KR101185442B1 - 단일히터를 갖는 연속흐름 ｐｃｒ 마이크로유체 디바이스 및 제조방법 - Google Patents

단일히터를 갖는 연속흐름 ｐｃｒ 마이크로유체 디바이스 및 제조방법 Download PDF

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Abstract

연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스가 개시된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스는 하부에 단일히터가 결합되는 유리기재; 상기 유리기재 상부에 결합되고, 샘플유체가 유입되는 샘플입구부와, 상기 샘플입구부와 일부가 연결되고 좌우 대칭되는 단절형 빗살무늬로 형성되는 제1채널부 및 상기 제1채널부에 수직방향으로 일단이 연결되는 컬럼부를 포함하고, 상기 유리기재 상부에 결합되는 하부PDMS층; 및 상기 컬럼부의 타단과 연결되고, 상기 제1채널부와 180도 회전 대칭되어 형성되는 제2채널부 및 상기 제2채널부와 연결되어 상기 샘플유체가 유출되는 샘플출구부를 포함하고, 상기 하부PDMS층 상부에 접합되는 상부PDMS층을 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

단일히터를 갖는 연속흐름 ＰＣＲ 마이크로유체 디바이스 및 제조방법{CONTINUOUS-FLOW PCR MICROFLUID DEVICE WITH SINGLE HEATER AND MANUFACTURING METHOD THE SAME}
본 발명은 마이크로유체 디바이스 및 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단일히터를 갖는 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스 및 제조방법에 관한 것이다.
최근 유체 기술과 MEMS(micro-electromechanical system)를 이용한 미세가공기술을 기존의 질병 분석/진단용 칩 기술에 접목시키는 시도가 많이 이루어지고 있다. 상기 시도는 적은 양의 액체 시료를 단위 칩에서 다룰 수 있도록 시료분석에 필요한 모든 구성요소를 소형화 및 집적화하여 랩온어칩(lap-on-a-chip)을 구현한다.
이와 같은 랩온어칩은 샘플전처리부, 핵산 증폭부, 증폭된 핵산을 이용해 진단결과를 내는 감지부로 구성된다. 특히, 상기 DNA증폭부는 랩온어칩 제조에 있어 가장 중요한 부분에 해당하며, 일반적으로 PCR(중합효소 연쇄반응) 방법이 이용되고 있다.
상기 PCR 방법은 타겟 DNA 증폭방법으로서 열에 안정한 DNA 중합효소, DNA 단량체, 프라이머, 주형 DNA 등으로 이루어진 반응액을 외부에서 주기적인 가열을 통해서 특정 타겟 DNA를 증폭해 내는 방법이다.
상기 PCR 방법을 적용하여 핵산을 증폭하는 마이크로유체 디바이스에서는 일반적으로 열변성(denaturation), 결합(annealing) 및 신장(extension) 단계를 위한 3개의 별도의 온도구역들이 필요하다. 표적 앰플리콘(amplicon)의 크기가 300bp 미만인 경우에는 열변성 및 신장 단계가 때로는 동일 온도에서 수행되고 있으나, 이러한 경우에도 여전히 2개의 별도 온도구역들이 요구되고 있다. 그리고 상기 온도구역들의 콘트롤을 위해 종래에는 금속 가열 블록, 박막 히터, 적외선 장치, 할로겐 램프, 마이크로웨이브, 백금 레지스터 또는 유도 가열장치들이 이용되어 왔다.
한편, 폴리(디메틸실록산)(Poly(dimethylsiloxane)), 이하 PDMS)은 제조공정의 간단함, 다양한 기재들과의 결합 용이성, 높은 광학투명성, 저렴한 비용 등의 장점으로 인하여 마이크로유체 디바이스 제조를 위해 가장 널리 채택되는 재료들 중 하나이다. 열은 높은 열전도도(1.1 W?K-1?m-1)를 가지는 유리기재를 통해 쉽게 전달되므로, 유리-PDMS 하이브리드 시스템이 연속흐름 PCR 실현을 위해 많이 이용되고 있다.
이와 같은 유리-PDMS 하이브리드 시스템에서는 비교적 낮은 열전도도(0.16 W?K-1?m-1)를 갖는 PDMS로 제조된 마이크로채널로 둘러싸여 상기 마이크로채널 내에서 비교적 안정한 온도가 유지되도록 한다. 한편, PDMS의 낮은 열전도도 때문에, 특정 두께를 갖는 평평한 PDMS 벌크는 수직방향으로 온도구배를 가지며 히터 위에 놓으면 PDMS의 최저면 및 최상면은 2개의 구별되는 온도범위를 나타낸다. 즉, 2개의 별도 온도구역들이 요구되는 PCR방법에 특히 유리하다.
따라서, 유리-PDMS 하이브리드 시스템에서 보다 정확하고 간소화된 온도 조절 및 측정과정을 제공하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다.
본 발명의 실시예들은 단일히터를 사용하여 연속흐름 PCR 동작을 간소화시킨 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면 하부에 단일히터가 결합되는 유리기재; 상기 유리기재 상부에 결합되고, 샘플유체가 유입되는 샘플입구부와, 상기 샘플입구부와 일부가 연결되고 좌우 대칭되는 단절형 빗살무늬로 형성되는 제1채널부 및 상기 제1채널부에 수직방향으로 일단이 연결되는 컬럼부를 포함하고, 상기 유리기재 상부에 결합되는 하부PDMS층; 및 상기 컬럼부의 타단과 연결되고, 상기 제1채널부와 180도 회전 대칭되어 형성되는 제2채널부 및 상기 제2채널부와 연결되어 상기 샘플유체가 유출되는 샘플출구부를 포함하고, 상기 하부PDMS층 상부에 접합되는 상부PDMS층을 포함하는 것을 특징으로 하는 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스가 제공될 수 있다.
또한, 상기 단일히터는 핫플레이트인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 하부PDMS층의 두께와 상기 상부PDMS층의 두께는 5:1인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 유리기재 하부에 단일히터를 결합하는 제1단계; SU-8 패턴화 유리 마스터로부터 복제 몰딩하여 샘플유체가 유입되는 샘플유체가 유입되는 샘플입구부 및 상기 샘플입구부와 일부가 연결되고 좌우 대칭되는 단절형 빗살무늬로 형성되는 제1채널부를 포함하는 하부PDMS층을 제조하는 제2단계;상기 제1채널부와 180도 회전 대칭되어 형성되는 제2채널부 및 상기 제2채널부와 연결되어 상기 샘플유체가 유출되는 샘플출구부를 포함하는 상부PDMS층을 제조하는 제3단계; 상기 하부PDMS층에 상기 제1채널부 및 상기 제2채널부를 수직방향으로 연결하는 컬럼부를 제조하는 제4단계; 및 상기 하부PDMS층의 하부에는 상기 유리기재를 결합시키고, 상기 하부PDMS층의 상부에는 상기 상부PDMS층을 접합시키는 제5단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스 제조방법이 제공될 수 있다.
이 때, 상기 제4단계는, PMMA 플레이트에 컬럼부재를 삽입하는 단계; SU-8 패턴화한 유리 마스터 상에 상기 컬럼부재를 맞춰 조정하는 단계; 상기 PMMA 플레이트 및 상기 유리 마스터 사이의 공간에 PDMS 전구체 및 경화제의 10:1(w/w) 혼합물을 채우는 단계; 및 열경화 후, 상기 PMMA플레이트 및 상기 유리 마스터를 제거하여 경화된 상기 PDMS를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 제1채널부 및 상기 제2채널부는 동일한 상기 SU-8 패턴화 유리 마스터를 사용하여 복제하고, 상기 제2채널부는 상기 제1채널부를 180도 회전 대칭시켜 배치하는 것을 특징으로 할 수 있다.
한편, 상기 하부PDMS층의 두께는 하기 [식1]에 의하여 산출되는 것을 특징으로 할 수 있다.
[식1]
Figure 112011039365563-pat00001
(여기에서, HPDMS는 하부PDMS층의 두께이며, λPDMS는 PDMS의 열전도도(0.16 W?K-1?m-1), ts ''는 열변성 온도, ts ' 는 결합/신장 온도, αA는 열전달계수)
이 때, 상기 [식1]의 αA는 하기 [식2]에 의하여 산출되는 것을 특징으로 할 수 있다.
[식2]
Figure 112011039365563-pat00002
(여기에서, α는 공기의 열전달계수, ts ' 는 결합/신장 온도, trt는 실온(25℃))
본 발명의 실시예들은 종래 2 이상의 열원을 사용하였던 연속흐름 PCR에서의 온도조절을 단일히터를 사용하여 구현 가능케 함으로써, 연속흐름 PCR에서의 온도조절을 간소화시켜 저비용 고효율의 온칩 핵산 증폭시스템을 제공할 수 있다.
또한, 샘플유체가 3차원 구조를 가지는 유체도관을 흐르게 하여 작은 공간에서도 작동 가능하도록 함으로써, 장비 휴대성, 타기능과의 융합 가능성 및 접근성을 향상시킬 수 있다.
또한, 유체도관의 형성시 컬럼부재금속 필러를 이용하여 한번에 많은 수의 컬럼부(고종횡비를 갖는 컬럼부)를 동시 형성함으로써, 제작공정을 보다 단순화 시킬 수 있다.
또한, 하부PDMS층을 온도에 따른 특정 두께로 조절함으로써 다양한 조건의 반응을 일으킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스의 사시도이다.
도 2는 도 1에 도시된 Ⅱ-Ⅱ선을 따라 취한 단면도이다.
도 3은 도1의 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스의 상면도이다.
도 4는 도1의 컬럼부를 형성하는 공정 흐름을 개략적으로 도시한 공정도이다.
도 5는 도1의 하부PDMS층의 적외선 카메라 영상을 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스에서 샘플유체의 이동을 나타내는 도면이다.
도7은 본 발명의 일 실시예에 따른 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스에서 샘플유체가 흐르는 모습을 촬영한 사진이다.
도 8은 열순환기를 사용하여 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100)에서 수행된 DNA 증폭 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들에 대하여 상세히 설명하도록 한다. 그러나, 본 발명의 실시형태는 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서의 첨부된 도면의 구성요소들은 설명의 편의를 위하여 확대 또는 축소되어 도시되어 있을 수 있음이 고려되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100)의 사시도이다. 도 1을 참조하면, 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100)는 유리기재(120)와, 유리기재(120) 상부에 결합되는 하부PDMS층(130) 및 하부PDMS층 상부에 접합되는 상부PDMS층(140)을 포함한다.
유리기재(120)는 하부에 단일히터(110)가 결합된다. 단일히터(110)는 다양한 열원수단을 사용 가능하며, 특정 열원수단에 한정되지 아니한다. 예를 들면, 단일히터(110)는 핫플레이트일 수 있다.
하부PDMS층(130)은 유리기재(120) 상부에 결합되고, 샘플유체(S)가 흐르는 공간 중 하층기재에 해당한다. 하부PDMS층(130)은 샘플입구부(131), 샘플입구부(131)와 연결되는 제1채널부(133) 및 제1채널부(133)와 수직방향으로 연결되는 컬럼부(135)를 포함한다.
샘플입구부(131)는 샘플유체(S)가 유입되는 곳으로, 하부PDMS층(130) 일측에 형성될 수 있다. 샘플입구부(131)에는 실리콘 튜브(미도시)를 삽입하여 샘플유체(S)를 유입시킬 수 있다.
제1채널부(133)는 샘플유체(S)가 흐르는 유로 중 일부를 구성하는 것으로, 샘플입구부(131)와 일부가 연결되어 있을 수 있다. 제1채널부(133)는 좌우 대칭되는 단절형 빗살무늬(미표기)를 갖는다. 이에 대해서는 다른 도면을 참조하여 후술하기로 한다.
컬럼부(135)는 샘플유체(S)가 흐르는 유로 중 일부를 구성하는 것으로, 제1채널부(133)에 수직방향으로 일단이 연결된다. 구체적으로, 제1채널부(133)는 단절형 빗살무늬 형태의 유체도관이 복수 개 소정각도로 기울어져 배열되고, 상기 유체도관의 양단에는 수직방향으로 컬럼부(135)가 연결된다.
상부PDMS층(140)은 하부PDMS층(130) 상부에 접합되고, 샘플유체(S)가 흐르는 공간 중 상층기재에 해당한다. 상부PDMS층(140)은 제2채널부(142) 및 제2채널부(142)와 연결되는 샘플출구부(144)를 포함한다.
제2채널부(142)는 샘플유체(S)가 흐르는 유로 중 일부를 구성하는 것으로, 제1채널부(133)와 180도 회전 대칭되어 형성된다. 즉, 제2채널부(142)는 제1채널부(133)와 마찬가지로, 좌우 대칭되는 단절형 빗살무늬(미표기)를 갖는다. 다만, 제2채널부(142)는 제1채널부(133)와 180도 회전 대칭되어 형성되는 바, 제1채널부(133) 및 제2채널부(142)는 소정 각도로 엇갈려서 상하로 배치된다. 이에 대해서는 다른 도면을 참조하여 후술하기로 한다.
샘플출구부(144)는 샘플유체(S)가 유출되는 곳으로, 상부PDMS층(140) 일측에 형성될 수 있다. 샘플출구부(144)에는 실리콘 튜브(미도시)를 삽입하여 샘플유체(S)를 유출시킬 수 있다.
도 2는 도 1에 도시된 Ⅱ-Ⅱ선을 따라 취한 단면도이다. 도 2를 참조하면, 하부PDMS층(130)과 상부PDMS층(140)은 두께(높이)를 다르게 할 수 있다. 이와 같은 두께 차이는 PDMS의 두께와 표면온도 사이에 대략적인 선형 상관관계가 존재하기 때문이다.
본 발명의 발명자들은 결합/신장 과정을 위해 원하는 표면온도를 얻기 위하여, 하부PDMS층(130)의 두께를 산출하는데 필요한 수식을 증명하게 되었다. 하부PDMS층(130)의 두께를 조절함으로써, 다양한 온도조건을 요구하는 반응에도 적용가능한 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100)를 제조 가능하다.
하부PDMS층(130)의 두께는 하기 [식1]에 의하여 산출될 수 있다.
[식1]
Figure 112011039365563-pat00003
여기에서 HPDMS는 하부PDMS층(130)의 두께이며, λPDMS는 PDMS의 열전도도(0.16 W?K-1?m-1)이다. 한편, ts ''는 열변성 온도이고, ts ' 는 결합/신장 온도이고, αA는 열전달계수이다. αA는 하기 [식2]에서와 같이 정의될 수 있다.
[식2]
Figure 112011039365563-pat00004
여기에서, α는 공기의 열전달계수이며, ts ' 는 결합/신장 온도이고, trt는 실온(25℃)이다. 한편, 공기의 열전달계수는 하기 [식3]에서와 같이 표현될 수 있다.
[식3]
Figure 112011039365563-pat00005
Nu는 너셀 수(Nusselt number)이며, 그라스호프(Grashof, Gr)와 프란드틀 수(Prandtl numbers, Pr)의 곱으로 정의된다. 상수 C 및 지수 n은 상기 너셀 수의 범위가 104~109에 있을 경우, 각각 0.54 및 0.25이다. 한편, λ는 공기의 열전도도(2.83*10-2 W?K-1?m-1)이고, l은 특성길이로 플레이트 원주에 대한 면적 비율로 정의된다.
한편, 그라스호프(Gr)은 하기 [식4]에서와 같이 표현될 수 있다.
[식4]
Figure 112011039365563-pat00006
β는 부피 열팽창계수(50℃에서 0.0031/℃)이고, g는 중력가속도(9.8 m?s-2?kg), ρ는 공기밀도(1.093 kg/m3), l은 특성길이(cm), μ는 공기의 동적점성도(dynamic viscosity, 1.96*10-5 Pa?s)이다. 한편, 프란드틀 수 (Pr)은 하기 [식5]에서와 같이 표현될 수 있다.
[식5]
Figure 112011039365563-pat00007
CP는 열용량(1.005 KJ/kg?℃)이다. 마이크로유체 디바이스의 크기 뿐만 아니라 열변성 및 결합/신장 온도가 주어진다면, 하부PDMS층의 두께가 상술한 식들에 의하여 산출될 수 있다.
도 3은 도1의 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100)의 상면도이다. 도 3을 참조하면, 하부PDMS층(130)은 일측에 샘플입구부(131)가 형성되고, 샘플입구부(131)은 유체도관을 따라 제1채널부(133) 일부와 연결된다. 제1채널부(133)는 중앙선을 기준으로 상하 대칭되는 단절형 빗살무늬(133a)를 갖는다(도3a 참조).
상부PDMS층(140)은 제1채널부(133)를 180도 회전대칭시킨 제2채널부(142)를 포함하고, 제2채널부(142)는 마찬가지로 단절형 빗살무늬(142a)를 갖는다. 한편, 상부PDMS층(140)은 제2채널부(142) 일부와 연결되어 연장되는 샘플출구부(144)를 포함한다(도3b 참조).
제2채널부(142)는 제1채널부(133)를 회전대칭시킨 것이므로, 제1채널부(133) 및 제2채널부(142)를 제조하기 위해서는 1개의 Si 마스터만 요구된다. 즉, 상대적으로 두꺼운 하부PDMS층(130)을 위한 SU-8 패턴을 유리에 제작하고, 상술한 바와 같이 제작된 유리 마스터로부터 PDMS를 이용하여 복제 몰딩하고, 상부PDMS층(140)은 동일한 상기 유리 마스터로부터 PDMS를 이용하여 복제 된다. 다만, 하부PDMS층(130) 및 상부 PDMS층(140)의 접합 전에 상부PDMS층(140)을 180도 회전시킨 후 접합할 뿐이다(도3c참조).
구체적으로, 하부PDMS층(130)은 바닥면에 도3a와 같은 제1채널부(133)가 형성되고, 제1채널부(133)에 수직방향으로 컬럼부(135)가 형성된다. 컬럼부(135)는 제1채널부(133)의 빗살무늬 양단마다 각각 형성된다. 다음으로, 상부PDMS층(140)의 제2채널부(142)는 컬럼부(135) 위에 제1채널부(133)와 대응되도록 위치되어, 접합된다. 이로써, 3차원 구조를 가지는 유체도관이 형성될 수 있다.
도 4를 참조하면, 컬럼부(135)를 제조하기 위한 기재로써 우선 폴리(메틸메타크릴레이트) (Poly(methylmethacrylate) : 이하 PMMA) 플레이트(1)를 준비한다. 다만, 후술할 컬럼부재(2)를 삽입 가능한 기재이면 되고, 반드시 PMMA 플레이트(1)에 한정되는 것은 아니다. 설명의 편의를 위해서 이하에서는 상기 기재가 PMMA 플레이트(1)인 경우로 한정하여 설명하기로 한다.
다음으로, 특정 높이를 갖는 상용 가능한 컬럼부재(2) 복수 개를 PMMA 플레이트(1)에 삽입한다. 상기 컬럼부재(2)는 기둥 형상으로 금속 또는 플라스틱으로 이루어질 수 있다. 컬럼부재(2)를 PMMA 플레이트(1)에 삽입하기 위하여, PMMA 플레이트(1) 일면을 천공하되, 상기 천공되어 형성되는 구멍들은 컬럼부재(2)의 직경보다 약간 작은 직경을 가지도록 천공한다. 이는 컬럼부재(2)가 PMMA 플레이트(1)에 빽빽하게 삽입되도록 하기 위함이다. 한편, 상기 구멍들은 제1채널부(132)의 각 채널(빗살무늬) 양단에 대응하도록 형성한다(도4a 참조).
다음으로, SU-8 패턴화한 유리 마스터(3) 상에 컬럼부재(2)를 맞춰 조정하고(도4b 참조), PDMS 전구체 및 경화제의 10:1(w/w) 혼합물을 컬럼부재(2)가 삽입된 PMMA 플레이트(1)와 유리 마스터(3) 사이의 공간(cavity, 4)에 채운다(도 4c 참조).
다음으로, 80℃에서 30분간 열경화 한 후, PMMA 플레이트(1)를 들어올려 제거하고, 경화된 상기 PDMS를 유리 마스터(3)에서 벗긴다(도4d 참조).
상술한 방법으로, 컬럼부(135)를 하부PDMS층(130)에서 쉽게 제조하고, 적당한 높이의 컬럼부재(2)를 사용하여 원하는 두께의 하부PDMS층(130)을 제조하는 것이 가능하다. 또한, 컬럼부(135) 제조시에 컬럼부재(2)를 이용하여 한번에 다수의 마이크로미터의 크기의 구멍들을 형성함으로써, 제조공정을 보다 단순화시킬 수 있다.보다 단순화된 제조공정을 통해 고종횡비를 갖는 수직형 컬럼부(135)를 다량 제조할 수 있다.
이하에서는, 본 발명의 일 실시예에 따른 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100)의 실제 제작과정 및 실험예에 대하여 설명하기로 한다.
1. 재료
SU-8 3050 및 SU-8 디벨로퍼(developer)는 MicroChem(Newton, MA, USA)에서 구하였다. PDMS 프리폴리머(Sylgard 184) 및 경화제는 Dow Corning(Midland, MI, USA)를 이용하였다. Taq 폴리머라제, PCR 버퍼 용액 및 dNTPs는 Promega에서 구하였다. 100 bp DNA 래더(ladder) 및 아가로스(agarose) LO3 파우더는 Takara에서 구하였다. 소혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA, V fraction)은 Sigma에서 구하였다. SYBR Green I는 Lonza에서 구하였다. 40℃에서 14.2~17 cSt 범위의 점성도를 갖는 파라핀 오일(Paraffin oil, light fraction)을 사용하였다. 플라스미드 벡터 pGEM-3Zf(+)(Promega)는 DNA 주형으로 사용하였다.
2. 마이크로유체 디바이스 제조
SU-8 3050은 1,800rpm에서 30s 동안 플라즈마 처리된 유리 기재(120) 위에 스핀코팅되고, 그 후 95℃에서 30분간 소프트 베이킹되었다. 마스크 얼라이너(CA-6M, Shinu M.S.T, Korea)를 사용하여 UV(365nm, 15mW/cm2)를 30초 간 노출한 후, 하드 베이킹을 65℃에서 1분간 수행하고, 95℃에서 4.5 분간 다시 수행하였다.
다음으로, SU-8 패턴화 유리 마스터를 이소프로필 알코올로 전체 세척하고 건조시켰다. PDMS 프리폴리머와 경화제의 10:1(w/w) 혼합물을 탈기시키고, 유리 마스터 위에 부었다. 다시 80℃에서 30분간 경화시킨 후, 2개의 PDMS 레플리카(제1채널부(133) 및 제2채널부(142))를 1개의 유리 마스터로부터 몰딩하였다.
하부 및 상부 PDMS 층(130,140)의 두께는 각각 7.5mm 및 1.5mm로 제조되었다. 각 채널의 폭, 깊이 및 길이는 각각 950㎛, 75㎛ 및 12.6mm이었다. 증폭 주기수는 35로 설계되었다.
컬럼부(135, ~1mm)는 하부PDMS층(130) 상의 제1채널부(133)에서 각 채널의 두 끝부분 상에 제조되었다. 컬럼부(135)를 제조하는 방법은 상기에서 설명하였는 바, 여기에서는 생략하기로 한다. 컬러부(135)는 고종횡비를 가지도록 제조할 수 있으며, 본 실시예에서는 7:1의 종횡비로 제조되었다. 또한, 유체 상호연결을 위해, 하부 및 상부PDMS층(130,140)으로 샘플출입구(131)를 천공하고, 상부PDMS층(140)에서만 샘플출구부(144)를 천공하였다. 한편, 샘플출입구(131)는 하부PDMS층(130)에만 천공하는 것이 가능하다.
다음으로, 산소 플라즈마(90W, 0.7torr, 40s)(Femto Science, Korea)를 사용하여, 하부PDMS층(130)을 제1채널부(133)를 하부면으로 하여 유리기재(120)에 결합하였고(1.5mm 두께), 하부PDMS층(130)의 상부면은 상부PDMS층(140)의 제2채널부(142)에 결합하였다. 다음으로, 실리콘 튜브(내경 1mm, 외경 2mm)를 샘플출입구(131) 및 샘플출구부(144)에 삽입하였다. 조립된 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100)의 폭, 길이 및 전체 높이는 각각 50mm, 57mm 및 10.5mm이었다.
3. 온도 컨트롤
연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100)의 표면온도는 적외선(IR) 카메라(FLIR Thermovision A320)를 사용하여 측정하였다. 동일한 온도에서 결합 및 신장을 수행함으로써, 본 실험에 2단계 온도조절 PCR을 적용하였다.
열변성 온도는 핫 플레이트(110, MSH-20D, Daihan Scientific, Korea)위에 결합된 유리 기재(120)의 상부면상에서 측정하고, 결합/신장 온도는 유리기재(120)의 상부 위에 결합된 하부PDMS층(130)의 상부면 위에서 측정하였다. 열변성 및 결합/신장 온도는 각각 95℃ 및 72℃로 조정되었다. 열군데를 무작위로 선정하여 온도를 측정하고, 영상분석기(FLIR Quick Plot)를 사용하여 평가하였다.
도 5는 도1의 하부PDMS층(130)의 적외선 카메라 영상을 나타내는 도면이다. 도 5를 참조하면, 유리기재(120)의 상부면과 하부PDMS층(130)의 상부면의 온도는 온도가 안정화된 후 측정하였고, 안정화는 5분 이내에 이루어졌으며, 도 5에 도시된 바와 같이, 온도는 각각 95.4±0.2℃ 및 71.9±0.3℃로 평가되었다. 변이계수(CVs)를 사용하여 나타낸 온도 정확도는 유리기재(120)의 상부면과 하부PDMS 층(130)의 상부면에 대하여 각각 0.2%(n=10) 및 0.5%(n=10)이었다.
도 5에 도시된 바와 같이, 온도 측정은 균일하였다. 한편, 영상을 찍었을 때 컬럼부(135)들은 비어있었기 때문에, 컬럼부(135)의 위치에서의 황색은 핫 플레이트(히터, 110)의 상부에 위치한 유리 기재(120)의 표면 온도를 나타낸다.
연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100)의 폭 및 길이가 각각 50mm 및 57mm이고, Gr, Pr, α 및 αA가 상기에서 논의된 이론 산정치에 근거하여, 각각 11157.82, 0.698, 10.794/m2?℃ 및 539.7W/m2인 것을 고려하면, 하부PDMS층(130)의 적당한 두께는 6.7mm로 계산되었다.
그러나, 결합/신장 온도는 계산의 편의성을 위해 72℃ 대신에 75℃로 간주되었다. 또한, 계산된 Nu 값(7788.16)은 최저임계값(104)보다 약간 작았다. 이러한 작은 Nu 값은 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100)의 차지 공간이 작기 때문이다.
그러나, Nu가 104~109의 범위 내에 있을 때와 유사한 상태로 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100) 내에 공기 대류가 있는 것을 고려하면, 최종 결과들은 0.25 및 0.54가 각각 n 및 C로 치환되는 경우에서도 크게 변하지 않았다. 상기 계산에 근거하여, 온도를 1℃ 낮추기 위해서는 PDMS 두께를 약 0.33mm 증가시키고, 두께와 최종 온도 사이에 선형 상관관계가 있음을 고려하면, 이론적으로 최종 두께가 7.7mm가 되게 하는, 72℃의 실제 결합/신장 온도를 위해 보정할 때 6.7mm의 상기 계산에 약 1.0mm의 두께 증가가 필요하다고 추정하였다.
본 실험에서, 하부PDMS층(130)의 두께는 7.5mm로 제조되고, 하부PDMS층(130)의 상부면 상에서 측정된 실제 온도(71.9±0.3℃)는 계산값과 잘 매치되었음을 확인하였다. 이와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100)는 결합/신장 온도를 측정할 필요가 없으며, IR 카메라의 사용을 병행하는 경우에는 히터 다이얼과 히터의 표면온도 사이에 적당한 상관관계가 성립될 때, 온도 측정은 연속흐름 PCR 공정을 매우 간소화함으로써 생략될 수 있음을 확인하였다.
온도 측정은 한 경우 이상의 다른 주위 조건들 하에서 수행하였으며, 균일한 표면온도는 측정조건과 무관한 전체 반응을 통해 달성되었다. 일단 하부PDMS층(130)의 상부면 온도가 희망 설정 온도에 도달하여 안정화(~5분)되었을 때, PCR이 개시되었다.
실시간으로 측정한 바에 따르면, 표면 온도 변동은 1시간 주기 동안 ±0.3℃ 이내로 측정오차를 가져 무시할 수 있으며, 이는 장치의 신뢰성 높은 온도안정성을 확인해준다.
전체 반응시간이 50분 미만인 것을 감안하면, 본 연구원들은 전체 반응주기 동안 안정한 온도가 유지됨을 안전하게 추정할 수 있다. 또한, 상기 균일한 온도분포는 하부PDMS층(130)을 제조함으로써 더욱 개선될 수 있어서, 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100)의 전체 표면 위에서 같은 두께를 가진다.
4. 연속흐름 PCR
우선, 주사기 펌프(KD Scientific 200)를 사용하여, 500㎕의 1.5mg/ml BSA 용액을 5㎕/분의 유속으로 도입한 후, 9㎕/분의 유속으로 파라핀 오일의 플러그를 도입하였다. 다음으로, 30㎕ 샘플 플러그를 도입한 후, 파라핀 오일의 다른 플러그를 도입하였다. 이 방법으로, 상기 샘플 플러그의 양단 모두를 상기 파라핀 오일의 두 플러그로 완벽하게 캡슐화하였다. 상기 샘플 플러그는 DNA 주형과 PCR 시약의 혼합물을 함유하였다. 플라스미드 벡터, pGEM-3Zf(+)(125ng/mL)를 DNA 주형으로 사용하였다.
PCR 시약들은 녹색 버퍼, 0.2mM dNTP 혼합물, 1.5mg/mL의 BSA, 1μM의 전방향 프라이머(forward primer)와 역방향 프라이머(reverse primer) 및 0.075U/㎕의 Taq 폴리머라제를 함유하였다. 상기 녹색 버퍼는 샘플 위치의 트랙킹을 쉽게 하기 위해 사용하였다.
프라이머는 다음과 같이 디자인되었다: 5'-CCG GCG AAC GTG GCG AGA AAG GAA GGG AAG AAA GC-3'(전방향) 및 5'-TCG CCT TGC AGC ACA TCC CCC TTT CGC CAG C-3' (역방향).
열순환은 95℃에서 10초간 72℃에서 10초간 35주기동안 실시하였다. DNA 앰플리콘은 UV 트랜스일루미네이터(transilluminator)(ATTO)를 사용하여 312nm에서 검출하였다. 직접비교를 위해, 열순환기(Applied Biosystems)를 사용하여 같은 반응조건에서 PCR을 수행하였다.
5. 샘플유체 도입
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100)에서 샘플유체(S)의 이동을 나타내는 도면이고, 도7은 본 발명의 일 실시예에 따른 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100)에서 샘플유체(S)가 흐르는 모습을 촬영한 사진이다.
도 6 및 도 7을 참조하면, 백색 화살표는 하부PDMS층상(130)의 제1채널부(133)를 통과하는 샘플유체(S)의 흐름을 나타내며, 흑색 화살표는 상부PDMS층상(140)의 제2채널부(142)를 통과하는 샘플유체(S)의 흐름을 나타낸다.
도 6에 도시된 바와 같이, 샘플유체(S)의 연속 상하 움직임이 성공적으로 입증되었으며, 전체 흐름 과정을 통하여 마이크로유체 디바이스(100) 내부에서 누출 또는 막힘이 발생하지 않았다. 한편, 제1채널부(133) 및 제2채널부(142)의 채널 폭은 상기 채널과 컬럼부(135)의 연결지점을 통해 통과할 때 샘플유체(S)의 움직임을 동시에 발생시키기 위해, 컬럼부(135)의 직경과 동일하도록 설계되었다. 이는 샘플유체(S)의 부드럽고, 연속적인 흐름을 유도할 수 있다. 한편, 샘플 플러그의 전방 및 후방 단부 모두에 파라핀 오일 플러그를 사용하였다. 이는 외부공기의 가능한 유입을 방해하여 기포형성을 억제하고, 실험내내 안정된 흐름을 유지시켰다.
6. DNA 증폭결과
도 8은 열순환기를 사용하여 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100)에서 수행된 DNA 증폭 결과를 나타내는 도면이다.
도 8을 참조하면, 레인 M은 100bp DNA 래더이다. 레인 1 및 3은 연이은 방법으로 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100)를 2회 사용하여 얻은 증폭결과(~230bp)를 나타내는 반면, 레인 2는 열순환기로부터 얻은 증폭된 표적을 나타낸다.
반응을 위해 사용된 플라스미드 벡터 pGEM-3Zf(+)의 농도가 125ng/mL이었던 것을 고려하면, DNA 주형의 절대량은 30㎕의 샘플 플러그에 대하여 대략 4ng과 등가이며, 이는 실시간 PCR을 수행하기 위해 채택된 일반적인 프로토콜과 거의 같다.
도 8a에서 볼 수 있는 바와 같이, 온칩 연속흐름 PCR로부터 얻은 표적 앰플리콘은 뚜렷하게 볼 수 있었으며, 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스(100) 안정된 액체 흐름뿐만 아니라, 상용 가능한 핫 플레이트(히터, 110)를 사용하여 실현된 성공적인 온도조절을 확인해주었다.
도 8b에 도시된 바와 같은 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 밴드 강도를 분석함으로써, 온칩 및 열순환기 결과와 비교되는 상대세기 스케일을 나타내는 그래프를 얻었다.
표적 밴드를 포함하는 회색 픽셀의 집적밀도로 나타낸 온칩 PCR 결과들의 평균효율이 열순환기에서 얻은 것의 약 31%이어도, 밴드는 연속흐름 온칩 PCR에서 뚜렷이 볼 수 있었을 뿐 아니라, 그들의 밴드 강도는 장치의 재활용성을 보장하는, 동일한 마이크로장치의 반복사용을 감소시키지 않았다.
장치 재활용성의 성공은 제1 반응과 제2 반응 사이의 음성 대조군 실험을 진행함으로써 확인되었다. 블랭크 샘플(주형만 배제한 샘플)을 진행했을 때, 겔 상에 밴드가 나타나지 않았으며, 이는 장치를 반복 사용함으로써 샘플 이월(carryover)이 일어나지 않음을 증명하는 것이다.
4개의 더 짧은 채널들을 배제한 각 PDMS 층 상에 총 35개의 평행 마이크로채널들을 제조하였다. 본 연구에서, 도입한 증폭 메카니즘의 개념에 근거하여, 각 PDMS층 상의 각 채널 수는 총 증폭주기 수를 나타낸다.
전체 반응주기 수가 20으로 감소될 때는, 앰플리콘들을 여전히 볼 수 있었다. 이는 전체 반응시간뿐만 아니라 전체 장치 크기가 더욱 감소될 수 있음을 나타낸다. 단일 반응에는 약 50분이 걸리며, 이는 열순환 과정에서 동일한 주기 수 및 전체 보유시간을 갖는 다른 온칩 연속흐름 PCR 시스템과 비교하여 약간 증가된 반응시간이다. 상기 약간의 증가는 컬럼부(135)를 통해 샘플유체(S)가 통과하는데 요구되는 추가 시간으로 인한 것이다. 그럼에도 불구하고, 이는 사용된 히터들의 수의 감소에 대한 트레이드-오프(trade-off)로 간주될 수 있다. 제조복잡성의 비용 및 증가된 제조비용으로 구멍들의 직경을 감소시킴으로써, 전체 반응시간이 추가로 감소될 수 있음을 확인하였다.
상술한 바와 같이 본 발명의 실시예들은 종래 2 이상의 열원을 사용하였던 연속흐름 PCR에서의 온도조절을 단일히터를 사용하여 구현 가능케 함으로써, 연속흐름 PCR에서의 온도조절을 간소화시켜 저비용 고효율의 온칩 핵산 증폭시스템을 구현할 수 있다. 또한, 샘플유체가 3차원 구조를 가지는 유체도관을 흐르게 하여 작은 공간에서도 작동 가능하도록 함으로써, 장비 휴대성, 타기능과의 융합 가능성 및 접근성을 향상시킬 수 있다. 또한, 유체도관의 형성시 컬럼부재를 이용하여 한번에 많은 수의 컬럼부(고종횡비를 갖는 컬럼부)를 동시 형성함으로써, 제작공정을 보다 단순화시킬 수 있다. 또한, 하부PDMS층을 온도에 따른 특정 두께로 조절함으로써 다양한 조건의 반응을 일으킬 수 있다.
이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.
100: 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스
110: 히터(핫플레이트) 120: 유리기재
130: 하부PDMS층 131: 샘플입구부
133: 제1채널부 133a: 빗살무늬형 채널
135: 컬럼부 140: 상부PDMS층
142: 제2채널부 142a: 빗살무늬형 채널
144: 샘플유출부 S: 샘플유체
1: PMMA 플레이트 2: 컬럼부재
3: 유리 마스터 4: 공간(CAVITY)

Claims (8)

  1. 하부에 단일히터가 결합되는 유리기재;
    상기 유리기재 상부에 결합되고, 샘플유체가 유입되는 샘플입구부와, 상기 샘플입구부와 일부가 연결되고 좌우 대칭되는 단절형 빗살무늬로 형성되는 제1채널부 및 상기 제1채널부에 수직으로 일단이 연결되는 컬럼부를 포함하고, 상기 유리기재 상부에 결합되는 하부PDMS층; 및
    상기 컬럼부의 타단과 연결되고, 상기 제1채널부와 180도 회전 대칭되어 형성되는 제2채널부 및 상기 제2채널부와 연결되어 상기 샘플유체가 유출되는 샘플출구부를 포함하고, 상기 하부PDMS층 상부에 접합되는 상부PDMS층을 포함하는 것을 특징으로 하는 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 단일히터는 핫플레이트인 것을 특징으로 하는 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 하부PDMS층의 두께와 상기 상부PDMS층의 두께는 5:1인 것을 특징으로 하는 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스.
  4. 유리기재 하부에 단일히터를 결합하는 제1단계;
    SU-8 패턴화 유리 마스터로부터 복제 몰딩하여 샘플유체가 유입되는 샘플유체가 유입되는 샘플입구부 및 상기 샘플입구부와 일부가 연결되고 좌우 대칭되는 단절형 빗살무늬로 형성되는 제1채널부를 포함하는 하부PDMS층을 제조하는 제2단계;
    상기 제1채널부와 180도 회전 대칭되어 형성되는 제2채널부 및 상기 제2채널부와 연결되어 상기 샘플유체가 유출되는 샘플출구부를 포함하는 상부PDMS층을 제조하는 제3단계;
    상기 하부PDMS층에 상기 제1채널부 및 상기 제2채널부를 수직으로 연결하는 컬럼부를 제조하는 제4단계; 및
    상기 하부PDMS층의 하부에는 상기 유리기재를 결합시키고, 상기 하부PDMS층의 상부에는 상기 상부PDMS층을 접합시키는 제5단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 제4단계는,
    PMMA 플레이트에 컬럼부재를 삽입하는 단계;
    SU-8 패턴화한 유리 마스터 상에 상기 컬럼부재를 맞춰 조정하는 단계;
    상기 PMMA플레이트 및 상기 유리 마스터 사이의 공간에 PDMS 전구체 및 경화제의 10:1(w/w) 혼합물을 채우는 단계; 및
    열경화 후, 상기 PMMA플레이트 및 상기 유리 마스터를 제거하여 경화된 상기 PDMS를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스 제조방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 제1채널부 및 상기 제2채널부는 동일한 상기 SU-8 패턴화 유리 마스터를 사용하여 복제하고,
    상기 제2채널부는 상기 제1채널부를 180도 회전 대칭시켜 배치하는 것을 특징으로 하는 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스 제조방법.
  7. 제 4항에 있어서,
    상기 하부PDMS층의 두께는 하기 [식1]에 의하여 산출되는 것을 특징으로 하는 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스 제조방법.
    [식1]
    Figure 112011039365563-pat00008

    (여기에서, HPDMS는 하부PDMS층의 두께이며, λPDMS는 PDMS의 열전도도(0.16 W?K-1?m-1), ts ''는 열변성 온도, ts ' 는 결합/신장 온도, αA는 열전달계수)
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 [식1]의 αA는 하기 [식2]에 의하여 산출되는 것을 특징으로 하는 연속흐름 PCR 마이크로유체 디바이스 제조방법.
    [식2]
    Figure 112011039365563-pat00009

    (여기에서, α는 공기의 열전달계수, ts ' 는 결합/신장 온도, trt는 실온(25℃))
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