KR101137978B1

KR101137978B1 - Method for isolating and purifying lipid derived from shellfish and the use of the functional lipid

Info

Publication number: KR101137978B1
Application number: KR1020100052057A
Authority: KR
Inventors: 박표잠; 김은경; 김연숙; 정특래; 양현필
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-06-02
Filing date: 2010-06-02
Publication date: 2012-04-20
Also published as: KR20110132497A

Abstract

본 발명은 패류 유래 기능성 지질의 분리 정제 방법 및 상기 방법에 의해 분리 정제된 기능성 지질의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 홍합, 굴 또는 바지락 유래 지질 추출물의 제조방법과 상기 제조방법에 의해 추출한 지질 추출물, 상기 지질 추출물로부터 항산화, 항암, 항염증 활성을 갖는 기능성 지질을 분리 정제하는 방법 및 상기 방법에 의해 분리 정제된 기능성 지질에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 패류로부터 보다 뛰어난 수율로 지질 추출물을 얻을 수 있으며, 본 발명의 지질 추출물은 항산화, 항암 및 항염증 활성을 가지므로 의약품, 건강기능식품의 조성물로 이용될 수 있다.
또한 본 발멸은 막분리공정을 이용하여 상기 지질 추출물로부터 항산화, 항암 또는 항염증 활성을 가지는 기능성 지질을 분리 정제하는 방법 및 상기 방법에 의해 분리 정제된 기능성 지질에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 지질 추출물 또는 기능성 지질을 유효성분으로 함유하는 항산화제, 항암제, 항염증제 및 건강기능식품에 관한 것이다.The present invention relates to a method for separation and purification of shellfish-derived functional lipids and the use of functional lipids separated and purified by the above method, and more particularly, to a method for preparing a mussel, oyster or clam-derived lipid extract and a lipid extracted by the method. An extract, a method for separating and purifying functional lipids having antioxidant, anticancer and anti-inflammatory activity from the lipid extract, and a functional lipid separated and purified by the method.
According to the production method of the present invention, it is possible to obtain a lipid extract in a more excellent yield from shellfish, since the lipid extract of the present invention has antioxidant, anti-cancer and anti-inflammatory activity can be used as a composition of medicines, health functional foods.
The present shedding also relates to a method for separating and purifying functional lipids having antioxidant, anticancer or anti-inflammatory activity from the lipid extract using a membrane separation process, and a functional lipid separated and purified by the method.
The present invention also relates to an antioxidant, anticancer agent, anti-inflammatory agent and health functional food containing the lipid extract or functional lipid as an active ingredient.

Description

METHODS FOR ISOLATING AND PURIFYING LIPID DERIVED FROM SHELLFISH AND THE USE OF THE FUNCTIONAL LIPID}

본 발명은 패류 유래 기능성 지질의 분리 정제 방법 및 상기 방법에 의해 분리 정제된 기능성 지질의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 홍합, 굴 또는 바지락 유래 지질 추출물의 제조방법과, 상기 지질 추출물로부터 막분리공정을 이용하여 항산화, 항암 또는 항염증 활성을 가지는 기능성 지질을 분리 정제하는 방법 및 상기 방법에 의해 분리 정제된 기능성 지질에 관한 것이다.The present invention relates to a method for separation and purification of shellfish-derived functional lipids and the use of functional lipids separated and purified by the method, and more particularly, to a method for preparing a mussel, oyster or clam-derived lipid extract, and membrane separation from the lipid extract. The present invention relates to a method for separating and purifying functional lipids having antioxidant, anticancer or anti-inflammatory activity using a process, and a functional lipid separated and purified by the method.

또한 본 발명은 상기 지질 추출물 또는 기능성 지질을 유효성분으로 함유하는 항산화제, 항암제, 항염증제 및 건강기능식품에 관한 것이다.The present invention also relates to an antioxidant, anticancer agent, anti-inflammatory agent and health functional food containing the lipid extract or functional lipid as an active ingredient.

해양생물은 종의 다양성과 더불어 서식환경의 특이성이라는 요인에 의하여 기존의 육상생물이 보유?생산할 수 없는 화학물질 및 생체 분자들을 함유하고 있으며, 이들의 생합성?분해에 관여하는 특이한 신종 효소와 보조인자들도 존재하고 있어서 신약물질과 새로운 생리 기능성 물질의 소재로서 관심이 집중되고 있다. 더욱이 육상생물을 대상으로 활발히 진행되어 왔던 선도물질의 탐색 및 개발이 한계에 이르기 시작함에 따라 자연히 해양생물로 관심대상이 전환되었다. 미국, 일본, 유럽 등과 같은 해양 선진국들에 의해서 현재까지 밝혀진 해양생물 유래의 항암, 항산화성, 항곰팡이성, 항균성, 항바이러스성, 항염증성을 나타내는 약리활성 물질들이 이미 다수 보고되어 있다. 또한 해양자원으로부터 식량자원의 생산에 관한 연구의 중요성도 점점 증가하고 있다. Marine organisms contain chemicals and biomolecules that cannot be possessed or produced by existing terrestrial organisms due to species diversity and specificity of the habitat environment, and are unique new enzymes and cofactors involved in their biosynthesis and degradation. There is also a lot of attention as a material of new drugs and new physiological functional materials. Moreover, as the exploration and development of leading materials, which have been actively conducted on land, began to reach their limits, the interests naturally turned to marine life. A number of pharmacologically active substances have been reported that show anti-cancer, antioxidant, anti-fungal, antimicrobial, antiviral, and anti-inflammatory properties from marine organisms, which have been discovered to date by marine advanced countries such as the US, Japan, and Europe. The importance of research on the production of food resources from marine resources is also increasing.

일반적으로, 패류(貝類)는 삼면이 바다로 둘러싸인 우리나라의 지역특성에 의해 연안지대에 다양한 종류가 서식하여 예로부터 중요한 식품자원으로 이용되어 온 것으로서, 1990년대 이후부터 패류의 인공양식이 보편화되면서 양식산의 비중이 90%를 상회하게 되고 그 생산량도 매년 신장됨에 따라 어가의 소득증대 및 어촌지역의 고용창출효과 측면 외에도 보다 위생적이고 풍미가 좋은 원료를 안정적으로 공급함과 동시에 패류 특유의 풍미와 영양특성을 살린 고부가가치 가공기술이 수산업 발전을 위한 주요 관심대상이 되고 있다.In general, shellfish have been used as important food resources since ancient times, due to the regional characteristics of Korea, surrounded by the sea on three sides, and has been used as an important food resource since the 1990s. As the share of fish farms exceeds 90% and its output increases every year, in addition to the increase in income of fish prices and the job creation effect in the fishing villages, it provides a more hygienic and savory raw material and provides the unique flavor and nutritional characteristics of shellfish. High value-added processing technology has been a major concern for the development of fisheries.

해양 및 수생 동물 지질을 추출하는 다양한 방법들이 알려져 있다. 예컨대, 헥산 및 에탄올과 같은 유기 용매를 이용하여 어류의 지질을 추출하는 것, 아세톤과 같은 용매를 사용하여 어류 근조직내의 지방 함량을 측정하는 것이 알려져 있다. 이와 같이 기존의 지질 추출 방법은 지질의 특성상, 유기 용매를 이용한 방법이 주를 이루어 왔다. 그러나 종래 기술 공정은 대개 실제 사용이 불가능하거나 수율이 낮다.
Various methods of extracting marine and aquatic lipids are known. For example, it is known to extract lipids from fish using organic solvents such as hexane and ethanol, and to measure fat content in fish muscle tissue using a solvent such as acetone. As such, conventional lipid extraction methods have been mainly made of organic solvents. However, prior art processes are usually not practically available or have low yields.

인간을 포함한 모든 호기성 생물체는 산소를 이용한 에너지 대사 과정에서 항상 발생하는 활성산소의 상해에 대하여 근본적으로는 자기방어 기구를 구비하고 있지만, 조직의 방어능을 초월한 활성산소의 생성은 최근 성인병이라 불리는 관절염, 순환기장애 뿐만 아니라 치매 등과 같은 여러 질환의 원인이 되고 있다.All aerobic organisms, including humans, are equipped with self-defense mechanisms to protect against free radicals that always occur during oxygen-based energy metabolism, but the production of free radicals beyond the defenses of tissues has recently been called arthritis, called adult disease. It is also a cause of various diseases such as dementia as well as circulatory disorders.

흔히 유해산소라 불리는 활성산소는 가장 안정한 형태의 산소인 삼중항산소(³O₂)가 산화, 환원과정에서 환원되어 생성되는 일중항산소인 슈퍼옥사이드 음이온(Superoxide anion; ¹O₂ ^-)과 과산화수소(H₂O₂), 하이드록실 라디칼(?OH)과 같은 짝짓지 않은 상태의 자유 라디칼로서, 이들은 단백질, DNA, 효소 및 T세포와 같은 면역계통의 인자를 손상시켜 질환을 일으킨다.Often free radical, called free radical is the most stable form of the oxygen in the triplet oxygen ⁽³ O ₂₎ oxidation, the superoxide anion singlet oxygen that is generated is reduced in the reduction process ^{_{^{(Superoxide anion; 1 O 2 -}}} ) and hydrogen peroxide As unpaired free radicals, such as (H ₂ O ₂ ) and hydroxyl radicals (? OH), they cause diseases by damaging factors of the immune system such as proteins, DNA, enzymes and T cells.

이러한 이유로 항산화제의 개발 연구가 활발히 진행되어 효소계열인 예방적 항산화제인 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase), 카탈라아제(Catalase), 글루타티온퍼옥시다제(Glutathioneperoxidase) 등과 같은 항산화효소와 천연항산화제인 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드(Carotenoid), 글루타티온(Glutathione) 및 합성 항산화제인 부틸히드록시아니졸(t-Butyl-4-hydroxyanisole; BHA) 디부틸히드록시톨루엔(3,5-(t-Butyl)-4-hydroxytoluene; BHT)등 많은 항산화제가 알려져 있으나, 항산화효소는 나이가 들어서 늙어감에 따라 활성산소에 대한 방어능력이 감소되며, 합성 항산화제 경우 그의 변이원성 및 독성이 지적되면서 뛰어난 항산화 효과에도 불구하고 부작용으로 인해 문제시되고 있는 반면, 천연 항산화제는 부작용이 거의 없어 식품첨가물 또는 약품으로 현재 널리 이용되고 있다. 그러나 천연 항산화제 중 가장 널리 이용되는 α-토코페롤의 경우 비싼 가격과 지용성이라는 이용상의 제약으로 대체 천연 항산화제의 개발이 요망되고 있다. For this reason, researches on the development of antioxidants have been actively conducted, and antioxidant enzymes such as superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase, which are enzyme-protective antioxidants, and vitamin E, a natural antioxidant, , Vitamin C, carotenoids, glutathione, and synthetic antioxidant butylhydroxyanisole (BHA) dibutylhydroxytoluene (3,5- (t-Butyl) -4 Although many antioxidants such as -hydroxytoluene (BHT) are known, antioxidant enzymes decrease the protection against free radicals as they age, and synthetic antioxidants have side effects despite their excellent antioxidant effects due to their mutagenicity and toxicity. On the other hand, natural antioxidants have little side effects and are currently widely used as food additives or drugs. There. However, in the case of α-tocopherol, which is the most widely used among natural antioxidants, the development of alternative natural antioxidants is desired due to the high price and fat soluble limitations.

암은 환경적 요인인 발암원들(carcinogens)에 의한 정상세포들의 변형으로 발생되고, 몸 안의 어느 부위에서도 발생할 수 있다. 암 세포는 일반적으로 성장인자의 신호에 대한 의존도가 낮아 세포증식이 조절되지 않고, 주변세포에 대한 접촉저해가 없으며, 분화의 특징이 결여되어 있다. 그리고 안지오제닉 인자(angiogenic factor)를 분비하여 주위의 조직에 침투, 전이하는 특징을 갖는다. Cancer is caused by the transformation of normal cells by environmental carcinogens and can occur anywhere in the body. Cancer cells generally have low dependence on the growth factor signal and thus do not regulate cell proliferation, lack of contact with surrounding cells, and lack characteristics of differentiation. In addition, it secretes angiogenic factors and penetrates and metastasizes to surrounding tissues.

대부분의 화학적 항암제들은 세포증식에 작용하여 효능을 발휘한다. 하지만 정상세포와 암세포의 증식제어의 차이에 기인한 것은 전무한 상태이므로, 암세포에 대한 선택성이 없어 정상세포에 오히려 독성을 나타내기 때문에 암세포에 대한 선택성이 우수하고 독성이 적으며 내성을 극복할 수 있는 새로운 항암제의 개발이 절실하다. 최근에는 인간에 효능이 뛰어나면서도 독성이 낮은 천연물로부터 항암성분의 탐색과 개발에 관심이 집중되고 있다. Most chemical anticancer drugs work by proliferating. However, due to the difference in the control of proliferation between normal cells and cancer cells, there is no state. Therefore, since there is no selectivity for cancer cells, they are rather toxic to normal cells. Development of new anticancer drugs is urgently needed. Recently, attention has been focused on the development and development of anticancer ingredients from natural products with high efficacy and low toxicity.

염증반응(inflammation)은 생체 또는 조직에 물리적 작용, 화학적 물질, 세균감염 등의 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이다. 일단 자극이 가해지면 국소적으로 히스타민(histamine), 세로토닌(serotonine), 브라디키닌(bradykinin), 프로스타글란딘(prostaglandins), 히드록실-에이코사테트라에노이산(hydroxyl-eicosatetraenoic acid; HETE) 및 류코트리엔(leukotriene)과 같은 혈관 활성물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 단핵포식세포(mononuclear phagocytes), 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophil), 자연살해세포(NK cell)가 손상부위로 침윤되어 염증을 유발하게 된다.Inflammation is a mechanism for repairing and repairing an injured area when an invasion that causes a physical change in a living body or tissue, such as a physical action, a chemical substance, or a bacterial infection, is applied. Once stimulation is applied topically, histamine, serotonin, bradykinin, prostaglandins, hydroxyl-eicosatetraenoic acid (HETE) and leukotriene (HETE) Vascularly active substances such as leukotriene are released to increase vascular permeability, causing monuclear phagocytes, macrophage, neutrophils, and natural killer cells to invade the damaged area and cause inflammation. Done.

감염이나 조직손상에 의해 발생하는 적당한 염증은 손상부위가 빠르게 회복되기 위한 정상적인 반응이다. 그러나 장기간에 걸친 지속적인 염증반응은 손상부위에 대한 회복을 지연시키고 주위 세포에 대한 상해를 동반하므로, 주변조직에 대한 방어력을 떨어뜨려 증세를 더욱 악화시킬 수 있어, 정상적인 염증반응을 유지하기 위한 항염증 제제가 필요한 것이다. 현재 일반적으로 사용되는 대부분의 항염증제는 스테로이드계의 약물이나, 스테로이드계의 약물은 인체의 저항성을 약화시키거나 염증 부위의 조직재생을 지연시키는 부작용을 가지고 있어 대체약물의 개발이 필요하다.Appropriate inflammation, caused by infection or tissue damage, is a normal reaction for the rapid recovery of a damaged area. However, long-term sustained inflammatory response delays recovery to the damaged area and injuries to surrounding cells, which can worsen the symptoms by lowering the defenses of surrounding tissues, and thus anti-inflammatory to maintain a normal inflammatory response. Formulation is required. Currently, most anti-inflammatory drugs commonly used are steroid-based drugs, but steroid-based drugs have a side effect of weakening the body's resistance or delaying tissue regeneration at an inflammation site, and thus, alternative drugs need to be developed.

따라서 본 발명의 목적은 패류자원으로부터 추출한 지질 추출물의 효과적인 추출방법과 그 방법으로 추출한 항산화, 항암, 항염증 효과를 갖는 지질 추출물을 제공하는 데 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide an effective extraction method of the lipid extract extracted from shellfish resources and a lipid extract having antioxidant, anticancer and anti-inflammatory effects extracted by the method.

또한 본 발명은 상기 지질 추출물로부터 가장 강력한 항산화, 항암 또는 항염증 효과를 갖는 기능성 지질을 분리 정제하는 방법을 제공하며, 상기 기능성 지질을 유효성분으로 하는 항산화제, 항암제, 항염증제 및 건강기능식품을 제공하는데 목적이 있다.In another aspect, the present invention provides a method for separating and purifying functional lipids having the most powerful antioxidant, anticancer or anti-inflammatory effect from the lipid extract, and provides an antioxidant, anticancer agent, anti-inflammatory agent and health functional food containing the functional lipid as an active ingredient. The purpose is to.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 패류로부터 지질 추출물을 제조하는 방법과 상기 지질 추출물로부터 고농도의 기능성 지질을 분리 정제하는 방법 및 상기 지질의 용도를 제공한다.
In order to achieve the above object, the present invention provides a method for preparing a lipid extract from shellfish, a method for separating and purifying a high concentration of functional lipid from the lipid extract and the use of the lipid.

본 발명에 있어서, 패류 유래 지질 추출물의 제조방법은 패류를 완충액에 용해시킨 후, 상기 용액에 지질 가수분해 효소를 첨가하여 가수분해하여 제조하는 단계를 포함한다.In the present invention, a method of preparing shellfish-derived lipid extract includes a step of dissolving the shellfish in a buffer, followed by hydrolysis by adding a lipid hydrolase to the solution.

상기 완충액은 인산염 완충액(phosphate buffer) 또는 글리신-염산 완충액(glycine-HCl beffer)이며, 상기 지질 가수분해 효소는 레시테이즈(Lecitase)이다. The buffer is phosphate buffer or glycine-HCl beffer, and the lipolytic enzyme is Lecitate.

또한, 상기 가수분해 단계는 pH 7.0 ~ 9.0의 완충액 중에서 반응온도 30 ~ 60℃, 반응시간 6 ~ 10시간 동안 가수분해하는 것이 좋고, 바람직하게는 반응온도 50℃, 반응시간 8시간에서 가수분해하는 것이 좋다.In addition, the hydrolysis step is preferably hydrolyzed at a reaction temperature of 30 to 60 ℃, reaction time 6 to 10 hours in a buffer of pH 7.0 ~ 9.0, preferably hydrolyzing at a reaction temperature of 50 ℃, reaction time 8 hours It is good.

본 발명은 패류 유래 지질 추출물을 보다 효율적으로 추출하기 위해서 상기 효소적 가수분해와 유기용매를 병행하여 사용할 수 있다. 구체적으로 본 발명은 상기 가수분해물을 원심분리하여 상층액과 잔사로 분리한 후, 상기 상층액과 잔사를 각각 유기용매로 추출하고, 상기 각각의 유기용매 추출물을 혼합하여 농축함으로써 최종 지질을 수확하는 것을 특징으로 한다. 이때 상기 유기용매는 메탄올(methanol), 클로로포름(chloroform) 및 헥산(n-hexane)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것이 좋다. The present invention can be used in combination with the enzymatic hydrolysis and the organic solvent in order to extract the shell-derived lipid extract more efficiently. Specifically, the present invention centrifugally separates the hydrolyzate into a supernatant and a residue, and then extracts the supernatant and the residue with an organic solvent, and concentrates by mixing the respective organic solvent extracts to harvest the final lipids. It is characterized by. At this time, the organic solvent is preferably at least one selected from the group consisting of methanol (methanol), chloroform (chloroform) and hexane ( n- hexane).

본 발명은 상기 제조방법에 의해 패류로부터 추출한 지질 추출물을 제공하며, 본 발명에서 상기 "추출물"은 추출액, 정제물, 희석액, 농축액 및 건조물을 모두 포함한다.
The present invention provides a lipid extract extracted from shellfish by the above production method, the "extract" in the present invention includes all of the extract, purified, diluent, concentrate and dried.

본 발명에 있어서, 상기 지질 추출물로부터 고농도의 기능성 지질을 분리 정제하는 방법은 (1) 패류 유래 지질 추출물을 크로마토그래피법으로 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 각 획분의 생리활성을 측정하는 단계; 및 (3) 상기 분리된 획분 중 생리활성이 가장 뛰어난 획분을 정제하는 단계를 포함하며, 상기 (1) 내지 (3) 단계를 반복 실시하여 단일 물질을 정제하는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the method for separating and purifying a high concentration of functional lipid from the lipid extract comprises the steps of: (1) separating the shell-derived lipid extract by chromatography; (2) measuring the biological activity of each of the separated fractions; And (3) purifying the fraction having the most physiological activity among the separated fractions, and repeating steps (1) to (3) to purify a single substance.

구체적으로 본 발명에서 지질 추출물로부터 기능성 지질을 분리 정제할 때, 상기 (1) 단계는 1차로 실리카 칼럼 크로마토그래피를 실시하고, 2차로 얇은 막 크로마토그래피(thin layer chromatography; TLC)를 실시함으로써 순도 높은 생리 활성 물질을 정제할 수 있다.Specifically, when the functional lipid is separated and purified from the lipid extract in the present invention, the step (1) is performed by first performing silica column chromatography and secondly by performing thin layer chromatography (TLC). Bioactive substances can be purified.

상기 지질 추출물로부터 항산화 물질을 분리 정제하기 위해서는, silica 60 (0.063 ~ 0.200 mm)을 헥산, 다이에틸에테르 및 아세트산 혼합 용매에 현탁하여 유리 칼럼에 충진한 후 평형을 맞추고 상기 지질 가수분해 추출물을 주입하여 실리카 칼럼 크로마토그래피를 실시하되, 바람직하게는 헥산 : 다이에틸에테르 : 아세트산 = 80 : 20 : 2 (v/v) 및 36 × 400 mm 인 유리 칼럼을 사용하는 것이 좋다. In order to separate and purify the antioxidant from the lipid extract, silica 60 (0.063 ~ 0.200 mm) was suspended in a mixed solvent of hexane, diethyl ether and acetic acid, filled in a glass column, equilibrated, and the lipid hydrolyzed extract was injected. Silica column chromatography is carried out, but preferably hexane: diethyl ether: acetic acid = 80: 20: 2 (v / v) and 36 x 400 mm glass columns.

본 발명에서는 상기 실리카 칼럼 크로마토그래피에 의해 분리된 물질은 얇은 막 크로마토그래피(TLC)에 의해 확인한 후 각 획분을 분리하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였다. 상기 DPPH 라디칼 소거 활성이 가장 뛰어난 획분을 골라 분취용 TLC를 이용하여 2 이상의 획분으로 세분화한 후 2차적으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였다. 이로써 지질 추출물로부터 항산화 활성이 가장 뛰어난 물질을 분리 정제할 수 있다.In the present invention, the material separated by silica column chromatography was confirmed by thin membrane chromatography (TLC), and then each fraction was separated to measure DPPH radical scavenging activity. The fraction having the most excellent DPPH radical scavenging activity was selected and subdivided into two or more fractions using preparative TLC, and then the DPPH radical scavenging activity was measured secondarily. This can separate and purify the substance having the highest antioxidant activity from the lipid extract.

얇은 막 크로마토그래피(TLC)의 전개용매는 헥산 : 다이에틸에테르 : 아세트산 = 80 : 20 : 2 (v/v)를 사용하였고, 발색시약은 20% H₂SO₄를 사용하였으며, 예비 TLC로 분리한 밴드의 실리카 겔을 긁어서 메탄올 또는 헥산에 녹인 후 농축기로 용매를 건조시켜 생리활성 측정 실험에 사용하였다.Thin layer chromatography (TLC) was used as a solvent for hexane: diethyl ether: acetic acid = 80: 20: 2 (v / v), and a color reagent was used as 20% H ₂ SO ₄ , and separated by preparative TLC. One band of silica gel was scraped and dissolved in methanol or hexane, and the solvent was dried with a concentrator to be used for physiological activity measurement experiments.

한편, 본 발명에서 항암 효과를 갖는 기능성 지질 및 항염증 효과를 갖는 기능성 지질에 대해서도 상기와 같은 방법을 사용함으로써 고농도의 기능성 지질을 분리 정제할 수 있다.Meanwhile, in the present invention, the functional lipid having an anticancer effect and the functional lipid having an anti-inflammatory effect can be separated and purified by using the same method as described above.

특히 상기 항산화 효과를 측정하는 단계는 DPPH 라디칼 소거 활성, 산화스트레스로 인한 세포 손상으로부터 세포보호 효능, 세포 내 활성산소종 생성에 미치는 효과, 세포 내 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD) 활성에 미치는 효과, 세포 내 카탈라아제(catalase) 활성에 미치는 효과, 세포 내 글루타티온 퍼옥사이드(glutathione peroxide) 활성에 미치는 효과, 세포 내 글루타티온-S-트랜스퍼라제(glutathione-S-transferase) 활성에 미치는 효과 및 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical) 소거능력을 측정하는 것을 포함한다.
In particular, the step of measuring the antioxidant effect on the DPPH radical scavenging activity, the cytoprotective effect from cellular damage due to oxidative stress, the effect on the generation of free radical species in the cell, the superoxide dismutase (SOD) activity in the cell Effect, intracellular catalase activity, intracellular glutathione peroxide activity, intracellular glutathione-S-transferase activity, and hydroxyl Measuring the radical scavenging ability.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 추출한 지질 추출물을 제공하며, 상기 물질을 유효성분으로 함유하는 항산화제, 항암제, 항염증제 및 건강기능식품을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 분리 정제 방법으로 분리 정제된 기능성 지질을 유효성분으로 함유하는 항산화제, 항암제, 항염증제 및 건강기능식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a lipid extract extracted by the manufacturing method, and provides an antioxidant, anticancer agent, anti-inflammatory agent and health functional food containing the substance as an active ingredient. The present invention also provides an antioxidant, anticancer agent, anti-inflammatory agent and health functional food containing the functional lipid separated and purified by the separation and purification method as an active ingredient.

또한, 본 발명의 패류 유래 지질 추출물 및 기능성 지질은 자유라디칼 소거 활성이 우수하므로 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 노화, 고혈압, 만성 알코올 중독, 죽상동맥경화증, 암, 관상심장질환, 간염, 백내장, 당뇨병, 각종 퇴행성 신경질환, 뇌졸중 발작, 심근경색, 염증, 퇴행성관절염, 류마티스 관절염, 궤양성 대장염, 크론병 등에서 선택되는 1종 이상의 질환을 억제 또는 치료하기 위한 의약품, 건강보조제, 화장료, 식품, 식품 첨가제 등에 유용하게 이용될 수 있으며, 이에 의해 제한되지 않는다.In addition, shellfish-derived lipid extracts and functional lipids of the present invention have excellent free radical scavenging activity, thereby causing aging, hypertension, chronic alcoholism, atherosclerosis, cancer, coronary heart disease, and hepatitis caused by oxides produced by free radicals. Medicines, health supplements, cosmetics, to suppress or treat one or more diseases selected from cataracts, diabetes, various degenerative neurological diseases, stroke attacks, myocardial infarction, inflammation, degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, ulcerative colitis, Crohn's disease, etc. It may be usefully used for food, food additives, and the like, but is not limited thereto.

본 발명의 지질 추출물 및 기능성 지질이 의약품으로 이용될 경우에는 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 제형으로 제조될 수 있는데, 이렇게 이루어진 약학조성물을 권리범위로 포함한다. 또한, 상기 약학조성물을 항산화제, 항암제 및/또는 항염증제로 사용하는 의약적 용도 역시 본 발명의 권리범위에 포함된다.When the lipid extract and the functional lipid of the present invention are used as a medicament, it may further include appropriate carriers, excipients, and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions, and in a pharmaceutically acceptable formulation according to a conventional method. It can be prepared, including the pharmaceutical composition made in this range of rights. In addition, the pharmaceutical use of the pharmaceutical composition as an antioxidant, an anticancer agent and / or an anti-inflammatory agent is also included in the scope of the present invention.

상기 담체 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드, 파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물류가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체 및 부형제는 모두 사용 가능하다. 또한 항산화 조성물을 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있다.The carrier or excipient includes water, dextrin, calcium carbonate, lactose, propylene glycol, liquid, paraffin, physiological saline, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, ziitol, erythritol, maltitol, starch, gelatin, calcium phosphate, calcium Silicates, cellulose, methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and minerals, which may be used one or more, but are not limited thereto. Both carriers and excipients can be used. In addition, when formulating the antioxidant composition, it may further include conventional fillers, extenders, binders, disintegrants, surfactants, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers or preservatives.

본 발명의 지질 추출물 및 기능성 지질이 화장료로 이용될 경우에는 주름개선 및 미백 기능성 화장품, 유연화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 에센스 등의 제형으로 제조될 수 있으며, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 지질 추출물 및 기능성 지질을 포함하여 주름개선 및 미백 원료 또는 통상의 화장료 원료로서 이외의 성분들을 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.When the lipid extract and the functional lipid of the present invention are used as a cosmetic, it can be prepared in the form of wrinkle improvement and whitening functional cosmetics, softening longevity, nourishing longevity, eye cream, nutrition cream, massage cream, cleansing cream, essence, etc. In the cosmetic composition of each formulation, components other than wrinkle improvement and whitening raw materials or ordinary cosmetic raw materials including lipid extracts and functional lipids can be appropriately selected and blended by those skilled in the art without difficulty according to the formulation or purpose of use of cosmetics. .

본 발명의 제조방법에 따르면, 기존의 가수분해 효소 또는 유기용매만을 이용하는 것보다 뛰어난 수율로 지질 추출물을 얻을 수 있다. 또한 본 발명의 제조방법에 의해 추출한 패류 유래 지질 추출물은 DPPH 라디칼 소거 효과, 알킬 라디칼 소거 효과, 지질 과산화 억제 효과, 세포 내 활성산소종(ROS) 생성 억제 효과가 뛰어나다. 뿐만 아니라 상기 지질 추출물은 정상세포에는 영향을 미치지 않으면서 암세포 사멸 및 암세포증식 억제 효과를 나타내며, 항염증 효과도 뛰어나다.According to the production method of the present invention, it is possible to obtain a lipid extract in an excellent yield than using a conventional hydrolase or an organic solvent only. In addition, shellfish-derived lipid extract extracted by the production method of the present invention is excellent in DPPH radical scavenging effect, alkyl radical scavenging effect, lipid peroxidation inhibitory effect, and intracellular reactive oxygen species (ROS) generation inhibitory effect. In addition, the lipid extract has an effect of inhibiting cancer cell death and cancer cell proliferation without affecting normal cells, and also has an excellent anti-inflammatory effect.

또한 본 발명의 분리 정제 방법에 의해 분리 정제된 지질 추출물 유래 기능성 지질 역시 뛰어난 항산화, 항암 및 항염증 효과를 나타낸다. In addition, functional lipids derived from the lipid extract separated and purified by the separation purification method of the present invention also exhibit excellent antioxidant, anticancer and anti-inflammatory effects.

본 발명의 지질 추출물 및 기능성 지질은 항산화, 항암 및 항염증 활성을 가지는 기능성 의약품, 건강기능식품의 조성물로 이용될 수 있다.Lipid extract and functional lipid of the present invention can be used as a composition of functional medicines, health functional foods having antioxidant, anticancer and anti-inflammatory activity.

또한 본 발명의 추출방법에 따르면, 막유화장치와 막반응기를 조합한 막분리공정기술을 이용하여 패류로부터 추출한 지질을 효소로 변형하면 자동화 장치를 구축할 수 있어 이를 이용한 대량 생산 공정이 이루어져 산업적 응용이 가능할 것으로 판단된다. 또한 생체촉매인 효소를 이용하여 패류 추출물의 기능성을 개선함으로써 기능성 물질의 화학적 합성에서 나타나는 문제점으로 거론되는 소재의 안전성 문제를 해결할 수 있다.In addition, according to the extraction method of the present invention, by using the membrane separation process technology combined with the membrane emulsifier and membrane reactor to transform the lipid extracted from shellfish with an enzyme can be built an automated device, the mass production process using the industrial application is made I think this will be possible. In addition, by improving the functionality of shellfish extract by using the enzyme as a biocatalyst can solve the safety problem of the material, which is mentioned as a problem in the chemical synthesis of functional materials.

도 1은 효소와 유기용매를 병용하여 추출한 홍합 유래 지질 추출물의 수율을 보여주는 그래프이다(도 1 내지 도 15에서 1, 메탄올; 2, 클로로포름; 3, 헥산; 4, 메탄올:클로로포름=1:1; 5, 클로로포름:헥산=1:1을 의미함).
도 2는 효소와 유기용매를 병용하여 추출한 바지락 유래 지질 추출물의 수율을 보여주는 그래프이다.
도 3은 효소와 유기용매를 병용하여 추출한 굴 유래 지질 추출물의 수율을 보여주는 그래프이다.
도 4는 홍합 유래 지질 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성도를 보여주는 그래프이다.
도 5는 홍합 유래 지질 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 ESR 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 바지락 유래 지질 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성도를 보여주는 그래프이다.
도 7은 바지락 유래 지질 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 ESR 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 굴 유래 지질 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성도를 보여주는 그래프이다.
도 9는 굴 유래 지질 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 ESR 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은 홍합 유래 지질 추출물의 알킬 라디칼 소거 활성을 보여주는 그래프이다.
도 11은 홍합 유래 지질 추출물의 알킬 라디칼 소거 활성의 ESR 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는 바지락 유래 지질 추출물의 알킬 라디칼 소거 활성을 보여주는 그래프이다.
도 13은 바지락 유래 지질 추출물의 알킬 라디칼 소거 활성의 ESR 스펙트럼을 나타낸다.
도 14는 굴 유래 지질 추출물의 알킬 라디칼 소거 활성을 보여주는 그래프이다.
도 15는 굴 유래 지질 추출물의 알킬 라디칼 소거 활성의 ESR 스펙트럼을 나타낸다.
도 16은 홍합 유래 지질 추출물의 TBA 반응 결과값을 보여주는 그래프이다(도 16 내지 도 21에서

, control;

, α-tocopherol;

, Methanol;

, Chloroform;

, n-Hexane;

, Methanol:Chloroform=1:1;

, Chloroform:n-Hexane=1:1를 의미함).
도 17은 바지락 유래 지질 추출물의 TBA 반응 결과값을 보여주는 그래프이다.
도 18은 굴 유래 지질 추출물의 TBA 반응 결과값을 보여주는 그래프이다.
도 19는 FTC 방법으로 특정한 홍합 유래 지질 추출물의 항산화 능력을 보여주는 그래프이다.
도 20은 FTC 방법으로 특정한 바지락 유래 지질 추출물의 항산화 능력을 보여주는 그래프이다.
도 21은 FTC 방법으로 특정한 굴 유래 지질 추출물의 항산화 능력을 보여주는 그래프이다.
도 22는 홍합 유래 지질 추출물의 세포 내 반응산소종 생성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다(도 22 내지 도 45에서 1, 메탄올; 2, 클로로포름; 3, 헥산; 4, 메탄올:클로로포름=1:1; 5, 클로로포름:헥산=1:1을 의미함).
도 23는 바지락 유래 지질 추출물의 세포 내 반응산소종 생성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 24는 굴 유래 지질 추출물의 세포 내 반응산소종 생성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 25는 홍합 유래 지질 추출물의 유방암 세포에서의 항암효과를 보여주는 그래프이다.
도 26은 바지락 유래 지질 추출물의 유방암 세포에서의 항암효과를 보여주는 그래프이다.
도 27은 굴 유래 지질 추출물의 유방암 세포에서의 항암효과를 보여주는 그래프이다.
도 28은 홍합 유래 지질 추출물의 폐암 세포에서의 항암효과를 보여주는 그래프이다.
도 29는 바지락 유래 지질 추출물의 폐암 세포에서의 항암효과를 보여주는 그래프이다.
도 30은 굴 유래 지질 추출물의 폐암 세포에서의 항암효과를 보여주는 그래프이다.
도 31은 홍합 유래 지질 추출물의 전립선암 세포에서의 항암효과를 보여주는 그래프이다.
도 32는 바지락 유래 지질 추출물의 전립선암 세포에서의 항암효과를 보여주는 그래프이다.
도 33은 굴 유래 지질 추출물의 전립선암 세포에서의 항암효과를 보여주는 그래프이다.
도 34는 홍합 유래 지질 추출물의 간암 세포에서의 항암효과를 보여주는 그래프이다.
도 35는 바지락 유래 지질 추출물의 간암 세포에서의 항암효과를 보여주는 그래프이다.
도 36은 굴 유래 지질 추출물의 간암 세포에서의 항암효과를 보여주는 그래프이다.
도 37은 홍합 유래 지질 추출물이 정상 신경세포(PC12 cells)에 미치는 영향을 보여주는 사진이다.
도 38은 바지락 유래 지질 추출물이 정상 신경세포(PC12 cells)에 미치는 영향을 보여주는 사진이다.
도 39는 굴 유래 지질 추출물이 정상 신경세포(PC12 cells)에 미치는 영향을 보여주는 사진이다.
도 40은 홍합 유래 지질 추출물이 정산 간세포(Chang cells)에 미치는 영향을 보여주는 사진이다.
도 41은 바지락 유래 지질 추출물이 정산 간세포(Chang cells)에 미치는 영향을 보여주는 사진이다.
도 42는 굴 유래 지질 추출물이 정산 간세포(Chang cells)에 미치는 영향을 보여주는 사진이다.
도 43은 홍합 유래 지질 추출물의 항염증 효과를 보여주는 그래프이다.
도 44는 바지락 유래 지질 추출물의 항염증 효과를 보여주는 그래프이다.
도 45는 굴 유래 지질 추출물의 항염증 효과를 보여주는 그래프이다.
도 46은 홍합 메탄올 추출물로부터 실리카 칼럼 크로마토그래피를 실시한 후 TLC를 실시한 결과를 보여준다.
도 47은 홍합 메탄올 추출물의 1차 TLC 획분의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내는 그래프이다.
도 48은 홍합 메탄올 추출물의 2차 TLC 획분의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내는 그래프이다.
도 49는 홍합 메탄올 추출물로부터 분리 정제한 H-I-e 획분의 DPPH 라디칼 발생량을 ESR 스펙트럼으로 보여준다.
도 50은 굴 메탄올 추출물로부터 실리카 칼럼 크로마토그래피를 실시한 후 TLC를 실시한 결과를 보여준다.
도 51은 굴 메탄올 추출물의 1차 TLC 획분의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내는 그래프이다.
도 52는 굴 메탄올 추출물의 2차 TLC 획분의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내는 그래프이다.
도 53은 굴 메탄올 추출물로부터 분리 정제한 G-III-b 획분의 DPPH 라디칼 발생량을 ESR 스펙트럼으로 보여준다.
도 54는 바지락 메탄올 추출물로부터 실리카 칼럼 크로마토그래피를 실시한 후 TLC를 실시한 결과를 보여준다.
도 55는 바지락 메탄올 추출물의 1차 TLC 획분의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내는 그래프이다.
도 56은 바지락 메탄올 추출물의 2차 TLC 획분의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내는 그래프이다.
도 57은 바지락 메탄올 추출물로부터 분리 정제한 B-IV-a 획분의 DPPH 라디칼 발생량을 ESR 스펙트럼으로 보여준다.
도 58은 홍합 추출물 H-I-e의 산화 스트레스로 인한 간세포 손상으로부터 세포 보호 효과를 나타내는 그래프이다.
도 59는 굴 추출물 G-III-b의 산화 스트레스로 인한 간세포 손상으로부터 세포 보호 효과를 나타내는 그래프이다.
도 60는 바지락 추출물 B-IV-a의 산화 스트레스로 인한 간세포 손상으로부터 세포 보호 효과를 나타내는 그래프이다.
도 61은 홍합 추출물 H-I-e의 간세포 내 활성산소종 생성 억제 효과를 보여준다.
도 62은 굴 추출물 G-III-b의 간세포 내 활성산소종 생성 억제 효과를 보여준다.
도 63은 바지락 추출물 B-IV-a의 간세포 내 활성산소종 생성 억제 효과를 보여준다.
도 64는 홍합 추출물 H-I-e의 간세포 내 SOD 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 65은 굴 추출물 G-III-b의 간세포 내 SOD 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 66은 바지락 추출물 B-IV-a의 간세포 내 SOD 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 67는 홍합 추출물 H-I-e의 간세포 내 카탈라아제 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 68은 굴 추출물 G-III-b의 간세포 내 카탈라아제 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 69는 바지락 추출물 B-IV-a의 간세포 내 카탈라아제 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 70는 홍합 추출물 H-I-e의 간세포 내 GPx 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 71은 굴 추출물 G-III-b의 간세포 내 GPx 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 72은 바지락 추출물 B-IV-a의 간세포 내 GPx 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 73은 홍합 추출물 H-I-e의 간세포 내 GST 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 74는 굴 추출물 G-III-b의 간세포 내 GST 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 75은 바지락 추출물 B-IV-a의 간세포 내 GST 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 76은 홍합 헥산 추출물로부터 실리카 칼럼 크로마토그래피를 실시한 후 TLC를 실시한 결과를 보여준다.
도 77는 홍합 헥산 추출물의 1차 TLC 분획의 전립선암 세포(PC3) 사멸효과를 나타내는 그래프이다.
도 78은 홍합 헥산 추출물의 2차 TLC 분획의 전립선암 세포(PC3) 사멸효과를 나타내는 그래프이다.
도 79는 홍합 추출물 H-III-b를 전립선암 세포(PC3)에 처리 시 세포 형태를 나타낸 사진이다.
도 80은 굴 헥산 추출물로부터 실리카 칼럼 크로마토그래피를 실시한 후 TLC를 실시한 결과를 보여준다.
도 81는 굴 헥산 추출물의 1차 TLC 분획의 전립선암 세포(PC3) 사멸효과를 나타내는 그래프이다.
도 82은 굴 헥산 추출물의 2차 TLC 분획의 전립선암 세포(PC3) 사멸효과를 나타내는 그래프이다.
도 83는 굴 추출물 G-III-a를 전립선암 세포(PC3)에 처리 시 세포 형태를 나타낸 사진이다.
도 84은 바지락 헥산 추출물로부터 실리카 칼럼 크로마토그래피를 실시한 후 TLC를 실시한 결과를 보여준다.
도 85는 바지락 헥산 추출물의 1차 TLC 분획의 전립선암 세포(PC3) 사멸효과를 나타내는 그래프이다.
도 86은 바지락 헥산 추출물의 2차 TLC 분획의 전립선암 세포(PC3) 사멸효과를 나타내는 그래프이다.
도 87는 바지락 추출물 B-III-a를 전립선암 세포(PC3)에 처리 시 세포 형태를 나타낸 사진이다.
도 88은 홍합 유래 지질 추출물로부터 분리한 H-III-b의 항유방암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 89는 홍합 유래 지질 추출물로부터 분리한 H-III-b의 항폐암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 90는 홍합 유래 지질 추출물로부터 분리한 H-III-b의 항간암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 91은 굴 유래 지질 추출물로부터 분리한 G-III-a의 항유방암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 92는 굴 유래 지질 추출물로부터 분리한 G-III-a의 항폐암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 93는 굴 유래 지질 추출물로부터 분리한 G-III-a의 항간암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 94은 바지락 유래 지질 추출물로부터 분리한 B-III-a의 항유방암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 95는 바지락 유래 지질 추출물로부터 분리한 B-III-a의 항폐암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 96는 바지락 유래 지질 추출물로부터 분리한 B-III-a의 항간암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 97는 홍합 메탄올 추출물로부터 실리카 칼럼 크로마토그래피를 실시한 후 TLC를 실시한 결과를 보여준다.
도 98은 홍합 메탄올 추출물의 1차 TLC 분획의 항염증 효과를 나타내는 그래프이다.
도 99는 홍합 메탄올 추출물의 2차 TLC 분획의 항염증 효과를 나타내는 그래프이다.
도 100는 굴 메탄올 추출물로부터 실리카 칼럼 크로마토그래피를 실시한 후 TLC를 실시한 결과를 보여준다.
도 101은 굴 메탄올 추출물의 1차 TLC 분획의 항염증 효과를 나타내는 그래프이다.
도 102은 굴 메탄올 추출물의 2차 TLC 분획의 항염증 효과를 나타내는 그래프이다.
도 103은 바지락 메탄올 추출물로부터 실리카 칼럼 크로마토그래피를 실시한 후 TLC를 실시한 결과를 보여준다.
도 104는 바지락 메탄올 추출물의 1차 TLC 분획의 항염증 효과를 나타내는 그래프이다.
도 105은 바지락 메탄올 추출물의 2차 TLC 분획의 항염증 효과를 나타내는 그래프이다.1 is a graph showing the yield of the mussel-derived lipid extract extracted by using an enzyme and an organic solvent in combination (1, 15 in methanol; 2, chloroform; 3, hexane; 4, methanol: chloroform = 1: 1; 5, meaning chloroform: hexane = 1: 1).
Figure 2 is a graph showing the yield of the clam-derived lipid extract extracted by using an enzyme and an organic solvent in combination.
3 is a graph showing the yield of oyster-derived lipid extract extracted by using an enzyme and an organic solvent in combination.
4 is a graph showing DPPH radical scavenging activity of mussel-derived lipid extracts.
5 shows the DPPH radical scavenging activity ESR spectra of mussel-derived lipid extracts.
6 is a graph showing the DPPH radical scavenging activity of the clam extract lipid extract.
Figure 7 shows the DPPH radical scavenging activity ESR spectrum of the clam derived lipid extract.
8 is a graph showing DPPH radical scavenging activity of oyster-derived lipid extracts.
Figure 9 shows the DPPH radical scavenging activity ESR spectrum of oyster derived lipid extract.
10 is a graph showing alkyl radical scavenging activity of mussel-derived lipid extracts.
11 shows ESR spectra of alkyl radical scavenging activity of mussel derived lipid extracts.
12 is a graph showing the alkyl radical scavenging activity of the clam derived lipid extract.
Figure 13 shows the ESR spectrum of the alkyl radical scavenging activity of the clam derived lipid extract.
14 is a graph showing alkyl radical scavenging activity of oyster derived lipid extract.
15 shows ESR spectra of alkyl radical scavenging activity of oyster derived lipid extracts.
16 is a graph showing the results of TBA reaction of mussel-derived lipid extract (FIGS. 16 to 21).

, control;

, α-tocopherol;

, Methanol;

, Chloroform;

, n- Hexane;

, Methanol: Chloroform = 1: 1;

, Chloroform: n -Hexane = 1: 1).
17 is a graph showing the results of TBA reaction of the clam derived lipid extract.
18 is a graph showing the results of TBA reaction of oyster derived lipid extract.
19 is a graph showing the antioxidant capacity of certain mussel-derived lipid extracts by the FTC method.
20 is a graph showing the antioxidant capacity of certain clam-derived lipid extracts by the FTC method.
21 is a graph showing the antioxidant capacity of a specific oyster-derived lipid extract by the FTC method.
FIG. 22 is a graph showing the effects of mussel-derived lipid extracts on the production of reactive oxygen species in cells (1, methanol; 2, chloroform; 3, hexane; 4, methanol: chloroform = 1: 1; FIGS. 22-45); 5, meaning chloroform: hexane = 1: 1).
Figure 23 is a graph showing the effect on the production of reactive oxygen species in cells of the clam-derived lipid extract.
24 is a graph showing the effect on the production of reactive oxygen species in cells of oyster-derived lipid extract.
25 is a graph showing the anticancer effect of the mussel-derived lipid extract in breast cancer cells.
Figure 26 is a graph showing the anticancer effect of the clam derived lipid extract in breast cancer cells.
27 is a graph showing the anticancer effect of oyster derived lipid extract in breast cancer cells.
28 is a graph showing the anticancer effect of the mussel-derived lipid extract in lung cancer cells.
29 is a graph showing the anticancer effect of the clam-derived lipid extract in lung cancer cells.
30 is a graph showing the anticancer effect of oyster derived lipid extract in lung cancer cells.
31 is a graph showing the anticancer effect of the mussel-derived lipid extract in prostate cancer cells.
32 is a graph showing the anticancer effect of the clam derived lipid extract in prostate cancer cells.
33 is a graph showing the anticancer effect of oyster-derived lipid extract in prostate cancer cells.
34 is a graph showing the anticancer effect of hepatic cancer-derived lipid extract in liver cancer cells.
35 is a graph showing the anticancer effect of hepatic cancer-derived lipid extract in liver cancer cells.
36 is a graph showing the anticancer effect of oyster derived lipid extract in liver cancer cells.
37 is a photograph showing the effect of the mussel-derived lipid extract on normal neurons (PC12 cells).
38 is a photograph showing the effect of the clam-derived lipid extract on normal neurons (PC12 cells).
39 is a photograph showing the effect of oyster-derived lipid extract on normal neurons (PC12 cells).
40 is a photograph showing the effect of the mussel-derived lipid extracts on Chang cells.
Figure 41 is a photograph showing the effect of the clam-derived lipid extracts on Chang cells.
42 is a photograph showing the effect of oyster-derived lipid extracts on Chang cells.
43 is a graph showing the anti-inflammatory effect of mussel-derived lipid extract.
44 is a graph showing the anti-inflammatory effect of the clam derived lipid extract.
45 is a graph showing the anti-inflammatory effect of oyster derived lipid extract.
46 shows the results of TLC after silica column chromatography from mussel methanol extract.
FIG. 47 is a graph showing the DPPH radical scavenging activity of the first TLC fraction of mussel methanol extract.
FIG. 48 is a graph showing DPPH radical scavenging activity of secondary TLC fractions of mussel methanol extracts. FIG.
Figure 49 shows the DPPH radical generation amount of HIe fraction separated and purified from mussel methanol extract in ESR spectrum.
Figure 50 shows the results of TLC after silica column chromatography from oyster methanol extract.
Fig. 51 is a graph showing the DPPH radical scavenging ability of the first TLC fraction of oyster methanol extract.
Fig. 52 is a graph showing DPPH radical scavenging ability of the second TLC fraction of oyster methanol extract.
Fig. 53 shows the ESR spectrum of DPPH radical generation amount of G-III-b fraction separated and purified from oyster methanol extract.
54 shows the results of TLC after silica column chromatography from clam methanol extract.
Fig. 55 is a graph showing the DPPH radical scavenging ability of the first TLC fraction of the clam methanol extract.
Fig. 56 is a graph showing the DPPH radical scavenging ability of the secondary TLC fraction of the clam methanol extract.
Fig. 57 shows the DPPH radical generation amount of the B-IV-a fraction separated and purified from the clam methanol extract by ESR spectrum.
58 is a graph showing the protective effect of hepatocyte damage from oxidative stress of mussel extract HIe.
Figure 59 is a graph showing the protective effect of hepatic cell damage from oxidative stress of oyster extract G-III-b.
FIG. 60 is a graph showing the protective effect of hepatocyte damage from oxidative stress of clam extract B-IV-a.
61 shows the inhibitory effect of free radical generation in hepatocytes of mussel extract HIe.
Figure 62 shows the inhibitory effect of free radical generation in hepatocytes of oyster extract G-III-b.
Figure 63 shows the inhibitory effect of free radical species production in hepatocytes of the clam extract B-IV-a.
64 is a graph showing the effect of mussel extract HIe on the SOD activity in hepatocytes.
65 is a graph showing the effect of oyster extract G-III-b on the SOD activity in hepatocytes.
FIG. 66 is a graph showing the effect of clam extract B-IV-a on SOD activity in hepatocytes. FIG.
67 is a graph showing the effect on the catalase activity in hepatocytes of mussel extract HIe.
68 is a graph showing the effect of oyster extract G-III-b on the catalase activity in hepatocytes.
69 is a graph showing the effect of clam extract B-IV-a on the hepatocyte catalase activity.
70 is a graph showing the effect of mussel extract HIe on the hepatocyte GPx activity.
71 is a graph showing the effect of oyster extract G-III-b on GPx activity in hepatocytes.
72 is a graph showing the effect of the clam extract B-IV-a on the hepatic GPx activity.
73 is a graph showing the effect of mussel extract HIe on hepatic GST activity.
74 is a graph showing the effect of oyster extract G-III-b on GST activity in hepatocytes.
75 is a graph showing the effect of the clam extract B-IV-a on the GST activity in hepatocytes.
76 shows the result of TLC after silica column chromatography from mussel hexane extract.
77 is a graph showing the prostate cancer cell (PC3) killing effect of the primary TLC fraction of mussel hexane extract.
78 is a graph showing the prostate cancer cell (PC3) killing effect of the second TLC fraction of mussel hexane extract.
79 is a photograph showing the cell morphology when mussel extract H-III-b is treated with prostate cancer cells (PC3).
80 shows the result of TLC after silica column chromatography from oyster hexane extract.
81 is a graph showing the prostate cancer cell (PC3) killing effect of the primary TLC fraction of oyster hexane extract.
82 is a graph showing the prostate cancer cell (PC3) killing effect of the second TLC fraction of oyster hexane extract.
83 is a photograph showing the morphology of oyster extract G-III-a when treated with prostate cancer cells (PC3).
FIG. 84 shows the results of TLC after silica column chromatography from clam hexane extract.
FIG. 85 is a graph showing the prostate cancer cell (PC3) killing effect of the primary TLC fraction of clam hexane extract.
86 is a graph showing the effect of killing prostate cancer cells (PC3) of the secondary TLC fraction of the clam hexane extract.
FIG. 87 is a photograph showing cell morphology when clam extract B-III-a is treated with prostate cancer cells (PC3). FIG.
88 is a graph showing the anti-mammary cancer effect of H-III-b isolated from the mussel-derived lipid extract.
89 is a graph showing the anti-lung cancer effect of H-III-b isolated from the mussel-derived lipid extract.
90 is a graph showing the anti-cancer cancer effect of H-III-b isolated from the mussel-derived lipid extract.
91 is a graph showing the anti-mammary cancer effect of G-III-a isolated from oyster derived lipid extract.
92 is a graph showing the anti-lung cancer effect of G-III-a isolated from oyster-derived lipid extract.
93 is a graph showing the anti-cancer cancer effect of G-III-a isolated from the oyster-derived lipid extract.
94 is a graph showing the anti-mammary cancer effect of B-III-a isolated from the clam extract lipid extract.
95 is a graph showing the anti-lung cancer effect of B-III-a isolated from the clam extract lipid extract.
96 is a graph showing the anti-hepatic cancer effect of B-III-a isolated from the clam extract lipid extract.
97 shows the results of TLC after silica column chromatography from mussel methanol extract.
98 is a graph showing the anti-inflammatory effect of the primary TLC fraction of mussel methanol extract.
99 is a graph showing the anti-inflammatory effect of the secondary TLC fraction of mussel methanol extract.
100 shows the results of TLC after silica column chromatography from oyster methanol extract.
101 is a graph showing the anti-inflammatory effect of the first TLC fraction of oyster methanol extract.
102 is a graph showing the anti-inflammatory effect of the secondary TLC fraction of oyster methanol extract.
Figure 103 shows the results of TLC after silica column chromatography from the clam methanol extract.
104 is a graph showing the anti-inflammatory effect of the primary TLC fraction of the clam methanol extract.
105 is a graph showing the anti-inflammatory effect of the secondary TLC fraction of the clam methanol extract.

이하, 본 발명의 구체적인 내용을 구체적인 실험예와 실시예를 들어 상세히 설명하고자 한다. 이들 실험예와 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 권리범위는 이들 실험예와 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, specific details of the present invention will be described in detail with reference to specific experimental examples and examples. These experimental examples and examples are only for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not limited only to these experimental examples and examples.

실험예 1 : 홍합, 바지락 및 굴의 성분분석Experimental Example 1 Analysis of Components of Mussels, Clams and Oysters

본 실험에 사용된 홍합, 바지락 및 굴 시료는 여수 수산시장에서 구입하였고, -20℃에 저장하여 사용하였다.
Mussel, clam and oyster samples used in this experiment were purchased from Yeosu fish market and stored at -20 ℃.

1. 시료의 일반성분 분석
1. Analysis of General Components of Samples

홍합 (Mytilus Coruscus), 바지락 (Ruditapes Philippinarum) 및 굴 (Crassostrea Gigas) 등을 동결건조하여 분쇄한 후 수분, 조단백질, 조지방, 당질 및 조회분 등 일반성분을 분석하였다. 수분은 105℃ 상압가열건조법, 조단백질은 자동 질소중류장치 (Kjeltec 2200 analyzer, FOSS Co., Slangerupgade, HIllerod, Denmark)를 이용한 semi-micro Kjeldahl 질소정량법, 조지방은 자동 조지방 추출기 (Soxhlet Avanti 2050, FOSS Co., Slangerupgade, HIllerod, Denmark)를 이용한 Soxhlet's 추출법, 당질은 phenol-sulfuric acid 법, 조회분은 600℃ 직접 회화법으로 각각 정량하였다. 각 실험은 3회 반복하여 얻은 평균값으로 나타내었다.Mussels ( Mytilus Coruscus ), Ruditapes Philippinarum and Oysters ( Crassostrea Gigas ) were lyophilized and ground, and then analyzed for general components such as moisture, crude protein, crude fat, sugar and crude ash. Moisture is 105 ℃ atmospheric pressure drying method, crude protein is semi-micro Kjeldahl nitrogen determination method using automatic nitrogen classifier (Kjeltec 2200 analyzer, FOSS Co., Slangerupgade, HIllerod, Denmark), crude fat is automatic crude fat extractor (Soxhlet Avanti 2050, FOSS Co , Slangerupgade, HIllerod, Denmark), Soxhlet's extraction method, phenol-sulfuric acid method and sugar content were quantified by direct incineration method at 600 ℃. Each experiment is represented by the average value obtained by repeating three times.

원료로 사용한 홍합, 바지락 및 굴 시료는 여수 수산시장에서 구입하였고, 지질과 리프리놀(lyprinol) 및 펩타이드를 추출 및 가수분해하기 위해 -20℃에 저장하여 사용하였으며, 홍합, 바지락, 굴의 일반성분 분석 결과는 하기 표 1에 나타내었다. Mussel, clam and oyster samples used as raw materials were purchased from Yeosu fish market, and stored and stored at -20 ℃ for extraction and hydrolysis of lipids, lyprinol and peptides. Analysis of general components of mussels, clams and oysters The results are shown in Table 1 below.

표 1.Table 1.

2. 시료의 아미노산 조성 분석
2. Analysis of Amino Acid Composition of Samples

홍합, 바지락, 굴의 아미노산 조성은 크로마토그래피의 고정상과 이동상의 흡착성이나 분배계수 차이에 기인한 이동속도 차를 이용한 자동 아미노산 분석계 (Amino Acid Analyzer)를 이용하여 유리아미노산과 구성아미노산을 각각 분석하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.The amino acid composition of mussels, clams, and oysters was analyzed using free amino acids and constituent amino acids using an automated amino acid analyzer using the difference in the rate of adsorption due to the adsorption or distribution coefficients of the fixed and mobile phases. The results are shown in Table 2 below.

표 2.Table 2.

3. 시료의 지방산 조성 분석
3. Analysis of Fatty Acid Composition of Samples

지방산 분석은 Shirai 등(2001)의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 지질 1 g을 0.5 M NaOH/MeOH 용액에 넣어 100℃에서 15분 동안 가열하여 가수분해시킨 후, 트라이아실글리세롤(triacylglycerol)과 인지질(phospholipid)은 0.5 M NaOH/MeOH 용액에 넣어 100℃에서 30초 동안 에스테르 교환반응을 시켰다. 그리고 지방산은 14% BF3/MeOH 용액으로 100℃에서 20초 동안 메칠화시켰다. 지방산 조성분석은 실리카 모세관 칼럼 (Supelcowas 30 m × 0.25 mm i.d.)이 장착된 기체 크로마토그래피(Gas chromatography)로 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.Fatty acid analysis was performed according to the method of Shirai et al. (2001). That is, 1 g of lipid was added to a 0.5 M NaOH / MeOH solution, heated at 100 ° C. for 15 minutes, and hydrolyzed. Triacylglycerol and phospholipid were added to a 0.5 M NaOH / MeOH solution at 100 ° C. The transesterification reaction was carried out for 30 seconds. Fatty acids were then methylated at 100 ° C. for 20 seconds with 14% BF 3 / MeOH solution. Fatty acid composition analysis was measured by gas chromatography equipped with a silica capillary column (Supelcowas 30 m x 0.25 mm i.d.), and the results are shown in Table 3 below.

표 3.Table 3.

실시예Example 1 : 홍합, 바지락 및 굴 유래 지질의 최적 추출 조건 측정 1: Determination of Optimal Extraction Conditions of Mussel, Clam and Oyster-derived Lipids

기존의 지질 추출 방법은 지질의 특성상, 유기 용매를 이용한 방법이 주를 이루어왔다. 그러나 본 연구에서는 좀 더 효율적인 추출 조건을 확립하기 위해서 리파아제(lipase) 단독, 유기용매 단독, 리파아제 및 유기용매 병용 등 3가지 군으로 추출군을 나누어 추출한 다음 각각의 수율을 측정하였으며, 그 결과는 도 1 내지 도 3과 같다. 홍합, 바지락 및 굴 모두 효소 또는 유기용매 단독 추출에 비해 효소와 유기용매를 병용하여 추출하였을 때 더 높은 수율을 나타내었다. 이는 효소로 인해 1차적으로 지질 분해가 어느 정도 이루어져 유기용매가 더욱더 효율적으로 지질 추출을 할 수 있었던 것으로 사료된다. 따라서 다음의 모든 실험은 효소적 가수분해 후, 유기용매 추출을 하여 얻어진 추출물로 실험을 실시하였다.Conventional lipid extraction methods have been mainly based on the characteristics of the lipid, using an organic solvent. In this study, however, the extraction groups were divided into three groups, lipase alone, organic solvent alone, lipase, and organic solvent combination, in order to establish more efficient extraction conditions. 1 to 3. Mussels, clams and oysters all showed higher yields when the enzyme and organic solvents were used in combination compared to the enzyme or organic solvents alone. It is believed that the organic solvent was able to extract lipids more efficiently due to some degree of lipid degradation primarily due to enzymes. Therefore, all the following experiments were conducted with extracts obtained by enzymatic hydrolysis and organic solvent extraction.

효소적 가수분해와 유기용매를 병용하는 방법은 다음과 같다. 홍합, 바지락 및 굴을 지질 가수분해 효소인 돼지 췌장 유래 포스포리파아제 A2(제품명 Lecitase L10, Novozyme, Nordisk, Denmark)로 가수분해 후 원심분리하여 상층액과 잔사를 각각 다시 유기 용매로 추출하는 방법이다. pH 8, 50℃에서 8시간 동안 효소적 가수분해를 실시 후, 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액과 잔사를 분리하여 얻었다. 그 상층액과 잔사를 다시 유기용매로 12시간 추출한 후 농축하여 최종 지질을 수확하였다.
The method of using enzymatic hydrolysis and an organic solvent together is as follows. Mussels, clams and oysters are hydrolyzed with phospholipase A2 (Lecitase L10, Novozyme, Nordisk, Denmark) derived from the pig pancreas, a lipid hydrolase, and centrifuged to extract the supernatant and the residue with an organic solvent. . After enzymatic hydrolysis at pH 8 and 50 ° C. for 8 hours, the supernatant and residue were separated by centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes. The supernatant and residue were again extracted with an organic solvent for 12 hours and concentrated to harvest the final lipids.

실험예 2 : 홍합, 바지락 및 굴 유래 지질 추출물의 항산화 효능 측정Experimental Example 2 Measurement of Antioxidant Activity of Lipid Extracts from Mussels, Clams and Oysters

1. DPPH 라디칼 소거 활성 측정
1. Measurement of DPPH radical scavenging activity

DPPH(1,1-다이페닐-2-피크릴하이드라질)는 짙은 자주색을 나타내며 그 자체가 질소 중심의 라디칼로서, 라디칼 전자의 비편재화에 의해 안정화된 상태로 존재한다. ESR을 이용한 DPPH 라디칼 소거능 측정법은 다음과 같다. 즉, 메탄올에 용해시킨 60 μM DPPH 60 ㎕와 농도별로 준비한 패류 유래 지질 추출물 60 ㎕를 혼합한 다음, 10초간 격렬하게 vortex하여 2분간 실온에 방치한 후, 모세관(capillary tube)에 옮겨 ESR 스펙트로미터(ESR spectrometer, JEOL Ltd., Tokyo, Japan)를 이용해 측정하였다. 이때의 ESR 분광계 조건은 다음과 같다. central field, 3475 G; modulation frequency, 100 kHz; modulation amplitude, 2 G; microwave power, 5 mW; gain, 6.3 × 10⁵ 및 temperature, 298 K 이었다. DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) is dark purple and is itself a nitrogen-centered radical that is stabilized by delocalization of radical electrons. DPPH radical scavenging activity using ESR is as follows. In other words, 60 μl DPPH dissolved in methanol and 60 μl of shellfish-derived lipid extract prepared by concentration were mixed, vigorously vortexed for 10 seconds, allowed to stand at room temperature for 2 minutes, and then transferred to a capillary tube to an ESR spectrometer. (ESR spectrometer, JEOL Ltd., Tokyo, Japan). ESR spectrometer conditions at this time are as follows. central field, 3475 G; modulation frequency, 100 kHz; modulation amplitude, 2 G; microwave power, 5 mW; gain, 6.3 × 10 ⁵ and temperature, 298 K.

도 4 내지 도 9는 홍합, 바지락 및 굴 유래 지질 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 결과를 나타내는데, 대부분위 추출물에서 농도의존적으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 보였다. 특히, 홍합, 바지락 및 굴 모두 메탄올 추출물이 가장 높은 DPPH 소거 활성을 보였으며, IC₅₀ 값은 각각 1.25 mg/㎖, 1.25 mg/㎖, 1.12 mg/㎖이었으며, 이는 지질 조추출물이므로 단일물질로 분리 정제를 하기에 충분한 가능성이 있다고 사료된다.
4 to 9 show the results of DPPH radical scavenging activity of the mussel, clam and oyster-derived lipid extracts, most of which showed DPPH radical scavenging activity in a concentration-dependent manner. In particular, methanol extracts of mussels, clams and oysters showed the highest DPPH scavenging activity, and IC ₅₀ values were 1.25 mg / ml, 1.25 mg / ml and 1.12 mg / ml, respectively. It is thought that there is sufficient possibility for purification.

2. 알킬 라디칼 소거 활성 측정
2. Determination of Alkyl Radical Scavenging Activity

알킬 라디칼(alkyl radical)은 AAPH(2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 다이하이드로라이드)에 의해 생성되어 POBN(α-(4-프로피닐 1-옥사이드)-N-3가-부틸니트론)과 반응한 양을 측정하였다. 즉, 10 ㎕의 PBS (phosphate buffered saline, 인산염 완충액), 10 ㎕의 농도별 지질 추출물, 10 ㎕의 40 mM AAPH, 10 ㎕의 40 mM POBN을 차례로 첨가한 후, 10초간 격렬하게 vortex 하였다. 이 혼합물을 37℃ 수욕조(water bath)에서 30분간 반응시킨 후, 모세관으로 옮겨 ESR 스펙트로미터로 알킬 라디칼 발생량을 측정하였다. 이때의 ESR 스펙트로미터 조건은 다음과 같다. 즉, central field, 3475 G; modulation frequency, 100 kHz; modulation amplitude, 2 G; microwave power, 10 mW; gain, 6.3 × 10⁵ 그리고 temperature, 298 K 이었다.Alkyl radicals are produced by AAPH (2,2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrolide) to form POBN (α- (4-propynyl 1-oxide) -N-3- The amount reacted with butylnitron) was measured. That is, 10 μl of PBS (phosphate buffered saline, phosphate buffer), 10 μl of concentration-specific lipid extract, 10 μl of 40 mM AAPH, and 10 μl of 40 mM POBN were sequentially added, followed by vigorously vortexing for 10 seconds. The mixture was reacted in a 37 ° C. water bath for 30 minutes and then transferred to a capillary tube to measure the amount of alkyl radicals generated by an ESR spectrometer. The ESR spectrometer condition is as follows. Central field, 3475 G; modulation frequency, 100 kHz; modulation amplitude, 2 G; microwave power, 10 mW; gain, 6.3 × 10 ⁵ and temperature, 298 K.

도 10 내지 도 15는 홍합, 바지락 및 굴 유래 지질 추출물의 알킬 라디칼 소거 활성 결과를 나타내는데, 대부분의 추출물에서 효과를 나타냈다.
10 to 15 show the results of alkyl radical scavenging activity of the mussel, clam and oyster-derived lipid extracts, showing the effect in most extracts.

3. 지질 과산화 억제능 측정
3. Measurement of Lipid Peroxidation Inhibition

패류 유래 지질 추출물의 지질 과산화 억제 활성을 TBA (Thiobarbituric acid)법에 의거하여 측정하였다. 이 방법은 유지를 자동 산화시켜 TBA가 불포화 지질의 산화 생성물과 반응하여 산화를 일으키는 정도를 측정하는 것으로써 리놀레산 모델 시스템(linoleic acid model system)은 Osawa 등 (1981)의 방법을 약간 변형하여 리놀레산 0.13 ㎖, 99.5% 에탄올 10 ㎖, 50 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 10 ㎖, 시료 1.3 mg을 넣어 혼합한 다음 총 용량이 25 ㎖이 되도록 증류수로 조정하였다. 이 반응 혼합물(reaction mixture)을 인큐베이터(40 ± 1℃, dark room, J-MIC2, Jisico co., Ltd., Korea)에 보관하면서 자동산화를 촉진시켰다.
Lipid peroxidation inhibitory activity of shellfish-derived lipid extracts was measured based on TBA (Thiobarbituric acid) method. This method measures the extent to which TBA reacts with oxidation products of unsaturated lipids to oxidize fats and oils by automatically oxidizing fats and oils. The linoleic acid model system slightly modifies the method of Osawa et al. ㎖, 10 mL of 99.5% ethanol, 10 mL of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) and 1.3 mg of sample were mixed and adjusted with distilled water so that the total volume was 25 mL. The reaction mixture was stored in an incubator (40 ± 1 ℃, dark room, J-MIC2, Jisico co., Ltd., Korea) to promote automatic oxidation.

TBA법에 의한 항산화 측정은 Ohkawa 등 (1979)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 40℃에서 보관한 반응 혼합물 1 ㎖에 20% TCA (Trichloroacetic acid) 2 ㎖과 0.67% TBA 2 ㎖을 혼합한 후 100℃에서 10분간 발색시킨 후 4℃로 유지시켜 반응을 종료시킨다. 3000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상층액의 흡광도를 532 nm에서 측정하였다. TBA 반응 결과는 24시간 간격으로 8일 동안 측정하였으며, 시료 대신 증류수를 넣은 대조구와 비교하여 나타내었다. 또한 일반적으로 강력한 항산화제로 알려져 있는 알파토코페롤(α-tocopherol)을 양성 대조구로 하여 시료의 항산화활성을 비교하였다.
Antioxidant measurement by the TBA method was measured according to the method of Ohkawa et al. (1979). In other words, 2 ml of 20% TCA (Trichloroacetic acid) and 2 ml of 0.67% TBA were mixed with 1 ml of the reaction mixture stored at 40 ° C, followed by color development at 100 ° C for 10 minutes, and then maintained at 4 ° C to terminate the reaction. After centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, the absorbance of the supernatant was measured at 532 nm. The TBA reaction results were measured for 8 days at 24 hour intervals and compared with the control in which distilled water was added instead of the sample. In addition, the antioxidant activity of the samples was compared with alpha-tocopherol, which is generally known as a potent antioxidant, as a positive control.

도 16 내지 도 18에 홍합, 바지락 및 굴의 TBA 반응 결과 값을 나타내었는데, 홍합의 경우 헥산 추출물의 활성이 가장 높았으며, 대조구와 비교했을 때, 7일 기준으로 대조구의 약 79.73%의 항산화활성을 나타내었으며 이는 알파토코페롤 활성의 84.29%에 해당하는 것이다(도 16). 따라서 가장 활성이 높았던 헥산 추출물로 농도별 실험을 실시하였으며, 그 결과 1.0%에서 대조구 대비 약 79.17%의 항산화 활성을 나타내었으며 그 이상의 농도 (2, 3, 5%)에서도 비슷한 활성을 나타내어 1.0%가 TBA 항산화 활성의 최적 농도로 판단되었다.16 to 18 shows the results of TBA reaction of mussels, clams and oysters, the highest activity of the hexane extract in the case of mussels, and compared with the control, about 79.73% of the antioxidant activity on the 7th day This corresponds to 84.29% of alphatocopherol activity (FIG. 16). Therefore, experiments were carried out with the hexane extract, which was the most active, showing the antioxidative activity of about 79.17% compared to the control at 1.0% and the similar activity even at higher concentrations (2, 3, 5%). It was determined to be the optimal concentration of TBA antioxidant activity.

바지락의 경우 클로로포름:헥산 추출물의 활성이 가장 높았으며, 대조구와 비교했을 때, 7일 기준으로 약 41.18%의 항산화활성을 나타내었으며, 이는 천연항산화제인 알파토코페롤 활성의 44.68%에 해당하는 것이다 (도 17). 따라서 가장 활성이 높았던 클로로포름:헥산 추출물로 농도별 실험을 실시한 결과 1.0%에서 대조구 대비 약 42.31%의 항산화 활성을 나타내었으며, 그 이상의 농도 (2, 3, 5%)에서도 비슷한 활성을 나타내어 1.0%가 TBA 항산화 활성의 최적 농도로 판명되었다.In the case of clam, the activity of chloroform: hexane extract was the highest, and compared to the control, it showed about 41.18% of antioxidant activity on a 7-day basis, corresponding to 44.68% of the activity of alphatocopherol, a natural antioxidant (FIG. 17). Therefore, as a result of experiment by concentration with chloroform: hexane extract, which was the highest activity, 1.0% showed about 42.31% of antioxidant activity compared to the control, and similar concentrations (2, 3, 5%) showed similar activity, 1.0% It was found to be the optimal concentration of TBA antioxidant activity.

굴의 경우 메탄올:클로로포름 추출물의 활성이 가장 높았으며, 대조구와 비교했을 때, 7일 기준으로 대조구의 약 56.25%의 항산화활성을 나타내었으며, 이는 천연 항산화제인 알파토코페롤 활성의 60.00%에 해당하는 것이다 (도 18). 따라서 가장 활성이 높았던 메탄올:클로로포름 추출물로 농도별 실험을 실시한 결과, 1.0%에서 대조구 대비 약 55.56%의 항산화 활성을 나타내었으며, 그 이상의 농도 (2, 3, 5%)에서도 비슷한 활성을 나타내어 1.0%가 TBA 항산화 활성의 최적 농도로 판명되었다.
Oyster showed the highest activity of methanol: chloroform extract, which showed about 56.25% of antioxidant activity compared to the control, which is equivalent to 60.00% of the natural antioxidant alphatocopherol activity. (FIG. 18). Therefore, as a result of experiment by concentration with methanol: chloroform extract, which was the most active, 1.0% showed antioxidant activity of about 55.56% compared to the control, and showed similar activity at higher concentrations (2, 3, 5%) and 1.0% Was found to be the optimal concentration of TBA antioxidant activity.

4. 철환원능력 측정
4. Iron Reduction Capability

FTC (Ferric thiocyanate) 법에 의한 측정은 유지의 자동산화에 의해 형성된 과산화물이 ferrous thiocyanate를 ferric thiocyanate로 산화시키는 정도를 비색법으로 측정하는 것으로, 리놀레산 모델 시스템은 TBA 법에 의한 측정에서 사용한 방법과 동일하게 사용하였으며 Mitsuda 등 (1966)의 방법에 따라 FTC 법을 실시하였다. 즉, 40℃에서 보관한 반응혼합물 100 ㎕에 75% 에탄올 4.7 ㎖, 30% 티오시안화 암모니아(ammonium thiocyanate) 0.1 mM, 3.5% HCl에 녹인 20 mM 염화철(ferrous chloride) 용액 0.1 ㎖을 넣고 혼합한 후, 실온에서 3분간 반응시켜 발색정도를 500 nm에서 흡광도를 측정하였다. FTC 결과는 24시간 간격으로 7일 동안 측정하였으며 시료 대신 증류수를 넣은 대조구와 비교하여 나타내었으며 TBA와 마찬가지로 알파토코페롤을 양성 대조구로 하여 시료의 항산화 활성을 비교하였다.
The FTC (Ferric thiocyanate) method is a colorimetric method to measure the degree of peroxide formed by the automatic oxidation of fats and oils to ferric thiocyanate by ferric thiocyanate. FTC method was used according to the method of Mitsuda et al. (1966). That is, 100 ml of the reaction mixture stored at 40 ° C. were mixed with 4.7 ml of 75% ethanol, 0.1 mM of 30% ammonium thiocyanate, and 0.1 ml of 20 mM ferrous chloride solution dissolved in 3.5% HCl. After reacting for 3 minutes at room temperature, the absorbance was measured at 500 nm. The FTC results were measured for 7 days at 24 hour intervals and compared with the control with distilled water instead of the sample. The antioxidant activity of the samples was compared with alpha-tocopherol as a positive control.

홍합 유래 지질 추출물의 항산화 활성을 FTC 방법에 의해 측정한 결과 TBA와 마찬가지로 헥산 추출물의 활성이 가장 높으며, 대조구와 비교했을 때, 7일 기준으로 대조구의 약 62.22%의 항산화활성을 나타내었으며 이는 알파토코페롤 활성의 66.51%에 해당하는 것이다 (도 19). 가장 활성이 높았던 헥산 추출물로 농도별 실험을 실시한 결과, 1.0% 농도에서 대조구 대비 약 62.89%의 항산화 활성으로 최적의 농도를 나타내었다.The antimicrobial activity of the mussel-derived lipid extract was measured by FTC method and showed the highest activity of hexane extract, similar to TBA, and showed an antioxidant activity of 62.22% of the control on a 7-day basis compared to the control. It corresponds to 66.51% of the activity (FIG. 19). Concentration experiments were conducted with the highest activity of hexane extract, showing an optimal concentration with antioxidant activity of about 62.89% at 1.0% concentration.

또한 바지락 유래 지질 추출물을 이용하여 FTC 값을 측정한 결과, TBA 법의 결과에서와 마찬가지로 클로로포름:헥산 추출물에서 가장 높은 활성을 나타내었으며, 대조구와 비교했을 때, 7일 기준으로 대조구의 약 33.91%의 항산화활성을 나타내었다 (도 20). 이는 알파토코페롤 활성의 36.45%에 해당하는 값이었다. 따라서 이 추출물을 사용하여 농도별 FTC 값을 측정한 결과에서도 최적 농도는 1% 였다.In addition, the FTC value was measured using the clam-derived lipid extract, and showed the highest activity in the chloroform: hexane extract as in the TBA method, and compared with the control, about 33.91% of the control on 7 days It showed antioxidant activity (FIG. 20). This corresponds to 36.45% of alphatocopherol activity. Therefore, the optimum concentration was 1% even when the FTC value of each extract was measured using this extract.

한편, 굴 유래 추출물의 항산화 활성은 FTC법에 의해 측정한 결과를 나타낸 것으로 메탄올:클로로포름 추출물의 활성이 가장 높은 활성을 나타내었으며, 대조구와 비교했을 때, 7일 기준으로 대조구의 약 38.99%의 항산화활성을 나타내었으며 이는 알파토코페롤 활성의 41.52%에 해당하는 값이었다 (도 21). 가장 높은 활성을 나타낸 메탄올:클로로포름 추출물을 사용하여 농도별 실험을 실시한 결과 1%에서 대조구 대비 약 38.44%의 항산화 활성을 나타내어 최적 농도로 판명되었다.
On the other hand, the antioxidant activity of the oyster-derived extract was measured by the FTC method, showing the highest activity of the methanol: chloroform extract, and compared with the control, about 38.99% of the antioxidant on the 7th day. Activity, which corresponds to 41.52% of alphatocopherol activity (FIG. 21). Concentration experiments using methanol: chloroform extract, which showed the highest activity, showed an antioxidant activity of about 38.44% compared to the control at 1%.

5. 활성산소종 생성에 미치는 영향
5. Effect on the generation of reactive oxygen species

패류 유래 지질 추출물이 마크로파지 세포 (Raw 264.7 cells) 내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성에 미치는 영향을 측정하였다. 활성산소종 (ROS)는 호흡과정에서 몸속으로 들어간 산소가 산화과정에 이용되면서 여러 대사과정에서 생성되어 생체조직을 공격하고, 세포를 손상시키는 산화력이 강한 산소종으로 과잉생성 시 우리 몸의 산화를 촉진시킨다. 실험방법은 다음과 같다. 즉, 6-well plate에 5×10⁵개의 마크로파지 세포를 접종하고 24시간 뒤에 패류 3종 지질 추출물 0.5 mg/㎖과 LPS (Lipopolysaccharide) 1 ㎍/㎖을 처리한 후 37℃, CO₂ 인큐베이터에 24시간 동안 반응시켰다. 24시간 후, 각 배지에 5 μM의 DCF-DA (2',7'-dichlorofluoroscein diacetate)를 첨가하여 30분 동안 반응시켜 수확하여 유세포 분석기 (FACScan, BD Science, USA)로 활성산소종 생성량을 측정하였다.The effects of shellfish-derived lipid extracts on the production of reactive oxygen species (ROS) in macrophage cells (Raw 264.7 cells) were measured. Free radical species (ROS) is a highly oxidative oxygen species that is produced by various metabolic processes as oxygen enters the body during the respiration process and attacks biological tissues and damages cells. Promote The experimental method is as follows. That is, after inoculating 5 × 10 ⁵ macrophage cells into a 6-well plate and treating the shellfish three lipid extracts 0.5 mg / ml and LPS (Lipopolysaccharide) 1 ug / ml after 24 hours, 37 ° C. in a CO ₂ incubator. The reaction was carried out for a time. After 24 hours, 5 μM of DCF-DA (2 ', 7'-dichlorofluoroscein diacetate) was added to each medium, followed by reaction for 30 minutes, harvested, and the amount of reactive oxygen species produced by flow cytometry (FACScan, BD Science, USA) was measured. It was.

실험 결과 홍합 유래 지질 추출물 중 메탄올, 헥산 추출물을 처리하였을 때, ROS 생성량이 감소한 것을 알 수 있었다 (도 22). 또한 바지락 유래 지질 추출물에서는 메탄올, 헥산, 클로로포름:헥산 추출물을 처리하였을 때, ROS 생성량이 감소한 것을 알 수 있었으며 (도 23), 굴 유래 지질 추출물에서는 메탄올, 클로로포름, 헥산, 메탄올:클로로포름, 클로로포름:헥산의 추출물에서 ROS 생성 억제 효과를 보였다 (도 24).
Experimental results showed that when the methanol and hexane extracts of mussel-derived lipid extracts were treated, ROS production was reduced (FIG. 22). In addition, the clam-derived lipid extract was found to reduce ROS production when methanol, hexane, and chloroform: hexane extracts were treated (FIG. 23). In the oyster-derived lipid extract, methanol, chloroform, hexane, methanol: chloroform, and chloroform: hexane The extract of showed an effect of inhibiting ROS production (Fig. 24).

실험예 3 : 홍합, 바지락 및 굴 유래 지질 추출물의 항암 효과 측정 및 정상세포에 미치는 영향Experimental Example 3: Antitumor effect of mussel, clam and oyster-derived lipid extracts on normal cells

패류 유래 지질 추출물이 암을 억제 할 수 있는지를 유방암 세포 MDA-MB-231 (ATCC, HTB-26), 폐암 세포 A549 (ATCC, CCL-185), 전립선암 세포 PC3 (ATCC, CRL-1435), 간암 세포 HepG2 (ATCC, CCL-13) 등을 요오드 프로피디움(propidium iodide, PI)으로 염색해 측정하였다. 요오드 프로피디움은 자동세포사멸인 아폽토시스를 측정하기 위해 자주 사용되는 형광색소로, DNA와 결합하므로 PI로 염색된 DNA양으로부터 세포사멸과 세포주기를 유추할 수 있었다. 즉, 12-well plate에 적당량의 암 세포를 접종하고 24시간 뒤에 패류 3종의 지질 추출물 0.5 mg/㎖을 처리한 후 37℃, CO₂ 인큐베이터에 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료되면 수확하여 4℃, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리후 상층액을 버리고, 인산염 완충액 300 μl를 첨가하여 잘 섞어 tween 20 0.5%가 함유된 차가운 에탄올 1 ㎖을 첨가하여 4℃에서 고정하였다. 24시간 후, 4℃, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리 후 상층액을 버리고, 여기에 인산염 완충액 1 ㎖을 첨가한 후 잘 섞어서 다시 4℃, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리하고, 상층액을 버린 다음, 여기에 RNase 10 μg/㎖이 포함된 요오드 프로피디움 용액 (최종농도 50 μg/㎖) 300 ㎕를 첨가하여 잘 섞어준 후 37℃에서 30분 염색하여 유세포 분석기(FACScan, BD Science, USA)에서 세포사멸과 세포주기를 측정하였다.Whether the shellfish-derived lipid extract can inhibit cancer breast cancer cells MDA-MB-231 (ATCC, HTB-26), lung cancer cells A549 (ATCC, CCL-185), prostate cancer cells PC3 (ATCC, CRL-1435), Liver cancer cells HepG2 (ATCC, CCL-13) and the like were measured by staining with propidium iodide (PI). Iodine propidium is a fluorescence pigment frequently used to measure apoptosis, which is an automatic cell death. Because it binds to DNA, apoptosis and cell cycle can be inferred from the amount of DNA stained with PI. That is, after inoculating an appropriate amount of cancer cells in a 12-well plate and treated with 0.5 mg / ㎖ of three shellfish lipid extracts after 24 hours, and reacted for 24 hours at 37 ℃, CO ₂ incubator. When the reaction was completed, harvested, centrifuged at 4 ℃, 13,000 rpm for 3 minutes and discarded the supernatant, and 300 μl of phosphate buffer was added and mixed well, 1 ml of cold ethanol containing tween 20 0.5% was added and fixed at 4 ℃. . After 24 hours, the supernatant was discarded after centrifugation at 4 ° C. and 13,000 rpm for 3 minutes, 1 ml of phosphate buffer was added thereto, mixed well, followed by centrifugation at 4 ° C. and 13,000 rpm for 3 minutes, and the supernatant was discarded. In addition, 300 μl of an iodine propidium solution (final concentration 50 μg / ml) containing 10 μg / mL of RNase was added thereto, followed by mixing well and staining for 30 minutes at 37 ° C. in a flow cytometer (FACScan, BD Science, USA). Apoptosis and cell cycle were measured.

홍합, 바지락 및 굴 유래 지질 추출물은 모든 추출물에서 유방암, 폐암, 전립선암, 간암 세포 사멸 효과를 나타내었고, 암세포 증식 억제 효과도 동시에 보였다(도 25 내지 도 36).
Mussel, clam, and oyster-derived lipid extracts showed breast cancer, lung cancer, prostate cancer, and liver cancer cell killing effects in all extracts, and also inhibited cancer cell proliferation (FIG. 25 to FIG. 36).

홍합, 바지락 및 글 유래 지질 추출물이 정상세포에 미치는 영향에 관하여 홍합, 바지락, 굴 지질 추출물을 정상세포에 처리 (1 mg/㎖)하여 위상차 현미경 (IX2-SLP, Olympus, Japan)을 통해 이미지를 촬영하였다. Effects of Mussels, Clams, and Lipid Extracts from Written on Normal Cells Mussels, clams, and oyster lipid extracts were treated on normal cells (1 mg / ml) and imaged through phase contrast microscopy (IX2-SLP, Olympus, Japan). Photographed.

홍합, 바지락 및 굴 유래 지질 추출물이 정상 신경세포 (PC12 cells)에 미치는 영향(도 37 내지 도 39) 및 정상 간세포 (Chang cells)에 미치는 영향(도 40 내지 도 42)은 패류 유래 지질 추출물을 처리한 군이 대조군 (control, DMSO)과 비슷한 모양을 유지하는 것으로 보아 패류 유래 지질 추출물은 정상 신경세포에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.
The effects of mussel, clam, and oyster-derived lipid extracts on PC12 cells (Figs. 37-39) and the effects on Chang cells (Figs. 40-42) were treated with shellfish-derived lipid extracts. Shell group-derived lipid extracts did not affect normal neurons, as one group retained a similar shape to the control (DMSO).

실험예 4 : 홍합, 바지락 및 굴 유래 지질 추출물의 항염증 효과 측정Experimental Example 4: Determination of anti-inflammatory effects of lipid extracts from mussels, clams and oysters

산화질소 (Nitric oxide)는 체내에서 L-아르기닌이 시트룰린을 생성할 때 생성되는 것으로, 과잉 생성시 우리 몸의 산화를 촉진시키는 자유 라디칼(free radical)로 알려져 있다. 홍합, 바지락 및 굴 유래 지질 추출물의 항염증 효과는 마크로파지 세포 Raw 264.7 에 LPS와 패류 3종의 지질 추출물을 처리하여, 패류 3종의 지질 추출물이 신경세포 내 산화질소 생성에 미치는 영향을 측정하였다. 즉, 6-well plate에 5×10⁵개의 마크로파지 세포를 접종하고 24시간 뒤에 패류 3종 지질 추출물 0.5 mg/㎖와 LPS (Lipopolysaccharide) 1 μg/㎖를 처리한 후 37℃, CO₂ 인큐베이터에 24시간 동안 반응시켰다. 24시간 후, 각 배지 50 ㎕를 새로운 96-well plate에 옮긴 후 sulfanilamide 50 ㎕를 첨가하여 실온에서 10분 방치한 다음 여기에 N-(1-나프틸) 에틸렌다이아민 다이하이드로클로라이드 (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride) 50 ㎕를 첨가하고 실온에서 15분 방치하여 550 nm에서 O.D. 값을 측정하였다. Nitric oxide is produced when L-arginine produces citrulline in the body, and is known as a free radical that promotes oxidation of the body when excess production occurs. The anti-inflammatory effects of mussel, clam and oyster-derived lipid extracts were treated with LPS and three types of shellfish extracts on macrophage cell Raw 264.7, and the effects of three shellfish extracts on nitric oxide production in neurons. That is, after inoculating 5 × 10 ⁵ macrophage cells into a 6-well plate and treating the shellfish three lipid extracts 0.5 mg / ml and LPS (Lipopolysaccharide) 1 μg / ml 24 hours later, they were treated with 37 ° C. in a CO ₂ incubator. The reaction was carried out for a time. After 24 hours, 50 μl of each medium was transferred to a new 96-well plate, and then 50 μl of sulfanilamide was added and allowed to stand at room temperature for 10 minutes, followed by N- (1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride (N- ( 50 μl of 1-Naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride) was added thereto and left at room temperature for 15 minutes to measure the OD value at 550 nm.

홍합 유래 지질 추출물이 마크로파지 세포 내에서, LPS로 인한 NO 생성량에 미치는 영향은 도 43에 나타나 있으며, LPS 단독 처리군에 비해 메탄올 추출물은 39.27%, 클로로포름 추출물은 20.88%, 헥산 추출물은 20.35%, 메탄올:클로로포름 추출물은 45.10% 및 클로로포름:헥산 추출물은 15.25%의 NO 생성 억제율을 나타내어 메탄올:클로로포름 추출물이 가장 높은 억제율을 보였다.The effect of the mussel-derived lipid extract on macrophage cells on NO production due to LPS is shown in FIG. 43, compared with LPS alone group, 39.27% methanol extract, 20.88% chloroform extract, 20.35% hexane extract and methanol. The chloroform extract showed 45.10% and the chloroform: hexane extract showed 15.25% NO production inhibition. The methanol: chloroform extract showed the highest inhibition rate.

한편 바지락 유래 지질 추출물의 경우는 LPS 단독 처리군에 비해 바지락 유래 지질 추출물 처리군에서 그 생성량이 감소하는데 메탄올 추출물은 45.10%, 헥산 추출물은 15.25%, 메탄올:클로로포름 추출물은 42.23% 및 클로로포름:헥산 추출물은 20.88%의 NO 생성 억제율을 나타내어 메탄올 추출물이 가장 높은 억제율을 보였으며 클로로포름 추출물은 효과를 보이지 않았음을 알 수 있었다 (도 44).In the case of the clam-derived lipid extract, the production amount of the clam-derived lipid extract treated group was lower than that of the LPS-only group. Showed an inhibition of NO production of 20.88%, methanol extract showed the highest inhibition rate and chloroform extract showed no effect (FIG. 44).

또한, 굴 유래 지질 추출물의 경우는 LPS 단독 처리군에 비해 메탄올 추출물은 39.27%, 클로로포름 추출물은 20.88%, 헥산 추출물은 20.35% 및 클로로포름:헥산 추출물은 15.25%의 NO 생성 억제율을 나타내었다 (도 45).
In addition, the oyster-derived lipid extract showed a 39.27% methanol extract, a chloroform extract 20.88%, a hexane extract 20.35% and a chloroform: hexane extract 15.25% compared to the LPS alone treatment group (FIG. 45). ).

실시예 2 : 홍합, 굴 및 바지락 지질 추출물로부터 항산화 물질 분리 및 정제Example 2 Isolation and Purification of Antioxidants from Mussel, Oyster and Clam Lipid Extracts

패류 유래 지질 추출물로부터 항산화 물질을 분리 정제하기 위하여 실리카 칼럼 크로마토그래피(silica column chromatography)를 실시한 후 TLC로 물질을 확인하였으며, 이를 4개의 획분으로 구분하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였다(도 46, 도 50, 도 54). 그 결과 홍합, 굴 및 바지락 메탄올 추출물로부터 각각 4개의 획분을 얻었으며, 4개의 획분 모두 농도의존적으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었으며, 홍합은 H-I 획분 (도 47), 굴은 G-III 획분 (도 51), 바지락은 B-IV 획분(도 55)에서 가장 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 보였다.In order to separate and purify antioxidants from shellfish-derived lipid extracts, silica column chromatography was performed, and the substances were identified by TLC. DPPH radical scavenging activity was measured by dividing into four fractions (FIG. 46, FIG. 50, FIG. 54). As a result, four fractions were respectively obtained from the mussel, oyster and clam methanol extracts, and all four fractions showed DPPH radical scavenging activity in a concentration-dependent manner, mussels were HI fractions (FIG. 47), and oysters were G-III fractions (FIG. 51), clam showed the highest DPPH radical scavenging activity in the B-IV fraction (FIG. 55).

상기 가장 높은 활성을 보인 획분을 분취용 TLC를 이용하여 2개 내지 5개의 획분으로 세분화하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였다. 앞의 결과와 같이 모든 획분이 농도의존적으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었으며, 그 중 홍합은 H-I-e 획분 (도 48), 굴은 G-III-b (도 52), 바지락은 B-IV-a (도 56)에서 가장 높은 활성을 보였다.The fraction showing the highest activity was subdivided into 2 to 5 fractions using preparative TLC to measure DPPH radical scavenging activity. As shown in the previous results, all fractions showed DPPH radical scavenging activity in a concentration-dependent manner, among which mussels were HIe fraction (FIG. 48), oysters were G-III-b (FIG. 52), and clams were B-IV-a ( 56) showed the highest activity.

1. 홍합, 굴 및 바지락 유래 지질 추출물의 실리카 칼럼 크로마토그래피
1. Silica Column Chromatography of Mussel, Oyster and Clam-derived Lipid Extracts

실리카 칼럼은 silica 60 (0.063 ~ 0.200 mm, Merck, Germany)을 헥산 : 다이에틸 에테르 : 아세트산(n-hexane : diethyl ether : acetic acid) = 80 : 20 : 2 (v/v)에 현탁하여 glass column (36 × 400 mm)에 충진한 후 평형을 맞추고 지질 추출물을 주입하여 얇은 막 크로마토그래피(TLC)로 물질을 확인하였다.
The silica column is suspended in silica 60 (0.063 ~ 0.200 mm, Merck, Germany) in hexane: diethyl ether: acetic acid (n-hexane: diethyl ether: acetic acid) = 80: 20: 2 (v / v) (36 x 400 mm), equilibrated and lipid extracts were injected to confirm the material by thin membrane chromatography (TLC).

2. 홍합, 굴 및 바지락 유래 지질 추출물의 얇은 막 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)
2. Thin layer chromatography (TLC) of lipid extracts from mussels, oysters and clams

전개용매 조건은 헥산 : 다이에틸 에테르 : 아세트산(n-hexane : diethyl ether : acetic acid) = 80 : 20 : 2 (v/v)로 전개하였고 예비 TLC(preparative TLC)로 분리한 밴드의 실리카 겔을 긁어서 메탄올 또는 헥산에 녹인 후 농축기로 용매를 건조시켜 분리된 물질을 얻어 실험에 사용하였다. 발색용액은 20% H₂SO₄를 사용하였다.
The developing solvent conditions were developed as hexane: diethyl ether: acetic acid (n-hexane: diethyl ether: acetic acid) = 80: 20: 2 (v / v), and the band of silica gel separated by preparative TLC was prepared. After scraping and dissolving in methanol or hexane, the solvent was dried with a concentrator to obtain a separated material, which was used in the experiment. As a coloring solution, 20% H ₂ SO ₄ was used.

3. DPPH 라디칼 소거 활성 측정
3. Measurement of DPPH Radical Scavenging Activity

DPPH는 짙은 자주색을 나타내며 그 자체가 질소 중심의 라디칼로서, 라디칼 전자의 비편재화에 의해 안정화된 상태로 존재한다. ESR을 이용한 DPPH 라디칼 소거 활성 측정법은 다음과 같다. 즉, 메탄올에 용해시킨 60 μM DPPH 60 ㎕와 농도별로 준비한 패류 유래 지질 추출물 60 ㎕를 혼합한 다음, 10초간 격렬하게 vortex하여 2분간 실온에 방치한 후, 모세관(capillary tube)에 옮겨 ESR 스펙트로미터 (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)를 이용해 측정하였다. 이때의 ESR 스펙트로미터 조건은 다음과 같다. central field, 3475 G; modulation frequency, 100 kHz; modulation amplitude, 2 G; microwave power, 5 mW; gain, 6.3 × 10⁵및 temperature, 298 K 이었다.
DPPH is dark purple and itself is a nitrogen-centered radical, which exists in a stabilized state by delocalization of radical electrons. Measurement of DPPH radical scavenging activity using ESR is as follows. In other words, 60 μl DPPH dissolved in methanol and 60 μl of shellfish-derived lipid extract prepared by concentration were mixed, vigorously vortexed for 10 seconds, allowed to stand at room temperature for 2 minutes, and then transferred to a capillary tube to an ESR spectrometer. (JEOL Ltd., Tokyo, Japan). The ESR spectrometer condition is as follows. central field, 3475 G; modulation frequency, 100 kHz; modulation amplitude, 2 G; microwave power, 5 mW; gain, 6.3 × 10 ⁵ and temperature, 298 K.

실험예 5 : 홍합, 굴 및 바지락 유래 지질 추출물의 항산화 활성 측정Experimental Example 5 Determination of Antioxidant Activity of Lipid Extracts from Mussels, Oysters, and Clam

본 실험예는 상기 홍합, 굴 및 바지락 유래 지질 추출물에서 분리 정제한 지질 소재의 항산화 효과를 측정하기 위한 다양한 실험을 보여준다.
This experimental example shows various experiments for measuring the antioxidant effect of the lipid material separated and purified from the mussel, oyster and clam derived lipid extract.

1. 산화 스트레스로 인한 간세포손상으로부터 세포보호 효능 측정
1. Measurement of Cytoprotective Effect from Hepatocellular Injury Due to Oxidative Stress

과산화수소(H₂O₂)에 의한 간세포(Chang cell)의 충격을 확인하기 위하여 Chang Cell을 30% 밀도로 12-well plate에 seeding하고, 24시간 후에 지질 추출물을 처리하였다. 처리 1시간 후, 1.5 mM의 과산화수소를 처리하고 24시간 경과하여 수확, 유세포 분석기를 이용한 세포사멸을 측정하였다. 구체적으로, 수확한 세포를 4℃, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액은 버리고, 여기에 1 ㎖의 차가운 PBS를 가해 세척한 다음, 다시 4℃, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 버린 후 300 ㎕의 차가운 PBS를 넣고 파이펫으로 잘 섞어 주었다. 상기에 1 ㎖의 0.5% tween 20-EtOH를 첨가하여 24시간 고정시키고, 고정시킨 세포를 1 ㎖의 차가운 PBS로 세척한 후, 최종농도 0.05 ㎎/㎖의 요오드 프로피디움 (propidium iodide)과 1 ㎍/㎖ RNase A를 첨가하여 37℃에서 30분간 염색한 다음 유세포 분석기(FACscan, BD, 미국)의 FL-2 파장을 적용하여 세포사멸 및 세포주기를 분석하였다.Chang cells were seeded on a 12-well plate at 30% density and treated with lipid extracts after 24 hours in order to confirm the impact of Chang cells by hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ). One hour after the treatment, 1.5 mM hydrogen peroxide was treated and harvested for 24 hours, and cell death was measured using a flow cytometer. Specifically, the harvested cells were centrifuged at 4 ° C. and 13,000 rpm for 3 minutes to discard the supernatant, and 1 ml of cold PBS was added thereto, followed by washing, followed by centrifugation at 4 ° C. and 13,000 rpm for 3 minutes. After discarding, 300 μl of cold PBS was added and mixed well with a pipette. 1 ml of 0.5% tween 20-EtOH was added thereto and fixed for 24 hours, and the fixed cells were washed with 1 ml of cold PBS, followed by final concentration of 0.05 mg / ml of propidium iodide and 1 µg. / Ml RNase A was added and stained at 37 ° C. for 30 minutes, and then cell death and cell cycle were analyzed by applying a FL-2 wavelength of a flow cytometer (FACscan, BD, USA).

결과는 도 58 내지 도 60에 나타내었으며, 본 발명의 패류자원 유래 지질 추출물로부터 분리 정제한 지질 소재가 산화 스트레스로부터 세포 보호능이 있다는 사실을 확인할 수 있었다.
The results are shown in Figure 58 to 60, it was confirmed that the lipid material separated and purified from shellfish-derived lipid extract of the present invention has a cell protection from oxidative stress.

2. 세포내 활성산소종 생성에 미치는 효과 측정
2. Determination of the effect on the generation of free radicals in cells

패류 유래 지질 추출물이 간세포(Chang cells) 내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성에 미치는 영향을 측정하였다. 실험방법은 다음과 같다. 즉, 6-well plate 0.8 × 10⁵개의 간세포를 접종하고 24시간 뒤에 패류 3종 지질 추출물과 H₂O₂ 1.5 mM을 처리한 후 37℃, CO₂ 인큐베이터에 24시간 동안 반응시켰다. 24시간 후, 각 배지에 5 μM의 DCF-DA(2',7'-dichlorofluoroscein diacetate)를 첨가하여 30분 동안 반응시켜 수확하여 유세포 분석기(FACScan, BD Science, USA)로 활성산소종 생성량을 측정하였다.The effects of shellfish-derived lipid extracts on the production of reactive oxygen species (ROS) in Chang cells were measured. The experimental method is as follows. In other words, 6-well plate 0.8 × 10 ⁵ hepatocytes were inoculated and treated with shellfish three lipid extracts and H ₂ O ₂ 1.5 mM 24 hours later, and then reacted for 24 hours at 37 ℃, CO ₂ incubator. After 24 hours, 5 μM of DCF-DA (2 ', 7'-dichlorofluoroscein diacetate) was added to each medium, followed by harvesting for 30 minutes, and the amount of reactive oxygen species produced by flow cytometry (FACScan, BD Science, USA) was measured. It was.

실험 결과 도 61 내지 도 63에서 나타나는 바와 같이 대조군에 산화적 스트레스를 유도한 H₂O₂ 군에서는 피크(peak)가 2개 이상으로 분리되면서 대조군과 확실한 대조를 이루었다. 한편, 홍합 추출물 H-I-e, 굴 추출물 G-III-b, 바지락 추출물 B-IV-a를 처리한 군에서는 피크 형태가 정상군으로 회복됨과 동시에 ROS가 감소하는 모습을 관찰할 수 있었다. 이로써 각각의 지질 소재는 간세포 내 산화스트레스로 유발된 활성산소종 생성을 억제한다는 것을 알 수 있다.
As shown in FIGS. 61 to 63, in the H ₂ O ₂ group that induced oxidative stress in the control group, the peak was separated into two or more peaks, which was in sharp contrast with the control group. Meanwhile, in the group treated with mussel extract HIe, oyster extract G-III-b, and clam extract B-IV-a, the peak shape was restored to the normal group and the ROS decreased. This suggests that each lipid material inhibits the generation of reactive oxygen species induced by oxidative stress in hepatocytes.

3. 세포내 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD) 활성에 미치는 효과 측정
3. Determination of effect on intracellular superoxide dismutase (SOD) activity

SOD는 초과산화이온을 산소와 과산화수소로 바꿔 줌으로써 독성으로부터 세포를 방어하는 역할을 한다. 산소에 노출된 거의 모든 세포에서 이러한 SOD에 의한 항산화방어기작이 중요하다. SOD protects cells from toxicity by converting excess oxides into oxygen and hydrogen peroxide. In almost all cells exposed to oxygen, this SOD-induced antioxidant defense mechanism is important.

SOD 분석은 잔틴/잔틴 옥사이드(xanthine/xanthine oxidase)에 의해 생성된 O₂ ^-에 의한 사이토크롬 c(cytochrome c)의 환원 반응을 SOD가 억제하는 정도를 측정하는 것으로, 요약하면 다음과 같다. 50 mM 인산칼륨 완충액(potassium phosphate buffer) (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 50 μM 잔틴(xanthine), 10 μM 사이토크롬 c(cytochrome c)가 포함된 반응액에 시료를 첨가하여 30℃에서 15분간 방치 후 잔틴 옥사이드(xanthine oxidase, XOD)를 첨가하여 반응을 개시하였으며 550 nm에서 30초 단위로 5분간 흡광도를 측정하였다. SOD analysis measures the extent to which SOD inhibits the reduction reaction of cytochrome c by O ₂ ⁻ generated by xanthine / xanthine oxidase. Samples were added to a reaction solution containing 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 50 μM xanthine, and 10 μM cytochrome c for 15 minutes at 30 ° C. After standing, the reaction was initiated by the addition of xanthine oxidase (XOD), and the absorbance was measured at 550 nm for 30 seconds in 5 minutes.

실험 결과는 도 64 내지 도 66에 나타내었다. 대조군에 비해 H₂O₂를 처리한 군에서는 그 활성이 감소한 한편, 홍합 추출물 H-I-e, 굴 추출물 G-III-b, 바지락 추출물 B-IV-a를 처리한 군에서는 SOD 활성이 더욱 감소하는 현상을 나타내었는데, 이는 각 지질 추출물로 인해 활성산소종이 감소함으로써, SOD 활성이 줄어든 것으로 사료된다.
Experimental results are shown in FIGS. 64 to 66. In the group treated with H ₂ O ₂ , the activity was decreased, whereas the group treated with mussel extract HIe, oyster extract G-III-b, and clam extract B-IV-a showed a further decrease in SOD activity. It is believed that SOD activity is reduced by the reduction of reactive oxygen species due to each lipid extract.

4. 세포내 카탈라아제(catalase) 활성에 미치는 효과 측정
4. Determination of effect on intracellular catalase activity

카탈라아제(catalase)는 과산화산소가 분해되어 물과 산소가 만들어지는 반응을 촉매하는 효소이다. 과산화수소와 같은 과산화물은 세포막에 나쁜 영향을 끼치기도 하고, 효소와 같이 몸속에서 중요한 기능을 하고 있는 물질들을 방해하기 때문에 몸속에 과산화수소가 존재하면 이를 빨리 파괴시켜 주어야 하는데, 카탈라아제가 이 역할을 한다.Catalase is an enzyme that catalyzes the reaction of oxygen peroxide to produce water and oxygen. Peroxides, such as hydrogen peroxide, can adversely affect cell membranes and interfere with substances that play an important role in the body, such as enzymes, so the presence of hydrogen peroxide in the body has to be destroyed quickly. Catalase plays this role.

카탈라아제 활성에 미치는 영향을 시그마사의 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, Eppendorf 튜브에 시료를 첨가하여 인산염 완충액으로 전체 75 ㎕가 되게 하여 비색분석을 위한 기질용액 25 ㎕를 첨가한 후, 각각의 튜브를 역전(inversion)하여 혼합한 다음 실온에서 5분 방치하여 정지 용액 900 ㎕를 첨가하였다. 이 중 10 ㎕를 취하여 새로운 Eppendorf 튜브로 옮겨 발색용액 1 ㎖를 첨가하고 역전하여 혼합한 후 15분 실온에서 방치한 다음 520 ㎚에서 흡광도 값을 측정하여 아래의 식에 따라 효소활성을 측정하였다. The effect on catalase activity was measured using Sigma's assay kit. Specifically, the sample was added to the Eppendorf tube to make 75 μl total with phosphate buffer, and 25 μl of substrate solution for colorimetric analysis was added. Each tube was inverted and mixed and left at room temperature for 5 minutes. 900 μl of stop solution was added. 10 μl of the solution was transferred to a new Eppendorf tube, 1 ml of color solution was added, inverted and mixed, and the mixture was left at room temperature for 15 minutes and the absorbance value was measured at 520 nm. The enzyme activity was measured according to the following formula.

지질 추출물에서 분리 정제한 지질 소재가 간세포 내 카탈라아제 활성에 미치는 영향을 측정한 결과는 도 67 내지 도 69에 나타내었다. 대조군에 비해 H₂O₂를 처리한 군에서는 그 활성이 감소하였으나, 홍합 추출물 H-I-e, 굴 추출물 G-III-b, 바지락 추출물 B-IV-a를 처리한 군에서는 카탈라아제 활성이 상승한 것을 관찰할 수 있다. 따라서 상기 지질 소재는 간세포 내 카탈라아제 활성을 높여주는 것으로 사료된다.
The results of measuring the effect of lipid material isolated and purified from the lipid extract on the catalase activity in hepatocytes are shown in FIGS. 67 to 69. In the group treated with H ₂ O ₂ , the activity was decreased, but the catalase activity was increased in the group treated with mussel extract HIe, oyster extract G-III-b, and clam extract B-IV-a. have. Therefore, the lipid material is thought to enhance the catalase activity in hepatocytes.

5. 세포내 글루타티온 퍼옥시다제(glutathione peroxidase, GPx) 활성에 미치는 효과 측정
5. Determination of the effect on intracellular glutathione peroxidase (GPx) activity

글루타티온은 생체에서 뽑아낸 최초의 결정성 폴리펩티드로 자연계에 널리 분포하여 동물, 효소 등 거의 모든 생체 내의 산화환원반응에 중요한 역할을 한다. GPx는 글루타티온 분자를 매개체로 하여 과산화수소를 분해하여 중화시킨다.Glutathione is the first crystalline polypeptide extracted from living organisms and is widely distributed in nature and plays an important role in redox reactions in almost all living organisms such as animals and enzymes. GPx decomposes and neutralizes hydrogen peroxide through the glutathione molecule.

GPx 활성에 미치는 영향을 시그마사의 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, Eppendorf 튜브에 아래의 표와 같이 정해진 양의 각 용매를 첨가하고, 각각의 튜브를 혼합하여 다음 340 ㎚에서 10초 간격으로 총 6번 흡광도 값을 측정하고, 아래의 식과 같이 효소활성을 계산하였다.
The effect on GPx activity was measured using Sigma's assay kit. Specifically, each solvent was added to the Eppendorf tube in a predetermined amount as shown in the table below, and the respective tubes were mixed to measure absorbance values for six times at 10 second intervals at the next 340 nm. Calculated.

단, 여기에서 6.22는 NADPH의 ε mM 값이다.
Where 6.22 is the ε mM value of NADPH.

실험 결과는 도 70 내지 도 72에 나타내었다. 대조군에 비해 H₂O₂를 처리한 군에서는 그 활성이 소량 증가하였다. 이는 산화스트레스로 인한 인체방어 체계의 일환이라 판단된다. 한편 홍합 추출물 H-I-e, 굴 추출물 G-III-b, 바지락 추출물 B-IV-a를 처리한 군에서는 GPx 활성이 대조군에 비해 모두 약 4배 상승한 것을 관찰할 수 있었으며, 이 결과로 볼 때 각각의 분리 정제된 지질 소재는 간세포 내 GPx 활성을 높여주는 것으로 볼 수 있다.
Experimental results are shown in FIGS. 70 to 72. Compared with the control group, the H ₂ O ₂ treated group showed a small increase in activity. This is considered to be part of the human defense system due to oxidative stress. On the other hand, in the group treated with mussel extract HIe, oyster extract G-III-b, and clam extract B-IV-a, the GPx activity was increased by about 4 times compared to the control group. Purified lipid material can be seen to enhance GPx activity in hepatocytes.

6. 세포내 GST(Glutathione-S-Transferase) 활성에 미치는 효과 측정
6. Determination of the effect on intracellular GST (Glutathione-S-Transferase) activity

글루타티온은 구행성의 그룹이 시스테인(cystein) 부분에 있어서 전자친화성 기질과 결합이 잘 되지 않아 반응이 느리다. 이 때 촉매제로 GST가 클루타치온과 전자친화성 기질을 결합시켜 H₂O₂를 중화시키는 역할을 한다.Glutathione reacts slowly because globular groups do not bind well with electron-affinity substrates in the cysteine region. At this time, GST acts as a catalyst to neutralize H ₂ O ₂ by combining glutathione and an electron-affinity substrate.

GST(glutathione-S-transferase) 활성에 미치는 영향을 시그마사의 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, Eppendorf 튜브에 기질용액 1,000 ㎕에 각각 시료 2 ㎕를 넣거나, 효소 보정군에 GST control 2 ㎕를 첨가한 후 혼합한 다음 340 ㎚에서 30초 간격으로 총 9회 흡광도 값을 측정하고, 아래와 같이 계산하였다.The effect on glutathione-S-transferase (GST) activity was measured using Sigma's assay kit. Specifically, 2 μl of each sample was added to 1,000 μl of substrate solution in an Eppendorf tube, or 2 μl of GST control was added to the enzyme calibrating group, followed by mixing. Then, the total absorbance value was measured 9 times at 30 seconds intervals at 340 nm. Calculated together.

각각의 패류자원 유래 지질 추출물에서 분리 정제한 지질 소재가 간세포 내 GST 활성에 미치는 영향을 측정한 결과는 도 73 내지 도 75에 나타내었다. 대조군에 비해서 H₂O₂를 처리한 군에서 GST 활성이 감소한 한편, 홍합 추출물 H-I-e, 굴 추출물 G-III-b, 바지락 추출물 B-IV-a를 처리한 군에서는 활성이 대조군에 비해 모두 약 2배 상승한 것을 관찰할 수 있었으며, 이 결과로 볼 때 각각의 분리 정제된 지질 소재는 간세포 내 GST 활성을 높여주는 것으로 볼 수 있다.
The results of measuring the effect of lipid material isolated and purified from each shellfish-derived lipid extract on GST activity in hepatocytes are shown in FIGS. 73 to 75. GST activity was decreased in the H ₂ O ₂ treated group compared to the control group, while the mussel extract HIe, oyster extract G-III-b, and clam extract B-IV-a treated all about 2% in the treated group. It was observed that the fold increased, and the results show that each isolated and purified lipid material enhances GST activity in hepatocytes.

실시예 3 : 홍합, 굴 및 바지락 유래 지질 추출물로부터 항암 물질 분리 정제Example 3 Purification of Anticancer Substances from Lipid Extracts from Mussels, Oysters and Clam

패류 유래 지질 추출물로부터 항암 물질을 분리 정제하기 위하여 상기 항산화 물질 분리 정제 시와 동일한 방법을 실시하였다. 즉, 홍합, 굴 및 바지락 헥산 추출물로부터 실리카 칼럼 크로마토그래피(silica column chromatography)를 실시한 후 TLC를 실시하였으며, 이를 4개의 획분으로 구분하여 전립선암 세포사멸율을 측정하였다. 그 결과, 홍합은 H-III 획분 (도 77), 굴은 G-III 획분 (도 81), 바지락은 B-III 획분(도 85)에서 가장 높은 전립선암 세포사멸율을 보였다.In order to separate and purify the anticancer substance from the shellfish-derived lipid extract, the same method as in the separation and purification of the antioxidant substance was performed. That is, TLC was performed after silica column chromatography from mussel, oyster and clam hexane extracts, and the prostate cancer cell death rate was measured by dividing it into four fractions. As a result, mussels showed the highest prostate cancer cell death rate in H-III fraction (FIG. 77), oysters in G-III fraction (FIG. 81), and clams in B-III fraction (FIG. 85).

상기 가장 높은 활성을 보인 획분을 분취용 TLC를 이용하여 각각 2개의 획분으로 세분화하여 전립선암 세포사멸율을 측정하였다. 그 중 홍합은 H-III-b 획분 (도 78), 굴은 G-III-a (도 82), 바지락은 B-III-a (도 86)에서 가장 높은 활성을 보였다.
The highest activity fractions were subdivided into two fractions using preparative TLC to measure prostate cancer cell death. Among them, mussels showed the highest activity in H-III-b fraction (FIG. 78), oysters in G-III-a (FIG. 82), and clams in B-III-a (FIG. 86).

본 실시예에서는 상기 실험예 3에 나타난 방법과 동일한 방법으로 지질 추출물로부터 분리 정제한 물질의 항암 효과를 측정하였다. 도 88 내지 도 94에 홍합, 굴 및 바지락 유래 지질 추출물로부터 분리 정제한 각각의 물질이 유방암, 폐암 및 간암에 대해서 세포사멸효과를 보이고 있음을 나타내는 실험 결과를 보여주고 있다.
In this example, the anticancer effect of the material separated and purified from the lipid extract in the same manner as shown in Experimental Example 3 was measured. 88 to 94 show experimental results showing that each substance separated and purified from mussel, oyster and clam derived lipid extracts showed apoptosis effect against breast cancer, lung cancer and liver cancer.

실시예 4 : 홍합, 굴 및 바지락 유래 지질 추출물로부터 항염증 물질 분리 정제Example 4 Isolation and Purification of Anti-Inflammatory Substances from Mussel, Oyster and Clam-Derived Lipid Extracts

패류 유래 지질 추출물로부터 항염증 물질을 분리 정제하기 위하여 상기 항산화 물질 분리 정제 시와 동일한 방법을 실시하였다. 즉, 홍합, 굴 및 바지락 메탄올 추출물을 가지고 실리카 칼럼 크로마토그래피(silica column chromatography)를 실시한 후 TLC를 실시하였으며, 이를 4개의 획분으로 구분하여 NO 발생율을 측정하였다. 그 결과, 홍합은 H-II 획분 (도 98), 굴은 G-I 획분 (도 101), 바지락은 B-III 획분(도 104)에서 가장 높은 활성을 보였다.In order to separate and purify the anti-inflammatory substance from the shellfish-derived lipid extract, the same method as in the above-described purification of the antioxidant substance was performed. That is, TLC was performed after silica column chromatography with mussel, oyster and clam methanol extracts, and the NO generation rate was measured by dividing it into four fractions. As a result, mussels showed the highest activity in H-II fractions (FIG. 98), oysters in G-I fractions (FIG. 101), and clams in B-III fractions (FIG. 104).

상기 가장 높은 활성을 보인 획분을 분취용 TLC를 이용하여 각각 2개의 획분으로 세분화하여 NO 발생율을 측정하였다. 그 중 홍합은 H-II-a 획분 (도 99), 굴은 G-I-c (도 102), 바지락은 B-II-b (도 105)에서 가장 높은 활성을 보였다.
The fraction showing the highest activity was subdivided into two fractions each using preparative TLC to measure the NO incidence. Among them, mussels showed the highest activity in H-II-a fraction (FIG. 99), oysters in GIc (FIG. 102), and clams in B-II-b (FIG. 105).

본 실시예에서는 상기 실험예 4에 나타는 방법과 동일한 방법으로 지질 추출물로부터 분리 정제한 물질의 항염증 효과를 측정하였다.
In this example, the anti-inflammatory effect of the material separated and purified from the lipid extract in the same manner as shown in Experimental Example 4 was measured.

이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. As described above, specific portions of the contents of the present invention have been described in detail, and for those skilled in the art, these specific techniques are merely preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereto. Will be obvious. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

Claims

(1) dissolving shellfish in a buffer;
(2) hydrolyzing by adding a lipid hydrolase to a buffer in which shellfish are dissolved in step (1);
(3) separating the hydrolyzate produced by step (2) into a supernatant and a residue by centrifugation;
(4) extracting the supernatant and the residue prepared by the step (3) with an organic solvent, respectively; And
(5) mixing the extract extracted by the step (4) and then concentrated to harvest the final lipid; method of producing shellfish-derived lipid extract comprising a.
However, the buffer used in step (1) is phosphate buffer or glycine-HCl buffer, and the lipid hydrolase used in step (2) is recitase (lecitase). .

delete

The method of claim 1,
Shellfish used in step (1) is a method of producing shellfish-derived lipid extract, characterized in that at least one selected from the group consisting of mussels, clams and oysters.

delete

The method of claim 1,
The step (2) is a method for producing a shell-derived lipid extract, characterized in that the hydrolysis in a buffer of pH 7.0 to 9.0 for 30 to 60 ℃, reaction time 6 to 10 hours.

The method of claim 1,
The organic solvent used in the step (4) is methanol (methanol), chloroform (chloroform) and hexane ( n- hexane) method for producing a shell-derived lipid extract, characterized in that at least one selected from the group consisting of.

The shellfish-derived lipid extract extracted by the method of any one of claims 1, 3, 6 or 7.

Antioxidant containing the shellfish-derived lipid extract of claim 8 as an active ingredient.

An anticancer agent comprising the shellfish-derived lipid extract of claim 8 as an active ingredient.

An anti-inflammatory agent containing the shellfish-derived lipid extract of claim 8 as an active ingredient.

Health functional food containing the shellfish-derived lipid extract of claim 8 as an active ingredient.

(1) separating the shell-derived lipid extract by chromatography;
(2) measuring the biological activity of each of the separated fractions; And
(3) purifying the fraction having the highest biological activity among the separated fractions;
It comprises, and repeating the steps (1) to (3) to purify a single substance, characterized in that the separation and purification method of shellfish-derived functional lipids.

The method of claim 13,
In step (1), the silica column chromatography is primarily performed, and secondly, thin membrane chromatography (TLC) is performed to separate and purify shellfish-derived functional lipids.

The method of claim 14,
The silica column chromatography or thin membrane chromatography is a shellfish-derived functional lipid, characterized in that using a solution of hexane, diethyl ether and acetic acid in a ratio of 80: 20: 2 (v / v) as a developing solvent Separation Purification Method.

An antioxidant containing shellfish-derived functional lipid separated and purified by the method of claim 15 as an active ingredient.

An anticancer agent containing the shellfish-derived functional lipid separated and purified by the method of claim 15 as an active ingredient.

An anti-inflammatory agent containing a shellfish-derived functional lipid separated and purified by the method of claim 15 as an active ingredient.

Health functional food containing a shellfish-derived functional lipid separated and purified by the method of claim 15 as an active ingredient.