KR101209836B1

KR101209836B1 - 신경줄기세포의 분화를 예측할 수 있는 뉴로스피어 부착 시스템

Info

Publication number: KR101209836B1
Application number: KR1020100115538A
Authority: KR
Inventors: 최강열; 김미연
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2010-11-19
Filing date: 2010-11-19
Publication date: 2012-12-07
Also published as: KR20120088060A

Abstract

본 발명은 후보물질의 신경줄기세포의 분화 유도 여부를 예측하고, 이를 통해 신경줄기세포의 분화를 유도하는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면 뉴로스피어에 후보물질을 처리하고 뉴로스피어가 배양용기에 부착하는지를 확인함으로써 후보 물질이 신경줄기세포를 분화 유도할 수 있는지를 매우 간단하게 판단할 수 있으며, 이를 통해 신경줄기세포의 분화 유도 약물을 쉽게 선별해 낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 신경줄기세포를 이용한 세포치료제의 개발에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

신경줄기세포의 분화를 예측할 수 있는 뉴로스피어 부착 시스템{Attachment of neuroespheres for differentiation of neural stem cells}

본 발명은 후보물질의 신경줄기세포의 분화 유도 여부를 예측하고, 이를 통해 신경줄기세포의 분화를 유도하는 약물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

후보물질이 신경줄기세포에 미치는 영향을 조사하여 이를 약물 스크리닝에 활용하는 방법에 대해 연구되고 있다. 즉, 신경줄기세포에 후보물질을 처리하여 신경줄기세포의 생존, 분화, 증식, 세포의 형태 변화 등을 평가함으로써 상기 후보물질의 독성이나 약효를 예측할 수 있다.

이렇게 약물 스크리닝에 신경줄기세포를 활용하기 위해서는 먼저 신경줄기세포의 수를 확장하는 것이 필수적이다. 신경줄기세포의 수를 확장함에 있어서 뉴로스피어 형태로 배양하는 방법이 많이 사용되고 있다. 그러나, 후보물질이 신경줄기세포에 미치는 영향을 조사하기 위해서는 이러한 뉴로스피어를 해리시켜 단일 세포를 만든 후 여기에 후보물질을 처리하여 그에 따른 효과를 조사하는 방법이 일반적으로 수행되고 있다.

본 발명은 뉴로스피어의 해리 단계 없이도 후보물질의 신경줄기세포의 분화 유도를 쉽게 예측하고, 이를 통해 신경줄기세포의 분화 유도를 위한 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명자들은 다기능성 성장인자의 일원인 BMP4 단백질의 특성을 연구하는 과정에서, 뜻하지 않게도 BMP4를 뉴로스피어에 처리하면 미코팅된 배양용기에 뉴로스피어가 부착되며, 이렇게 부착된 뉴로스피어 내의 신경줄기세포들은 성상세포로 분화되어 있음을 확인하였다. 즉, 배양용기에 뉴로스피어가 부착한다는 것이 곧 뉴로스피어에 포함된 신경줄기세포들이 분화하였음을 의미한다는 사실에 대해 밝혔다.

따라서, 본 발명은 후보물질을 포함하는 배지 중에서 뉴로스피어를 배양하는 단계; 및 뉴로스피어가 배양용기에 부착하도록 하는 후보물질을 신경줄기세포의 분화 유도를 위한 약물로 선별하는 단계를 포함하는 신경줄기세포의 분화 유도를 위한 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.

기존에는 뉴로스피어의 배양 후 해리를 통해 단일세포로 만든 후 여기에 후보물질을 처리하여 이에 따른 분화 여부를 일일이 확인하는 방법을 사용하였다. 그러나, 본 발명에 따르면 후보물질의 처리에 따라 뉴로스피어가 배양용기에 부착하는지 여부를 확인하면 후보물질이 신경줄기세포의 분화에 미치는 영향을 쉽게 파악할 수 있게 된다. 이 경우 후보물질의 신경세포 분화 유도능을 손쉽게 판단할 수 있어, 후보물질이 신경줄기세포를 어떠한 세포로 분화유도하는지 확인하는 단계를 거쳐야 하는 후보물질의 수를 현저히 감소시킬 수 있으므로, 약물의 스크리닝을 고효율로 신속하게 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 약물의 스크리닝 방법은 후보물질의 처리에 따른 뉴로스피어의 부착성에 의해 신경줄기세포의 분화유도능을 예측하는데 특징이 있다. 따라서, 뉴로스피어의 배양 방법, 뉴로스피어에 후보물질을 처리하는 방법 등은 특별히 제한되지 않으며, 통상적으로 이용되고 있는 방법을 이용할 수 있다.

다만, 예를 들어 설명하자면 다음과 같다. 뉴로스피어의 형성을 위한 신경줄기세포는 동물의 뇌실하대로부터 분리한 조직으로부터 얻을 수 있다. 신경줄기세포를 예컨대, N2 배지 중에서 2일 내지 4일 동안 배양하면 뉴로스피어를 형성시킬 수 있다. 이렇게 얻어진 뉴로스피어를, 조사하고자 하는 후보물질을 포함하는 N2 배지 중에서 다시 1일 내지 4일 동안 배양한 후 후보물질에 의한 뉴로스피어의 부착성을 조사함으로써 후보물질의 신경줄기세포 분화 유도 여부를 예측할 수 있게 된다. 한 구체예에서, 뉴로스피어의 부착성을 조사하기 위한 과정에서 사용되는 배지는 후보물질을 포함하는 N2 배지일 수 있다. 또한, 상기 배지에서의 배양은 이에 제한되는 것은 아니나 1일 내지 4일 동안 수행될 수 있다. 또한, 이러한 배양에 사용되는 배양용기는 미코팅된 배양용기일 수 있다.

한편, 상기 신경줄기세포의 분화는 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte), 미세아교세포(microglia), 희소돌기아교세포(oligodendroglia), 뇌실막세포(ependymal cell), 슈반세포(Schwann's cell) 또는 신경절교세포(capsular cell)로의 분화일 수 있다. 앞서 설명한 방법은 신경줄기세포의 분화 유도를 위한 약물의 스크리닝을 위한 일차적인 선별 방법으로서 사용될 수 있다. 따라서, 신경줄기세포의 분화를 유도하는 약물로서 선별된 물질이 구체적으로 어떠한 세포로 분화유도 되었는지에 대해 확인하기 위해서는 이의 분석을 위한 추가적인 단계가 수행되어야 한다. 그러므로, 본 발명의 한 구체예에서, 상기 방법은 상기 배양된 뉴로스피어에 대해 면역세포화학염색 또는 형광이용세포분류를 수행하여 상기 선별된 약물이 신경줄기세포를 어떠한 신경계 세포로 분화유도 하는지 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법을 제공한다.

하기 실시예에서는, 면역세포화학염색을 통하여 뉴로스피어의 분화여부를 Tuj1(신경세포로의 분화 마커), GFAP(성상세포로의 분화 마커), 및 MBP(희소돌기아교세포로의 분화 마커)와 같은 분화 마커를 통하여 확인하였다. 또한 형광이용세포분류는 부유된 상태 및 약물 처리 이후 부착된 뉴로스피어를 각각 모아 PFA 로 고정한 뒤 0.1 % Triton X-100으로 permeabilization 시키고 GFAP 항체와 인큐베이션시킨 후 FACSCalibur라는 기계를 사용하여 세포를 하나씩 읽어 Cell quest라는 프로그램을 이용하여 GFAP항체의 발광여부를 분석하여 성상세포로의 분화여부를 확인하였다.

본 발명에 따르면 뉴로스피어에 후보물질을 처리하고 뉴로스피어가 배양용기에 부착하는지를 확인함으로써 후보 물질이 신경줄기세포를 분화 유도할 수 있는지를 매우 간단하게 판단할 수 있으며, 이를 통해 신경줄기세포의 분화 유도 약물을 쉽게 선별해 낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 신경줄기세포를 이용한 세포치료제의 개발에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 농도별, 시간별로 BMP4를 처리하였을 때 뉴로스피어의 부착성의 변화, BMP4의 길항제인 Noggin에 의해 뉴로스피어의 부착성의 변화를 보여준다.
도 2는 BMP4의 처리에 의해 부착성이 유도된 뉴로스피어 내의 신경줄기세포들이 성상세포로 분화되었음을 보여준다.
도 3은 BMP4의 처리에 의해 부착성이 유도된 뉴로스피어 내의 신경줄기세포들이 N-cadherin을 발현하고 있음을 보여준다.
도 4는 BMP4의 처리에 의해 부착성이 유도된 뉴로스피어 내의 신경줄기세포들이 이주능을 갖고 있음을 보여준다.
도 5는 미지의 후보물질들이 각기 다른 뉴로스피어의 부착성을 나타냄을 보여준다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[ 실시예 ]

[ 실시예 1] 후보물질에 의한 뉴로스피어의 부착성 확인

임신 14일 된 Sprague-Dawley (SD) rat (KOATECH, Gyeonggi do, Korea)의 배아의 뇌의 뇌실하대에서 신경줄기세포를 분리하였다. 신경줄기세포를 상기 조직으로부터 물리적으로 분리해 내고, 1×10⁵ cells/ml의 농도로 미코팅된 6-웰 플레이트 중에서 키웠다. 신경줄기세포는 N2 배지[100 uM 퓨트레신, 30 nM 셀레나이트, 20 nM 프로게스테론, 1.55 mg/ml D-(+)-글루코스, 25μg/ml 인슐린, 0.1μg/ml 아포-트랜스페린 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0.5 mM 글루타맥스, 100 IU/ml 페니실린, 및 10 ng/ml bFGF (Peprotech, Princeton, NJ, USA)와 20 ng/ml 인간 EGF가 보충된 100 μg/ml 스트렙토마이신 용액을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)/F12 (1:1) (Invitrogen,Carlsbad, CA, USA)] 중에서 배양되었다. 배양 3 내지 4일 후 뉴로스피어가 형성되었다. 트립신-EDTA (Invitrogen)를 이용하여 뉴로스피어를 상기 배양 용기로부터 효소적으로 분리하였다.

후보물질에 의한 뉴로스피어의 부착성 확인을 위해, 뉴로스피어를 Deleyrolle 과 Reynolds (Deleyrolle LP, Reynolds BA (2009) Identifying and enumerating neural stem cells: application to aging and cancer. Prog Brain Res 175:43 51.)가 사용한 방법을 이용하여 10 ng/ml의 bFGF와 20 ng/ml의 EGF를 포함하는 N2 media 에서 배양하였으며, 6 웰 플레이트에 웰 당 2 X 10⁵ cell로 분주한 뒤 2 일 후 후보물질로서 BMP4를 처리하고 2 일 동안 관찰하였다. 농도별, 시간별 BMP4를 처리한 결과, 도 1A에 나타낸 바와 같이, 뉴로스피어는 코팅되지 않은 플레이트임에도 불구하고 바닥에 부착되는 현상을 나타내었으며, 농도가 높을수록 더 빠른 시간에 이러한 현상을 관찰할 수 있었다. 기존 방법의 경우 신경줄기세포는 poly-L-ornithine 과 fibronectin에 의하여 코팅된 플레이트에만 잘 부착할 수 있는 것으로 알려져 있으며 코팅되지 않은 플레이트의 경우는 신경줄기세포 하나 하나가 부유된 상태로 존재하면서 뉴로스피어를 형성하여 성장하는 것으로 알려져 있다. 또한, 도 1B에 나타낸 바와 같이, 이러한 BMP4에 의한 뉴로스피어의 부착성은 BMP4의 길항제인 Noggin에 의하여 그 현상이 저해되는 것을 관찰하였으며, 이러한 현상을 토대로 BMP4가 뉴로스피어의 부착성을 유도하고 있음을 확인하였다.

[ 실시예 2] 부착된 뉴로스피어의 분화 여부 확인

뉴로스피어의 부착성이 뉴로스피어의 분화를 나타내는 것인지 확인하기 위해 부착성을 나타낸 뉴로스피어가 특정 세포로 분화 유도되었는지 확인하고자 하였다. 실시예 1에서 후보물질로 사용된 BMP4는 신경줄기세포에 있어 성상세포로의 분화를 유도하는 물질로 알려져 있다. 따라서, BMP4에 의해 부착된 뉴로스피어가 성상세포로의 분화 유도되었는지 확인하고자 하였다. 신경줄기세포의 분화 유도 여부를 확인하기 위해, 면역세포화학염색 방법과 형광이용세포분류 방법을 이용하였다.

먼저, 면역세포화학염색을 하기 위하여 24 웰 플레이트에 커버 슬립을 넣고 15 ug/ml의 폴리 -L-오르니틴과 10 ug/ml의 파이브로넥틴으로 코팅한 뒤 뉴로스피어를 넣고, BMP4를 1.0 ng/ml로 2 일간 처리한 후, 4 % 파라포름알데하이드(PFA)로 고정하였다. 0.2 % triton X-100으로 permeabilization 시키고 10 % 정상 염소 혈청으로 블로킹시킨 후 성상세포 마커인 GFAP 를 이용하여 분화가 유도되었는지 관찰하였다. 신경세포의 마커인 Tuj1이나 희소돌기아교세포의 마커인 MBP 항체에 의하여서는 염색이 되지 않았으나 성상세포의 마커인 GFAP 항체에 의하여서는 잘 염색이 되는 것으로 보아 BMP4가 뉴로스피어의 성상세포로의 분화를 촉진시킨 것을 알 수 있으며, 이는 Noggin에 의하여서 그 효과가 줄어드는 것을 관찰함으로써 다시 한 번 확인하였다. (도 2A, B)

조금 더 확실한 효과를 확인하기 위하여 뉴로스피어가 부유된 상태에서 BMP4를 처리하여 부착시키고 이 상태의 뉴로스피어를 형광이용세포분류 방법을 이용하여 확인하였다. 부유된 상태의 뉴로스피어와 BMP4에 의하여 부착이 유도된 세포들을 모아 4 % PFA 로 고정한 뒤 0.1 % Triton X-100으로 permeabilization 시키고 GFAP 항체와 인큐베이션시킨 후 분석하였다. 분석 결과 부유된 상태의 뉴로스피어의 경우보다 BMP4에 의하여 부착성이 유도된 경우 성상세포로의 분화가 눈에 띄게 증가함을 알 수 있었고 Noggin에 의해서도 역시 조절되는 것을 확인함으로써 BMP4에 의하여 가지게 된 뉴로스피어의 부착성은 성상세포로의 분화를 의미함을 확인할 수 있다. (도 2C)

[ 실시예 3] N- cadherin 의 유도를 통한 뉴로스피어의 부착성

뉴로스피어의 부착성이 분화를 나타내는 표지이라면 어떠한 신호전달기작을 이용하여 이러한 형태가 나타나는지 알아보기 위하여 세포부착과 연관된 물질인 N-cadherin의 단백질 및 RNA 의 변화를 관찰하였다. 단백질의 양적 변화를 관찰하기 위하여 부유된 뉴로스피어 및 BMP4에 의하여 부착된 세포들을 1500 rpm에서 2분간 원심분리하여 모은 후, 상층액을 버리고 RIPA 버퍼(25 mM Tris, pH 7.6; 150 mM NaCl; 1% NP-40; 1% sodium deoxycholate; 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS))로 라이시스하였다. 4 ℃, 12000 rpm에서 30 분간 원심분리하고 100 ℃ 에서 10 분간 가열하여 10~12 % SDS-폴리아크릴아마이드 겔을 걸었다. 단백질을 전기영동하여 나이트로셀룰로스 막으로 옮기고, 5 % 탈지분유로 1 시간 블로킹하였다. N-cadherin, p-Akt, β-actin 항체를 사용하여 수행하였으며, 단백질 밴드는 Enhaced ChemiLuminescence (ECL) 을 사용하여 시각화 하였다.

모아진 세포를 Trizol을 사용하여 라이시스 하였고, 2 ug 의 total RNA를 200 U의 역전사효소를 사용하여 42 ℃ 에서 한시간 반응하여 cDNA를 얻었다. 만들어진 cDNA는 10 mM dNTP, 10 pmol primers, 1 U Taq polymerase 를 사용하여 증폭하였으며, 사용된 프라이머는 다음 [표 1]과 같다:

	정방향	역방향
N-cadherin	5'-caagagcttgtcagaatcagg-3	5'-catttggatcatccgcatc-3
NCAM	5'-caaaaatgacgaagccgaat-3	5'-gtggacgttctccaggtgat-3
GFAP	5'-acctgcgaccttgagtcctt-3	5'-tacaggaatggtgatgcggt-3
Hprt	5'-cctgctggattacattaaagcgct-3	5'-gtcaagggcatatccaacaacaaa-3
Tuj1	5'-cagcaaagtgcgtgaggagt-3	5'-gcggaagcagatgtcgtaga-3

그 결과, BMP4 에 의하여 부착성이 증가된 세포는 N-cadherin 의 단백질과 RNA 의 양이 모두 증가하였으며, BMP4에 의하여 활성화 된 PI3 Kinase-Akt pathway는 PI3 Kinase 억제제인 LY294002에 의하여 그 활성화가 감소되었고, 더불어 N-cadherin의 단백질양과 RNA의 양이 모두 감소하였다. 또한, N-cadherin의 억제제로 Anti-N-cadherin 을 사용하였는데 이는 세포막에서 발현하는 N-cadherin의 세포 외부에 붙는 항체로써 N-cadherin이 부착성을 갖는데 방해하는 요소이다. 이 항-N-cadherin을 사용한 경우 BMP4에 의하여 얻어진 부착성이 억제되어 다시 부유된 뉴로스피어의 형태로 존재하는 것을 관찰하였다. 이를 바탕으로 BMP4에 의하여 증가된 뉴로스피어의 부착성은 N-cadherin을 통하고 있음을 알 수 있다. (도 3)

[ 실시예 4] BMP4 에 의해 분화된 세포의 이주 특성

BMP4에 의한 뉴로스피어의 부착성이 신경줄기세포의 성상세포로의 분화를 의미함과 동시에, 향후 줄기세포 치료에 있어 이주(migration)의 능력을 나타내는지 확인하기 위하여 상기 설명하였던 코팅된 커버 슬립에 뉴로스피어를 얹고 BMP4를 처리한 뒤, 실시간으로 관찰하였다. 뉴로스피어의 중심부로부터 세포의 이동을 측정한 결과 BMP4를 처리한 군이 같은 시간 내에 가장 먼 곳까지 이동하는 것이 관찰되었으며, Noggin 과 항-N-cadherin 을 같이 처리한 경우는 그 효과가 줄어드는 것을 관찰하였다. 즉, BMP4 는 뉴로스피어의 부착성을 증가시킬 뿐 아니라 이주도 촉진한다는 것을 알 수 있었다(도 4). 따라서, 후보물질이 뉴로스피어의 부착성을 증가시키는 경우 분화를 의미할 뿐만 아니라 이주능을 갖고 있음을 나타낼 수 있음을 확인하였다.

[ 실시예 5] 뉴로스피어 시스템을 이용한 약물 스크리닝

이상의 실험결과는 뉴로스피어의 부착성이 분화와 직접적 연결된다는 것을 의미하고 있으므로, 분화를 유도하는 약물의 스크리닝을 이러한 뉴로스피어의 부착성을 이용하여 수행해 볼 수 있다.

상기의 실험과 마찬가지로 신경줄기세포를 뉴로스피어 형성 방법으로 배양한 뒤 미분화가 유지되도록 10 ng/ml 의 bFGF와 20 ng/ml의 EGF를 처리한 상황에서 미지의 약물들(화합물 1 내지 17)을 각각 5 ?g/ml씩 2 일 동안 처리하였다. 무처리 대조군으로는 자연스런 분화를 유도할 수 있는 bGFG와 EGF 가 처리되지 않은 군, 양성 대조군으로는 신경세포로의 분화를 유도하는 것으로 알려져 있는 1 mM의 VPA (Valproic acid)를 처리한 군과 성상세포로의 분화를 유도하는 것으로 알려져 있는 1.0 ng/ml의 BMP4를 처리한 군을 사용하였고, 이들을 각각의 약물이 처리된 군과 비교하였다. 그 결과, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 화합물 2, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 16 및 17이 분화를 유도하는 약물로서 선별되었다.

이와 같이 뉴로스피어 시스템을 이용하면 분화유도를 위한 약물을 쉽게 스크리닝할 수 있다.

Claims

후보물질을 포함하는 배지 중에서 뉴로스피어를 배양하는 단계;
뉴로스피어가 배양용기에 부착하도록 하는 후보물질을 신경줄기세포의 분화 유도를 위한 약물로 선별하는 단계를 포함하는
신경줄기세포의 분화 유도를 위한 약물의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 배지는 후보물질을 포함하는 N2 배지인 방법.
제1항에 있어서,
상기 배양은 1일 내지 4일 동안 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 배양용기는 미코팅된 배양용기인 방법.
제1항에 있어서,
상기 신경줄기세포의 분화는 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte), 미세아교세포(microglia), 희소돌기아교세포(oligodendroglia), 뇌실막세포(ependymal cell), 슈반세포(Schwann's cell) 또는 신경절교세포(capsular cell)로의 분화인 방법.
제1항에 있어서,
상기 배양된 뉴로스피어에 대해 면역세포화학염색 또는 형광이용세포분류를 수행하여 상기 선별된 약물이 신경줄기세포를 어떠한 신경계 세포로 분화유도하는지 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.