KR101199750B1 - 장기간 건성안 토끼 동물모델 및 이를 이용한 건성안 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법 - Google Patents
장기간 건성안 토끼 동물모델 및 이를 이용한 건성안 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 장기간 건성안 토끼 동물모델 및 이를 이용한 건성안 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특정 용량의 보톡스-B, 염화벤잘코늄 또는 이들의 혼합물을 토끼의 눈물샘 주사 또는 점안함으로써 재현성 및 실용성이 우수함과 동시에 간단한 시술로 12주와 같은 장기간의 건성안 토끼 동물모델을 확립할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 장기간 건성안 토끼 동물을 이용하여 실제 건성안을 겪고 있는 환자의 치료 또는 예방용 약물을 스크리닝 할 수 있다.
Description
본 발명은 재현성과 실용성이 있으며 장기간 건성안 모델을 구현할 수 있는 건성안 토끼 동물모델 및 이를 이용한 건성안 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
건성안은 눈물이 부족하거나 눈물이 지나치게 증발하거나 눈물 구성성분의 균형이 맞지 않아서, 안구 표면이 손상되고 눈이 시리고 자극감, 이물감, 건조감 같은 자극증상을 느끼게 되는 눈의 질환이다.
최근, 콘택트렌즈 착용자 수의 증가, 인공 냉방 환경에서의 생활시간 증가, 및 TV 수상기 및 컴퓨터 사용 증가로 인한 영상 표시 단말기(VDT) 화면의 응시 기회 확대로 인하여 건성안 발병률이 증가하고 있다.
건성안의 경우 대부분, 눈물막을 보완하는 층, 예컨대 유층, 수층 또는 점막층 중 하나에 이상이 생겨 각막/결막 장애가 야기된다. 그 중에서도 점막층의 이상은 심각한 각막 장애의 원인이 되어, 각막 상피 세포의 장애로 인한 각막 상피 장애 또는 각막 상피 진무름 뿐만 아니라 각막 궤양 예컨대, 각막 기질 등의 궤양 및 안감염까지 일으킬 수 있으며, 일부 경우에는 각막 이식이 필요하게 되기도 한다.
현재 가장 많이 사용되는 건성안 치료법은 뮤신의 치환체로서 점탄성 화합물, 예컨대 메틸셀룰로오스, 황산 콘드로이친 및 히알루론산을 함유하는 인공 눈물의 국소 적용을 들 수 있다. 그러나 상기 화합물들은 물리학적 및 생리학적으로 뮤신과 상이함에 따라, 그 치료 효능이 제한적이다.
한편, 이러한 건성안 치료제를 개발하기 위하여 현재 알려진 건성안 동물모델로는 쥐를 이용한 건성안 동물모델이 있으나, 이러한 동물모델은 건조한 환경을 지속적으로 유지해야 하고 특수 고안된 장치와 환경을 세팅하는 것이 쉽지 않으며, 8주 이내의 단기간 동물모델만을 제공할 뿐이어서 인간이 겪는 건성안과 같은 장기간 건성안 모델로서 사용할 수 없는 문제가 있었으며, 특히 쥐와 인간 간 안구의 차이로 인하여 쥐를 이용한 건성안 동물모델에서는 효과적인 건성안 치료제를 개발할 수 없었다.
따라서, 현재 알려진 건성안 치료제들이 충분하지 못할 뿐 아니라, 이러한 건성안 치료제를 개발하기 위해 개발된 동물모델도 한계가 있기 때문에 새로운 건성안 치료제의 개발에 효과적으로 활용할 수 있는 동물모델의 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 극복하고 새로운 건성안 동물모델의 개발을 위해 연구 노력한 결과, 장기간 건성안 동물모델로서 토끼를 최초로 이용함으로써 재현성 및 실용성이 우수함과 동시에 간단한 시술로 12주와 같은 장기간의 건성안 동물모델을 구현할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 재현성 및 실용성이 우수함과 동시에 간단한 시술로 12주와 같은 장기간 건성안 토끼 동물모델을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 장기간 건성안 토끼 동물모델을 이용한 건성안 예방 또는 치료용 약물의 효과 판정을 위한 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 보톡스-B, 염화벤잘코늄 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 물질을 토끼의 눈물샘에 주사 또는 점안하여 얻어진 것을 특징으로 하는 장기간 건성안 토끼 동물모델을 제공한다.
본 발명에 따른 토끼 동물모델은 보톡스-B 0.5 내지 1.0U/0.1cc의 토끼 눈물샘 주사 및 0.2% 염화벤잘코늄(2mg/1ml)의 토끼 눈 점안에 의해 얻어질 수 있으며, 일 실시예로서 보톡스-B 0.5U/0.1cc의 토끼 눈물샘 주사 및 0.2% 염화벤잘코늄의 토끼 눈 점안을 통해 얻어질 수 있으며, 또한 다른 실시예로서 보톡스-B 1.0U/0.1cc를 토끼의 눈물샘에 주사하여 얻어질 수 있다.
이때, 보톡스-B 주사량이 상기 범위를 벗어나면 눈물샘 외에 눈꺼풀 전체의 위축이 일어나 불완전한 눈깜박임에 의한 노출성 각막염을 유발할 수 있는 등의 부작용이 야기될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 장기간 건성안 토끼 동물모델에 후보 약물을 투여하는 단계; 및 상기 토끼 동물모델에서 건성안의 개선 정도를 평가하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 건성안 예방 또는 치료용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 건성안 예방 또는 치료용 약물의 스크리닝 방법은 하기 i) 내지 viii) 지표 중 어느 하나 또는 둘 이상의 지표를 생리식염수를 투여한 대조군의 그것과 비교하여 후보 약물을 투여한 약물처리군에서의 건성안의 개선 정도를 평가할 수 있다:
i) 눈물분비량의 변화
ii) 각막 형광 염색의 변화
iii) 술잔세포의 변화
iv) 눈물샘의 위축 변화
v) 염증세포의 침윤 변화
vi) 각막상피의 탈락 변화
vii) 점액분비세포의 변화
viii) 자멸세포의 변화
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 장기간 건성안 토끼 동물모델에 있어서, 보톡스-B의 용량을 1.0 unit/0.1cc까지 증량하여 건성안을 유발한 경우 보톡스-B 0.5 unit/0.1cc만을 주사한 실험군보다 장기간 염증성 건성안이 유지되었으며, 염화벤잘코늄 점안군과 비교하여서도 염증성 건성안 유발이 유의한 것을 확인할 수 있었다.
도 4 내지 도 15를 참조하면, 본 발명에 따른 장기간 건성안 토끼 동물모델과 같이 보톡스-B 1.0 unit/0.1cc의 눈물샘 주사에 의해 눈물샘 구조가 위축되었고, 이에 따라 눈물분비량이 유의하게 장기간 감소함으로써 각막미란을 지속적으로 유발하였고, 이로 인해 2차적으로 각막의 염증을 유발한 것으로 판단되었다. 또한 이러한 염증성 건성안에 대한 검증은 각결막 특수염색을 통한 술잔세포 수의 감소, 자멸세포의 증가로 확인되었다.
또한, 각막염증을 좀더 유발하고자 하는 경우 염화벤잘코늄 점안을 추가적으로 시행하여 염증성 각막염 모델을 유발할 수 있으며, 기존의 건성안 동물모델이 그 실현성이나 재현성에서 문제를 보인 반면, 본 발명과 같이 토끼 눈물샘에 대한 보톡스-B 1.0 unit/0.1cc의 주사를 통하여 간편하게 1번의 시술로 12주까지 장기간의 염증성 건성안 토끼 동물모델을 확립할 수 있었다.
본 발명에 따른 토끼 동물모델은 최적 농도 보톡스-B의 토끼 눈물샘 주사와 염화벤잘코늄의 토끼 눈 점안을 통하여 재현성 및 실용성이 우수함과 동시에 간단한 시술로 12주와 같은 장기간의 건성안 토끼 동물모델을 확립할 수 있다. 특히, 종래 사용해 오던 쥐 등의 동물모델은 단기간의 건성안 동물모델일 뿐 아니라, 인간과의 유연관계의 한계로 인하여 이러한 건성안 동물모델을 이용한 건성안 치료 또는 예방용 약물 개발에 한계가 있었는데, 본 발명에 따른 장기간 건성안 토끼 동물모델은 이러한 문제점을 개선하여 실제 건성안을 겪고 있는 환자의 치료 또는 예방용 약물 개발에 보다 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 상하부 눈물샘에 대한 보톡스-B 주사 방법을 개시한 것이고,
도 2는 보톡스-B 2.0unit을 주입한 토끼에서 발생한 눈꺼풀 위축과 노출성 각막염을 나타낸 것이고,
도 3은 본 발명에 따른 토끼 동물모델에서의 눈물분비량 비 변화를 나타낸 것이고,
도 4는 각막형광염색 등급기준을 나타낸 것이고,
도 5 및 도 6은 본 발명에 따른 토끼 동물모델에서의 각막형광염색 변화를 나타낸 것이고,
도 7 및 도 8은 본 발명에 따른 토끼 동물모델에 있어서 각각 실험 2주와 8주째 각 군에서 압흔세포검사 결과를 나타낸 것이고,
도 9 및 도 10은 본 발명에 따른 토끼 동물모델에 있어서 각각 실험 2주와 8주째 각 군에서 눈물샘의 H&E 염색 분석 결과를 나타낸 것이고,
도 11 및 도 12는 본 발명에 따른 토끼 동물모델에 있어서 각각 실험 2주와 8주째 각 군에서 각막의 H&E 염색 분석 결과를 나타낸 것이고,
도 13은 본 발명에 따른 토끼 동물모델에 있어서 실험 2주째 각 군에서 결막의 MUC5AC 염색 분석 결과를 나타낸 것이고,
도 14 및 도 15는 본 발명에 따른 토끼 동물모델에 있어서 각각 실험 2주와 8주째 각 군에서 각막의 TUNEL 염색 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 보톡스-B 2.0unit을 주입한 토끼에서 발생한 눈꺼풀 위축과 노출성 각막염을 나타낸 것이고,
도 3은 본 발명에 따른 토끼 동물모델에서의 눈물분비량 비 변화를 나타낸 것이고,
도 4는 각막형광염색 등급기준을 나타낸 것이고,
도 5 및 도 6은 본 발명에 따른 토끼 동물모델에서의 각막형광염색 변화를 나타낸 것이고,
도 7 및 도 8은 본 발명에 따른 토끼 동물모델에 있어서 각각 실험 2주와 8주째 각 군에서 압흔세포검사 결과를 나타낸 것이고,
도 9 및 도 10은 본 발명에 따른 토끼 동물모델에 있어서 각각 실험 2주와 8주째 각 군에서 눈물샘의 H&E 염색 분석 결과를 나타낸 것이고,
도 11 및 도 12는 본 발명에 따른 토끼 동물모델에 있어서 각각 실험 2주와 8주째 각 군에서 각막의 H&E 염색 분석 결과를 나타낸 것이고,
도 13은 본 발명에 따른 토끼 동물모델에 있어서 실험 2주째 각 군에서 결막의 MUC5AC 염색 분석 결과를 나타낸 것이고,
도 14 및 도 15는 본 발명에 따른 토끼 동물모델에 있어서 각각 실험 2주와 8주째 각 군에서 각막의 TUNEL 염색 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 건성안 토끼동물 모델 제작
2kg 흰색토끼 15마리 30안을 다음과 같이 3마리 6안씩 5군으로 나누어 실험하였고, 다음과 같이 안구 건조증을 유발하였다. 먼저, 준비된 토끼를 대상으로 틸레타민(Tiletamine)과 졸라제팜(Zolazepam)의 혼합마취제(Zoletilㄾ, Virbac Lab, France) 12.5mg/Kg 및 자일라진(Xylazine, Rompunㄾ, Bayer Korea, Korea) 12.5mg/kg을 근육 내 주사하여 토끼를 마취시켰다. 이때, 각 실험군을 다음과 같이 분류하였다.
A군 : 상,하부 눈물샘에 생리식염수를 주사한 대조군
B군 : 0.2% 염화벤잘코늄 하루 2번씩 점안한 실험군
C군 : 보톡스-B 0.5U/0.1cc를 눈물샘에 주사한 실험군
D군 : 보톡스-B 1U/0.1cc를 눈물샘에 주사한 실험군
E군 : 보톡스-B 0.5U/0.1cc를 눈물샘에 주사하고 하루 2번 0.2% 염화벤잘코늄을 점안한 실험군
그리고, 도 1과 같이 외상방의 주눈물샘과 내하방의 덧눈물샘에 26게이즈 주사침을 이용하여 각각 보톡스-B를 주입하였다. 이때, 보톡스-B의 용량은 80kg 성인에서 보톡스 표준용량인 20unit을 기준으로 하여, 2kg 토끼로의 주입 용량으로 환산하여 0.5unit을 최소주입용량으로 결정하였다. [(2000 g/80,000 g) x 20U =0.5U]
그리고, 3마리 토끼 단안 눈물샘에 각각 0.5unit, 1.0unit 및 2.0unit을 주입하여 눈꺼풀 및 안구, 전신적 부작용 유무를 관찰하였다. 0.5unit 및 1.0unit를 주입한 토끼에서는 특기할 만한 부작용을 관찰하지 못하였으나, 2.0unit을 주입한 토끼에서는 전신적 부작용은 없었으나 눈깜박임이 거의 관찰되지 않았으며, 깜박임 시에도 완전한 눈꺼풀의 닫힘이 이루어지지 않았다. 즉 고용량의 보톡스 주입에 의해 눈물샘 외에 눈꺼풀 전체의 위축이 일어나 1주 이내에 불완전한 눈깜박임에 의한 노출성 각막염이 유발된 것을 확인하였다(도 2 참조). 이에 토끼 눈물샘 주입을 위한 보톡스 용량을 0.5unit 및 1.0unit으로 결정하였다.
<실시예 2> 건성안 토끼동물 모델의 유용성 평가
1. 셔머 테스트(shirmer test)
마취된 토끼에서 세극등 현미경으로 각막을 관찰하고 플루오르신 각막염색을 시행하여 점상각막염이 없는 것을 확인한 후, 아무 조작도 가하지 않은 상태에서 5x35 mm의 와트만 필터지 스트립을 하측결막낭 외측 1/3 부위에 삽입한 후, 5분 뒤에 접힌 부분으로부터 누액으로 적셔진 부분의 길이를 mm 단위로 측정하는 안구건조증 검사인 셔머 테스트(shirmer test)를 시행하였다. 이때, 실험 시작 후 3일, 5일, 1주 이후 1주 간격으로 12주까지 셔머 테스트(shirmer test)를 시행하여 눈물 분비량 변화를 관찰하였고, 눈물분비량은 변이를 최소화하기 위하여 실험 후 셔머 테스트 측정치를 실험전 측정값으로 나누어 눈물분비량의 상대값 비로 나타내어 대조군과 비교하였으며, 통계방법으로는 Mann-Whitney U test를 시행하였다.
그 결과, 하기 표 1 및 도 3과 같이 C 내지 E군의 모든 실험군은 실험 후 3일째부터 눈물분비량의 비가 통계적으로 유의하게 감소하였으며(p<0.05), B군은 5일 이후부터 유의하게 감소하였다. 한편, C군을 제외한 실험군이 12주째까지 유의한 감소를 유지하였다(p<0.05). 12주째 각 실험군 간의 눈물분비량의 비 차이는 통계적으로 유의하지는 않으나 E, D, B, C군의 순으로 많이 감소하였다.
A(N=6) | B(N=6) | C(N=6) | D(N=6) | E(N=6) | |
3D | 1.24±0.26 | 0.95±0.36 | 0.72±0.29 | 0.65±0.22 | 0.65±0.28 |
5D | 1.22±0.32 | 0.85±0.38 | 0.71±0.26 | 0.66±0.28 | 0.68±0.24 |
7D | 1.32±0.28 | 0.81±0.42 | 0.72±0.22 | 0.71±0.24 | 0.69±0.26 |
2W | 1.22±0.22 | 0.78±0.26 | 0.79±0.36 | 0.69±0.26 | 0.72±0.20 |
3W | 1.38±0.36 | 0.79±0.28 | 0.78±0.33 | 0.75±0.32 | 0.71±0.30 |
4W | 1.18±0.18 | 0.72±0.36 | 0.77±0.36 | 0.71±0.29 | 0.68±0.32 |
5W | 1.18±0.25 | 0.77±0.25 | 0.74±0.24 | 0.70±0.24 | 0.65±0.31 |
6W | 1.15±0.26 | 0.78±0.28 | 0.88±0.29 | 0.72±0.27 | 0.68±0.29 |
7W | 1.22±0.33 | 0.8±0.21 | 0.85±0.31 | 0.69±0.36 | 0.69±0.21 |
8W | 1.11±0.38 | 0.82±0.29 | 0.82±0.32 | 0.73±0.25 | 0.72±0.22 |
9W | 1.25±0.28 | 0.78±0.32 | 0.91±0.37 | 0.75±0.31 | 0.71±0.38 |
10W | 1.15±0.42 | 0.75±0.28 | 0.89±0.25 | 0.78±0.20 | 0.69±0.26 |
11W | 1.14±0.21 | 0.77±0.34 | 0.95±0.33 | 0.77±0.21 | 0.68±0.24 |
12W | 1.11±0.40 | 0.81±0.27 | 0.98±0.20 | 0.75±0.25 | 0.69±0.32 |
2. 각막형광염색 검사
마취된 토끼에서 세극등 현미경으로 각막을 관찰하였고, 플루오르신 각막염색을 시행하여 각막형광염색 변화를 검사하였다. 이때, 실험 시작 후 3일, 5일, 1주 이후 1주 간격으로 12주까지 각막형광염색 검사를 시행하여 각막형광염색 등급을 1등급 내지 4등급으로 분류하였다. 이때, 도 4에서 0등급은 어떠한 점상염색이 관찰되지 않는 상태이고, 1등급 내지 3등급은 각각 1/8, 1/4 및 1/2 이하로 점상염색이 관찰되는 상태이며, 4등급은 1/2 이상으로 점상염색이 관찰되는 상태를 의미한다.
그 결과, 도 5및 도 6과 같이 보톡스-B를 주사한 C, D, E군은 3일째부터 유의한 각막 염색 증가를 나타내었다(p<0.05). BAC 점안군인 B 및 E군은 5일째부터 유의한 각막 염색 증가를 나타내었다. 보톡스-B 0.5unit/0.1cc를 주사한 C군은 6주째부터 각막 염색 등급이 감소하기 시작하여 10주 이후부터는 대조군과 비교하여 유의한 차이가 없었다. 나머지 B, D, E군은 12주째까지 2등급 이상의 각막 형광 염색이 유지되었으며, 통계적으로는 유의하지 않으나 D, B, E군의 순으로 각막 형광 염색 등급이 높았으며, 이는 눈물분비량의 비와 연관성을 가지는 것으로 나타났다.
3. 압흔세포검사(impression cytology)
실험 2주와 8주째 각 군에서 셀룰로오스 아세테이트 여과지를 5x5 mm 크기로 잘라 상부 결막에 90g의 압력으로 9초간 눌러 압흔세포검사(impression cytology)를 시행하여 70% 에틸알코올로 고정한 후 PAS 염색을 시행하고 고배율(x200) 시야에서 술잔세포를 관찰하였다. 이때, 술잔세포의 수를 모두 세어서, 서로 다른 부위에서 겹치지 않도록 하여 10회 반복한 후 평균값을 구하여 대조군과 비교하였으며, 통계방법으로는 repeated ANOVA test를 시행하였다.
그 결과, 하기 표 2와 도 7 및 도 8과 같이 모든 실험군에서 2주와 8주째 측정된 술잔세포의 밀도가 유의하게 감소하였으나 C군은 8주째 통계적으로 유의한 감소는 유지하였으나 가장 밀도가 높게 관찰되었다.
Group | 2weeks | 8weeks |
A | 18.50±5.56 | 23.8±8.25 |
B | 7.40±4.56* | 8.50±2.55* |
C | 3.55±2.25* | 12.80±3.64* |
D | 4.05±3.51* | 4.50±1.58* |
E | 2.50±2.15* | 3.40±2.21* |
4. 눈물샘의 생검 및 H&E 염색 분석
실험 2주 및 8주째의 각 실험군에서 1마리의 토끼를 희생하여 양안 주눈물샘 및 덧눈물샘을 생검하여 포르말린에 고정시킨 후, H&E 염색을 시행하여 염증세포 침윤 여부, 분비샘의 변화를 검토하였다.
그 결과, 도 9 및 도 10과 같이 실험 2주와 8주째 시행한 눈물샘의 조직검사상 보톡스-B를 주사한 C, D, E군에서는 눈물샘의 위축이 전체적으로 관찰되었으며, BAC를 점안한 B과 E군에서는 눈물샘의 위축보다는 염증세포의 침윤이 다수 관찰되었다.
5. 각막의 생검 및 H&E 염색 분석
실험 2주 및 8주째의 각 실험군에서 1마리의 토끼를 희생하여 각막을 생검하여 포르말린에 고정시킨 후, H&E 염색을 시행하여 염증세포 침윤 여부, 분비샘의 변화를 검토하였다.
그 결과, 도 11과 같이 실험 2주째 시행한 각막의 조직검사상 D, E군에서 각막상피의 얇아짐이 관찰되었으며, 특히 D군에서 각막의 상피의 얇아짐이 뚜렷하였다. B, C, D군에서 각막 상피의 탈락이 관찰되었다. B, D, E군에서는 염증세포의 침윤 또한 관찰되었다. 그리고, 도 12와 같이 실험 8주째까지 이러한 소견은 유지되었으나 C군의 각막에서는 각막 얇아짐 소견이나 염증세포 침윤소견이 뚜렷하지 않았다.
6. 결막의 생검 및 MUC5AC 염색 분석
실험 2주째의 각 실험군에서 1마리의 토끼를 희생하여 각결막을 생검하여 포르말린에 고정시킨 후, MUC5AC 면역특수염색을 시행하여 결막 상피세포의 점액분비세포의 변화를 검토하였다. 보다 상세하게는, MUC5AC 염색은 먼저 0.1M 인산완충용액(phosphate-buffered-saline solution; PBS, pH 7.4)에 4% 파라포름알데히드가 포함된 고정액으로 조직을 고정하였다. PBS로 3번의 세척과정을 거친 후, pH 7.3의 PBS에 1% 일반 생리식염수와 0.2% 트립톤 X-100을 포함시켜 조직을 얼음 위에서 5분간 반응시켜 세포의 투과력을 증강시켰다. 이후 1% BSA-PBS가 포함된 10% 생리식염수로 조직을 1시간 동안 반응시킨 후, 실온에서 1% BSA-PBS에 희석된 일차항체에 1시간 동안 반응시키고 PBS로 3회 세척하였다. 이차항체로 1시간 동안 반응시킨 후 다시 조직을 PBS로 3회 세척하고 광학 현미경으로 세포를 관찰하였다.
그 결과, 도 13과 같이 실험 2주째 시행한 각결막의 MUC5AC 염색상 모든 실험군에서 점액분비세포가 거의 관찰되지 않았으며, 특히 D, E군에서는 점액세포가 관찰되지 않았다.
7. 결막의 생검 및 TUNEL 염색 분석
실험 2주 및 8주째의 각 실험군에서 1마리의 토끼를 희생하여 각막을 생검하여 포르말린에 고정시킨 후, TUNEL 염색을 시행하여 각막의 자멸세포의 변화를 검토하였다. 보다 상세하게는, TUNEL 염색은 POD in situ 세포사 분석 키트(Roche, Germany)를 사용하였는데, 먼저 파라핀 블록을 3μm의 두께로 만든 후 이를 60℃에서 1시간 동안 열을 가하여 파라핀을 제거한 후 자일렌과 100% 에탄올, 95% 에탄올 및 PBS로 세척하여 탈수시켰다. 조직 절편을 프로테아제K(20 μg/ml)에 15분, 퍼옥시데이즈의 활성을 막기 위해 3% H2O2에 처리하였다. 슬라이드를 물로 씻어 낸 후 PBS 용액에 5분간 담그고, 실온에서 평형완충액을 점적하여 2분간 반응시켰다. 그리고 말단 뉴클레오티드 전이효소(terminal deoxynucleotidyl transferase; TdT) 효소를 슬라이드에 점적한 후 습식 챔버에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 PBS 용액에 3차례 세척하여 건조시킨 다음 커버터-POD 용액(50μl)을 조직에 점적한 후 30분 동안 배양하였다. 이를 다시 PBS 용액으로 3회 세척한 후 DAB(diaminobenzidine) 기질 용액(500μl)을 떨어뜨려 5분간 반응시켜 발색 반응이 일어나게 하였다. 발색 반응이 일어난 세포층을 확실하게 구별하기 위해서 헤마톡실린(Harris, USA) 용액으로 대조 염색을 시행하였다. 마지막으로 95% 에탄올, 100% 에탄올 및 자일렌 용액에서 순차적으로 세척하여 탈수시킨 후 마운팅하여 조직 표본을 완성하였다. 염색이 끝난 후 광학현미경으로 관찰하여 갈색으로 염색된 핵을 가진 세포를 자멸세포(apoptotic cell)로 판정하였다. 이때, 세포사 지표(Apoptotic index)는 500개의 세포 중 양성으로 염색된 세포의 수로 정의하였으며, 세포의 수는 저배율 시야에서 세포가 균등하게 분포된 부위를 선택한 후 다시 200배의 고배율 시야에서 측정하였으며, 3회 측정한 후 평균값을 사용하였고, 통계방법으로는 repeated ANOVA test(p<0.05)를 시행하였다.
그 결과, 하기 표 3 및 도 14 및 도 15와 같이 모든 실험군에서 자멸세포수가 대조군보다 유의하게 높게 관찰되었으며, C군은 2주보다 유의하게 세포사 지표가 감소하는 소견을 보였다.
실험군 | 세포사 지표(apoptotic index) | |
2주째 | 8주째 | |
A (대조군) | 1.50±1.25 | 2.30±1.65 |
B (0.2% BAC 처리군) | 8.40±2.50* | 7.40±2.50** |
C (BTX-B 0.5U/0.1cc 처리군) | 7.55±2.25* | 5.55±3.15** |
D (BTX-B 1.0U/0.1cc 처리군) | 9.70±1.56* | 8.70±1.76** |
E (BTX-B 0.5U/0.1cc & 0.2% BAC 처리군) | 8.25±2.15* | 9.25±3.75** |
상기 실험결과들을 종합하면, 보톡스-B 용량을 1.0 unit/0.1cc까지 증량하여 건성안을 유발한 경우 보톡스-B 0.5 unit/0.1cc만을 주사한 실험군보다 장기간 염증성 건성안이 유지되었으며, BAC 점안군과 비교하여서도 염증성 건성안 유발이 유의한 것을 확인할 수 있었다.
즉, 보톡스-B 1.0 unit/0.1cc의 눈물샘 주사에 의해 눈물샘 구조가 위축되었고, 이에 의하여 눈물분비량이 유의하게 장기간 감소함으로써 각막미란을 지속적으로 유발하였고, 이로 인해 2차적으로 각막의 염증을 유발한 것으로 판단된다. 또한 이러한 염증성 건성안에 대한 검증은 각결막 특수염색을 통한 술잔세포 수의 감소, 자멸세포의 증가로 확인되었다.
또한, 각막염증을 좀더 유발하고자 하는 경우 BAC 점안을 추가적으로 시행하여 염증성 각막염 모델을 유발할 수 있으며, 기존의 건성안 동물모델이 그 실현성이나 재현성에서 문제를 보인 반면 이번 토끼 눈물샘에 대한 보톡스-B 1.0 unit/0.1cc의 주사를 통하여 간편하게 1번의 시술로 12주까지 장기간의 염증성 건성안 모델이 확립되었으며, 이는 지속적인 BAC 점안군에 비교하여서도 유의하였다.
Claims (6)
- 보톡스-B 0.5 내지 1.0U/0.1cc를 토끼의 눈물샘에 주사하여 얻어진 것을 특징으로 하는 장기간 건성안 토끼 동물모델.
- 청구항 1에 있어서, 상기 동물모델은 염화벤잘코늄을 추가로 점안하여 얻어진 것을 특징으로 하는 장기간 건성안 토끼 동물모델.
- 청구항 2에 있어서, 상기 동물모델은 보톡스-B 0.5U/0.1cc 및 0.2% 염화벤잘코늄을 토끼의 눈물샘에 주사 또는 점안하여 얻어진 것을 특징으로 하는 장기간 건성안 토끼 동물모델.
- 청구항 1 에 있어서, 상기 동물모델은 보톡스-B 1.0U/0.1cc를 토끼의 눈물샘에 주사하여 얻어진 것을 특징으로 하는 장기간 건성안 토끼 동물모델.
- 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 따른 장기간 건성안 토끼 동물모델에 후보 약물을 투여하는 단계; 및 상기 토끼 동물모델에서 건성안의 개선 정도를 평가하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 건성안 예방 또는 치료용 약물의 스크리닝 방법.
- 청구항 5에 있어서, 상기 건성안의 개선 정도를 평가하는 단계는 후보 약물을 투여한 약물처리군에서의 하기 i) 내지 viii) 지표 중 어느 하나 또는 둘 이상의 수치를 생리식염수를 투여한 대조군의 그것과 비교하여 건성안의 개선 정도를 평가하는 것을 특징으로 하는 건성안 예방 또는 치료용 약물의 스크리닝 방법:
i) 눈물분비량의 변화
ii) 각막 형광 염색의 변화
iii) 술잔세포의 변화
iv) 눈물샘의 위축 변화
v) 염증세포의 침윤 변화
vi) 각막상피의 탈락 변화
vii) 점액분비세포의 변화
viii) 자멸세포의 변화
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