KR101203954B1

KR101203954B1 - 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포를 포함하는 면역 조절용 조성물

Info

Publication number: KR101203954B1
Application number: KR1020100034854A
Authority: KR
Inventors: 박정규; 김정식; 박민정; 김상준
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-04-15
Filing date: 2010-04-15
Publication date: 2012-11-22
Also published as: KR20110115380A

Abstract

본 발명은 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포를 포함하는 면역 조절용 조성물 및 췌도 세포 이식용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 분화된 혈관 내피 세포 성질을 갖는 세포는 혈관 생성능력과 면역을 억제하는 능력이 뛰어나, 면역반응을 억제하여 예방 또는 치료될 수 있는 질환, 특히 췌도 세포 이식 시 유용하게 사용될 수 있다.

Description

혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포를 포함하는 면역 조절용 조성물 {Composition for immunoregulation comprising endothelial-like mesenchymal stem cell}

본 발명은 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포를 포함하는 면역 조절용 조성물 및 췌도 세포 이식용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 분화된 혈관 내피 세포 성질을 갖는 세포를 포함하는, 췌도 이식 시 수여자의 면역 조절을 할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

MSC (mesenchymal stem cell)는 골수에서 분리되는 세포로써 내배엽 (endodermal), 중배엽 (mesodermal), 외배엽 (neuroectodermal) 세포 계통 (lineage)으로 분화할 수 있는 능력을 갖고 있다고 알려져 있다.

한편 내피 전구세포 (Endothelial progenitor cell (이하 EPC))는 CD34를 세포 표면에 발현하는 세포로써, 인간 말초혈액에서 분리된 EPC는 혈관을 생성하고 손상된 내피를 회복시키는 능력을 갖고 있다고 알려져 있다. 골절된 모델에서의 EPC는 골수에서 말초 순환 (peripheral circulation)으로 이동하면서 새로운 골을 형성하는데 관여하고, 골절 치료를 유도한다고 알려져 있다. 췌도 이식 (Islet transplantation)에 있어서, 이식되는 기관 내의 혈관신생은 영양소와 산소 같이 췌도 생존을 높일 수 있고, 췌도 세포의 손실을 최대한 줄이기 위해 없어서는 안될 요소들을 충분히 조달하기 위한 혈류를 생성하는데 중요한 역할을 한다. Daniel N et al.은 공여자 췌도 내피 세포가 이식한 췌도의 혈관 생성에 참여를 했다는 논문을 발표하였고 Marcela B et al.은 공여자와 수여자 내피 세포 모두 이 과정에 중요한 역할을 하였다고 한다. 상기와 같이 EPC가 췌도 이식에서 나타내는 혈관 신생에 큰 기여를 한다. 하지만 충분한 양의 내피 전구세포를 말초 혈액에서 얻기가 힘들다는 점과 그들이 갖고 있는 낮은 증식 능력이 치료과정에서 장애로 발생한다.

따라서 장기 이식시의 면역반응을 억제하면서 혈관을 생성할 수 있는 충분한 양의 혈관 내피 세포 성질을 갖는 세포 확보가 매우 절실한 상태이다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 노력한 결과, 골수 유래 중간엽 줄기세포를 분화시켜 얻은 세포가 혈관 생성능력과 면역 반응 억제능력이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 면역 조절용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 췌도 세포 이식용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포 (EMSC)를 포함하는 면역 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 분화된 것이 바람직하다.

상기 분화는 골수 유래 중간엽 줄기세포에 VEGF를 포함한 성장인자를 첨가하여 이루어질 수 있다.

또한 본 발명의 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포는 vWF, TGF-beta, VEGFR-1를 양성 발현하는 면역학적 특성을 지니는 것이 바람직하다.

상기 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포는 자극된 비장세포의 증식을 억제함으로써 면역반응을 조절하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포를 포함하는 면역 조절용 조성물을 함유하는, 췌도 세포 이식용 조성물을 제공한다.

상기 조성물의 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포는 췌도 이식 시 혈관 신생을 촉진하고 수여자의 면역 거부 반응을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의하면 내피 전구세포보다 in vitro 상 비교적 많은 양을 생산할 수 있는 MSC를 이용하여 내피 전구세포 특징을 가지고 있으면서 면역반응을 효과적으로 억제할 수 있는 조성물을 얻을 수 있다. 이러한 조성물은 췌도 세포 이식 시혈관 생성을 촉진시킴과 동시에 면역 반응을 억제시키므로 장기 이식에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 현미경을 관찰하여 MSC와 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포 (EMSC) 의 형태학적 (morphology) 차이를 나타낸 것이다. 왼쪽 그림이 MSC로서, 방추 (spindle) 모양이며, 오른쪽 그림은 EMSC를 나타낸 것으로 돌기가 길게 뻗어나간 모습이 관찰된다.
도 2a, 2b 및 2c는 MSC 와 EMSC 표면에서 발현되는 마커의 차이를 확인한 결과이다.
도 3은 MSC 와 EMSC 표면에서 발현되는 케모카인 (chemokine) 수용체 차이를 확인한 결과이다.
도 4는 EMSC에서 혈관 내피세포의 마커로 쓰이는 vWF의 발현 여부를 웨스턴 블롯과 FACS 로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 MSC와 EMSC의 혈관 생성력의 차이를 관찰하기 위해 수행한 혈관 신생분석 (angiogenesis assay) 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 MSC와 EMSC의 면역 억제 능력을 알아보기 위해 MLR-유도, 항체-유도로 자극된 비장세포의 증식 억제정도를 측정한 결과이다.

본 발명에서는 마우스 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포 (MSC)를 이용하여 내피 전구세포 (EPC)로 분화시켜, 분화시키지 않은 MSC와 혈관생성능력, 표면 마커의 발현여부, 면역반응억제 가능여부에 대해 비교함으로써 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포 (EMSC)의 특성에 대해 살펴보았다. 이하 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명은 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포 (endothelial-like mesenchymal stem cell; EMSC)를 포함하는 면역 조절용 조성물에 관한 것이다.

상기 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포는 중간엽 줄기세포에서 분화된 것이 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "중간엽 줄기세포"는 골수(bone marrow), 혈액, 진피 및 골막에서 분리되는 줄기세포로서, 다양한 세포 예컨대 지방세포, 연골세포 및 뼈세포 등으로 분화할 수 있는 전능성 (pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포를 의미한다. 상기 중간엽 줄기세포는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간의 간엽줄기세포일 수 있으며, 본 발명의 일실시예에 따르면 마우스의 중간엽 줄기세포이다.

중간엽 줄기세포를 얻는 과정을 구체적인 실시예에 따라 설명하면 다음과 같다: 인간 또는 마우스를 포함하는 포유동물, 바람직하게는, 인간의 간엽줄기세포 소스, 예컨대, 혈액 또는 골수로부터 간엽줄기세포를 분리한다. 상기 골수는 경골, 대퇴골, 척수 또는 장골로부터 추출할 수 있다. 이어, 골수로부터 세포를 얻고, 이들 세포를 적합한 배지에서 배양한다. 배양과정에서 부유 세포를 제거하고 배양 플레이트에 부착된 세포들을 계대 배양하여, 최종적으로 구축된(established) 간엽줄기세포를 수득한다.

본 발명의 상기 EMSC는 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 분화되는 것이 바람직하다.

상기 분화는 골수 유래 중간엽 줄기세포에 VEGF (vascular endothelial growth factor)등의 성장인자를 첨가함으로써 유도할 수 있다.

보다 구체적으로 상기 EMSC 는,

골수 유래 중간엽 줄기세포에 열로 불활성화된 10% 우태아 혈청, 50ug/ml의 겐타마이신 (gentamycin), 2mM의 L-글루타민 (L-glutamine), 100uM의 비필수 아미노산 (non-essential amino acid), 10mM의 HEPES, 55uM의 2-메르캅토에탄올 (2-Mercaptoethanol)이 함유되어있는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Gibco)으로 5% CO_2,37℃의 조건에서 배양하는 단계; 및

상기 배양한 MSC 가 컨플루언트 (confluent) 한 상태에서 2% FBS 와 VEGF (vascular endothelial growth factor) 를 포함하는 성장인자가 함유된 EGM-2 배지 (Lonza Biosciences) 로 교체하여 배양하는 단계;

를 포함하여 분화될 수 있다.

상기와 같은 방법으로 분화된 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포 (EMSC)는 MSC에서 발현되는 CD34에 대하여 음성의 면역학적 특성을 지니는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 EMSC는 보통의 EPC에서 발현된다고 알려진 CD31 및 VEGFR2에 대하여도 발현되지 않는 특성을 가진다. 아울러, 세포 표면에서 발현하고 있는 활성된 TGF-β는 MSC 보다 더 많이 발현하고, TGF-β의 잠재형 (latent form)인 LAP 의 경우는 MSC 보다 적게 발현하는 특성이 있다.

또한 본 발명의 EMSC는 CCR1, CCR4, CCR9과 CCR10 등은 발현하고 있지만 CCR7이나 CD62L가 발현되지 않고, 혈관내피 세포의 성질을 갖는 vWF가 발현되는 특성을 가진다.

본 발명의 상기 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포는 자극된 비장세포의 증식을 억제함으로써 면역 반응을 조절할 수 있다.

본 발명의 면역 조절용 조성물은 항원의 작용에 대하여 숙주가 항체를 만드는 능력 (체액성 면역반응) 또는 세포성 면역반응을 일으키는 능력을 조절하기 위한 것을 의미한다.

상기 조성물의 한 형태로서, EMSC와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역 반응 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "면역반응 억제용"은 수용자 (recipient)에서 면역반응을 억제하는 용도를 의미한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 면역반응의 억제가 필요한 수용자에게 투여하여 면역반응을 효과적으로 억제하는 용도로 사용될 수 있으며, 이는 다양한 질환 또는 질병의 치료 효능을 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 용어"수용자"란 면역 질환으로부터 고통받거나 또는 이식된 조직 또는 기관의 면역거부 위험이 있는 동물을 의미하며, 바람직하게는 인간 및 쥐와 같은 포유류 동물을 의미하며, 가장 바람직하게는 인간이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질병 또는 질환은, 면역반응을 억제하여 예방 또는 치료될 수 있는 모든 질환을 포함한다. 가장 대표적인 질환 또는 질병은, 자가면역질환, 염증성 질환 및 이식 거부(graft rejection)이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 자가면역질환의 예는 알로페시아 그레아타 (alopecia greata), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루우-피부염(celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 면역이상 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증, Churg-Strauss 증후군, 반흔성유천포창, CREST 증후군, 한냉 응집소 질환, 크론씨병, 원판성 낭창, 복태성복합한냉글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스 질환, 귈레인 바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, IgA 신경염, 연소자성 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼합성 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 타입 I 또는 면역-매개 당뇨병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결정성 다발동맥염, 다발연골염, 자가면역성 다선 증후군, 류마티스 다발성근통, 다발성 근염과 피부근염, 일차성 무감마글로불린혈증, 일차성 담증성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증, 강직인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 다가야스 동맥염, 일시적 동맥염, 거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 자가면역질환은 류마티스 관절염, 타입 I 당뇨병, 다발성 경화증, 전신성 홍반 루푸스 및 아토피를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 이식된 조직, 기관 또는 세포에 대해 면역 거부 반응을 억제하는 데 유용하다. 본 발명의 면역억제용 조성물은 수용자의 상태를 악화 또는 심화시키는 것을 예방하는데 효과적이다. 예를 들어, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 즉 타입 I 당뇨병은 인슐린을 분비하는 랑게르한스 샘의 β 세포에 대한 자가 면역 반응으로부터의 결과인 것으로 믿어지는 자가 면역 질환이다. 랑게르한스 샘의 β 세포의 완전한 파괴 전에 IDDM의 초기 단계로 고통받는 수용자의 치료는 잔존하는 인슐린 분비 β 세포의 추가의 파괴를 예방하거나 또는 억제하기 때문에, 질병이 더욱 진전하는 것을 예방하는데 유용하다.

한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화할 수 있다. 상기 조성물을 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 좌약, 관장, 경구성 장용제 등을 선택할 수 있고, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 EMSC 의 혈관 생성능력을 확인하였고, 항체로 활성화시킨 비장세포에 MSC 와 EMSC 의 세포 배양액을 첨가해주었을 때 EMSC 가 비장세포의 증식을 억제함을 확인할 수 있었다.

바람직하게는, 상기의 실험 결과를 바탕으로 본원 발명의 면역 조절용 조성물은 췌도 세포 (islet) 이식 시 수여자의 면역 거부 반응을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 췌도 이식 시 본원 발명의 EMSC를 수여자에 투여함으로써 혈관 생성 및 면역 조절을 할 수 있다.

췌도 이식에는 뇌사 도너 췌도 이식, 심정지 도너 췌도 이식 및 생체 췌도 이식 등이 포함된다. 본 발명에 있어서의 췌도 이식은 동종 동계 이식(isograft), 동종 이계 이식(allograft)이어도 된다. 동종 동계 이식이란, 동일한 균일계의 동물 사이에서 행해지는 이식으로, 인간에 있어서는 일란성 쌍생아 사이에서 행해지는 이식이다. 동종 이계 이식이란, 유전원 조성이 상이한 2개의 개체 사이에서 행해지는 이식으로, 인간에 있어서는 이란성 쌍생아 사이에서의 이식이나, 전혀 혈연관계가 없는 개체 사이에서의 이식이 이에 해당한다.

또한 본원 발명은 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포 (EMSC)를 포함하는 면역 조절용 조성물을 함유하는 췌도 세포 이식용 조성물에 관한 것이다.

상기 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포는 췌도 이식 시 혈관 신생을 촉진하고 수여자의 면역 거부 반응을 억제하는 것을 특징으로 한다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 세포와 실험 재료 준비

본 발명에서 사용된 마우스는 Koatech에서 제공하는 Balb/c mice를 사용하였다. 또한 MSC는 Imperial College Faculty of Medicine의 Dr. Elizabeth Simpson의 실험실로부터 얻었으며, Balb/c 골수에서 분리한 MSC를 사용하였다.

FACS 분석과 웨스턴 블롯 (western blot)에 쓰인 항체들에는 CD34-FITC, CXCR4-PE, CD3ε-PE-Cy7, CD25-APC-Cy7, CD105-PE, CD73-PE, CD90.2-FITC, CD11b-PerCP-Cy5.5, CD14-FITC, CD45-APC, CD44-APC 및 적절한 동형 대조군 (appropriate isotype controls (e-bioscience)), CD106-FITC, VEGFR2-PE, Streptavidin-PE, CXCR5-PE, CD62L-PE (BD-Pharmingen), vWF, CCR4, CCR-10 (abcam), TGF-β, LAP, 마우스 IgG1 동형, VEGFR1 (R&D systems), 닭 IgY-비오틴 (Jackson Immunoresearch), MMP-2,3 and 9, 염소 항-토끼 (goat anti-rabbit) IgG-PE, CCR-1-PE, Bcl-2, 염소 항-마우스 (goat anti-mouse) IgG-HRP, 염소 항-토끼 (goat anti-rabbit) IgG-HRP, 당나귀 항-염소 (donkey anti-goat) IgG-HRP (santacruz), 염소 IgG 동형-비오틴 컨트롤 (goat IgG isotype-biotin control), CD31 (Southern Biotech), CCR7-PE (biolegend), GAPDH (Calbiochem), Caspase-3, phospho-STAT-5, STAT-5, Cyclin D2, cdk-2, p27kip1 (Cell signaling) 가 쓰였다. 비장세포의 활성화에 쓰인 항체는 항-CD3ε, 항-CD28 항체(e-bioscience)가 쓰였다.

실시예 2: 세포 배양과 MSC 분화 유도 과정

MSC 세포를 불활성화된 10% 우태아 혈청, 50ug/ml의 겐타마이신 (gentamycin), 2mM의 L-글루타민 (L-glutamine), 100uM의 비필수 아미노산 (non-essential amino acid), 10mM의 HEPES, 55uM의 2-메르캅토에탄올 (2-Mercaptoethanol)이 함유되어있는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Gibco)으로 5% CO_2,37℃의 조건에서 배양하였다.

상기 배양한 1x10⁵의 MSC를 100mm 플레이트에 seed한 다음 24시간이 지나서 컨플루언트 (confluent) 해진 후 2% FBS와 VEGF (vascular endothelial growth factor) 를 포함하는 다양한 성장인자가 함유된 EGM-2 배지 (Lonza Biosciences) 로 교체하여 배양하였다. 이후 이틀에 한번 씩 새 배지로 교환해주었다.

7일 동안 분화시킨 MSC를 배양접시에서 media만 제거한 다음 PBS로 한번 세척해 주고 앞서 MSC를 배양할 때 쓰는 10% FBS를 함유하는 DMEM으로 바꿔 준 후 48시간 더 배양하였다. 이 후 배양액을 얻고 2000rpm에 10분동안 원심분리하여 얻은 상청액을 1.5ml 마이크로튜브에 분할 (aliquot)하여 -70℃에 보관하였다.

실시예 3: 수행한 실험 방법

유세포 분석 (Flow cytometry analysis)

세포는 PBS로 한 번의 세척을 거쳐 trypsinized된 후 다시 한번의 PBS로 씻어 주었다. 이 후 형광이 붙어있는 항체 같은 경우에는 바로 4℃에서 40분을 혹은 1차 항체 40분, 2차 항체 40분을 반응시켜 보고자 하는 항원과 항체의 부착을 유도하였다. 음성 대조군 (negative control)으로는 같은 타입의 동형 대조군 (isotype control)을 사용하였다. 그런 다음 1% BSA와 0.1% 아지드화 나트륨 (sodium azide)을 함유하고 있는 PBS로 한번 씻어 준 후 FACSCanto (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg, Germany)를 사용해 FACSDiva 소프트웨어로 분석하였다.

혈관 신생 측정 (In vitro angiogenesis assay)

각 세포군 (cell population)이 나타내는 모세관 생성력을 in vitro 혈관 신생 키트 (angiogenesis kit (Chemicon, CA)) 를 이용해 비교 분석하였다. 프로토콜은 제조자가 지시한 대로 실행하였다. 처음 50ul의 ECMatrix 용액을 희석제 (diluents buffer)에 녹인 후 96 웰 세포 배양 접시 (tissue culture plate)에 넣고 37℃에서 1시간 배양시켜 ECMatrix를 생성해준 다음 각각의 세포를 웰당 1x10⁴씩 seed한 후 6시간과 24시간 후 현미경으로 관찰하였다. Pattern/value는 제조자에서 제시하는 기준을 참고하여 계산했으며 random view field는 5개 이상을 택하여 평균을 계산하여 나타내었다.

웨스턴 블롯 (Western blot analysis)

세포를 차가운 PBS로 씻은 뒤 Qproteome mammalian protein prep kit (Qiagen)을 이용하여 깼다. 세포 파쇄물 (Cell lysate)은 4℃에서 15분간 배양한 뒤 12,000xg로 15분간 원심 분리하였다. 이렇게 해서 얻은 상청액을 이용하여 BCA assay (Pierce) 를 통하여 정량을 실시한 뒤 동량의 단백질을 2-머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol)이 들어있는 SDS 샘플 버퍼와 섞고 100℃에서 10분간 열을 가해주었다. 이렇게 해서 얻은 샘플을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 (SDS-polyacrylamide gel)에서 분리한 후 PVDF 멤브레인으로 옮기고 면역블롯팅 (immunoblotting)을 실행하였다. 블롯킹 (Blocking)은 5% 탈지유 (skim-milk)가 들어있는 TBST로 1시간 동안 배양한 후에 1차 항체를 4℃에서 밤새 처리해 주고 HRP가 붙어있는 2차 항체를 상온에서 1시간 처리해 주었다. 그 후 supersignal west pico chemiluminescent substrate (Pierce)로 시각화시켰다.

마우스 비장세포 준비

Balb/c를 경추탈골 시킨 뒤 비장을 적출하고, 적출한 비장을 냉동 슬라이드 (frosted slide) 두 장을 겹쳐 갈아주는 방식으로 기계적 분리 (mechanical dissociation) 시켜 비장세포를 얻었다. 이렇게 해서 얻은 비장세포에 적혈구 용해 완충액 (Red blood cell lysing buffer (Sigma-Aldrich))을 이용하여 5분간 적혈구를 파괴시킨 후 400xg에서 8분간 원심분리 하였다. PBS로 두번 씻은 비장세포를 트리판 블루 염색 (trypan-blue staining)을 통해 세포수를 확인하고 90%이상의 세포가 살아있는 것을 관찰한 뒤 여러가지 실험에 사용하였다.

세포 증식 측정 ( CFSE , [3H]- thymidine incorporation )

96웰 플레이트 (well plate)에 미리 하루전에 항-CD3 Ab(3ug/ml)와 항-CD28 Ab (1ug/ml)을 코팅해 놓고 4℃에 보관해 두었다. 다음 날 5x10⁵의 비장세포를 1웰당 넣어주고 동시에 EMSC CM 혹은 대조군으로써 10% FBS가 함유된 DMEM을 넣어주었다. 실험의 특성에 맞게 배양을 한 웰에 1uCI의 [³H]-thymidine(Amersham,Buckinghamshire,UK)을 넣어 주고 나서 18시간이 지난 후 유리 섬유 필터 (glass fiber filter)를 이용해 세포를 얻었다. 티미딘의 결합 (Thymidine incorporation)정도는 microbeta TriLux luminescence counter (Perkin Elmer)를 사용해 읽었으며 결과는 1분당 읽어지는 count (cpm)로 나타내었다. 모든 실험은 각각의 샘플당 3웰씩 3회 반복하여 진행하였다.

세포의 증식은 5,6-carboxyfluorescein diacetate-succinimyl ester (CFSE) (Molecular probes, Eugene, OR)로도 측정하였으며 이 실험은 세포를 PBS로 씻어낸 다음 2x10⁶씩의 세포당 5uM의 CFSE를 1ml PBS에 풀어 넣어 준 후 37℃에서 10분간 배양하였다. 그 후 차가운 10% FBS를 함유하고 있는 배지에 두번 씻어 내고 CFSE의 강도를 FACSCanto를 이용하여 분석하였다. 또한 Modfit LT 3.0 소프트 웨어 (Verity software house)를 이용하여 분석하였다.

실시예 4: 실험 결과

(1) 마우스 MSC와 EMSC의 특성

MSC와 EMSC를 현미경으로 관찰 할 시 형태학적 (morphology) 차이가 두드러 지게 나타났다. MSC의 경우 전형적인 방추 모양 (spindle shape)인데 비해 EMSC는 돌기 (dendrite)가 더욱 길게 뻗어나가며 얇아지는 형태를 띠고 있다. 면역학적 표면 분자 (Immunological surface molecule)들에서도 약간의 차이를 보인다. MSC는 CD106, CD34, VEGFR1, CD105, CD72, CD44의 발현이 양성으로 나온데 비해 EMSC는 CD34를 거의 발현하지 않는 것으로 나타났으며, 보통의 내피전구세포에 발현된다고 알려진 CD31과 VEGFR2는 발현하지 않는 것으로 나타났다. 또한 특이하게도 세포의 표면에 발현하고 있는 활성된 TGF-β같은 경우 EMSC가 더 많이 발현하고 있는 양상을 보이며, TGF-β의 잠재형 (latent form)인 LAP의 경우에는 반대로 EMSC보다는 MSC가 더 높은 발현률을 보였다. 케모카인 수용체 (Chemokine receptor)들의 발현양상도 비교해 보았는데 EMSC가 MSC보다는 전반적으로 낮은 발현률을 나타냈으며 CCR1, CCR4, CCR9과 CCR10등은 발현하고 있지만 CCR7이나 CD62L의 발현은 관찰할 수 없었다. MSC에서 EMSC로의 분화가 제대로 이루어 졌는지 확인하기 위해 내피세포의 마커로 쓰이는 vWF의 발현여부를 웨스턴 블롯과 FACS로 확인해보았다. 양성대조군 세포로는 마우스 혈관 내피세포 주 SVEC을 썼는데 SVEC와 EMSC의 세포 용해물 (cell lysate)에서 얻은 단백질에서는 vWF의 발현이 확인되는 반면 동량의 MSC 단백질에서는 나타나지 않았다. 이로써 EMSC가 MSC에서 분화해 내피세포의 특성을 갖고 있다는 것이 분명해 졌고 또한 MSC와는 약간의 다른 면역 관련 단백질(immunological-associate protein)의 발현을 보인다는 것을 확인할 수 있었다.

(2) 혈관생성력의 차이

EMSC와 MSC의 혈관생성력의 차이를 관찰하기 위해서 in vitro 혈관신생 분석 (angiogenesis assay)을 실행하였다. SVEC을 양성 대조군으로 비교한 결과 EMSC와 SVEC 모두 혈관신생을 유도한지 6시간 후 완벽한 폴리곤 (polygon) 형태를 만들었지만 MSC는 그에 비해 약간의 sprouting만 생성할 뿐이었다. 더 나아가 24시간 후에 다시 한번 관찰 하였을 때 MSC와 SVEC은 모두 아폽토시스 (apoptosis)가 일어나 세포 사멸이 관찰되었지만 EMSC의 경우에는 앞서 6시간에 관찰된 것과 같이 완벽한한 폴리곤 형태를 유지하고 있는 것을 보았다. 이로써 EMSC가 MSC에 비해 혈관 생성능력이 뛰어나다는 것을 알 수 있었다.

(3) EMSC의 면역 억제 능력

MSC에 대한 면역억제능력과 그에 관한 기전은 이전에 알려진 바가 있지만 MSC에서 분화한 EMSC가 면역세포의 반응에 억제능력을 나타낸다는 보고는 없었다. 그리하여 EMSC또한 MSC와 같이 면역 억제 능력를 나타내는지 알아보기 위하여 Balb/c에서 적철한 비장세포를 irradiate한 C57BL/6의 비장세포로 자극을 준 후 EMSC와 MSC를 각각 처리해 보았다. 그 후 시간의 흐름에 따라 비장세포의 증식을 억제하는 패턴을 관찰해 보았다. 또한 EMSC의 배양액과 MSC의 배양액 또한 각각 처리해 보았는데 MSC와 MSC의 배양액, EMSC와 EMSC의 배양액을 처리한 각각의 그룹 모두 비장세포의 증식을 효과적으로 억제하고 또한 이런 현상은 혼합된 림프구 반응 (mixed lymphocyte reaction)을 유도시키고 나서 72시간 까지도 지속되는 것으로 나타났다.

두 번째로는 항-CD3, CD28 항체로 활성화 시킨 비장세포의 증식에 영향을 미치는지 알아보았다. 이때도 앞서와 마찬가지로 억제능력을 뚜렷이 나타내는 것을 관찰 할 수 있었다. 또한 비장세포의 증식정도를 CFSE를 표지화 (labeling)하여 관찰한 실험에서도 EMSC 배양액을 넣어주면 효과적으로 면역억제 반응이 일어남을 관찰 할 수 있었다. 이로써 EMSC에서 분비된 가용성 인자 (soluble factor)에 의해 동종-반응 (allo-reactive) 및 항체로 활성된 비장세포 증식이 효과적으로 억제된다는 결론을 얻을 수 있었다.

Claims

골수 유래 중간엽 줄기세포에 VEGF 를 포함한 성장인자를 첨가하여 분화되며, vWF, TGF-beta, VEGFR-1 로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상을 발현하는 면역학적 특성을 지니는 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포를 포함하는, 면역 억제용 약제학적 조성물.
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제 1항에 있어서, 상기 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포는 자극된 비장세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는, 면역 억제용 약제학적 조성물.
제 1항의 면역 억제용 약제학적 조성물을 포함하는 췌도 세포 이식용 약제학적 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 혈관 내피 세포성 중간엽 줄기세포는 췌도 이식 시 혈관 신생을 촉진하고 수여자의 면역 거부 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 췌도 세포 이식용 약제학적 조성물.