KR101176343B1 - 모린다 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성물질 함량을 증대시키는 방법 - Google Patents

모린다 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성물질 함량을 증대시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 모린다 속(Morinda sp.) 식물로부터 유도된 부정근을 MS 배지에 접종하여 배양한 후, 메틸 자스모네이트를 처리하여 배양 후 부정근을 수확하는 단계를 포함하는 2단계 배양에 의한 모린다 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성물질 함량을 증대시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 생장 및 생리활성물질 함량이 증대된 모린다 속(Morinda sp.) 식물 부정근에 관한 것이다.

Description

모린다 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성물질 함량을 증대시키는 방법{Method for increasing growth and bioactive compound content of Morinda sp. adventitious root}
본 발명은 모린다 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성물질 함량을 증대시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 모린다 속(Morinda sp.) 식물로부터 유도된 부정근을 MS 배지에 접종하여 배양한 후, 메틸 자스모네이트를 처리하여 배양 후 부정근을 수확하는 단계를 포함하는 2단계 배양에 의한 모린다 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성물질 함량을 증대시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 생장 및 생리활성물질 함량이 증대된 모린다 속(Morinda sp.) 식물 부정근에 관한 것이다.
모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia)는 방글라데시를 비롯한 동남아시아 지역에서 식품, 향신료, 음료 및 자양강장제 등 다양한 분야에서 이용되고 있는 대표적인 약용식물로 20가지 이상의 생리활성물질을 함유하고 있으나, 목본류로 수확까지의 기간이 8년 이상으로 길고 재배지도 한정되어 있어 식물체에서 직접 생리활성물질을 추출하여 상업화하는 데에는 여러 가지 제약이 있다.
식물조직배양기술은 식물의 세포 및 기관을 연중 균일하게 대량생산하는 가장 보편적인 방법이다(Lee et al., 2008, Kor. J. Hort. Sci. Technol. 26:306-312). 그러므로 균일한 품질관리가 필요한 산업시장의 원료로 모린다를 공급하기 위해서는 식물조직배양기술을 이용하여 대량생산하는 것이 수요자의 욕구를 만족시킬 수 있는 효과적인 생산방법이라고 할 수 있다. 최근 약용식물의 세포(Lee et al, 2006, J. Plant Biol. 49:427-431), 체세포배(Shohael et al., 2008, Biochem. Eng. J. 38:270-273) 및 부정근(Jeong et al, 2009, Acta Physiol. Plant 31:219-222) 등의 식물조직에서 조직배양기술을 이용하여 생리활성물질을 생산하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이 중 부정근을 이용한 배양은 배양체의 생장이 빠르고, 연속적인 증식과 안정적인 공급이 가능하며, 상업적 대량화가 용이하다(Kim et al, 2004, J. Plant Biol. 47:356-36). 또한 조직배양기술을 이용하여 생리활성물질을 생산하는 기내배양의 경우 환경조절이 용이하기 때문에 연중 균일한 품질의 생리활성물질을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 인위적으로 함량을 증가시킬 수 있는 장점도 있다(Zhao et al., Biotechnol. Adv. 23:283-333). 이를 이용한 방법을 엘리시테이션(elicitation)이라하며 생물적 엘리시터(elicitor) 또는 비생물적 엘리시터를 이용하여 미치광이풀(Scopolia parviflora) (Kang et al., 2004, Plant Sci. 166:745-751), 인삼(Panax ginseng) (Ali et al., 2005, Plant Sci. 169:83-92) 및 에키네시아(Echinacea purpurea ) (Wu et al., 2007, J. Plant Biol. 50:636-643) 등 다양한 약용식물 부정근의 생리활성물질 함량을 증가시키려는 실험들이 활발히 진행되었다.
모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia)의 경우, 식물조직배양기술을 이용한 부정근의 기내 생장과 생리작용에 관한 보고(Baque et al., 2010, In Vitro Cell. Dev. Biol. 46:71-80)는 일부 이루어졌으나, 화학적 엘리시터를 이용하여 부정근의 생장과 생리활성물질 함량을 효과적으로 증가시키는 방법에 대하여는 보고된 바 없다.
한국공개특허 제2009-0131937호에는 모린다 속 식물 부정근의 배양 방법이 개시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 식물로부터 부정근을 유도 및 배양한 다음, 메틸 자스모네이트를 처리하여 배양한 결과, 부정근의 생장 및 생리활성물질 함량이 증가한 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 모린다 속(Morinda sp.) 식물로부터 유도된 부정근을 MS 배지에 접종하여 배양한 후, 메틸 자스모네이트를 처리하여 배양 후 부정근을 수확하는 단계를 포함하는 2단계 배양에 의한 모린다 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성물질 함량을 증대시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 생장 및 생리활성물질 함량이 증대된 모린다 속(Morinda sp.) 식물 부정근을 제공한다.
본 발명의 배양 방법을 이용하면 바이오메스와 생리활성물질의 함량이 높은 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 부정근을 효과적으로 대량생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 배양 방법으로 얻어진 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 부정근의 바이오메스와 생리활성물질은 화장품, 식품, 향신료, 음료 및 자양강장제 등의 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 식물 재료를 나타낸 것이다.
도 2는 배양 4주 후, 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 부정근 내 DPPH 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 배양 4주 후, 초기 MJ 농도가 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 부정근의 생장에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 4는 배양 4주 후, 추가 MJ 처리기간이 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 부정근의 생장에 미치는 영향을 나타낸 것이다. Ho, H1, H2, H3 및 H4는 MJ 처리 후 각각 0, 2, 4, 6 및 8일 후 수확한 부정근을 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 모린다 속(Morinda sp.) 식물로부터 유도된 부정근을 MS 배지에 접종하여 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양 후, 메틸 자스모네이트를 처리하여 배양 후 부정근을 수확하는 단계를 포함하는 2단계 배양에 의한 모린다 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성물질 함량을 증대시키는 방법을 제공한다.
상기 부정근의 유도는 당업계에서 통상적으로 이용되는 방법으로 수행될 수 있다. 상기 부정근 유도 배지에는 식물 생장조절제로서 IBA (indole butyric acid), IAA (indole acetic acid), NAA (naphthalene acetic acid), GA (gibberellin) 또는 BAP (benzyl amino purine) 등이 첨가될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, IBA 5mg/L 및 수크로스 30g/L가 첨가된 1/4 MS 배지에서 식물체의 잎으로부터 부정근을 유도할 수 있다.
상기 (a)단계에서 부정근은 바람직하게는 생체중 기준으로 10~20 g/L로 접종할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 13~17 g/L, 더더욱 바람직하게는 15 g/L로 접종할 수 있다.
상기 (a)단계에서 부정근의 배양은 바람직하게는 IBA 2~10 mg/L 및 수크로스 5~40 g/L가 첨가된 1/4 MS 배지에서 20~40일 동안 수행될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 IBA 3~7 mg/L 및 수크로스 25~35 g/L가 첨가된 1/4 MS 배지에서 25~30일 동안 수행될 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 IBA 5 mg/L 및 수크로스 30 g/L가 첨가된 1/4 MS 배지에서 28일 동안 수행될 수 있다.
상기 (b)단계에서 메틸 자스모네이트 처리 농도는 바람직하게는 100~200μM일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 140~160μM, 더더욱 바람직하게는 150μM일 수 있다. 상기 메틸 자스모네이트는 본 발명에서 부정근의 생장 및 생리활성물질의 함량을 증대시키기 위해 사용된 화학적 엘리시터(elicitor)이다.
상기 (b)단계에서 메틸 자스모네이트를 처리 후 바람직하게는 2~6일 동안, 더욱 바람직하게는 4일 동안 배양 후 부정근을 수확할 수 있다.
상기 모린다 속(Morinda sp.) 식물은 모린다 시트리폴리아 (Morinda citrifolia), 모린다 안구스티폴리아 (Morinda angustifolia), 모린다 아스페룰라 (Morinda asperula), 모린다 아스테로세파 (Morinda asteroscepa), 모린다 파시쿨라타 (Morinda fasciculata), 모린다 자스미노이데스 (Morinda jasminoides), 모린다 론기플로라 (Morinda longiflora), 모린다 루시다 (Morinda lucida), 모린다 나나 (Morinda nana), 모린다 오피시날리스 (Morinda officinalis), 모린다 파나멘시스 (Morinda panamensis), 모린다 파르비폴리아 (Morinda parvifolia), 모린다 푸베센스 (Morinda pubescens), 모린다 로욕 (Morinda royoc), 모린다 팅크토리아 (Morinda tinctoria), 모린다 트리메라 (Morinda trimera), 모린다 움벨라타 (Morinda umbellata) 또는 모린다 유카타넨시스 (Morinda yucatanensis)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 상기 모린다 속(Morinda sp.) 식물은 모린다 시트리폴리아 (Morinda citrifolia)이다.
상기 생리활성물질은 생체의 기능을 증진시키거나 또는 억제시키는 물질을 말하며, 안쓰라퀴논(anthraquinone), 페놀 화합물(phenolic), 플라보노이드(flavonoid), 이소플라본(isoflavone), 베타글루칸, 루틴(rutin), 제니스테인(genistein), 글리시테인(glycitein), 제아잔틴(zeaxanthin), 폴리페놀(polyphenol), 시린진(syringin), 프로폴리스(propolis), 레스베라트롤(resveratrol), 트리터펜(triterpen), 라이코펜(lycopene), 퀘르세틴(quercetin), 사포닌(saponin), 옥타코사놀(octacosanol), 피토스테롤(phytosterol), 진세노이드(ginsenoid), 안토시아닌(anthocyanin), 카테킨(catechin) 또는 감마리놀렌산(gamma linolenic acid) 등일 수 있으나, 바람직하게는, 상기 생리활성물질은 안쓰라퀴논(anthraquinone), 페놀 화합물(phenolic) 또는 플라보노이드(flavonoid)이다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 생장 및 생리활성물질 함량이 증대된 모린다 속(Morinda sp.) 식물 부정근을 제공한다. 상기 모린다 속(Morinda sp.) 식물 부정근은 상기한 모린다 속 식물들의 부정근을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 식물의 부정근이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험방법
부정근의 유도 및 증식
모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 종자를 4% 및 2% 차아염소산 나트륨(sodium hypochlorite) 용액으로 각각 20분 및 10분씩 표면 살균한 뒤 멸균수로 3회 세척하였다. 그 후 수크로스 30g/L가 첨가된 MS 배지(Murashige and Skoog, 1962, Physiol. Plant 15:473-497)를 이용하여 기내 식물체를 유도하였다. 유도된 식물체의 잎을 10mm × 10mm 조각으로 절단하여 IBA (indole butyric acid) 5mg/L, 수크로스 30g/L가 첨가된 1/4 MS 배지에서 최종 부정근을 유도-증식하여 본 실험에 사용하였다. 배지는 1N NaOH를 이용하여 pH 5.8로 조정 후, 공기용적이 250mL인 삼각플라스크에 100mL씩 분주하여 121℃, 1.2기압에서 20분간 멸균하여 사용하였다. 배양은 생체중을 기준으로 15g/L 접종밀도로 부정근을 접종한 후, 23±2℃가 유지되는 암조건에서 100rpm 속도로 액체 진탕 배양하였다 (도 1).
초기 메틸 자스모네이트 ( MJ , methyl jasmonate ) 농도가 모린다 시트리폴리아( Morinda citrifolia ) 부정근의 생장과 생리활성물질 생산에 미치는 영향
모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 부정근의 생장 및 생리활성물질 축적에 적합한 초기 MJ 농도를 조사하기 위하여 IBA 5mg/L 및 수크로스 30g/L가 첨가된 1/4 MS 배지에 MJ를 각각 0, 50, 100, 150 및 200μM로 처리하여 4주간 배양하였다. 배지는 1N NaOH를 이용하여 pH 5.8로 조정 후, 공기 용적이 250mL인 삼각플라스크에 100mL씩 분주하여 121℃, 1.2기압에서 20분간 멸균하여 사용하였다. 배양은 생체중을 기준으로 15g/L 접종밀도로 부정근을 접종한 후, 23±2℃가 유지되는 암조건에서 100rpm 속도로 진탕 배양하였고, 각 처리군 당 5회 반복하였다. 배양 4주 후, 생장량 측정을 위해 생체중, 건물중 및 생체중에 대한 건물중 비율을 측정하였으며, 생리활성물질로는 총 안쓰라퀴논(anthraquinone), 총 페놀 화합물(phenolic) 및 총 플라보노이드(flavonoid) 함량을 측정하였다. 기타 부정근의 생리특성을 파악하고자 부정근의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다.
MJ 처리기간이 모린다 시트리폴리아 ( Morinda citrifolia ) 부정근의 생장 및 생리활성물질 생산에 미치는 영향
모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 부정근의 생장 및 생리활성물질 축적에 적합한 MJ 처리기간을 조사하기 위하여, 선행 실험에서 생리활성물질 축적에 가장 효과적인 결과를 나타낸 MJ 150μM을 배양 4주 후에 처리한 다음 0, 2, 4, 6 및 8일 후에 수확하여 부정근의 생장량 및 생리활성물질 함량을 측정하였다. 기타 배양조건 및 조사항목은 이전 실험과 동일하게 실시하였다.
생장량 측정
배양 4주 후, 배지를 제거한 부정근을 흡습지를 이용하여 충분히 수분을 제거한 다음 생체중을 측정하였다. 생체중을 측정한 부정근을 60℃로 고정시킨 건조기에서 48시간 건조 후 건물중을 측정하였으며, 생체중에 대한 건물중 비율은 Shohael 등(2006, Process Biochem. 41:1179-1185)의 방법에 따라 하기의 식을 이용하여 계산하였다.
생체중에 대한 건물중 비율 = (최종 수확한 건물중) / (최종 수확한 생체중) × 100
생리활성물질 함량 측정
건조한 0.1g의 부정근을 80%(w/v) 에탄올에 침지하여 냉각관이 부착된 환류 냉각 추출장치(LS-2050-S10, LS-TECH, Korea)를 이용하여 80℃에서 2시간 추출하였다. 추출액은 여과지(Advantec 110mm, Toyo Rosihi Kaisha Ltd., Japan)를 이용하여 여과한 다음 50mL로 정용하여 최종 추출물을 조제하였다.
부정근의 총 안쓰라퀴논 함량은 Zenk 등(1975, Palnt Med. 28:79-101)의 방법에 따라 측정하였다. 추출액 및 표준물질용액을 0.45μm 마이크로 필터를 이용하여 여과 후, 434nm 파장에서 분광광도계(UV-1650 PC, Shimadzu, Japan)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 알리자린(alizarin) (Sigma chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 사용하였으며, 부정근의 총 안쓰라퀴논 함량은 mg/g?DW로 나타내었다.
Foline-Ciocalteu 시약이 추출물의 총 페놀 화합물에 의해 환원되면서 몰리브덴 청색으로 발색하는 Foline-Ciocalteu 방법(1927, J. Biol. Chem. 27:627-650)에 기초한 Ali 등(2006, Enz. Microbial Technol. 39:982-990)의 방법을 이용하여 부정근의 총 페놀 화합물 함량을 측정하였다. 추출액 및 표준물질용액 0.05mL에 증류수 2.55mL을 첨가한 뒤, 2N Foline-Ciocalteu 시약 용액(10배 희석; Sigma chemical Co., St. Louis, MO, USA) 0.1mL을 첨가하였다. 6분 뒤 혼합액에 20%(w/v) Na2CO3 용액 0.5mL을 첨가한 후 30분간 암상태로 방치한 다음 분광광도계를 이용하여 760nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 갈릭산(garlic acid) (Sigma chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 사용하였으며, 부정근의 총 페놀 화합물 함량은 mg/g?DW로 나타내었다.
부정근의 총 플라보노이드 함량은 비색법 (Colorimetric method)에 기초한 Sakanaka 등(2005, Food Chem. 89:569-575)의 방법에 따라 측정하였다. 추출액 및 표준물질용액 0.25mL에 증류수 1.25mL을 첨가한 뒤, 5%(w/v) NaNO2 용액 0.075mL을 첨가하였다. 6분 뒤 혼합액에 10%(w/v) AlCl3 용액 0.15mL을 첨가한 후, 5분간 방치한 다음 1N NaOH 용액 0.5mL을 첨가하였다. 혼합액의 최종 부피가 2.5mL이 되도록 증류수를 첨가한 뒤 분광광도계를 이용하여 510nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 (+/-) 카테킨(catechin) 표준용액(Sigma chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 사용하였으며, 부정근의 총 플라보노이드 함량은 mg/g?DW로 나타내었다.
DPPH 라디칼 소거 활성( 전자공여능 ) 측정
라디칼 비편재시 짙은 자주색을 나타내며 안정된 상태로 존재하는 질소 중심의 라디칼인 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma chemical Co., St. Louis, MO, USA)가 추출물의 라디칼과 반응하여 변색하는 DPPH 방법(Blois, 1958, Nature 181:1199-1201)에 기초한 Kim 등(2007, Separation Purification Technol. 56:401-406)의 방법을 이용하여 부정근의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다. 추출액 0.2mL과 100%(w/v) 에탄올에 녹인 200μM DPPH 용액 0.8mL을 암상태에서 혼합한 다음 5분간 방치한 뒤, 분광광도계를 이용하여 517nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 추출액 대신 시료 추출 용액인 40%(w/v) 메탄올을 이용하여 위와 동일한 방법으로 측정하였으며, 아래 식을 이용하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 계산하였다.
DPPH 라디칼 소거 활성 = [(대조군의 흡광도) - (시료 첨가군의 흡광도) / (대조군의 흡광도)] × 100
실시예 1: 초기 MJ 농도가 모린다 시트리폴리아 ( Morinda citrifolia ) 부정근 의 생장 및 생리활성물질 생산에 미치는 영향
모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 부정근의 생장량 및 생리활성물질 함량을 증가시키기 위하여 MJ 농도를 0, 50, 100, 150, 200 및 300μM 농도로 달리 처리하여 4주간 배양한 결과는 표 1과 같다. MJ 100μM 이상 처리군들의 경우 부정근의 생장량이 대조군의 50% 이하로 감소하였으며, 가장 높은 농도인 300μM 처리군에서는 대조군의 28% 생장만이 이루어져 MJ 농도가 증가할수록 부정근의 생장억제 현상이 강하게 발생함을 알 수 있었다. 한편으로, 배양 4주 후 부정근 내 DPPH 활성이 배지 내 MJ 농도가 높아질수록 증가하였다(도 2).
식물체 내부에 인위적으로 피토알렉신의 양을 증가시키기 위하여 엘리시터로서 첨가하는 MJ는 배양체의 입장에서는 병원균의 침입으로 인식되므로 일반적으로 일정 농도 이상을 사용할 경우 대조군에 비해 배양체의 생장량이 감소한다. 미치광이풀 모상근 배양 시 MJ 농도가 100μM 이상일 경우 모상근의 생장량이 감소하였으며(Kang et al., 2004, Plant Sci. 166:745-751), 오갈피(Eleutherococcus sessiliflorus) 체세포 배 배양에서도 MJ 200μM 이상의 농도에서 체세포 배의 생장량이 감소하였다(Shohael et al., 2008, Biochem. Eng. J. 38:270-273). 또한 자스몬산(jasmonic acid)을 엘리시터로 사용한 Ahn 등(2006, J. Kor. For. Soc. 95:32-27)의 실험 결과에서는 배지 내 자스몬산의 농도가 증가할수록 섬오갈피 부정근의 생장량이 급격히 감소하여 배지 내 엘리시터 첨가에 의한 부정근의 생장 억제 현상이 발생하는 것을 알 수 있었다. 따라서 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 부정근 배양에서도 대조군에 비해 불포화 지방산인 리놀렌산로부터 합성되는 자스몬산 및 이의 메틸 에스테르 화합물인 메틸 자스모네이트(Cheong and Choi, 2003 Trends Genet. 19:409-413)를 배지 내에 첨가한 처리군에서 부정근의 생장량이 감소한 것으로 생각되었다(도 3).
Figure 112010046524680-pat00001
상기 값은 5번 반복 실험하여 평균 및 표준편차로 나타내었다.
배양 4주 후, 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 부정근 내 생리활성물질 함량을 측정한 결과, 모든 처리군에서 대조군에 비해 건물 1g 당 함유하고 있는 총 생리활성물질 함량이 높았다(표 2). 특히 MJ 150μM 처리군에서 모든 생리활성물질 함량이 가장 높았으며, 총 안쓰라퀴논, 총 페놀 화합물 및 총 플라보노이드 함량이 대조군에 비해 각각 199%, 267% 및 280% 증가하여 건물 1g 속에 함유된 총 생리활성물질 함량이 300.08mg/g?DW로 대조군에 비해 현저히 증가하였다.
이와 같이 대조군에 비해 부정근의 생장량이 감소한 처리군에서 배양체 내 생리활성물질 함량이 가장 높게 나타나는 현상은 타 약용식물의 기내 배양에서도 보고되었다. 오갈피 체세포 배 배양 시 대조군에 비해 생장량이 감소하였던 MJ 200μM 처리군에서 엘레우테로시드(eleutheroside) 함량이 가장 높았으며(Shohael et al., 2008. Biochem. Eng. J. 38:270-273), 자스몬산의 농도가 증가할수록 생장량이 감소한 인삼 부정근(Yu et al., 2000, Kor. J. Plant Tiss. Cult. 27:309-315)과 섬오갈피 부정근(Ahn et al., 2006. J. Kor. For. Soc. 95:32-27) 배양에서도 각각 자스몬산 1.0mg/L 및 0.01mg/L 처리군에서 가장 높은 생리활성물질 생산량이 나타났다고 보고되었다. 이와 같이 엘리시터의 종류와 농도에 따라 배양체 내 생리활성물질의 축적양상이 다르게 나타나는 것은 배양환경 및 배양체의 형태에 따라 배양체가 엘리시터에 감응하는 정도가 다르기 때문으로 생각되었다.
Figure 112010046524680-pat00002
상기 값은 5번 반복 실험하여 평균 및 표준편차로 나타내었다.
엘리시테이션은 0일째에 수행되었다.
가장 높은 총 생리활성물질 함량을 나타낸 MJ 150μM 처리군의 경우 최종 수확할 수 있는 건물중이 대조군에 비해 50%로 낮아 부정근의 생장 및 생리활성물질 생산에 적합한 MJ 농도가 서로 다른 것을 알 수 있었다. 따라서 액체 배지를 이용하여 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 부정근을 배양할 때 생장량의 감소 없이 부정근 내 생리활성물질 함량을 효과적으로 촉진시키는 방법을 고안하고자 추가 실험을 진행하였다.
실시예 2: MJ 의 처리기간이 모린다 시트리폴리아 ( Morinda citrifolia ) 부정근의 생장 및 생리활성물질 생산에 미치는 영향
모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 부정근의 생장 및 생리활성물질 함량을 증가시키기 위하여 선행 실험에서 생리활성물질 축적에 가장 효과적인 결과를 나타낸 MJ 150μM을 배양 4주 후에 처리한 다음 0, 2, 4, 6 및 8일 후에 수확하는 2단계 배양(two stage culture)을 실시하였다(도 4). 대조군과 비교해 MJ 처리 8일 후에 수확하는 처리군을 제외한 모든 처리군에서 부정근의 생장량 감소가 관찰되지 않았다. 따라서, 배양 4주 후에 MJ 150μM을 처리할 경우 부정근의 생장량 감소가 발생하지 않음을 알 수 있었다(표 3). 또한 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 부정근 내 생리활성물질 함량을 측정한 결과 대조군에 비해 모든 처리군에서 건물 1g 당 함유하고 있는 총 생리활성물질 함량이 높았다(표 4). 특히 MJ 150μM 처리 4일 후에 수확한 부정근 내 모든 생리활성물질 함량이 가장 높았으며, 총 안쓰라퀴논, 총 페놀 화합물 및 총 플라보노이드 함량이 대조군에 비해 각각 134%, 139% 및 139%로 현저하게 증가하였다.
이상의 결과를 종합해 볼 때, 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 부정근을 생체중을 기준으로 15g/L 접종밀도로 부정근을 접종한 후, IBA 5mg/L, 수크로스 30g/L 및 MJ 150μM이 첨가된 1/4 MS 배지를 이용하여 4주간 배양하여 수확하는 방법에 비해, MJ를 제외한 동일한 방법으로 4주간 배양한 다음, MJ 150μM을 처리하여 4일 동안 배양 후 부정근을 수확하는 2단계 배양(two stage culture)을 할 경우 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia) 부정근의 생장 및 생리활성물질 함량을 효과적으로 증가시킬 수 있다.
Figure 112010046524680-pat00003
H0 (MJ 무처리): 28일째에 수확된 군, H1: 엘리시테이션 후 2일째에 수확된 군, H2: 엘리시테이션 후 4일째에 수확된 군, H3: 엘리시테이션 후 6일째에 수확된 군, H4: 엘리시테이션 후 8일째에 수확된 군.
Figure 112010046524680-pat00004
H0 (MJ 무처리): 28일째에 수확된 군, H1: 엘리시테이션 후 2일째에 수확된 군, H2: 엘리시테이션 후 4일째에 수확된 군, H3: 엘리시테이션 후 6일째에 수확된 군, H4: 엘리시테이션 후 8일째에 수확된 군.

Claims (9)

  1. (a) 모린다 속(Morinda sp.) 식물로부터 유도된 부정근을 MS 배지에 접종하여 20~40일 동안 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양 후, 메틸 자스모네이트를 처리하여 2~4일 동안 배양 후 부정근을 수확하는 단계를 포함하는 2단계 배양에 의한 모린다 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성물질 함량을 증대시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계에서 부정근은 생체중 기준으로 10~20 g/L로 접종하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계의 MS 배지는 2~10 mg/L IBA(indole butyric acid) 및 5~40 g/L 수크로스가 첨가된 1/4 MS 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계에서 메틸 자스모네이트 처리 농도는 100~200μM인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 모린다 속(Morinda sp.) 식물은 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 생리활성물질은 안쓰라퀴논(anthraquinone), 페놀 화합물(phenolic) 또는 플라보노이드(flavonoid)인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제3항, 제5항, 제7항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 생장 및 생리활성물질 함량이 증대된 모린다 속(Morinda sp.) 식물 부정근.
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