KR101207706B1 - 대장균 유래 ｘｙｌＦ 프로모터 단편을 포함하는 자일로즈 유도성 발현벡터 및 이를 이용한 단백질 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장균에 존재하는 자일로즈 유도성(xylose-inducible) 프로모터를 포함하는 자일로즈 유도성 단백질 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 벡터를 도입시킨 형질전환체를 이용하면 원하는 단백질을 자일로즈 유무에 따라 선택적으로 발현시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 재조합벡터 또는 형질전환체는 자일로즈를 포함하는 바이오매스 자원의 효율적 이용 등에 응용될 수 있다.

Description

대장균 유래 ｘｙｌＦ 프로모터 단편을 포함하는 자일로즈 유도성 발현벡터 및 이를 이용한 단백질 생산방법{Xylose-inducible expression vector comprising a fragment of ｘｙｌＦ promoter of E. coli and method for producing proteins using them}

본 발명은 대장균에서 유래한 자일로즈 유도성 프로모터인 xylF 또는 xylA 프로모터의 특정 영역을 포함하는 재조합벡터 및 이를 이용하여 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

농산폐자원의 대부분을 차지하는 목질계 리그노셀룰로오스(lignocellulose)는 당질이나 전분을 대체하는 연료용 에탄올 생산용 원료로서의 가능성을 인정받아 최근 세계적인 주목을 받고 있다. 이렇게 바이오매스 자원을 이용한 연료 및 화학원료 생산기술은 주로 석유자원의 의존도를 낮추기 위한 대안으로 제시되어 왔으며 최근에는 재생가능한 자원인 바이오매스를 생물공학적 발효공정기술을 이용하여 바이오에너지로 생산하는 실용화 연구가 미국, 브라질 및 유럽 등지에서 매우 활발히 진행되고 있다. 특히 미국은 이러한 바이오매스 연구에 있어서 정부 주도의 상용화 기술개발과 보급을 추진하고 있으며 2008년 기준으로 연방 연구비로만 매년 5억 달러(4천 8백억원)를 투입하여 연료용 알코올 생산연구에 박차를 가하고 있다. 목질계 바이오매스를 이용한 바이오 에탄올 생산에 대한 연구는 비교적 오랜 역사를 가지고 있으며 목질계 바이오매스의 전처리 기술 및 당화 공정 개선, 바이오매스에서 유래한 당의 발효를 위한 균주개발, 저농도 에탄올의 효율적 증류기술 등에 대한 연구가 축척되어 있다.

그러나 현재는 목질계 바이오매스의 효과적 이용을 위하여 이미 과거에 오랜기간동안 조사, 연구된 내용의 반복보다는 보다 구체적이고 적극적인 기술혁신이 필요하고 이러한 기술혁신의 한 부분으로 재조합 미생물을 이용하여 당화공정과 발효공정을 동시에 수행하고자 하였다. 특히 발효를 위한 효모와 당화에 필요한 효소를 생산하는 재조합 대장균의 혼합 적용 등도 구체적으로 검토되고 있다. 이에 따라 대장균 등을 이용한 외래 단백질의 발현시스템이 검토되고 있으나 현재 대장균의 발현시스템은 대부분 진핵이나 고등생물의 단백질을 다루는 등 의?약학용에 초점이 맞추어져 있으며 시스템의 유지나 운영에 추가 유도물질과 유지물질을 투입해야 하는 등 고비용이 발생하고 있는 실정이다. 또한 이러한 물질들은 독성을 유발할 수도 있어 바이오매스의 발효와 같은 공정에는 적합하지 않고 유도물질을 사용하지 않고는 재조합단백질의 효율적인 생산을 바랄 수 없다. 따라서 바이오매스 산업의 기술을 혁신하고 경제성을 맞추기 위해서는 대장균에서 저비용으로 유지, 운영할 수 있는 바이오매스 당화 전용 단백질 발현시스템이 필요할 것으로 판단된다. 이에 본 발명자는 앞으로 반드시 개발되어야 할 목질계 바이오매스 이용 분야의 유전공학적 도구를 미리 개발하고 선점하고자 한다.

본 발명의 목적은 자일로즈(xylose)에 의해 특이적으로 발현이 증가되는 대장균의 자일로즈 오페론의 특정 프로모터 조절 서열을 포함하는 재조합벡터를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합벡터에 의해 형질전환된 미생물 및 이를 이용하여 자일로즈가 포함된 배지에서 특이적으로 단백질을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대장균(Escherichia coli) 유래 xylA 또는 xylF 프로모터의 단편을 포함하는 재조합벡터를 제공한다. 바람직하게 상기 xylA 프로모터의 단편은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 부위이며, 상기 xylF 프로모터의 단편은 서열번호 2의 염기서열을 갖는 부위이다.

추가로 상기 재조합벡터는 발현을 원하는 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있으며, 상기 유전자는 상기 프로모터 단편에 작동가능하게 연결되어 발현된다. 상기 목적 단백질의 종류에는 제한이 없으며, 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드, 구조 단백질, 조절 단백질, 결합 단백질, 신호 전달 단백질, 부착 단백질, 독소, 효소, 호르몬, 항체, 항원 등이 될 수 있다.

다른 양태로 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)이다. 상기 형질전환은 공지의 방법으로 수행할 수 있다(Sambrook et al., 1989 등).

또 다른 양태로 본 발명은 상기 형질전환된 재조합 미생물을 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 구체적으로 상기 방법은 상기 재조합 미생물을 배양하여 목적 유전자를 발현시키는 단계; 및 상기 유전자 발현에 의해 만들어진 단백질을 분리하는 단계를 포함한다. 바람직하게 상기 배양은 자일로즈가 포함된 배지에서 이루어진다. 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)이다. 상기 단백질을 분리하는 방법에는 제한이 없으며, 예를 들어 종래 알려진 화학적인 방법, 전기 또는 압력을 이용한 물리적 방법으로 세포를 파쇄하여 세포 내에서 생산된 재조합 단백질을 회수하는 방법, 별도의 운반단백질이 발현될 수 있도록 재조합벡터를 제작하는 방법 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 자일로즈 유도성 단백질 발현 벡터는 자일로즈가 있는 환경에서 발현이 특이적으로 유도될 수 있는 조절서열 부위를 포함하고 있다. 따라서 상기 벡터로 형질전환된 대장균은 자일로즈에 의해 목적단백질을 대량생산할 수 있다. 본 발명의 재조합벡터 또는 형질전환체를 사용하여 자일로즈를 포함하는 바이오매스 자원을 효율적으로 활용할 수 있다.

도 1은 E. coli의 자일로즈 오페론 및 자일로즈 대사와 관련된 유전자들의 구성을 나타낸 모식도이다. 하단은 잠정적인 전사체의 지도를 보여준다(Sofia et al., 1994).
도 2는 xylA 프로모터에 의한 전사체의 크기를 확인한 실험 결과를 보여준다. 화살표는 전사 개시 위치를 나타낸다.
도 3은 xylA 프로모터 전사체의 노던 블랏 분석결과를 나타낸다. (A)는 1㎍의 RNA 마커(레인 1) 및 자일로즈에 의해 유도된 E. coli JM109로부터 추출한 100㎍의 총 RNA(레인 2)의 아가로스젤(1.0%) 전기영동 결과이다. (B)는 젤 A로부터 노던 교잡 분석을 수행한 결과이다.
도 4는 플라스미드 pUX29 및 그것의 부분적인 결손(deletion) 플라스미드들의 xylA 프로모터의 DNA 서열을 나타낸다. pUX30, pUX31, pUX33, 및 pUX35 xylA 프로모터 영역들의 번역개시코돈(translational initiation codon)으로부터 각각 -209, -171, -124, 및 -59bp 위치까지 결손되었다. 상단의 숫자는 뉴클레오티드 위치를 나타낸다. 직접 반복(direct repeat) XylR 결합 위치들은 밑줄로 표시하였다. 잠정적인 CRP-결합 일치 서열(putative CRP-binding consensus sequence)은 이탤릭체로 표시하였다. 제한효소 인식부위는 뉴클레오티드 서열 아래쪽에 표시하였다.
도 5는 xylA 프로모터 결손 시리즈들의 구성적 발현(constitutive expression)을 나타낸다.
도 6은 E. coli L-아라비노즈(arabinose) 오페론에서의 AraC에 의한 DNA 루핑(looping) 및 언루핑(unlooping) 모델을 나타낸다.
도 7은 xyl 프로모터 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 잠정적인 CRP 결합 부위는 이탤릭체로 나타내었다. XylR 결합부위는 화살표 밑줄로 나타내었다.
도 8은 xyl 프로모터 내 2개의 XylR 결합부위 사이의 절반의 나선형 회전(half helical turn) DNA 삽입을 나타낸 모식도이다.
도 9는 xylA 프로모터-lacZ 융합 시리즈들의 구성적 발현을 나타낸 것이다.
도 10은 잠정적인 XylR 결합부위를 갖는 확장된 xyl 프로모터 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 11은 확장된 xylA 프로모터-lacZ 융합 시리즈들의 구성적 발현을 나타낸 것이다.
도 12는 xylF 프로모터-lacZ 융합 시리즈들의 구성적 발현을 나타낸 것이다.
도 13은 xyl 프로모터의 루핑 억제 모델 가설을 나타내는 모식도이다.
도 14는 pXA428, pXA600 및 pXF428의 제작에 사용된 xylAF 프로모터 영역을 나타낸다. 잠정적인 XylR 결합부위에 밑줄표시를 하였다. pXA428(또는 pXF428의 역상보)의 프로모터 영역은 이탤릭체로 표시하였고, pXA600의 것은 네모칸 안에 들어 있다. I_AO, I_A1, I_A2, I_F1, I_F2 는 XylR DNA 결합 도메인에 대한 절반의 잠정적인 DNA 결합 부위이다. xylA 개시 코돈으로부터 20개 아미노산 펩티드까지 번역이 되도록, "CCG" 를 "TAG"로 치환하였다.
도 15는 자일로즈-유도 발현 벡터 제작의 모식도이다. (a) xylF 프로모터를 사용한 pXF428의 제작, (b) xylA 프로모터를 사용한 pXA428 및 pXA600의 제작. 각각의 프로모터는 pUC18의 같은 위치에 삽입되었다.
도 16은 리포터 어세이를 나타낸다. o-나이트로페닐-베타-D-갈락토피라노시드를 기질로 사용하여 420nm에서 분광광도계로 베타-갈락토시다제 활성을 측정한다.
도 17은 pXF428에 결합된 lacZ의 여러 유도인자에 의한 발현수준을 보여준다. 베타-갈락토시다제 1단위(unit)는 28℃, pH7.0 에서, 분당 1umol을 생산하는 효소의 양으로 정의된다(Miller, 1972). 에러 바(error bar)는 3 반복 평균의 표준편차를 나타낸다. LB(None)는 3시간의 프리컬쳐 후 아무런 유도인자도 포함하지 않은 LB 배지를 나타낸다.
도 18은 pXF428에 xylF 터미네이터를 연결하여 pXFt23을 구축하는 모식도를 나타낸다.
도 19는 pXFt23에 xylR 영역(1988 bp)을 삽입하여 pXFt-RF2, pXFt-RR3를 제작하는 모식도를 나타낸다. pXFt-RF2와 pXFt-RR3에 삽입된 xylR은 전사의 방향만 다르다.
도 20은 pXFt23에 추가로 xylA 프로모터를 도입하고 프로모터 하류에 xylR을 삽입하는 모식도를 나타낸다. 구축된 플라스미드, pXFt-AR23에서 xylR은 xylA 프로모터로부터 발현된다.
도 21은 pXA428 및 pXA600에 xylR 프로모터를 포함한 xylR 영역을 삽입하여 pXAR4280과 pXAR6000을 제작하는 모식도이다. pXAR4280에서는 xylR이 xylF 프로모터와의 방향이 같으나, pXAR6000에서의 xylR이 이와 역상보적으로 위치해 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 대장균 자일로즈 오페론의 작용기작

(1) 조절단백질 XylR의 억제자(repressor)로서의 역할

자일로즈는 xylF, xylG 및 xylH 에 의해 암호화된 자일로즈 운반 단백질들에 의해 세포 안으로 도입되며, 자일로즈 아이소머라제(xylose isomerase) (xylA)에 의해 자일룰로즈(xylulose)로 전환된 후, 자일룰로즈 키나아제(xylulose kinase) (xylB)에 의해 인산화된다(도 1). 이 유전자들의 발현은 xylR에 의해 암호화된 전사 조절인자, XylR에 의해 조절된다. xylAB 및 xylFGH, 및 xylR 은 양방향 xylAF 프로모터에 의해 영향을 받는다. 대장균에서 xylAF 프로모터는 자일로즈 오페론 상의 주요한 프로모터들이다. xylA 유전자와 xylF 유전자 사이에 양방향으로 위치하는 xylAF 프로모터는 자일로즈에 의해 자극받으며, 오페론 상의 유전자들의 전사에 영향을 미친다.

대장균 자일로즈 오페론의 XylR에 의한 조절 양상을 탐구하기 위해 실험하던 중 XylR이 활성자(activator)로서의 역할뿐만 아니라 자일로즈가 존재하지 않을 경우에는 억제자로 작용하여, 자일로즈 오페론의 전사 개시를 저해한다는 몇 가지 증거를 발견하고 XylR에 의한 xylAF 양방향 프로모터(프로모터)의 조절을 모델링하였다.

(2) xyl cluster의 전사 인자들에 대한 검증

대장균의 xyl 오페론의 염기서열은 대장균 게놈 프로젝트에 의해 76.0 분대부터 81.5 분대의 유전자의 염기서열이 Sofia 등(1994)에 의해 결정되면서 밝혀졌다. 이들은 xylA와 xylF 사이의 영역(intergenic region)에는 양방향으로 갈라진 프로모터가 각각 존재하며(도 1), 특히 xylA는 두개의 프로모터를 가질 것으로 추정하였다. 이밖에 xylB 유전자의 상류에도 약한 프로모터가 있는 것으로 추정하였으며 전사의 종결은 xylA , B의 경우는 각각의 종결부위가 존재하는 것으로 추정하였으나 xylA 프로모터에 의한 전사체는 xylB까지도 확장될 것으로 추정했다. 이들은 xylF 유전자 하류에 종결부위가 있음에도 불구하고 xylF 프로모터에 의한 전사체가 xylR까지 확장될 것을 예측하였다.

Sofia 등에 의해 예측된 xylA를 전사하는 두 개의 프로모터가 실제로 존재하는지 알아보기 위하여 프라이머 확장(primer extension)법으로 xylA의 전사개시점을 확인하였다(도 2). 도 2에 나타나듯이 xylA의 전사체는 하나만 확인되었으며 반복실험에 의해서도 더 이상의 전사개시점을 발견하지 못하였다. 따라서 xylA는 Sofia 등의 추정과는 달리 하나의 프로모터에 의해서 발현이 조절되는 것으로 확인된다.

도 3은 xylA 프로모터에 의한 전사체의 크기를 확인한 실험이다. 대장균 JM109를 자일로즈 배지에서 충분히 xylA의 발현을 유도하며 생육시킨 후 xylA의 구조유전자를 프로브(probe)로 하여 노던교잡분석(northern hybridization)한 결과, 그림에서와 같이 두 개의 전사체가 확인되었다. 크기가 작은 주된 밴드(band)는 1.5 kb에 해당되었으며 약한 밴드는 4.0 kb에 해당되었다. 도 1의 지도와 비교하면 이들 중 1.5 kb의 밴드는 xylA 유전자 바로 아래에서 전사가 종결된 mRNA 단편이고, 4.0 kb는 xylB까지 전사가 확장된 단편으로 생각된다. 이 결과는 Sofia 등의 추정과 부합되었다.

(3) xylA 프로모터의 구성적 발현(constitutive expression)

대장균 xylA 프로모터의 조절양상을 밝히기 위하여 xylA 프로모터 결손 시리즈(deletion series)들을 가지고 자일로즈 아이소머라제(xylose isomerase)의 발현양상을 살펴보았다.

xylA 프로모터 결손(deletion) 플라스미드는 pUX30(209 bp 상류), pUX31(170 bp 상류), pUX33(124 bp 상류), pUX35(59 bp 상류)와 xylA와 xylF 사이의 영역(intergenic region)이 모두 포함된 pUX29(767 bp 상류)를 제작하여 사용하였다. 이들이 가지는 xylA 프로모터의 크기는 도 4에 나타내었다. 이들은 모두 프로모터에 xylA 유전자가 변형 없이 연결되어 있으므로 자일로즈 아이소머라제를 측정함으로써 프로모터의 발현 여부를 용이하게 알아볼 수 있었다.

이들 플라스미드를 대장균 JM109로부터 NTG 처리하여 분리한 xylA 변이주 DH77에 형질전환하여 얻은 균주들을 LB 배지에서 자일로즈로 유도하거나 유도하지 않고 생육시킨 다음 효소활성을 측정하였다(표 1). 표 1에서 나타난 바와 같이 xylA 프로모터가 xylA 개시코돈을 기준으로 －124 bp까지 결손되면 효소의 발현이 줄어들고, －59 bp까지 결손되면 거의 효소를 생산하지 못하였다.

프로모터 결손이 E. coli DH77(xylA 돌연변이) 내 xylA 유전자의 발현에 미치는 영향

균주	자일로즈 아이소머라제, umol/mg
	자일로즈	무처리(None)	비율＊
JM109	3.81 ±0.12	0.02 ±0.02	0.52
DH77/pUX29	5.41 ±0.28	0.24 ±0.08	4.44
DH77/pUX30	6.04 ±0.27	1.66 ±0.04	27.48
DH77/pUX31	6.03 ±0.27	1.79 ±0.04	29.68
DH77/pUX33	2.16 ±0.13	0.30 ±0.02	13.89
DH77/pUX35	0.30 ±0.01	0.07 ±0.06	?

^＊(none/xylose)×100 (%) 으로 측정된 구성적 발현(constitutive expression)율.

균주를 LB 배지에서 2시간 동안 키운 후, 배양액에 0.4% 자일로즈를 첨가하거나 첨가하지 않았다. 상기 배양액을 37℃에서 2시간 동안 추가로 배양하였다.

도 5에서 보는 바와 같이 JM109나 xylA와 xylF 사이의 영역(intergenic region)이 모두 포함된 DH77/pUX29(767 bp 함유)의 경우에는 구성적인 발현이 거의 없거나 낮았으나, 209 bp xylA 프로모터만을 가진 DH77/pUX30과 170 bp xylA 프로모터만을 가진 DH77/pUX31에서 구성적인 발현이 자일로즈에 의한 최대 발현의 27% 및 30%가 되었다. 이러한 결과로부터 유추하여 볼 때, xylA 개시코돈을 기준으로 -209bp 상류에는 자일로즈에 의한 자극이 없을 때 xylA 프로모터의 작용을 억제하는 부분(element)이 존재하며, 이러한 부위가 제거되면 프로모터가 충분히 억제되지 못하여 약간의 구성적 발현(constitutive expression)이 나타나는 것으로 판단된다.

(4) xylA 프로모터의 XylR에 의한 looping repression 가설

1) 대장균 L-아라비노즈(arabinose) 오페론 조절과의 유사성

대장균 L-아라비노즈 오페론의 조절단백질 AraC는 araBAD 프로모터에 활성자(activator)와 억제자(repressor)로 작용한다. araBAD 프로모터의 경우에도 araB의 개시코돈으로부터 －280 부위가 결손되면 높은 구성적인 발현이 나타나는 것이 보고되었다(Dunn 등, 1984). L-아라비노즈 오페론에서 조절 단백질 AraC가 araBAD와 araC의 사이 영역(intergenic region)의 양방향 프로모터를 조절하는 가설은 도 6과 같다. 즉, 아라비노즈가 존재하지 않을 경우에는 AraC 이합체(dimer)가 그림과 같이 각각의 operator(I ₁ , O ₂ )에 결합하여 DNA의 looping 구조를 형성시켜 전사를 일으키지 못하도록 하는 억제자(repressor)의 역할을 수행하다가 아라비노즈의 유도에 의해 AraC 이합체의 형태가 변하여 O₂에 결합하던 이합체의 한쪽이 direct repeat sequence(I ₁ - I ₂ )로 옮겨지면서 looping 구조가 파괴되어 활성자로서의 역할을 수행한다는 것이다. 도 7에서 보는 바와 같이 xylA 프로모터에 존재하는 XylR의 결합부위도 araBAD 프로모터와 유사하게 -35 region이 direct repeat sequence의 마지막 부분과 일부가 겹쳐 있으며, CRP 결합부위도 XylR 결합부위의 바로 위에 존재하고 있다. 또한, araBAD 프로모터의 경우 -280 부위에 존재하고 있는, 제 2의 AraC 결합부위 O ₂ 와 유사하게 xylA 프로모터의 상류 -250 부근에도 또다른 XylR 결합부위가 존재하고 있다. 이렇게 양방향 xyl 프로모터 부위가 양방향 ara 프로모터와 유사한 형태를 가지고 있으며, 조절단백질도 같은 AraC/XylS 군에 포함되며, DNA 결합 도메인의 형태가 일치하는 등 서로 비교적 높은 상동성을 가지고 있었다. 따라서 xylA 프로모터의 repression이 XylR dimer에 의한 looping repression일 가능성이 높을 것으로 판단하였다.

2) DNA의 위상에 의한 looping repression의 해제 실험

상기 looping repression 가설을 증명하기 위하여 두 영역의 XylR 결합부위 사이의 DNA에 짧은 DNA 단편을 도입하여 looping repression의 가설을 시험하였다. 도 8의 실험 계획에서 보듯이, 야생형(wild type) xyl 프로모터에서 XylR의 두 군데 결합부위는 DNA 상에서 같은 면에 위치하고 있으며, 따라서 XylR dimer에 의한 looping이 가능하게되어 프로모터의 억제(repression)가 나타나지만 중간에 5 bp의 DNA 서열이 도입되면 XylR 결합부위는 위치가 반대 면이 될 것이므로 looping을 하지 못하게 되어 억제가 일어나지 않게 될 것이다.

실험은 총 365 bp의 xyl 프로모터 영역으로 실시하였으며, 정확한 측정과 다른 간섭요인을 제거하기 위해 각 프로모터에 lacZ 유전자를 융합하여 β-galactosidase 활성을 측정하였다. 각 프로모터 영역은 자일로즈 오페론을 모두 포함하고 있는 pBX1을 주형으로 5 bp와 10 bp가 도입되도록 설계된 PCR 프라이머(표 2)를 이용하여 각각을 PCR하고 그 단편을 pUC19에 클로닝하였다. pUC19에 삽입된 프로모터 부위의 염기서열을 확인하고 이를 다시 pMC1403의 lacZ에 프레임이 바뀌지 않도록 삽입하였다. XylR 결합부위인 I _F 가 결손된 173 bp의 프로모터가 삽입된 pMA173, I _A 와 I _F 가 모두 정상적으로 삽입된 pMA365, 이들 XylR 결합부위 사이에 5 bp의 DNA가 도입된 pMA365+5, 그리고 XylR 결합부위사이에 10 bp의 DNA가 도입되어 결합부위가 다시 같은 면에 위치하게 된 pMA365+10을 제작하였다. 각 플라스미드들은 대장균 JM109에 형질전환하여 DM-xylose와 DM-glycerol 배지에서 생육시켜 xylA 프로모터의 발현을 살펴보았다(도 9).

xyl 프로모터 영역의 클로닝 및 돌연변이에 사용된 PCR 프라이머들

프라이머	서열
Ap-U	cggaattctcttcgaggaattaccca(서열번호 3)
Ap-D	cgggatccatattgaactccataatca(서열번호 4)
Fp-U	cggaattcaaaaatgcaataagtacaat(서열번호 5)
Fp-D	cgggatccatggtgtagggccttctgt(서열번호 6)
Ap-U10	cccaagcttattctcttcgaggaattaccc(서열번호 7)
Fp-U10	cccaagcttcaaaaatgcaataagtacaat(서열번호 8)

제한효소 BamH Ⅰ 부위는 이탤릭체. EcoR Ⅰ 부위는 밑줄. Hind Ⅲ 부위는 박스표시.

형질전환된 플라스미드가 세포 내에서 multi-copy로 존재하므로 이들을 억제하기 위하여 필요한 XylR 이합체의 양이 충분치 않을 수 있다는 판단 하에 이들 균주에 xylR을 가지고 있는 플라스미드 pLGX339를 동시에 형질전환하여 실험을 실시하였다. 표 3과 같이 xylA 프로모터에서 173 bp만을 가지는 경우나 half와 full integral turn의 DNA를 도입한 경우뿐만 아니라 xylA 프로모터에 변이가 없이 사이영역(intergenic region)인 365 bp가 전부 포함된 경우에도 모두 구성적인 발현이 나타났다.

xylA 프로모터에 삽입된 절반 및 완전한 회전이 xylA 프로모터에 융합된 lacZ 의 발현에 미치는 영향

균주	베타-갈락토시다제 (umol/mg)		비율＊
	DM-자일로즈	DM-글리세롤
JM109/pMA173	1965.52 ±235.78	230.03 ±55.80	11.70 ±2.84
JM109/pMA365	2945.01 ±274.97	608.05 ±83.07	20.60 ±2.82
JM109/pMA365+5	711.80 ±103.39	62.95 ±21.53	8.80 ±3.02
JM109/pMA365+10	3360.03 ±468.55	659.04 ±136.46	19.61 ±4.06

^＊%(DM-글리세롤/DM-자일로즈)×100(%)으로 측정된 구성적 발현(constitutive expression)율. 균주들은 DM 최소배지에서 10 시간 동안 생장했다. 각각의 탄소원의 농도는 0.5% 였다. 각각의 수치들은 3 반복 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.

3) xyl 프로모터 영역의 확장

상기 결과는 상기 (3)항의 xylA 프로모터 deletion series의 구성적 발현 양상과 크게 차이를 보여주었다. 이들 두 실험은 모두 multi-copy plasmid 상태로 진행되었으며 사용된 프로모터 영역도 거의 일치하였으며 다만 pMA series의 경우에는 활성 측정을 위해 xylA 구조유전자 대신 lacZ 유전자를 연결시켜 놓은 것이 차이가 있었다. 이렇게 두 실험의 조건에서 다른 것은 xylA 프로모터 deletion series의 pUX29의 경우 xylA 프로모터에 xylA가 변형 없이 그대로 연결되어 있으며 프로모터 상류 쪽으로도 xylF 개시코돈을 지나 －600 bp까지의 영역이 존재하고 있는 것이다. 따라서, 억제를 위한 xylA 프로모터 영역은 xylA와 xylF의 구조유전자까지 확장되어 있을 가능성이 있었다. 이러한 프로모터의 확장 가능성을 검토하기 위하여 알려진 네 곳의 XylR 결합부위의 서열을 서로 비교하여 75% 이상 동일한 부분을 일치 서열(consensus sequence)로 결정하였다(표 4). 표 4에서 보는 바와 같이 결정된 일치 서열과 xyl 프로모터 영역의 서열을 서로 비교하여 xylA 구조유전자에 1 개와 xylF 구조유전자에 2 개의 XylR이 결합할 가능성이 있는 부위를 추가로 발견하여 각각 I _AO 와 I _FO1 , I _FO2 로 명명하였다. 추가로 발견된 XylR 결합 부위의 위치는 도 10에 나타내었다.

XylR 결합 일치 서열 및 잠정적인 추가적 XylR 결합 부위

알려진 XylR 결합부위들	잠정적인 XylR 결합부위들
I A1 tgtgaattatctcaat(서열번호 9) I A2 tgtgaaataacataat(서열번호 10) I F1 gaaataaaccaaaaat(서열번호 11) I F2 atcgaaagataaaaat(서열번호 12) Consensus --GAAA-A A-AAT	I AO tatgaaggctcaaaat(서열번호 13) I FO1 gaaaataaagaacatt(서열번호 14) I FO2 ccaaagaagtcaaaat(서열번호 15)

표 4에서 추정한 추가의 XylR 결합부위를 도입하여 looping repression의 해제 여부를 실험하였다. 각 프로모터 영역은 표 5에서와 같이 추가로 2 개의 PCR 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다.

확장된 xyl 프로모터 영역의 클로닝 및 돌연변이에 사용된 PCR 프라이머들

프라이머	서열
A600 A-60	cggaattccggttatcatgttttcaat(서열번호 16) cgggatccgggtttgaggattttgagcc(서열번호 17)

제한효소 BamH Ⅰ부위는 이탤릭체로 표시. EcoR Ⅰ 부위는 밑줄.

증폭된 PCR 단편들을 pUC19에 각각 cloning하여 염기서열을 확인한 다음, 도 11에 나타낸 바와 같이 365 bp의 기본 프로모터에 I _FO 가 추가된 pMA600과 여기에 다시 I _AO 가 추가된 pMA600-60, 기본 365 bp에 I _AO 가 추가된 pMA365-60과 여기에서 I _F 가 제거된 pMA173-60, 또 pMA365-60에 half helical turn의 DNA가 추가된 pMA365-60+5와 full helical turn이 추가된 pMA365-60+10을 각각 제작하였다. 제작된 플라스미드는 대장균 JM109에 형질전환하여 그 억제 양상을 조사하였다(도 11).

표 6에 나타난 바와 같이 확장된 프로모터를 포함하여 조사한 xylA 프로모터의 억제는 I _AO 에 해당하는 60 bp와 I _F 가 포함되어 있을 때만 일어났다. 즉, pMA365-60의 경우 억제가 나타났으며, 여기에 +5 bp를 추가하여 DNA의 위상을 반대로 한 pMA365-60+5의 경우에는 억제가 해제되었고, 여기에 추가의 +5 bp를 삽입하여 DNA 위상을 원래대로 회복시킨 pMA365-60+10의 경우에는 pMA365-60과 같은 수준의 억제가 일어났다. 이것으로 보아 I _AO 가 XylR 중합체에 의한 looping repression에 필수적인 부위인 것으로 보이며 pMA173-60에서는 여전히 억제가 일어나지 않는 것으로 보아 ?365와 ?173 사이에 존재하는 I _F1 , I _F2 중의 하나가 looping repression을 위해 XylR 이합체가 결합하는 또 다른 부위로 보인다.

(4) xylF 프로모터의 발현

xylA 프로모터에서 60 bp의 xylA 구조유전자와 xylF 프로모터의 XylR 결합 부위가 포함되어 있을 때만 억제 현상이 일어나므로 XylR 이합체와 DNA looping에 의한 억제를 가정한다면, xylF 프로모터에서도 동일한 현상이 나타나야 할 것이다. 따라서, xylF 프로모터에서도 xylA 프로모터의 실험과 동일하게 발현양상을 살펴보았다. xylF 프로모터를 PCR하기 위한 primer는 표 16과 표 18의 것을 그대로 사용하여 도 12와 같이 모두 7 개의 플라스미드를 제작하고 이를 JM109에 형질전환한 후 자일로즈 유도 유무에 따른 발현도를 서로 비교하여 구성적인 발현량을 %로 나타내었다.

도 12와 표 7에서와 같이 DNA의 위상이 같은 pMF365-60과 pMF365-60+10의 구성적 발현 비율은 5% 이하로 다른 실험구들의 9 ~ 14%에 달하는 구성적인 발현에 비교하면 발현이 억제되었음을 알 수 있었다. 또한 xylF 프로모터도 역시 365 bp의 프로모터로는 모두 거의 동일한 수준의 구성적 발현이 나타났으나, 60 bp의 추가에 의해 구성적 발현도가 현저히 떨어졌다. 즉, 60 bp의 I _AO 가 있어야 억제가 일어났다. 그러나 half helix turn의 DNA가 삽입되어 DNA의 위상이 반대로 변하자 구성적 발현이 다시 증가하였으며, full helix turn의 삽입으로 DNA의 위상이 회복되자 억제도 회복되었다. 따라서 xylF 프로모터도 역시 DNA looping에 의한 억제를 받는 것으로 판단되었다.

(5) xylA , xylF 양방향 프로모터의 조절가설

이상과 같은 실험 결과로, xylA와 xylF의 억제 현상이 DNA looping에 의한 것으로 판단하고, 이렇게 DNA looping을 일으키는데 관여하는 것으로 보이는 xylF 프로모터 상의 I _F 부위와 xylA 구조유전자 상의 I _AO 부위에 의한 looping repression model을 도 13과 같이 가정해 보았다. 즉, 세포 내에 자일로즈가 존재하지 않을 경우에는 자체의 구성적인 프로모터에 의해 발현된 XylR 이합체가 I _F1 과 I _AO 에 결합하여 loop 구조를 형성함으로써 xylA와 xylF 프로모터에서의 전사를 억제한다. 자일로즈가 세포 내에 유입이 되면 자일로즈와 결합하여 공간구조가 바뀌어져 XylR 이합체가 더 가까운 쪽의 결합부위를 선호하게 되어 I _AO 에 결합해 있던 이합체의 한쪽이 I _F2 로 옮겨와 결합하게 되고, 따라서 XylR이 xylF 프로모터와 xylA 프로모터의 전사를 촉진하는데 아무런 문제가 없는 것으로 판단되어진다.

실시예 2: 재조합벡터의 제작

대장균 유래 xylA 및 xylF 프로모터 단편을 얻기 위하여, E. coli K12 의 genomic DNA를 주형으로 하고, 표 8의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃ 2분, 58℃ 1분, 72℃ 1분의 30사이클로 수행하였다.

xylAF 프로모터의 증폭에 사용된 프라이머들

pXF428 삽입 xylF 프로모터용 프라이머
XF-Aat	5' - GGC GACGTC TCCCGGACGGGTTTGAGGATTTT - 3'(서열번호 18)
XF-Hind	5' - CCC AAGCTT GCTAGCCATATGGGTGTAGGGCC - 3'(서열번호 19)
pXA428 삽입 xylA 프로모터용 프라이머
XA-Aat	5' - GGC GACGTC CTCGAGGGTGTAGGGCCTTCTGTA - 3‘(서열번호 20)
XA-Hind	5' - CCC AAGCTT GCTAGCCATATGCTAGTTTGAGGATTTTGAGCCTT - 3'(서열번호 21)
pXA600 삽입 xylA 프로모터용 프라이머
A600-Aat	5' - GGC GACGTC CTCGAGCGGTTTATCATGTTTTCA - 3‘(서열번호 22)
A600-Hind	5' - CCC AAGCTT GCTAGCCATATGATTGAACTCCATAATCAG- 3'(서열번호 23)
리포터 어세이에 사용되는 lacZ 증폭용 프라이머
LZ-Nhe	5' - CTA GCTAGC GTCGTTTTACAACGTCGTGA - 3'(서열번호 24)
LZ-Xba	5' - TCC TCTAGA TTATTTTTGACACCAGAC - 3'(서열번호 25)

상기에서 수득한 PCR 산물을 분리하고, 각각의 프라이머 양끝에 달린 제한효소 자리에 맞게 제한효소를 처리하였다. 이와 함께, 상기 사용한 제한효소와 동일한 제한효소로 플라스미드pUC18(Sigma, USA)를 절단하였다. 상기 제한효소 처리한 PCR 산물과 상기 절단된 pUC18 벡터를 T4 DNA 리가아제를 이용하여 연결하였다.

이에 따라 428 bp의 xylF 프로모터 단편(서열번호 2)이 pUC18의 다중클로닝부위(multiple cloning site)의 상류(upstream)에 접합되었고, 이를 pXF428이라 명명하였다. 또한, 서열번호 2의 xylF 프로모터 단편의 역상보적 서열(reverse complementary sequence)인 xylA 프로모터 단편을 상기와 같은 방법으로 pUC18에 삽입하고, 이를 pXA428이라 명명하였다.

또한, 같은 방법으로, 유전자 상류로부터 xylF 유전자 일부까지 포함시킨 영역(유전자 개시코돈으로부터 239 bp 지점까지 확장시킨 604bp 부분(서열번호 1)을 pUC18에 접합시키고, 이를 pXA600이라 명명하였다(도 15).

이어 프로모터로부터 발현되는 목적 유전자의 발현에 영향을 미치는 터미네이터(terminator) 부위를 삽입하고자 상기 pXF428의 다중클로닝부위 하류지점에 터미네이터 영역을 삽입하였다. Sofia(1994)에 의하여 밝혀진 터미네이터 영역은 28 bp 이며, 이를 삽입하고자 PCR 프라이머에 이 서열을 부가하여 터미네이터가 포함된 영역을 증폭하였다. PCR 산물을 pXF428의 EcoRⅠ - PvuⅡ 단편에 삽입함으로써 이 180 bp 안에 터미네이터가 삽입되게 하여 pXFt23을 제작하였다(도 18).

xylF 터미네이터 증폭에 사용된 프라이머들

프라이머	서열
ter-F1	5＇- CGGGGGCGTGATTTGTAATCATGGTCATAGCT - ＇3 (서열번호 26)
ter-F2	5＇- ccagcgcggAGCGGGGGCGTGATTT - ＇3 (서열번호 27)
ter-F3 (EcoRⅠ)	5＇- gGAATTCgccccagcgcggAGCGG - ＇3 (서열번호 28)
ter-R (PvuⅡ)	5＇- ATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGA - ＇3 (서열번호 29)

이 후, 리포트유전자를 통한 발현을 확인하기 위하여 pXFt23에 lacZ를 삽입하였으며 JM109 균주로 형질전환하였다. 이 플라스미드에 xylR을 연결하여 보다 조절된 발현을 보고자 하였다. 우선 xylR이 pXFt23에서 발현되기 위한 프로모터로서 xylR 자체의 프로모터와 xylA 프로모터, 두 가지로 나누어 구축하기로 하였다.

xylR 프로모터는 오페론 상의 xylH 유전자를 일부 포함한 xylR 유전자 상류의 809 bp를 선택하였으며 프로모터로부터 xylR 유전자까지 총 1,988 bp에 이른다. 이 영역을 표 10의 프라이머들을 사용하여 증폭하여 pXFt23의 PvuⅡ 사이에 삽입하였으며 이 경우 xylR은 두 가지 방향으로 삽입될 수 있다. 실제, pXFt23에 xylR(xylR 프로모터 - xylR)을 삽입하여 목적 유전자(다중클로닝부위에 삽입될)와 방향성이 일치하는 플라스미드와 xylR의 방향이 역상보적인(reverse complimentary) 플라스미드를 얻었다(도 19). 이들을 각각 pXFt-RF2와 pXFt-RR3로 명명하고 리포터 어세이를 위하여 lacZ를 연결하고 JM109 균주로 재형질전환하였다.

xylR을 연결할 xylA 프로모터를 삽입하기 위하여 pXA428의 프로모터인 428 bp의 xylA 프로모터 영역을 증폭할 프라이머를 제작하였다. 이 때, 프로모터 하류부분에 xylR이 삽입될 수 있도록 SpeⅠ, NcoⅠ 제한인식 서열을 부가하고 양 말단은 PvuⅡ로 하여 프로모터가 pXFt23의 PvuⅡ 사이에 삽입될 수 있게 하였다. 이 때, xylA 프로모터 - xylR 이 정방향 또는 역방향의 두 가지 경우로 삽입될 수 있는데 형질전환 후 xylA 프로모터가 목적 유전자와 역상보적인 방향으로 삽입된 플라스미드만 얻을 수 있었다. 이 플라스미드에 xylR을 삽입하고자 벡터와 인서트를 SpeⅠ, NcoⅠ으로 절단 후, 연결하여 xylA 프로모터에 의하여 xylR이 발현될 수 있는 플라스미드를 획득하고 이를 pXFt-AR23이라 명명하였다(도 20). 이와 같이 pXF428을 플라스미드 골격으로 하여 터미네이터를 연결하여 삽입 유전자의 전사가 종결되도록 하고 여기에 조절유전자 xylR과 그 프로모터를 삽입하여 유전자 발현이 보다 세밀하게 조절되도록 제작하였다.

pXFt-RF2와 pXFt-RR3에 삽입하기 위한 xylR 증폭용 프라이머들

프라이머	서열
XR-f (PvuⅡ)	5＇- ATG CAGCTG GGCATACTCATTGGCATCAC - 3＇(서열번호 30)
XR-r (PvuⅡ)	5＇- ATG CAGCTG CTACAACATGACCTCGCT - 3＇(서열번호 31)

다음으로는 앞서 구축한 pXA428과 pXA600의 xylA 프로모터에 의한 발현에 대한 xylR의 영향을 알아보기 위하여 pXFt-RF2, pXFt-RR3의 구축에 이용된 1,988 bp의 xylR 영역(도 18)을 pXA428과 pXA600의 PvuⅡ 사이에 삽입하였다. 형질전환 후, pXA428에 삽입된 xylR은 pXFt-RF2와 같은 정방향이었으며, pXA600에 삽입된 것은 pXFt-RR3의 xylR과 같은 방향이었다. 이를 각각 pXAR4280과 pXAR6000으로 명명하였다(도 21).

pXFt23에 삽입될 xylA 프로모터 증폭용 프라이머들

프라이머	서열
PA-pvu	5＇- TGC CAGCTG GGTGTAGGGCCTTCTGTAGTTAG - 3＇(서열번호 32)
PA-snp	5＇- ATG CAGCTGCCATGGACTAGT CTAGTTTGAGGATTTTGAGCCTT - 3＇(서열번호 33)

xylA 프로모터 하류에 삽입될 xylR의 증폭을 위한 프라이머들

프라이머	서열
Rf-Spe	5＇- CCG ACTAGT ATGTTTACTAAACGTCACCGCATC - 3＇ (서열번호 34)
Rr-Nco	5＇- CATG CCATGG CTACAACATGACCTCGCTAT - 3＇ (서열번호 35)

실시예 3: 재조합벡터를 이용한 목적유전자의 발현

xylA 및 xylF 프로모터의 작동을 실험하기 위하여, 상기 제작된 재조합벡터를 전기천공법(electroporation)을 이용하여 E. coli DH5α에 도입하였다. 상기 형질전환 균주는 암피실린이 첨가된 LB 배지에서 선별하였다.

상기 프로모터의 발현수준을 측정하기 위하여, lacZ 를 리포터로 사용하였다(도 16 및 도 17). 각각의 플라스미드를 함유한 균주들을 3시간 동안 프리컬쳐(pre-culture) 한 뒤에 4시간 동안 0.5% 자일로즈가 포함된 LB 배지에서 배양하면서 발현을 유도하였다. 자일로즈 유도하에 xylF 프로모터로부터 발현된 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)수준은 자일로즈가 없을 때보다 더 높았으며, 구성적 발현(constitutive expression)은 자일로즈 유도의 약 10% 수준이었다(표 13). xylA 프로모터의 발현수준은 xylF 프로모터보다 높았으며, pXA428의 발현이 더 높은 발현수준을 보인 pXA600 보다 자일로즈에 의해 더 많이 조절되었다.

구성적 발현율은 (글리세롤 유도 베타-갈락토시다제 활성/자일로즈 유도 베타-갈락토시다제 활성) × 100(%)로 계산하였다. 각각의 수치는 3 반복의 평균으로 나타내었다.

리포터 어세이(reporter assay)에서, lacZ가 융합된 pXA428을 포함하는 JM109는 자일로즈에 의해 긴밀하게 조절되는 발현을 보였고, JM109/pXA600-lacZ 로부터의 베타-갈락토시다제의 발현수준은 JM109/pXF428-lacZ 및 JM109/pXA428-lacZ 보다 높았다.

또한, pXA428과 pXA600에 xylR 영역을 도입한 pXAR4280과 pXAR6000은 lacZ 리포터 어세이에서 다소 엇갈린 발현수준을 보여주었다. pXA428은 자일로즈의 지배를 강하게 받는 발현양상을 나타냈으나 pXAR4280은 lacZ의 발현수준도 낮았고 구성적인 발현이 5배 수준으로 증가하였다. 반면 pXA600은 lacZ의 발현수준이 높고 15% 이상의 구성적 발현을 보인데 반해 pXAR6000은 lacZ의 발현수준도 증가하였고 구성적인 발현은 2배 가까이 감소한 양상을 보여주었다(표 14). 이들 플라스미드에 삽입된 xylR은 자일로즈의 영향을 받지 않는 구성적인 프로모터의 에 의하여 발현된다.

구성적 발현율은 (글리세롤 유도 베타-갈락토시다제 활성/자일로즈 유도 베타-갈락토시다제 활성) × 100(%)로 계산하였다. 각각의 수치는 3 반복의 평균으로 나타내었다.

xylF 프로모터에 대한 xylR의 작용양상을 알아보고자 pXF428에 터미네이터를 삽입한 pXFt23에 1988 bp의 xylR 영역을 연결하여 제작한 pXFt-RF2와 pXFt-RR3의 lacZ 발현수준을 측정하였다. xylR의 방향이 서로 다른 두 벡터에서의 lacZ 발현은 pXFt23의 발현수준보다 다소 높은 수준이었으나 구성적인 발현이 두 배 이상 증가하였다.

또한, xylA 프로모터로부터 발현된 xylR에 의한 보다 정밀한 조절을 위하여 pXFt23에 xylA 프로모터를 추가로 연결하여 여기에 xylR을 삽입한 pXFt-AR23의 lacZ 발현을 살펴보았다. xylR이 자일로즈의 영향을 크게 받는 xylA 프로모터로부터 발현되는만큼 pXFt-AR23에서의 lacZ 발현은 자일로즈가 존재하지 않을 시, 자일로즈 유도구의 lacZ 발현의 7%에 불과하였다(표 15).

구성적 발현율은 (글리세롤 유도 베타-갈락토시다제 활성/자일로즈 유도 베타-갈락토시다제 활성) × 100(%)로 계산하였다. 각각의 수치는 3 반복의 평균으로 나타내었다.

위의 플라스미드 벡터들은 대장균을 숙주로 하는 자일로즈 유도성 발현 벡터로서 다중 클로닝 부위 상류에 xylF 프로모터나 xylA 프로모터가 있고, 자일로즈를 첨가하면 목적 유전자가 발현되고 자일로즈 부재 시, 그 발현은 억제되었다. 이러한 조절을 더 정밀하게 하기 위하여 조절 유전자 xylR을 각 벡터들에 도입하였다.

이 벡터들은 pUC18 로부터 제작되었고, 각 벡터마다 발현 수준에 약간은 다른 패턴을 보였지만, 자일로즈 유도성이라 볼 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

1. (a) 목적 단백질을 암호화하는 유전자;
   (b) 상기 유전자와 작동가능하게 연결된 서열번호 2의 염기서열을 갖는 대장균 유래 xylF 프로모터 단편;
   (c) 서열번호 30 및 서열번호 31을 프라이머로 이용해 대장균으로부터 증폭된 xylR 유전자; 및
   (d) 서열번호 28 및 서열번호 29을 프라이머로 이용해 대장균으로부터 증폭되어 삽입된 28bp의 터미네이터 유전자를 포함하는 재조합벡터.
2. 제 1 항의 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
3. 제 2 항의 재조합 미생물을 자일로즈가 포함된 배지에서 배양하여 목적 유전자를 발현시키는 단계; 및 상기 유전자 발현에 의해 만들어진 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 단백질 생산방법.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 단백질 생산방법.

Images