었다.

한편, 본 발명에 따른 식품 보존용 조성물의 경우, 상기 조성물의 유효성분인 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴 가공물에서 상기 가공물은 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴의 효소 분해물 또는 상기 효소 분해물을 막으로 걸러낸 분획물일 수 있다.

상기 효소 분해물은 우럭껍질 젤라틴의 기능성 개선을 목적으로 고온가압하에서 추출된 젤라틴에 대하여 효소를 처리하여 반응시킨 효소 가수분해 산물일 수 있다. 상기 가수분해는 젤라틴가수분해효소(gelatinase)에 의해 이루어질 수 있으며, 일반적으로 젤라틴가수분해효소는 젤라틴을 세포막을 통과하여 생물체가 이용할 수 있는 폴리펩티드, 펩티드 및 아미노산과 같은 그것의 서브 화합물 형태로 가수분해시켜 주는 단백분해효소(proteolytic enzyme)를 말한다. 본 발명의 젤라틴가수분해효소에는 예를 들어, Alcalase, Flavourzyme, Neutrase 및 Protamex 와 같이 상용화된 효소나 비상용화된 효소가 사용될 수 있으며 그 종류에는 제한이 없다.

바람직하게는 Alcalase, Flavourzyme, Neutrase 및 Protamex 의 효소를 사용하여 2단 가수분해를 실시하여 수득한 효소 분해물 일 수 있다.

또한, 상기 젤라틴 가공물은 상기 기술된 효소 분해물, 즉 가수분해 산물을 막(membrane)을 장착한 한외여과 시스템으로 분획화하여 수득한 분획물일 수도 있다. 이때 상기 막은 종래 시중에서 판매하고 있는 여과용 막이라면 모두 사용가능하고 바람직하게는 2종 이상의 막을 사용하여 여과할 수 있다. 또한, 상기 막으로 여과하는 방법은 한외여과(ultrafiltration) 방법이 사용될 수 있다. 상기 '한외여과'는 반투과막에 대해 용액에 유체 정역학적 압력을 가하는 방식의 막 여과 방법을 말한다. 분산된 고체나 고분자량의 용질은 남아 있게 되지만, 물이나 저분자량의 용질은 막을 통과하게 된다. 상기 방법에 사용되는 막(membrane)은 실험 목적(분자량에 따른 크기 제한)에만 부합한다면 그 종류에는 제한이 없으며, 상용화된 거름 종이 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 막을 이용하여 분획물을 분리 및 수득하는 방법은 상기 효소 분해물, 즉 가수분해물을 10~15 kDa 및 5~8 kDa 막에 순차적으로 한외여과시킨 뒤 5~8 kDa 막을 통과하지 못한 상층액을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명자들은 상기 방법으로 수득한 우럭 껍질 유래의 젤라틴 가수분해물이 안전하게 장기간 식품을 보전할 수 있는지를 조사하기 위해, 상기 가수분해물의 항산화활성을 조사하였는데, 즉, 여러 가지 효소를 사용하여 수득한 가수분해물 중 알칼라제로 1시간 동안 처리하고 이어서 플라보자임으로 2시간 동안 연속적으로 가수분해한 가수분해물이 다른 효소 처리물에 비해 항산화 활성이 가장 높은 것으로 나타났다. 또한, 동시에 메트로옴 란시메터 (Metrohm Rancimat)로 측정하여 상대적인 항산화 활성 지표인 PF 값(가수분해물 또는 분획물 첨가 대두유의 유도기/물 첨가 대두유의 유도기)을 측정하였는데, 그 값은 3.72인 것으로 나타났다.

또한, 상기 가수분해물을 대상으로 4종류의 막(즉, molecular weight cut off; 1, 5, 10 및 30 kDa)을 장착한 한외여과 시스템을 사용하여 가수분해물을 분획한 분획물에 대해 항산화 활성을 조사하였는데, 그 결과, 5 kDa 막을 통과한 분획물에서 가장 높은 항산화 활성을 나타내었고, 이때 이 분획물의 PF 값은 5.13인 것으로 나타났다(도 5 및 6 참조).

이상의 결과를 통해 본 발명자들은 저비용이면서 항산화 활성이 우수한 젤라틴 가수분해물은 알칼라제 및 플라보자임으로 각각 1시간 및 2시간 동안 연속적으로 가수분해한 다음, 이를 10~15 kDa 막과 5~8 kDa 막을 연속적으로 적용하여 수득한 분획물(10~15 kDa 막을 통과한 다음 5~8kDa 막 미통과 상층액)임을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 우럽 껍질로부터 추출한 젤라틴 가공물을 포함하는 식품 보존용 조성물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 우럭 껍질로부터 젤라틴을 추출하는 단계; 및 상기 추출한 젤라틴을 효소 가수분해시키는 단계를 포함하는 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴을 이용한 식품 보존용 조성물의 제조방법을 제공할 수 있다. 이때 상기 젤라틴 추출 단계는 공지의 방법이나 그 변형을 이용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 고온가압 추출법으로 수행하였다.

나아가 본 발명은 상기 기술한 바와 같이 젤라틴을 효소 가수분해시키고 이를 다시 막을 이용하여 분획화한 막 분획물을 포함하는 식품 코팅용 필름을 제조하는 단계; 및 상기 필름으로 저장하고자 하는 식품을 코팅하는 단계를 포함하는 식품의 저장방법을 제공할 수 있다.

이때 본 발명의 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물의 첨가량은 대상 식품의 저장상 향상 효과 및 항산화 효과를 나타낼 수 있는 양이면 제한이 없으며, 해당 식품의 조성 및 저장 조건에 따라 결정될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 식품의 저장방법에서 식품 코팅용 필름의 제조는 당업계에 공지된 일반적인 식품 코팅용 필름의 제조방법과 동일하며, 단지 제조과정에서 본 발명에 따른 상기 막 분획물을 유효성분으로 포함하는 것에 차이점이 있다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 젤라틴의 효소 가수분해물을 막 분리하여 수득한 막 분획물을 포함하는 필름을 사용하여 멸치를 코팅처리 하였다. 이때 필름의 제조를 위한 가수분해물의 첨가비율(이하 첨가비율로 칭함)과 필름 처리 전 마른멸치의 예비 건조시간(이하 예비 건조시간이라 칭함)을 표면반응분석법으로 살펴 본 결과 첨가비율은 4.57%이었고, 예비건조 시간은 180.4분이었으며, 이들에 의한 예측 과산화물가는 19.4 meq/kg이었다.

또한, 마른 멸치의 수율 및 수분함량은 코팅 처리한 마른멸치가 각각 24.7% 및 24.8%인 것으로 나타난 반면, 코팅처리 되지 않은 마른멸치는 각각 24.2% 및 24.9%인 것으로 나타남에 따라 코팅 처리한 멸치가 코팅 처리하지 않은 대조군 멸치에 비해 높은 수율을 나타내었으나, 수분함량의 경우 유의적인 차이가 없었다(도 11 내지 17 참조).

또한, 마른멸치의 과산화물가, TBA가 및 친유성 갈변 지수(lipophilic browning index)를 각각 비교한 결과, 코팅 처리한 마른멸치의 경우 각각 16.8 meq/kg, 0.377 및 0.482인 것으로 나타난 반면, 코팅 처리하지 않은 대조군 멸치의 경우, 각각 47.9 meq/kg, 0.381 및 0.555인 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 우럭 껍질 유래의 젤라틴 가공물을 함유한 필름으로 식품을 코팅한 경우, 대조군에 비해 지질산화가 현저하게 억제되는 것을 알 수 있었다.

따라서 본 발명자들은 본 발명에 따른 상기 젤라틴 가공물이 항산화 활성이 우수하므로 이를 식품 보존을 위한 용도로 사용할 경우 식품의 가공 및 저장안정성을 개선 및 향상시킬 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 본 발명의 다른 일실시예를 통해 마른멸치의 저장 과정 중 본 발명에 따른 필름 코팅 처리의 유무에 따라 마른멸치의 품질안정성을 조사하였는데, 그 결과, 마른 멸치의 수분함량은 코팅 처리 유무에 관계없이 모두 감소하였고, 두 제품 간에 감소폭에 있어서도 차이가 없었다. 마른 멸치의 과산화물가, TBA가 및 (20:5n-3+22:6n-3)/16:0는 저장 6주째에 코팅 처리 마른멸치가 각각 20.4 meq/kg, 0.471 및 1.39로 코팅 무처리 마른멸치의 각각 58.2 meq/kg, 0.768 및 1.01에 비하여 과산화물가 및 TBA가의 경우 낮았고, (20:5n-3+22:6n-3)/16:0의 경우 높았다. 이와 같은 결과로 미루어 보아 마른멸치에 항산화성이 인정되는 우럭껍질 유래 가수분해 분획물을 주로 하는 필름으로 코팅 처리하는 경우 항산화성이 인정되어 고품질 유지 기간이 연장되는 것으로 나타났다(도 11 내지 도 17 참조).

이상의 결과로 미루어 보아 횟감 제조 중 부산물로 대량 양산되는 우럭껍질은 우수한 항산화물 소재로 사용할 수 있는 바, 대부분 버려지고 있는 우럭껍질을 유용한 용도로 사용할 수 있는 방안을 본 발명에서 제안하고 있다.

따라서 본 발명은 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴 가공물을 포함하는 식품 보존용 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 조성물은 식품을 제조하는 경우 식품 원료와 함께 첨가될 수 있는 조성물을 말하며 본 발명의 식품 보존용 조성물에는 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴 가공물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 미네랄, 합성 풍미제, 천연 풍미제, 착색제, 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜 등이 독립적으로 또는 조합하여 첨가될 수 있다.

상기 조성물을 첨가할 수 있는 식품은 바람직하게는 육가공식품 또는 수산가공식품을 포함한 식품류, 육류, 음료수, 초코렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알콜음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류일 수 있으며, 바람직하게는 멸치와 같이 저장 과정에서 변질 되기 쉬운 수산물에서 선택된 식품일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 멸치, 새우, 오징어, 뱅어, 명태 및 조개로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 멸치, 새우, 오징어, 뱅어, 명태 또는 조개는 코팅 처리 전 끓인 후, 찬 공기로 건조시키는 예비 건조 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

우럭 껍질 젤라틴의 추출

<1-1> 실험재료의 준비

대한민국 거제시 소재 수협 소속의 싱싱회 가공공장으로부터 횟감의 부산물인 우럭(Sebastes hubbsi)의 껍질을 입수하였다. 상기 껍질은 기계적으로 분리되어 있었고, 남아 있던 근육과 비늘은 수작업으로 제거되었다. 흐르는 수돗물로 잘 씻은 후, 상기 껍질을 폴리에틸렌 백(bag)에 담고, 사용할 때까지 -25℃에서 보관하였다. 본 실시예에서 사용된 다른 모든 시약들은 분석용 품위(analytical grade)를 가졌으며, 추가적인 정제(purification) 없이 사용되었다.

<1-2> 우럭껍질로부터 젤라틴의 추출

우럽껍질로부터 젤라틴을 추출하기 위해 먼저 우럭 껍질을 찬 수돗물로 10분간 씻고, 가용성 단백질 및 외부 물질들을 제거하기 위해 체로 걸렀다. 상기 세척 과정을 3번 더 반복한 다음, 비-콜라겐성 물질을 제거하고 효소들을 불활성화 시키기 위해 5℃에서 교반기(No 1, Lab Tech., Daejeon, South Korea)로 상기 세척된 우럭 껍질에 10 부피(v/w)의 알칼리 용액(0.33-1.67 M 수산화 칼슘)을 2시간 동안 처리한 후, 수산화칼슘을 제거하기 위해 찬 수돗물로 세척하였다. 세척 후, 상기 껍질을 1.0 M 아세트산으로 중화시키고 찬 수돗물로 다시 세척하였다. 젤라틴은 전처리된 껍질에 3 부피(v/w)의 증류수를 첨가한 후, 각각 높은 수율을 얻기 위해 오토클레이브(autoclave) (MAC-6100, EYELA, 일본, 도쿄)에서 83.2-117.0℃로 9.5-110.5분간, 최적 조건 하에서 산출된 젤라틴과 비교하기 위해 워터 배스(water bath) (BS-21, Jeio Tech. Daejeon, Korea)에서 60℃로 120분간 추출되었다. 탈색 및 탈취를 위해 추출된 양 젤라틴 용액 모두 활성탄 속에 둔 후, 20℃에서 15분간 5,300 × g 로 원심분리 하였다. 거름종이(Whatman No. 3)로 상층을 진공여과 시킨 후, 50℃에서 16시간 동안 건조시켰다.

<1-3> 실험설계

우럭 껍질로부터의 젤라틴 추출을 최적화하기 위해 central composite design (CCD)(J. Royal Stat. Soc. (Series B) 13, p:1-45)을 채택하였다. 실험 설계에서 CCD는 17개의 시료들(factorial points; 8, star points; 6 및 central points; 3)로 구성되며(표 2 참조), 젤라틴 가공은 알칼리 처리 및 열수(hot-water) 추출의 두 개의 중요한 과정을 거쳐 가공하는데, 즉, 외래 물질을 제거하고 효소를 불활성화 시키기 위한 알칼리(Ca(OH)₂)의 농도(M, X₁), 열수 추출에서의 온도(℃, X₂) 및 시간(min, X₃)들을 독립변수로 선택하였다. 상기 3개의 독립변수들의 범위 및 중심점(center point)의 값들은 예비 실험 결과들에 기초하였다(표 1). 젤라틴 함량(%, Y₁) 및 수득률(%, Y₂)을 종속변수로 선정하였다(표 2). 또한, 외래 물질을 제거하고 효소를 불활성화 시키기 위한 알칼리(Ca(OH)₂)의 농도(M, X₁), 열수 추출에서의 온도(℃, X₂) 및 시간(min, X₃)들을 독립변수로 선택하였다. 상기 3개의 독립변수들의 범위 및 중심점(center point)의 값들은 예비 실험 결과들에 기초하였다(표 1). 젤라틴 함량(%, Y₁) 및 수득률(%, Y₂)을 종속변수로 선정하였다(표 2). 예기치 못한 변이들이 관찰 결과에 영향을 미치는 것을 최소화하기 위해 실험 수행(experimental runs)은 임의적으로 이루어졌다.

우럭 껍질로부터의 젤라틴 추출에 대한 CCD에서 독립변수들의 실험 범위 및 수치

독립변수	Symbol	범위 및 수준
독립변수	Symbol	-1.682	-1	0	+1	+1.682
Ca(OH)₂농도 (M)	X₁	0.33	0.60	1.00	1.40	1.67
추출온도 (℃)	X₂	83.2	90.0	100.0	110.0	117.0
추출시간 (min)	X₃	9.5	30.0	60.0	90.0	110.5

우럭 껍질로부터의 젤라틴 추출에 대한 CCD 및 독립변수들에 대한 종속변수들의 반응

Run no.	Coded levels of variable			Response
Run no.	X ₁ Ca(OH) ₂ (M)	X ₂ Temp. (℃)	X ₃ Time (min)	Y ₁	Y ₂	Coefficients assessed by
1	-1	-1	-1	87.1	13.1	Fractional factorial design (8 points)
2	1	-1	-1	90.2	14.3
3	-1	1	-1	85.5	17.8
4	1	1	-1	87.1	18.4
5	-1	-1	1	85.6	13.7
6	1	-1	1	89.4	14.5
7	-1	1	1	82.2	18.6
8	1	1	1	87.5	19.6
9	-1.682	0	0	82.6	14.4	Star points (6 points)
10	1.682	0	0	88.6	17.0
11	0	-1.682	0	89.8	14.3
12	0	1.682	0	87.0	19.3
13	0	0	-1.682	89.0	15.8
14	0	0	1.682	87.0	17.9
15	0	0	0	88.1	17.8	Central points (3 points)
16	0	0	0	88.3	17.7
17	0	0	0	88.2	17.6
Y ₁ (젤라틴 함량, %), Y ₂ (젤라틴 수득률, %)

<1-4> 젤라틴 함량 및 수득률

젤라틴 함량은 12.82의 변환 지수(conversion factor)를 사용한 Sato 등에 의해 공지된 방법에 따라 하이드록시프롤린(hydroxyproline) 함량을 측정함으로써 예측하였는데, 하이드록시프롤린 함량은 ISO에 기재된 방법을 이용하여 측정하였는데, 즉, 건조된 젤라틴(10 mg)을 시험관에 넣고, 3 mL 의 6 N HCl 을 첨가하였다. 상기 시료 용액들을 드라이 배스(dry bath) (HF 21, Yamato Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 110℃에서 12시간 동안 가수분해하였다. 산 가수분해 후에, 상기 시료 용액들을 6 N NaOH로 중성화시키고, 마이크로필터(microfilter)로 여과한 후, 2 mL 의 acetate/citrate 완충액(pH 6.0)과 혼합하고, 25 mL 을 0.3 M NaCl 과 합하였다. 7% (w/v) 클로라민(chloramine) T (p-toluene sulfonchloramide의 sodium salt) 1 부피에 대해 acetate/citrate 완충액(pH 6.0) 4 부피의 비율로 혼합하여 산화 용액을 준비하였다. 분취량(aliquot)을 시험관에 옮긴 후, 이소프로판올(isopropanol) (300 uL) 및 산화 용액(oxidant solution) (600 uL)을 첨가하고, 실온에서 4분간 두었다. 4분 후에, Ehrlich`s 시약 용액(4 mL)을 각각의 시험관에 첨가하고, 혼합한 후, 워터 배스(BS-21, Jeio Tech. Daejeon, Korea)에서 60℃로 25분간 가열하였다. 용액의 흡광도는 분광광도계(UV-140-02, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)로 660 nm에서 측정하였다. 시료용액의 하이드록시프롤린 함량은 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich Co.) (St. Louis, Mo., USA)에서 구입한 분석용 등급(analytical grade)의 하이드록시프롤린을 사용한 표준으로부터 도출된 적정 곡선으로부터 계산되었다. 젤라틴의 수득률은 다음 식으로 계산하였다:

(생성(resultant) 젤라틴의 무게/ 젤라틴 생산에 사용되는 전-처리 우럭 껍질의 무게) x 100.

<1-5> 일반 조성 및 중금속

AOAC(Assn of Official Analytical Chemists)의 방법에 따라 105°C에서 오븐 건조로 수분 함량을 측정하였고, semi- micro Kjeldahl 절차로 총 단백질을 측정하였으며, 550°C 의 회화로에서 측정하였다. 또한, Bligh 및 Dyer 등에 의해 공지된 방법(J. Biochem. Physiol. 37: 911-917., 1959 참조)의 방법에 따라 총 지질을 메탄올-클로로포름 혼합물로 추출하였다. 수은 함량은 수은분석기 (SP-3A, Nippon Instrument Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 KFDA에서 제시한 금아말감법으로 측정하였다. 납, 카드뮴 및 크롬 등과 같은 중금속은 시료를 습식법으로 분해한 다음, ICP(ICP, Atomscan 25, Thermo Electron Co., Waltham, MA, USA)를 이용하여 분석하였다.

<1-6> 최적 반응을 위한 조건 및 예측 값들의 증명

세 개의 독립변수들인, Ca(OH)₂ 농도(1.00 M), 추출온도(100℃) 및 추출시간(60분)을 우럭 껍질로부터 젤라틴을 추출하는데 최적화시키기 위한 CCD의 중심 조건으로 채택하였다. 다중 반응들의 코드화(coded) 또는 비코드화된 값들의 최적 조건들을 표 3에 나타내었다.

종속변수들의 예측 값(젤라틴 함량 = 87.8% 및 젤라틴 수득률 = 19.1%)과 실제 값들을 비교하기 위하여 최적 조건(Ca(OH)₂ 농도 = 1.1 M, 추출온도 = 106.6℃, 추출시간 = 68.8 분) 하에서 증명 실험을 수행하였다(표 4). 최적 조건 하에서 준비된 젤라틴의 실제 값들은 젤라틴 함량이 87.5% 및 수득률이 18.9%였다. 실제 측정치와 예측한 값들 사이에 차이가 거의 나타나지 않았다. 상기 결과들은 예측된 RSM이 우럭 껍질로부터의 젤라틴 처리의 최적화에 채택되었다는 것을 보여준다.

최적화 조건 하에서의 실험 및 예측 결과

종속변수	예측 값	실험 값
Y ₁ (젤라틴 함량, %)	87.8	87.5
Y ₂ (수득률, %)	19.1	18.9

<1-7> 고온/고압의 최적 조건하에서 젤라틴 함량, 일반적 조성 및 수득률

최적 조건 하에서 준비된 G-HTHP 및 G-OC 사이의 젤라틴 함량, 일반적 조성(proximate composition), 및 수득률을 비교하였다(표 5).

고온/고압(G-HTHP) 및 일반적인 온도(G-OC)에서 추출된 우럭 껍질 젤라틴의 젤라틴 함량, 일반적 조성, 젤라틴 수득률 및 헌터 컬러 값

Components		Rockfish skin gelatin extracted at
Components		G-HTHP		G-OC
젤라틴 함량 (%)		87.5	±0.1	90.7	±0.3
일반적 조성(Proximate composition) (g/100g)	Moisture	9.1	±0.4	9.0	±0.1
	Protein	91.0	±0.4	90.9	±0.2
	Lipid	0.3	±0.1	0.0	±0.0
	Ash	0.4	±0.1	0.5	±0.1
젤라틴 수득률 (%)		18.9	±0.3	12.3	±0.2
헌터 컬러 값 (Hunter color value)	L	48.15	±0.91	60.04	±0.43
	a	2.33	±0.10	2.29	±0.08
	b	10.72	±0.16	15.20	±0.24
	E	49.81	±0.90	39.67	±0.48
G-HTHP : 106.6 에서 68.8분간 추출된 젤라틴 G-OC : 60 에서 120분간 추출된 젤라틴

G-HTHP의 수득률은 18.9%로서 G-OC의 수득률(12.3%)보다 54%가 높다. 고온에서 젤라틴을 추출하는 방법은 생성 젤라틴의 가격을 절감시킬 수 있으므로 상기 결과들은 젤라틴을 생산하는데 있어 많은 이점들을 시사한다. G-HTHP의 일반적 조성은 G-OC의 것과 유사하였다. Hayashi 등이 보고한 내용에 따르면 식용 젤라틴은 16% 미만의 수분 및 3% 미만의 조회분(crude ash)을 포함하여야 한다.

<실시예 2>

가수분해 및 한외여과 시스템에 의한 우럭 껍질 젤라틴의 항산화 활성 증가

<2-1> 실험재료

대한민국 거제시 소재 수협 소속의 싱싱회 가공공장으로부터 횟감의 부산물인 우럭(Sebastes hubbsi)의 껍질을 입수하였다. 상기 껍질은 기계적으로 분리되어 있었고, 남아 있던 근육과 비늘은 수작업으로 제거되었다. 흐르는 수돗물로 잘 씻은 후, 상기 껍질을 폴리에틸렌 백(bag)에 담고, 사용시까지 -25℃에서 보관하였다.

노보사(Novo Co.) (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)에서 알칼라제(Alcalase) (2.4 LFG, Bacillus licheniformis 유래, 최적 온도 55-70℃, 최적 pH 6.5-8.5), 플라보자임(Flavourzyme) (500 MG, Asperigillus oryzae 유래, 최적 온도 50℃, 최적 pH 7.0), 뉴트라아제(Neutrase) (0.8 L, Bacillus amyloliiensquefaciens 유래, 최적 온도 45-55℃, 최적 pH 6.0) 및 프로타멕스(Protamex) (1.5 MG, Bacillus sp.유래, 최적 온도 40℃, 최적 pH 6.0-7.0)를 구입하였다.

밀리포어사(Millipore Co.) (Bedford, MA, USA)에서 2차 우럭 껍질 젤라틴 효소분해물(SRSGH)의 분획(fractionation)을 위한 한외여과 막 시스템(The ultrafiltration (UF) membrane bioreactor system) (Minitan^TM) 및 그것의 막(membrane) (각각 1, 5, 10 및 30kDa)들을 구입하였다.

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide (DMPO), 2,2-azobis (2-amidino- propane) hydrochloride (AAPH) α-(4-pyridyl-1-oxide)-N-tert-butylnitrone (4-POBN)를 포함한 모든 라디칼 시험 화합물들은 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich Co.) (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

본 실시예에서 사용된 다른 모든 시약들은 분석용 등급(analytical grade)으로, 추가적인 정제(purification) 없이 사용되었다.

<2-2> 젤라틴 가수분해물 및 그 분획물의 준비

연속적인 2단계의 프로테아제(protease) 처리를 통해 우럭 껍질로부터 젤라틴 가수분해물(hydrolysate)을 준비하였다.

1차 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물(FRSGH)의 준비를 위해, 젤라틴을 증류수에 용해시킨 후, 알칼라제(Alcalase), 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라아제(Neutrase) 및 프로타멕스(Protamex)의 4개의 효소들 중 하나로 가수분해 시켰다. 단백질 대 효소의 비율은 100:2 (w/w) 였으며, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 및 6.0시간 동안 배치반응기(batch reactor)에서 최적온도(Alcalase, 60℃, Flavourzyme, 50℃; Neutrase, 50℃; Protamex 40℃)로 반응시킨 후, 사용한 프로테아제를 불활성화시키기 위해 98℃에서 10분간 가열하였다. 1차 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물(FRSGH)을 동결 건조시킨 후 분획(fractionation)에 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.

2차 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물(SRSGH)의 준비를 위해, 알칼라제로 2시간 동안 배양한 FRSGH를, 알칼라제를 제외한 나머지 세 개의 효소들(플라보자임, 뉴트라제 및 프로타멕스) 중의 하나로 가수분해시켰다. 단백질 대 효소의 비율은 100:2 (w/w) 였으며, 2시간 동안 각각의 최적 온도로 반응시킨 후, 불활성화를 위해 98℃로 10분간 가열하였다. 상기 SRSGH를 동결 건조시킨 후, 분획(fractionation)에 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.

상층액(SRSGH-Ⅰ, >30kDa 분획) 및 투과물들(SRSGH-Ⅱ, 30~10kDa 분획; SRSGH-Ⅲ, 10~5kDa 분획; SRSGH-Ⅳ, 5~1kDa 분획; SRSGH-Ⅴ, <1kDa 분획)을 얻기 위해, 상기 SRSGH 산물을 4 종류의 한외여과 막(ultrafiltration (UF) membrane) (molecular weight cut-offs ; 1, 5, 10 및 30kDa) 으로 분획하였다. SRSGH의 상기 분획물 (SRSGH-Ⅰ) 및 투과물들 (SRSGH-Ⅱ~Ⅴ) 을 진공동결 건조기 (FDU-540, EYELA , 일본)에서 5일간 동결 건조시켰다.

<2-3> 가수분해율

Hoyle와 Merritt에 의해 공지된 방법에 따라 가수분해율(hydrolysis degree)을 측정하였는데, 즉, 동일한 부피의 가수분해물을 50 mL 의 20% 삼염화아세트산 (trichloroacetic acid, TCA)과 혼합하고, 2,560 x g 로 15분간 원심분리 하였다. 그 상층액을 질소 분석에 사용하였고, 가수분해율은 다음의 식에 의해 계산하였다:

가수분해율 (%) = (10% TCA-가용성 질소/총질소)×100

<2-4> 항산화성

항산화 활성의 측정은 120 ℃에서 자동화된 메트로옴 란시메터(Model 743, Herisau, Switzerland)를 사용하여 FRSGH, SRSGH 및 SRSGH-Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ 및 Ⅴ 의 항산화 활성을 측정하였다. 각각의 측정에 앞서 유리기구들을 깨끗이 닦았다. 대두유 시료들은 반응 용기 내에서 직접적으로 무게를 쟀다. 가수분해물 또는 투과물들(0.5 g)을 2.5 g 대두유에 첨가하였다. 시료를 관통하는 공기이동률은 20 L/hr 에 맞췄다. 대두유의 산화 과정에서 방출된 휘발성 반응 산물들을 수거 용기에서 60 mL 의 증류수에 수집하였다. 종말점(end point)까지의 전도율(conductivity) 변화를 자동적으로 나타냈다. 동일한 실험 조건들에서 각각의 대두유로 (가수분해물이나 투과물이 없는) 대조실험을 수행하였다. 항산화 활성은 각각의 시료마다 중복하여 측정하였고, 유도기(induction period (IP, hr)) 를 기록하였다. 가수분해물이나 투과물들의 상대적인 항산화성을 다음과 같이 정의되는 protection factor (PF)로 표현하였다:

PF = (가수분해물 또는 투과물을 넣은 콩기름의 IP/증류수를 넣은 콩기름(대조군)의 IP)× 100

또한, DPPH 자유 라디칼 소거 활성의 측정을 위해 60 uL 펩티드 용액(또는 대조군으로서 에탄올 그 자체)을 에탄올 용액에서 60 uL의 DPPH(60 uM)에 첨가하고, 10초간 잘 섞은 후에 상기 용액을 100 uL quartz capillary tube에 옮기고, JES-FA ESR 분광광도계(JEOL Ltd., 일본, 도쿄)를 사용하여 DPPH 자유 라디칼에 대한 펩티드의 소거 활성을 측정하였다. 이후 2분 후에 ESR 분광광도계에서 스핀 첨가물(adduct)를 측정하였다. 실험 조건들은 다음과 같다: 자기장, 336.5 ± 5 mT; 전력, 5 mW; 변동주기(modulation frequency), 9.41 GHz; 진폭, 1 x 1000; sweep time. 30 초.

또한, ESR 분광광도계를 이용한 수산기(hydroxyl) 라디칼 소거 활성 측정은 Rosen 과 Rauckman에 의해 공지된 방법(Method Enzymol, 105, 198~209 참조)에 따라 수행하였다. 수산기 라디칼은 펜톤 (Fenton) 반응 (Fe²⁺ + H²O → OH + OH^-) 으로 발생시켰으며, 잘 알려져 있는 ^?OH 및 라디칼들의 발생인자를 신속하게 nitron spin trap DMPO와 반응시켰다. 반응 혼합물은 20 uL 시료, 20 uL 의 30 M DMPO, 20 uL FeSO₄?7H₂O 및 20 uL 의 10 mM H₂O₂를 포함한다. 결과산물인 DMPO-OH 첨가물(adducts)을 조사하고 2.5분 후에 ESR 스펙트럼을 기록하였다. 측정 조건은 다음과 같다: 중심장(central field) 3475G; 변동 폭(modulation width) 0.2 mT; 파장 100 mT; 마이크로웨이브 전력(microwave power) 1 mW; sweep width 10 mT 및 온도 298 K.

Riboflavin/EDTA 용액의 UV 조사로 과산화물(superoxide) 라디칼들을 발생시키고, 발생된 라디칼의 소거능을 조사하였다. 즉, 0.8 mM riboflavin, 1.6 mM EDTA, 800 mM DMPO 및 시료를 포함하는 반응 혼합물을 UV 램프로 365 nm 에서 1분간 조사(irradiation)하였다. 측정을 위해 상기 혼합물들을 ESR 분광광도계의 100 uL quartz capillary tube에 옮겼다. 실험 조건들은 다음과 같다: 자기장, 336.5 ± 5 mT; 전력, 10 mV; 변동 주기(modulation frequency), 9.41 GHz; 진폭, 1 x 1000; sweep time, 1 분.

또한, AAPH에 의해 알킬(Alkyl) 라디칼들을 발생시키고, 발생된 라디칼의 소거 활성을 조사하였는데, 20 uL 의 증류수, 20 uL 의 추출물(extract), 20 uL 의 40 mM AAPH 및 20 uL 의 40 mM 4-POBN 을 포함하는 반응 혼합물을 37℃ 에서 30분간 배양한 후, 상기 반응물들을 50 uL 유리 모세관에 옮기고 ESR 분광광도계에 맞추었다. 측정 조건들은 다음과 같다: 중심장 3475G; 변동 폭 0.2 mT; 진폭 500; 마이크로웨이브 전력 8 mW; sweep width 10 mT 및 온도 298 K.

<2-5> Angiotensin Ⅰ converting enzyme (ACE) 저해 활성

ACE의 저해 활성도를 측정하기 위해 토끼의 폐로부터 정제된 효소인 50 uL 의 ACE, 용액 (60 mU/mL) 및 100 uL 의 붕산 나트륨 완충액(sodium borate buffer) (pH 8.3)을 포함하는 15 uL 의 시료 용액을 37℃에서 5분간 전배양(pre-incubated)한 후, 125 uL 의 기질(pH 8.3에서 0.6 M NaCl을 포함하는 0.1 M 붕산 나트륨 완충액 내의 5 mM hippuryl-His-Leu)과 함께 37℃에서 30 분간 배양시켰다. 상기 반응은 20 uL 의 10% trifluoroacetic acid을 첨가함으로써 종료되었다. 히퓨릭산의 농도는 Zorbax 300SB C₆ column (4.6 mm x 150 mm)과 함께 HPLC (Hewlett Packed Co., HP 1100, USA) 를 사용하여 측정하였다. IC₅₀ 값은 ACE 저해 활성의 50%를 저해하는데 필요로 하는 저해인자의 농도로 정의되었다.

<2-6> 아미노산 조성 및 분자량 프로파일

아미노산 분석기(Biochrom. 30, Pharmacia. Biotech., Uppsala, Sweden)를 사용하여 항산화 펩티드를 포함하는 FRSGH, SRSGH 및 SRSGH-Ⅲ 의 아미노산 조성을 측정하였다. 상기 시료들을 진공/밀봉된 관에서 진한 염산으로 110℃ 에서 16시간 동안 가수분해 시켰다. 40℃의 진공 증발기에서 상기 산-시료들을 증발 건조시키고, 구연산나트륨 완충액(sodium citrate buffer) (pH 2.2) 으로 희석시킨 뒤, 아미노산 분석 시료로 사용하였다.

분자량 프로파일은, HTHP 하에서 추출된 20 마이크로리터의 젤라틴, 및 FRSGH, SRSGH 및 SRSGH-Ⅲ과 같은 그것의 가공물을 100 mM NaCl 을 포함한 pH 6.0의 50 mM 인산나트륨으로 적정한 Shodex protein KW-804 column (i.d . 8 mm x 300 mm, Showa Denko, Tokyo, Japan)에 주입하고, Shimadzu HPLC (LC-10AT vp, Shimadzu, 일본, 교토)를 이용하여 1 mL/min 의 이동율(flow rate)로 분석하였다. 215 nm 에서 Shimadzu UV-Vis detector (SPD-10AV vp, Shimadzu)로 단백질의 용리(elution) 프로파일을 모니터하였다. 사용된 표준 단백질들(Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)의 분자량들은 다음과 같다: aprotinin (6,500 Da), cytochrome c (12,400 Da) 및 carbonic anhydrase (29,000 Da), bovine serum albumin (66,000 Da) 및 alcohol dehydrogenase (150,000 Da).

<2-7> FRSGH의 항산화 활성 및 화학적 특성

FRSGH 의 가수분해율은 1.5 시간(프로타멕스 및 뉴트라제 시스템의 경우)에서 2.0 시간(알칼라제 및 플라보자임 시스템의 경우) 내에 증가하였으며, 이어서 모든 효소 시스템에서 추가적인 가수분해와 함께 약간의 감소를 보였다(도 1). 상기 가수분해율의 감소는 아마도 가수분해물에 의한 효소의 저해 또는 펩티드 형성과 같은 역반응에 의해 야기된 것으로 보인다. 2시간 동안 절단된 4 종류의 가수분해물들 중에서, 알칼라제-처리 가수분해물(AH)은 84.5%의 가장 높은 가수분해율을 보였고, 이어서 플라보자임-처리 가수분해물(FH) (73.0%), 프로타멕스-처리 가수분해물(PH) (68.7%) 및 뉴트라아제-처리 가수분해물(NH) (61.8%) 의 순이었다.

생물학적 활성이 있는 가수분해물들의 기능적 특성들은 처리 조건뿐만 아니라 분자 구조, 분자량에 큰 영향을 받는다. 효소 가수분해는 다른 생물활성들을 동정하기 위해 단백질들의 기능성을 변형시키기 위한 가장 중요한 도구가 되고 있으며, FRSGH의 항산화활성은 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 효소의 종류 및 가수분해 시간에 대해 독립적이었다.

네 종류의 상업적 효소들 중 하나로 1-6시간 동안 최적 pH에서 배양한 FRSGH의 항산화 활성

효소	가수분해 시간 (hr)
효소	1.0	1.5	2.0	3.0	6.0
대조군	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
Alcalase	2.00±0.05	1.12±0.09	1.15±0.07	0.99±0.05	0.92±0.10
Flavourzyme	1.78±0.05	1.28±0.06	1.47±0.10	1.28±0.08	1.13±0.10
Neutrase	1.27±0.06	0.94±0.09	0.99±0.09	0.91±0.09	0.97±0.10
Protamex	1.77±0.04	1.38±0.06	1.47±0.06	1.59±0.08	1.41±0.02
대조군은 항산화 활성 시험에 젤라틴 가수분해가 첨가되지 않은 것으로 정의된다. 20 mM ascorbic acid 및 우럭 껍질 젤라틴의 항산화 활성은 각각 1.99±0.03 및 0.86±0.07이었다.

동일한 효소로 분해된 FRSGHs 중에서, 1.0 시간 동안 분해된 FRSGH에서 가장 높은 항산화성이 관찰되었고, 이것은 AH에 대해 2.00, FH에 대해 1.78, NH에 대해 1.27 및 PH에 대해 1.77이었다. FRSGHs 중에서, 알칼라제로 1시간 동안 가수분해시킨 FRSGH가 2.00의 가장 높은 항산화 효과 뿐만 아니라 1.10 mg/mL의 IC₅₀ 값으로 우수한 angiotensin-Ⅰ converting enzyme (ACE) 저해 활성을 나타냈다. FRSGH 의 가수분해율 및 항산화 활성 결과에 따르면, 가수분해율 및 항산화 활성 사이의 상관관계는 발견되지 않았다. 이러한 결과들은 항산화 활성이 펩티드의 아미노산 서열에만 영향을 받기 때문일 것이다.

또한, 분자량 분포를 조사하기 위해 Sephadex G-50 상에서 젤 크로마토그래피를 이용하여 우럭 껍질 유래 G-HT/HP 및 그것의 알칼라제-처리 젤라틴 가수분해물(FRSGH)을 분리하였다(도 2). 젤라틴 및 그것의 가수분해물 사이의 분자량 분포 차이를 발견할 수 있었다. 12 분에서 21 분 사이에 수집된 분획물에서 G-HT/HP 의 흡광도를 검출하였고, 단일한 넓은 피크로 나타났다. 하지만, 19.5 분에서 25.5 분 사이에 수집된 분획물에서 검출된 FRSGH의 흡광도는 샤프한 단일 피크로 나타났다. G-HT/HP 및 FRSGH 의 분자량 프로파일 결과는 효소 가수분해에 따른 분자량의 뚜렷한 감소를 보여준다. 가수분해율에 의존적인 펩티드 사슬 길이는 관능 및 건강 기능성과 관련하여 중요한 의미를 갖는다(Gbogouri et al., 2004). Jeon 등(1999) 은 가수분해물의 분자량과 항산화 활성의 특이성 사이에 상관관계가 있다는 것을 보고한 바 있다. 따라서 보고된 상기 논문과 상기 분자량 프로파일에 관한 실험 결과에 따르면 알칼라제로 1시간 동안 배양한 가수분해물은 항산화 활성을 나타낼 것이다.

알칼라제를 1시간 동안 처리한 FRSGH의 (g/100 g 아미노산으로 나타낸) 아미노산 조성을 표 7에 나타내었다.

FRSGH의 아미노산(AA) 조성¹⁾

아미노산	g/100g AA	아미노산	g/100g AA
Aspartic acid	4.4	Methionine	1.5
Hydroxyproline	8.3	Isoleucine	0.7
Threonine	2.4	Leucine	1.8
Serine	5.3	Tyrosine	0.4
Glutamic acid	9.2	Phenylalanine	1.9
Proline	10.9	Hydroxylysine	0.9
Glycine	25.6	Lysine	4.4
Alanine	9.3	Histidine	0.9
Valine	1.8	Arginine	10.3
¹⁾FRSGH : 알칼라제로 60℃에서 1시간 동안 분해한 1차 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물

FRSGH의 아미노산 조성은 종래 알려져 있는 우럭 껍질 콜라겐의 조성과 거의 유사한 것으로 나타났으며, 이러한 결과들은 알칼라제가 높은 항산화 활성 및 ACE 저해 활성을 갖는 우럭 껍질 젤라틴 유래 가수분해물의 준비에 가장 효과적인 프로테아제(protease)라는 것을 알 수 있었다.

<2-8> SRSGH의 항산화 활성 및 화학적 특성

SRSGHs 의 2차 가수분해율은 모든 효소 시스템에서 증가하였으며(도 3), 추가적인 가수분해와 함께 약간의 감소 또는 변화가 있었다. 2차 가수분해율의 감소는 아마도 생성물에 의한 효소 저해나 역반응에 의해서 나타난 것일 수 있다. 또한, 2시간 동안 배양한 SRSGH 의 2차 가수분해율은 AFH (66.8%)에서 가장 높았고, 이어서 ANH (78.8%) 및 APH (77.6%) 순이었다.

SRSGH의 항산화 효과를 표 8에 나타냈다. Flavourzyme으로 2.0 시간, Neutrase으로 2.0 및 6.0 시간 및 Protamex 로 1.0, 1.5, 3.0 및 6.0 시간 동안 처리한 SRSGHs에서 항산화 활성이 증가하기는 하였으나, FRSGH를 3개의 단백분해효소(proteolytic enzymes) 중의 하나로 추가 분해한 후에 다른 SRSGHs는 약간 감소하거나 변화하였다. 이러한 결과들은 아마도 항산화 활성이 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향 받았기 때문일 것이다.

알칼라제 처리 젤라틴 가수분해물에 세 종류의 상업적 효소들 중 하나로 1-6시간 동안 추가로 배양한 SRSGH의 PF로 표시한 항산화 활성

효소	가수분해 시간 (hr)
효소	1.0	1.5	2.0	3.0	6.0
대조군 ¹⁾	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
Flavourzyme	2.01±0.03	1.92±0.05	3.72±0.10	1.96±0.05	1.89±0.05
Neutrase	1.42±0.05	1.59±0.08	2.18±0.05	2.08±0.05	2.12±0.05
Protamex	2.18±0.05	2.32±0.06	1.98±0.06	2.16±0.06	2.18±0.05
¹⁾ 대조군은 항산화 활성 시험에 젤라틴 가수분해가 첨가되지 않은 것으로 정의된다. ²⁾ 20 mM ascorbic acid 및 우럭 껍질 젤라틴의 항산화 활성은 각각 1.99±0.03 및 0.86±0.07이었다.

SRSGHs 중에서, 2시간 동안 플라보자임으로 가수분해한 SRSGH 는 3.72 의 가장 높은 항산화 활성 뿐 아니라 IC₅₀0.82 mg/mL 의 우수한 ACE 억제 활성을 나타냈다. 2시간 동안 플라보자임으로 가수분해한 SRSGH 의 항산화 활성은 천연 항산화제로 사용되는 20 mM L-아스코르빈산의 것(1.91) 보다 훨씬 높았다. 따라서, 이러한 결과들은 2시간 동안 플라보자임으로 가수분해한 SRSGH 가 일부 항산화 펩티드를 포함한다는 것을 보여준다. 결론적으로, 우럭 껍질 젤라틴의 알칼라제 및 플라보자임에 의한 연속적인 효소 가수분해는 가수분해 펩티드들의 항산화 활성을 증가시킨다는 것을 암시한다.

분자량 분포를 조사하기 위해 Sephadex G-50 상에서 젤 크로마토그래피를 이용하여 고온/고압(G-HT/HP) 하에서 추출된 우럭 껍질 젤라틴 및 그것의 관련 물질(FRSGH 및 SRSGH)들을 분리하였다(도 4). 젤라틴 및 그것의 가수분해물 사이의 분자량 분포 차이를 발견할 수 있었다. FRSGH 및 SRSGH 모두에서, 19.5 분에서 25.5 분 사이에 수집된 분획물에서 검출된 흡광도는, 크로마토그램 상에서 유사한 단일 피크로 나타났다. 이러한 결과들은 플라보자임에 의한 펩티드 역반응의 근거가 될 수 있다.

알칼라제로 1시간 및 플라보자임으로 2시간 동안 연속적으로 배양한 SRSGH의 (g/100 g 아미노산으로 나타낸) 아미노산 조성을 표 9에 나타내었다.

FRSGH 및 SRSGH의 아미노산 조성 (g/100g AA)

아미노산	우럭 껍질 젤라틴 가수분해물 ¹⁾
아미노산	FRSGH	SRSGH
Aspartic acid	4.4	4.3
Hydroxyproline	8.3	8.8
Threonine	2.4	2.5
Serine	5.3	5.2
Glutamic acid	9.2	9.1
Proline	10.9	10.8
Glycine	25.6	25.9
Alanine	9.3	9.1
Valine	1.8	2.1
Methionine	1.5	1.6
Isoleucine	0.7	0.8
Leucine	1.8	1.9
Tyrosine	0.4	0.4
Phenylalanine	1.9	2.0
Hydroxylysine	0.9	0.9
Lysine	4.4	4.5
Histidine	0.9	0.9
Arginine	10.3	9.2
Total	100.0	100.0
¹⁾FRSGH : 알칼라제로 60에서 1시간 동안 처리한 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물, SRSGH : 알칼라제로 1시간 및 플라보자임으로 2시간 동안 연속적으로 분해된 2차 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물.

SRSGH 의 아미노산 조성은 glycine (25.9%), proline (10.8%), alanine (9.1%) 및 glutamic acid (9.1%)가 풍부한 반면, cystine (검출되지 않음), methionine (1.6%), tyrosine (0.4%), hydroxylysine (0.9%) 및 histidine (0.9%)은 부족하였다. SRSGH 의 아미노산 조성은 FRSGH 뿐만 아니라 우럭 껍질 콜라겐의 것과 거의 동일했다.

<2-9> SRSGH-Ⅲ 의 항산화 활성 및 화학적 특성

한외여과 막을 통과한 SRSGH-Ⅲ 는 원래의 가수분해물과 비교하여 원하는 질량의 분획물을 얻을 수 있고 일부 기능들을 증가시키는 등 몇 가지 장점들을 보여주며, 이와 함께 크로마토그램 방법과 비교하여 분리 방법이 단순하고 생산 비용이 절감되는 효과가 있다.

높은 항산화 활성을 갖는 투과물들의 분획을 위해, 30-, 10-, 5- 및 1-kDa 의 분자량 cut-offs (MWCO) 를 가진 4 종류의 한외여과 막(ultrafiltration membrane)들을 사용하여 분자 크기에 따라 연속적으로 SRSGH을 투과하였다. 생성된 상층물(supernatant) 및 투과물은 다음과 같이 명명한다: SRSGH-Ⅰ, 30 kDa 막 불투과 상층물; SRSGH-Ⅱ, 30 kDa 막 투과 및 10 kDa 막 불투과 투과물; SRSGH-Ⅲ, 10 kDa 막 투과 및 5 kDa 막 불투과 투과물; SRSGH-Ⅳ, 5 kDa 막 투과 및 1 kDa 막 불투과 투과물; 및 SRSGH-Ⅴ, 1 kDa 막 투과물.

SRSGH-Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ 및 Ⅴ 의 (PF로 나타낸) 항산화 활성을 도 5에 나타냈다. SRSGH-Ⅲ 의 항산화 활성(5.13)이 가장 높았으며, SRSGH-Ⅳ (2.12) 가 그 다음이었다. SRSGH-Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅴ 의 항산화 활성은 1.25 에서 1.86 사이였다. 20 mM 아스코르빈산의 항산화 활성은 1.94로서, SRSGH-Ⅲ 및 Ⅳ 의 것보다 낮은 반면 SRSGH-Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅴ 의 것보다는 높았다.

IC₅₀ 값으로 표현된 ACE 저해 효과는 SRSGH-Ⅲ 가 0.82 mg/mL 로서, FRSGH의 것(1.10 mg/mL) 보다 높았으나, SRSGH의 것(0.82 mg/mL)과는 큰 차이가 없었다(도 6).

상기 결과들은 SRSGH 가 항산화 및 ACE 저해 활성과 같은 건강기능성을 증가시키기 위한 보조 물질로 사용될 수 있음을 시사한다.

전자 스핀 트래핑 기술(electron spin trapping technique)을 이용하여 SRSGH-Ⅲ 가 DPPH free, 하이드록시(hydroxy), 과산화물(superoxide) 및 알킬 라디칼들을 제거하는 능력을 측정하였다. ESR 신호 강도로 표시된 생성 크로마토그램 및 백분율로 표시한 그들의 라디칼 소거 활성(RSA)을 대조군의 ESR 신호 강도와 비교한 결과를 각각 도 7 및 도 8에 나타냈다. SRSGH-Ⅲ 의 처리는 DPPH 라디칼 생성에서 대조군에 비해 소거 활성(4 mg/mL에서 93.0±2.2%)이 증가하였고, 이것은 SRSGH의 것(45.8±1.0%)보다 높았고, 20 mM 아스코르빈산의 것(95.5±0.2%)과 유사했다. 동일 농도의 SRSGH-Ⅲ 존재 하에, 조사된 리보플라빈 시스템(irradiated riboflavin system)에서 발생한 과산화물 음이온-DMPO(superoxide anion-DMPO) 스핀 부가물(adduct)의 신호는 73.8±0.4%로 억제되었으며, 이것은 SRSGH의 것(67.8±1.5%)보다 높았으나, 20 mM 아스코르빈산의 것(77.4±0.4%)보다 낮았다.

하이드록실 라디칼을 생성시키기 위해 펜톤(Fenton) 반응을 사용하였고, DMPO-OH 부가물의 전형적인 1:2:2:1 ESR 신호 역시 동일한 농도의 SRSGH-Ⅲ과 함께 높은 비율(95.2±0.1%)로 억제되었고, 이것은 SRSGH의 것(94.7±4.8%)과 유사했으나, 20 mM 아스코르빈산의 것(93.0±0.3%) 보다 높았다. 이러한 결과들은 아마도 펩티드를 포함하는 대부분의 유기 분자들이 매우 활성적인 하이드록시 라디칼들에 의해 산화되기 쉽기 때문일 것이다. 추가로, 이러한 증가된 활성은 또한 61.0%의 더 높은 킬레이팅(chelating) 능력에 기인한 것이며, 이것은 펜톤 반응을 거쳐 하이드록시 라디칼의 발생을 지연시킨다. 알킬 라디칼은 4-POBN의 존재 하에서 AAPH로부터 생성되었다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, SRSGH-Ⅲ 의 처리는 4 mg/mL 농도에서 AAPH로부터 생성된 4-POBN 라디칼의 스핀 부가물의 강도를 대조군에 비해 상당히 감소(73.7±1.9% 저해 활성)시켰고, 이것은 SRSGH의 것(64.8±3.3%)보다 높지만, 20 mM 아스코르빈산의 것(83.4±1.5%)보다는 낮았다.

ESR 스펙트럼의 분석 결과를 비교하여, SRSGH-Ⅲ 가 네 종류의 라디칼 모두에서 투여량-의존적 소거 효과를 나타낸다는 것을 보여주었으나, 소거 효과의 정도는 달랐다. 네 종류의 라디칼 중에서, DPPH 및 하이드록시(hydroxyl) 라디칼들이 더 효과적으로 소거되었다.

펩티드 크기를 분석하기 위해 고온/고압 조건에서 추출한 우럭 껍질 젤라틴(G-HT/HP) 및 관련 물질들(FRSGH, SRSGH 및 SRSGH-Ⅲ)을 Sephadex G-50 상에서 젤 크로마토그래피로 분리하였다(도 9). 모든 우럭 껍질 젤라틴 및 그것의 가수분해물들은 넓은 단일 피크를 나타냈다. G-HT/HP 의 흡광도는 12 분에서 21 분 사이에 수집된 분획들에서 검출하였고, FRSGH 및 SRSGH는 19.5 분에서 25.5 분, SRSGH-Ⅲ 는 20.5 분에서 25.5 분이었다. 이러한 결과들은 효소 가수분해 또는 막 분획에 따른 분자량의 뚜렷한 감소를 보여준다.

SRSGH 및 SRSGH-Ⅲ 의 (g/100 g 아미노산으로 나타낸) 아미노산 조성을 표 10에 나타내었다.

SRSGH 및 SRSGH-Ⅲ의 아미노산(AA) 조성 (g/100g AA)

아미노산	SRSGH ¹⁾	SRSGH- ²⁾
Aspartic acid	4.3	4.6
Hydroxyproline	8.8	11.8
Threonine	2.5	-
Serine	5.2	5.3
Glutamic acid	9.1	9.4
Proline	10.8	11.7
Glycine	25.9	18.0
Alanine	9.1	9.4
Valine	2.1	2.1
Methionine	1.6	1.5
Isoleucine	0.8	0.8
Leucine	1.9	2.0
Tyrosine	0.4	0.5
Phenylalanine	2.0	2.2
Hydroxylysine	0.9	1.2
Lysine	4.5	5.6
Histidine	0.9	1.2
Arginine	9.2	12.8
Total	100.0	100.1
¹⁾SRSGH : 알칼라제로 1시간 및 플라보자임으로 2시간 동안 연속적으로 분해된 2차 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물. SRSGH-Ⅲ : 10 kDa 막을 통과하였으나 5 kDa 막을 통과하지 못한 투과물들.

SRSGH 및 SRSGH-Ⅲ 의 아미노산 조성은 hydroxyproline (각각 8.8% 및 11.8%), glycine (각각 25.9% 및 18.0%), proline (각각 10.8% 및 11.7%), alanine (각각 9.1% 및 9.4%), glutamic acid (각각 9.1% 및 9.4%) 및 arginine (각각 9.2% 및 12.8%)에서는 높았지만, threonine (각각 2.5% 및 미검출), cystine (모두 미검출), valine (모두 2.1%), methionine (각각 1.6% 및 1.5%), isoleucine (모두 0.8%), leucine (각각 1.9% 및 2.0%) 및 tyrosine (0.4% 및 0.5%), hydroxylysine (각각 0.9% 및 1.2%) 및 histidine (각각 0.9% 및 1.2%)에서는 낮았다. 아미노산 조성 결과에 따르면, 주요 아미노산 조성에서 SRSGH 및 SRSGH-Ⅲ 간의 차이가 발견되었다.

상기의 결과들을 종합해 보면, SRSGH-Ⅲ 은 상대적으로 높은 항산화 활성 및 철 이온 킬레이팅(ferrous ion-chelating) 효과를 나타내므로 기능성 식품 첨가물로서 사용될 수 있을 것이다.

<실시예 3>

우럭 껍질 젤라틴 가수분해물에 의한 멸치의 품질 향상

<3-1> 재료준비

고성 연해에서 그물로 잡은 멸치(Engraulis japonica) (몸 길이, 5.8-6.8 cm; 몸무게, 1.1-1.6 g)를 사용하였다.

노보사(Novo Co.) (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)에서 알칼라아제(Alcalase) (2.4 LFG, Bacillus licheniformis 유래, 최적 온도 55-70℃, 최적 pH 6.5-8.5) 및 플라보자임(Flavourzyme) (500 MG, Asperigillus oryzae 유래, 최적 온도 50℃, 최적 pH 7.0)을 구입하였다.

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide (DMPO), 2,2-azobis (2-amidino- propane) hydrochloride (AAPH) α-(4-pyridyl-1-oxide)-N-tert-butylnitrone (4-POBN)를 포함한 모든 라디칼 시험 화합물들은 시그마-알드리히사(Sigma-Aldrich Co.) (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

본 실시예에서 사용된 다른 모든 시약들은 분석용 등급(analytical grade)이었으며, 추가적인 정제(purification) 없이 사용되었다.

<3-2> UF 막을 이용한 고기능성 투과물의 분획

1차 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물(FRSGH)의 준비를 위해, 상기 실시예의 방법으로 추출 및 제조된 우럭 껍질 젤라틴을 증류수에 용해시킨 후, 단백질 대 효소의 비율을 100:2 (w/w)로 하여 알칼라제(Alcalase)로 60℃에서 1시간 동안 가수분해 시킨 후, 효소를 불활성화 시키기 위해 98℃에서 10분간 가열하였다. 2차 우럭 껍질 젤라틴 가수분해물(SRSGH)의 준비를 위해, 생성된 알칼라제 처리 가수분해물을 50℃에서 2.0 시간 동안 플라보자임으로 재가수분해시켰다. 단백질 대 효소의 비율은 100:2 (w/w) 였으며, 효소를 불활성화 시키기 위해 98℃에서 10분간 가열하였다. 마지막으로 생성된 SRSGH 을 각각 30, 10, 5 및 1 kDa 의 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는 4종류의 한외여과 막에 연속적으로 투과시켰고, 이를 SRSGH-Ⅲ 라 하였다. SRSGH-Ⅲ 를 동결 건조시키고 냉동건조기에서 4-6 일간 보관하였다.

<3-3> 코팅된 마른(boiled-dried) 멸치의 준비

대한민국 고성의 한산수산에서 5% NaCl 용액에서 포획된 멸치를 즉시 끓인 후, 끓인 멸치를 연구실로 옮겼다. 상기 끓인 멸치를 SRSGH-Ⅲ 농도를 최적화하고 SRSGH-Ⅲ-based solution을 처리하기 위한 끓인 멸치의 전-건조(pre-drying) 시간을 최적화하기 위한 CCD에 의해 채택된 11개의 그룹으로 나누고, 송풍냉동법(cold-air blast)으로 13~15 시간 동안 건조시켰다. 생성된 자건(boiled-dried) 멸치들을 지퍼 필름 백(저밀도 폴리에틸렌, 25 x 30 cm, Cleanwrap Co., Korea)에 포장하고 저장 안정성 실험에 사용할 때까지 20℃에서 보관하였다.

<3-4> 코팅된 마른 멸치의 물리화학적 특성

(1) 일반적인 조성, 염분 및 산-불용성 재(ash)의 측정

AOAC(Association of Official Analytical Chemists, Washington DC., USA, p 69-74.참조)의 방법에 따라 일반성분 조성을 측정하였고, 염도는 염도계(salinity meter) (460CP, ISTEK, KOREA)를 사용하여 측정하였다. 산-불용성 회분(acid-insoluble ash)은 대한민국 KS규격(Korean Standard Association. 2004. Korean Standards-Dried anchovy. Korean Standard Association. H 6026.)에 따라 실시하였다.

(2) 수분활성도, pH, VBN (volatile basic nitrogen) 의 측정 및 지질 추출

수분활성도(water activity)는 Thermoconstanter (Novasina MS1, Novasina Co., Switzerland)를 사용하여 측정하였다.

pH 측정기(Metrohm 744, Metrohm, Swiss)를 사용하여 pH를 측정하였다. VBN 함량은 Conway의 미량확산법(micro-diffusion method)에 따라 측정하였다.

총지질은 Bligh 및 Dyer등에 의해 공지된 방법(J. Biochem. Physiol., 37, 911-917. 참조)에 따라 클로로포름/메탄올 혼합용액으로 추출하였다.

(3) 코팅된 마른 멸치의 물리화학적 특성

코팅 및 코팅되지 않은 마른 멸치의 일반적인 조성, 산-불용성 회분 및 염도를 비교하여 표 11에 나타내었다.

식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅된 마른 멸치의 화학적 특성

Components		마른 멸치
Components		무코팅		코팅
Proximate composition (g/100 g)	Moisture	24.9	±1.4	24.8	±1.1
	Protein	52.9	±0.3	54.5	±0.0
	Lipid	6.6	±0.4	6.0	±0.3
	Ash	14.7	±0.4	14.4	±0.4
Water activity		0.638	±0.002	0.625	±0.004
Volatile basic nitrogen (mg/100g)		17.5	±0.4	13.2	±0.4
Acid-insoluble ash		0.2	±0.1	0.2	±0.0
Salinity (%)		5.7	±0.4	5.9	±0.2
¹⁾ Coated : 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치, Uncoated : 필름 무코팅 마른 멸치

코팅된 마른 멸치의 단백질 함량은 무코팅 멸치의 것보다 높았으나, 지질 함량은 낮았다. 이러한 결과는 SRSGH-Ⅲ 가 젤라틴 펩타이드로 구성되었기 때문일 것이다. 산-불용성 회분에서는 두 멸치 모두에서 차이가 없었다. 이 결과는 아마도 본 실시예에서 끓인 멸치가 냉풍건조법(cold-air blast)으로 건조되었기 때문일 것이다. 코팅된 마른 멸치의 염도는 5.7%로서, 무코팅 마른 멸치의 것(5.9%)보다 약간 낮았다. 한국 KS규격은 마른 멸치의 우수 등급(special grade)은 28.0% 미만의 수분 함량, 8.0% 미만의 염분 및 1.0% 미만의 산-불용성 재를 포함하여야 한다고 규정한다. 상기 결과 및 한국 KS규격에 따르며, 본 실험에서 사용한 코팅 및 무코팅된 마른 멸치는 모두 우수 등급으로 분류된다. 코팅된 마른 멸치의 휘발성염기질소 (VBN) 함량은 13.2 mg/100g 로서, 무코팅 멸치의 것(17.5 mg/100g) 보다 낮았다.

코팅된 마른 멸치의 수득률 및 과산화물 값은 각각 24.7% 및 20.2 meq/kg 였으며, 무코팅 마른 멸치의 경우 각각 24.2% 및 58.3% 였다(도 10). 상기 결과는 마른 멸치를 생산하기 위한 SRSGH-Ⅲ-based 용액에 의한 필름 코팅 처리가 마른 멸치의 수득률 및 항산화 활성을 증가시키는 큰 장점을 갖는다는 것을 보여준다. Kim 및 Heu (2002) 는 상품화된 마른 멸치의 품질 비교 연구를 수행하였으며, 상품화된 마른 멸치의 VBN 함량은 28 mg/100g 부터 37 mg/100g 라고 보고하였다.

코팅된 마른 멸치의 수용성 및 지용성 갈변도는 각각 0.05 및 0.48 이었으며, 이것은 무코팅 마른 멸치의 것(각각 0.06 및 0.56)보다 낮았다(도 11).

과산화물가 및 갈변도의 결과들은 마른 멸치를 SRSGH-Ⅲ-based 용액으로 코팅하면 가공, 유통 및 저장 기간 동안 마른 멸치의 산화를 지연시킬 수 있다는 점을 보여준다.

실온에서 보관하는 동안의 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅된 마른 멸치의 수분 변화를 도 12에 나타냈다. 처음 2주간 코팅된 마른 멸치의 수분 함량은 24.9%에서 20.8%로 감소했고, 그 후 5% 유의성에서 별다른 차이가 없었다. 무코팅 멸치의 수분 함량은 코팅된 것과 유사하였다.

실온에서 보관하는 동안의 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅된 마른 멸치의 VBN 함량 변화를 도 13에 나타냈다. 건조 후 즉시, 코팅된 마른 멸치의 VBN 함량은 13.2 mg/100g 에 달하였으며, 이것은 무코팅 멸치의 것(17.5 mg/100g) 보다 낮았다. 저장 중 무코팅 마른 멸치의 VBN 함량은 17.5 mg/100g 으로부터 35.2 mg/100g 까지 지속적으로 증가하였으나, 코팅된 마른 멸치의 것은 1주째 13.2 mg/100g 부터 16.7 mg/100g 까지 약간 증가하였으며 그 후 거의 변화가 없었다. 저장기간 동안의 마른 멸치의 이러한 VBN 수준의 증가는 아민 및 인지질의 산화에서 기인될 수 있다. 상기 결과들은 마른 멸치에 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅을 하는 것은 휘발성 염기 질소(volatile basic nitrogen)의 형성을 막는데 효과적임을 보여준다.

<3-5> Peroxide value (POV) 및 thiobarbituric acid (TBA) 값

AOCS official method Cd 8-53에 따라 POV 값을 측정하였다. 1 그램의 추출 지질을 250mL 의 삼각플라스크에 넣고, 아세트산 대 클로로포름의 비율이 3:2 (v/v) 인 혼합 용액 25 mL 을 첨가하였다. 상기 시료 용액을 혼합하고, 1 mL 의 포화 요오드화칼륨을 삼각플라스크에 첨가하였다. 상기 용액을 이따금씩 흔들어 주면서 암소에서 5분간 둔 후, 75 mL 의 증류수를 첨가하고 혼합한 다음, 0.5 mL 의 1% 녹말 용액을 삼각플라스크에 넣었다. 파랑/보라색이 사라질 때까지 상기 혼합 용액을 0.05 N 티오황산나트륨(sodium thiosulfate)으로 적정하였다. POV는 milliequivalent (meq) peroxide/kg oil 로 나타내었다.

식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름 코팅이 자숙 멸치의 1차 산화 산물을 의미하는 POV 변화에 미치는 효과를 도 14에 나타냈다. 건조 직후의 무코팅 마른 멸치의 POV는 47.9 meq/kg 이었으며, 이것은 생 멸치의 것(11.5 meq/kg)보다 4.2 배 높았다. 이러한 결과는 생 멸치의 가열 및 건조 과정이 지질 산화에 큰 영향을 미친다는 것을 의미한다. 그것은 아마도 주로 지질 산화의 초기 단계에서 발생하는 과산화물의 생성 때문일 것이다. 하지만, 코팅된 마른 멸치의 POV 는 건조 직후 16.8 meq/kg 로서, 생 멸치의 것보다 1.5 배 높았다. 이러한 결과는 상기 코팅된 멸치가 마른 멸치의 총 지질의 지질 산화를 막는데 효과적임을 나타낸다. 저장 기간 동안의 무코팅 마른 멸치의 POV 는 2주까지는 변화가 없었고, 그 후 4주까지 증가하였으나, 그 후 감소하였다. 저장 기간 동안의 마른 멸치의 POV 감소는 과산화물의 생성 보다 분해에 기인한 것으로 보인다. 저장기간 동안, 코팅된 마른 멸치의 POV 는 유사한 패턴을 보였으나, 증가 및 감소 수준은 코팅되지 않은 것보다 매우 낮았다.

또한, TBA 값의 분석을 위해 2 그램의 시료를 균질화하고 둥근 플라스크에 97.5 mL 의 증류수, 2.5 mL 의 4 N HCl, 및 3 방울의 실리콘 오일과 함께 넣고 상기 플라스크를 증류 기구에 연결하였다. 가열을 개시한 시점부터 10분 내에 50 mL 의 증류액을 모을 때까지 상기 연결된 플라스크를 electric mantle로 가열하였다. 정확히 5 mL 의 증류액을 stoppered tube 내 5 mL 의 TBA 용액에 첨가하고, 핑크색 발색을 위해 워터 배스에서 35분간 가열(95℃)하였다. 상기 튜브를 냉각수에서 10분간 냉각시키고 분광광도계(UV-2550, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 532 nm 에서 흡광도를 측정하였다. TBA 값은 532 nm에서 측정된 흡광도로 정의하였다.

마른 멸치의 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름 코팅이 말론알데히드(malonaldehyde)와 같은 2차 산화 산물을 의미하는 TBA 변화에 미치는 효과를 도 15에 나타냈다. 건조 직후에 코팅된 마른 멸치의 TBA 값은 0.377로서, 코팅되지 않은 것(0.381)과 유사했으나, 무코팅 및 코팅된 마른 멸치의 TBA 값은 저장 기간의 경과와 함께 각각 0.381 및 0.377 로부터 각각 0.768 및 0.471로 증가하였다. TBA 값의 증가율은 코팅된 마른 멸치보다 무코팅 마른 멸치에서 더 높았다. 이러한 결과들은 코팅 및 무코팅 마른 멸치의 총 지질로부터의 말론알데히드(malonaldehydes)가 전체 저장 기간 동안 연속적으로 생성됨을 의미하며, 생성 정도는 코팅되지 않은 것보다 코팅된 마른 멸치에서 더 낮았다.

<3-6> 지방산 조성

메틸화시킨 후에(AOCS, 1990), 캐피러리 칼럼 (30 m x 0.32 mm I.d., Supelco, Inc., Belletonte, PA, USA)을 장착한 GLC (Shimadzu GC 14A, Shimadzu Seisakusho, Co. Ltd., Kyoto, Japan)를 이용하여, 추출된 지질의 지방산 조성을 분석하였다. 주입기(injector) 및 프레임-이온화 검출기(frame-ionization detector)를 250℃에서 유지하였고 컬럼을 3℃/min에서 180℃ (초기시간 8분) 에서 230℃ 까지로 프로그램화하고, 최종 시간 세트를 15분으로 하였다. 1.0 kg/cm² 의 일정한 유입(inlet) 압력에서 운반가스로 헬륨을 사용하였고, 스플릿(split) 비율은 1:50 이었다. 지방산 동정은 내부 표준물질 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)와 비교하여 실시하였다. 데이터는 지방산의 전체 면적에 대한 피크 면적의 백분율로 계산하였다.

저장 기간 동안 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치의 총 지질의 지방산 조성 변화를 표 12에 나타냈다.

실온 저장 기간 동안의 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치의 지방산 변화를 나타낸다. (Area %)

지방산	저장 기간 (week)
	0		1		2		4		6
	NC	C	NC	C	NC	C	NC	C	NC	C
14:0	5.7	3.3	5.5	4.4	6.2	4.6	7.3	4.8	7.6	5.0
15:0	0.6	0.6	0.6	0.8	0.6	0.5	0.8	0.6	0.8	0.5
16:0	21.0	19.6	22.2	20.0	23.9	20.4	25.0	21.4	25.8	22.0
17:0	0.9	0.7	0.9	0.8	1.1	0.6	0.6	0.7	0.8	0.4
18:0	6.8	6.0	6.7	6.1	7.6	6.7	7.7	6.2	7.4	6.3
20:0	0.6	0.7	0.5	0.7	0.6	0.5	0.5	0.6	0.4	0.6
Saturates	35.6	30.9	36.4	32.8	40.0	33.3	41.9	34.3	42.8	34.8
16:1n-7	8.0	7.5	9.1	7.7	10.4	8.0	10.4	8.6	10.6	9.2
18:1n-9	5.4	5.5	5.6	5.4	5.5	5.6	5.8	6.0	6.2	6.1
18:1n-7	3.8	3.5	3.9	3.7	3.7	3.6	3.3	3.5	3.9	3.8
20:1n-9	0.2	0.2	0.1	0.6	0.6	0.1	0.4	0.2	0.1	0.2
20:1n-7	0.4	0.4	0.2	0.3	0.2	0.2	0.3	0.4	0.4	0.2
22:1n-9	0.1	0.1	0.2	0.1	0.1	0.2	0.2	0.2	0.1	0.1
22:1n-7	0.2	0.3	0.2	0.4	0.2	0.2	0.2	0.4	0.1	0.2
Monoenes	18.1	17.5	19.3	18.2	20.7	17.9	20.6	19.3	21.4	19.8
16:2n-4	0.7	1.3	0.6	0.9	0.5	0.8	0.3	0.5	0.6	1.1
16:3n-4	1.0	0.9	0.6	1.0	0.8	0.7	0.7	0.9	0.6	1.5
16:3n-1	0.7	0.9	0.6	1.0	0.5	0.1	0.2	0.1	0.9	0.5
16:4n-1	0.5	0.5	0.5	0.4	0.7	0.8	0.4	0.6	0.7	1.0
18:2n-6	0.7	0.6	0.6	0.6	0.5	0.4	0.6	0.6	0.7	0.6
18:2n-4	0.2	0.2	0.3	0.3	0.3	0.3	0.2	0.2	0.2	0.3
18:3n-4	0.2	0.4	0.4	0.5	0.1	0.7	0.2	0.4	0.2	0.2
18:3n-3	0.5	0.4	0.6	0.5	0.3	0.5	0.3	0.7	0.3	0.6
18:4n-3	0.6	0.5	1.1	1.0	0.9	1.1	0.5	0.9	0.6	1.4
20:2n-6	0.1	0.1	0.1	0.2	0.1	0.2	0.1	0.5	0.1	0.1
20:3n-3	0.1	0.1	0.3	0.2	0.1	0.2	0.1	0.5	0.1	0.1
20:4n-6	3.7	3.6	3.3	3.4	3.0	3.2	2.9	3.5	2.4	2.7
20:4n-3	0.3	0.8	0.3	0.5	0.4	0.6	0.3	0.2	0.2	0.4
20:5n-3	14.7	17.1	13.9	15.1	12.5	14.3	12.9	13.6	12.8	13.5
21:5n-3	0.3	0.7	0.6	0.6	0.5	0.9	0.7	1.0	0.5	1.1
22:4n-6	0.3	1.3	0.4	1.1	0.3	1.3	0.4	1.1	0.3	1.0
22:5n-6	0.6	0.7	0.5	0.5	0.5	1.8	0.5	1.5	0.2	0.9
22-5n-3	1.6	1.2	1.8	1.2	1.5	1.2	1.3	1.6	1.1	1.3
22:6n-3	19.5	21.3	17.8	20.1	16.2	19.7	14.9	18.0	13.3	17.1
Polyenes	46.3	52.6	44.3	49.1	39.7	48.8	37.5	46.4	35.8	45.4
¹⁾ Coated : 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치, NC : 필름 무코팅 마른 멸치

시료 종류 및 저장 기간에 관계없이, 모든 시료들에서 32종의 지방산이 검출되었다. 대부분 시료들의 다중불포화(Polyunsaturated) 지방산들이 가장 높은 수준(44.3-52.6%)이었고, 다음으로 포화지방산(30.9-36.4%) 및 단일불포화(monounsaturated) 지방산들(17.5-19.8%)의 순이었다. 하지만, 2주 이상 저장된 일부 무코팅 시료들에서는, 포화 지방산들이 가장 높은 수준(40.0-42.8%)을 보였고, 다중불포화 지방산들(35.8-39.7%) 및 단일불포화 지방산들(20.6-21.4%)이 뒤를 따랐다. 저장 기간 동안, 모든 시료들에서 포화 및 단일불포화 지방산 조성들이 저장 기간의 연장과 함께 증가한 반면, 다중불포화 지방산 조성은 감소하였다. 포화 및 단일불포화 지방산 조성의 증가는 주로 저장 기간 동안의 16:0 및 16:1n-7 및 18:1n-9 의 증가에 기인한다. 반면에, 다중불포화 지방산의 감소는 EPA 및 DHA의 감소에 기인한다. 이러한 저장 기간 동안의 지방산 조성의 증가 및 감소율은 코팅 마른 멸치 보다 무코팅 멸치에서 더 현저하였다. 모든 시료들에서 주요한 지방산들은 16:0 (19.6-25.8%), 18:0 (6.0-7.7%), 16:1n-7 (7.5-10.6%), 20:5n-3 (12.5-17.1%) 및 22:6n-3 (13.3-21.3%)의 5종류였고, 이것은 다른 어류의 것과 유사한 패턴이었다.

<3-7> 건강 기능성

코팅 및 무코팅 마른(boiled-dried) 멸치의 라디칼 소거 활성 및 ACE 저해 활성과 같은 건강 기능성 특성들을 측정하기 위해, 시료들을 믹서기(MFC SI mill, Janke and Kunkel Ika-Wreck, Staufen, Germany)로 갈고 50-mesh 표준체 (50, Chung Gye Sang Gong Ltd, Korea)를 통해 이동시켰다. 20 g 의 마른 멸치를 200 mL 의 증류수에 혼합하고 95℃ 워터 배스(BS-21, Jeio-tech, Korea)에서 1시간 동안 끓인 후, Whatman No. 1 (Whatman Ltd., England) 거름 종이를 사용하여 진공에서 여과시켰다. 그 후, 상기 추출물을 진공증발기(N-1000, EYELA, Japan)를 사용하여 20 mL 까지 농축시켰다. 상기 농축물들은 라디칼 소거 활성 및 ACE 저해 활성의 전처리를 위한 시료로 이용되었다. 또한, ESR 분광광도계를 이용하여 DPPH, 하이드록시(hydroxy), 과산화물(superoxide) 및 알킬 라디칼 소거 활성을 측정하였으며, hippuryl-His-Leu에서 방출된 히퓨릭산(hippuric acid)의 농도를 측정함으로써 코팅 및 무코팅 멸치의 ACE 저해 활성을 평가하였다. 각각의 평가를 위해, 토끼의 폐로부터 정제된 50 uL 의 ACE, 용액 (60 mU/mL) 및 100 uL 의 붕산 나트륨 완충액(sodium borate buffer) (pH 8.3)를 포함하는 15 uL 의 시료 용액을 37℃에서 5분간 전배양(pre-incubated)한 후, 125 uL 의 기질(pH 8.3에서 0.6 M NaCl을 포함하는 0.1 M 붕산 나트륨 완충액 내의 5 mM hippuryl-His-Leu)과 함께 37℃에서 30 분간 배양시켰다. 상기 반응은 20 uL 의 10% trifluoroacetic acid을 첨가함으로써 종료되었다. 히퓨릭산의 농도는 Zorbax 300SB C₆ column (4.6 mm x 150 mm)과 함께 HPLC (Hewlett Packed Co., HP 1100, USA) 를 사용하여 측정하였다. IC₅₀ 값은 ACE 저해 활성의 50%를 저해하는데 필요로 하는 저해인자의 농도로 정의되었다.

식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치의 Angiotensin-I converting enzyme (ACE) 저해 활성을 IC₅₀으로 나타내었다(도 16). 상기 코팅된 마른 멸치의 ACE 억제 활성은 6.9 mg/g로서, 무코팅 멸치의 것(12.9 mg/g)보다 낮았다. 그것은 아마도 SRSGH-Ⅲ 이 더 강한 ACE 억제 활성을 갖기 때문일 것이다. 상기 결과는 마른 멸치가 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅됨으로써 개선될 수 있음을 보여준다.

<3-8> 갈변도(Browning Index)

지용성 갈변도를 측정하기 위하여, 클로로포름 대 메탄올이 2:1 (v/v)의 비율로 혼합된 50 mL 의 혼합 용액과 함께 10 g 의 시료를 비커에 첨가하고, 균질화한 후, 여과하였다. 클로로포름 층을 분리하기 위하여 상기 여과액을 실온에서 하루 동안 두었고, 지용성 갈변도는 430 nm에서 측정된 클로로포름 층의 흡광도로 정의하였다. 수용성 갈변도의 측정을 위해 클로로포름-메탄올 잔존물(residue)을 50 mL 의 증류수와 함께 비커에 두고 균질화한 후, 여과하였다. 수용성 갈변도는 430 nm에서 측정된 여과물(filtrate)의 흡광도로 정의하였다.

식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름 코팅이 1차 산화 산물을 의미하는 지용성 및 수용성 갈변도에 미치는 영향을 도 17에 나타냈다. 건조 직후, 코팅된 마른 멸치의 지용성 및 수용성 갈변도는 각각 0.482 및 0.045로서, 무코팅 멸치의 것들(각각 0.555 및 0.057)보다 낮았다. 무코팅 멸치의 지용성 및 수용성 갈변도는 저장 기간의 경과와 함께 각각 0.381 및 0.377에서 각각 0.768 및 0.471로 증가하였고, 지용성 및 수용성 갈변도 모두의 증가율은 무코팅 멸치보다 코팅 멸치에서 더 낮았다. 상기 결과들은 마른 멸치의 갈변이 아미노-카보닐 반응 보다는 지질 산화에 의해 야기된다는 것을 보여준다.

<3-9> 아미노산, 미네랄 및 인 조성

총 아미노산 조성은 시료를 진공/밀봉된 관에서 110℃ 로 24시간 동안 6 N HCl로 가수분해하여 제조하였다. 유리 아미노산은 시료를 80% 에탄올로 추출하고 5-sulfosalicylic acid 로 제단백하여 제조하였다. 이들 총아미노산 및 유리아미노산의 조성은 아미노산 분석기(Biochrom 30, Pharmacia Biotech., Sweden)로 측정하였다. 또한, 무기질과 인은 질산을 이용한 습식분해법으로 전처리한 다음 ICP로 분석하였다. 무기질 및 인의 분석을 위한 시료는 5그램의 시료를 800 mL Kjeldahl 플라스크에 넣고, 20 mL 의 농축 질산 및 10 mL 의 70% 과염소산(perchloric acid)을 첨가하였다. 그 후 상기 용액의 색이 없어지고 짙은 흰색 연기가 나타날 때까지 가열하였다. 무색 용액을 생성하는데 필요한 만큼 산의 첨가를 반복하였다. 분해(digestion) 용액을 탈이온수로 정용 (25 mL)하여 제조하였다. 무기질과 인의 분석은 유도 결합 플라즈마 분광광도계(ICP, Atomscan 25, Thermo Electron Co., Waltham, MA, USA)를 이용하여 실시하였다.

<3-10> 관능 평가

구조적 스케일링 검사(structured scaling test)를 이용하여 10 명의 교육을 거친 패널에 의해 코팅 및 무코팅 멸치의 관능 평가를 수행하였다. 외관, 향, 맛 및 색의 측면에서 전체적인 품질을 5단계 (5, excellent; 4, good; 3, fair; 2, poor; 1, unacceptable) 로 평가하였다.

코팅 및 무코팅 마른 멸치 사이의 관능 평가 결과를 표 13에 나타냈다.

식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치의 관능 평가 결과

마른(Boiled-dried) 멸치 ¹⁾	관능 평가 요소
마른(Boiled-dried) 멸치 ¹⁾	외관		향		맛		색
Uncoated	3.0	±0.0	3.0	±0.0	3.0	±0.0	3.0	±0.3
Coated	4.2	±0.4	3.6	±0.4	3.2	±0.3	3.9	±0.3
¹⁾ Coated : 식용 SRSGH-Ⅲ-based 필름으로 코팅한 마른 멸치, Uncoated : 필름 무코팅 마른 멸치

코팅된 마른 멸치의 외관, 향 및 색에 대한 평가에서 각각 4.2 점, 3.6 점 및 3.9 점으로, 무코팅 멸치의 것보다 높았다. 하지만, 맛에 관한 평가에서는 양자간 큰 차이가 없었다. 관능 평가 결과에 따르면, 코팅된 멸치의 품질이 무코팅 멸치의 것보다 우수하다는 것을 알 수 있다.

<3-11> 통계처리

ANOVA (analysis of variance) 테스트를 이용하여 통계적 분석을 수행하였다. 평균들 사이의 유의적 차이는 P<0.05 (Steel and Torrie, 1980)에서 Systat version 7.5K (SPSS, Inc. Richmond, Va., USA) 를 이용하여 수행하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

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우럭 껍질로부터 100-110℃의 추출온도에서 65-75분간 고온가압추출 방식으로 젤라틴을 추출하는 단계; 및
상기 추출한 젤라틴을 효소 가수분해하여 가수분해물을 제조하는 단계를 포함하는, 우럭 껍질로부터 추출한 젤라틴을 포함하는 식품 보존용 조성물의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 가수분해물을 2종 이상의 막(membrane)으로 걸러내어 막 분획물을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 보존용 조성물의 제조방법.
삭제
제4항에 있어서,
상기 효소 가수분해는 서로 다른 두 종류 이상의 효소들을 동시에 또는 연속적으로 반응시키는 것을 특징으로 하는 식품 보존용 조성물의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 효소는 알칼라제(Alcalase), 플라보루자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase) 및 프로타멕스(Protamex)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식품 보존용 조성물의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 막 분획물을 분리하는 단계는 상기 가수분해물을 10~15 kDa 및 5~8 kDa 막에 순차적으로 한외여과(ultrafiltration)시킨 뒤 5~8 kDa 막을 통과하지 못한 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 보존용 조성물의 제조방법.
제5항의 방법으로 수득한 막 분획물을 포함하는 식품 코팅용 필름을 제조하는 단계; 및 상기 필름으로 저장하고자 하는 식품을 코팅 처리하는 단계를 포함하는 식품의 저장방법.
제4항, 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 식품 보존용 조성물.