KR101132305B1 - 적색색소를 생산하는 신규 미생물 종 주시켈라 루비더스 및이로부터 생산되는 적색 색소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 적색 색소를 생산하는 주시켈라 루비더스(Zooshikella rubidus) 또는 상기 주시켈라 루비더스와 동일한 RFLP(Restriction fragment length polymorphism) DNA 프로파일을 갖는 주시켈라 루비더스, 주시켈라 루비더스를 배양하는 단계를 포함하는 적색색소의 제조방법, 주시켈라 루비더스가 생산하는 적색색소 성분 중 프로디지오신, 사이클로프로디지오신 및 프로디지오신 유도체, 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 주시켈라 루비더스의 배양추출물을 포함하는 항암용 조성물, 항균조성물, 천연염료 조성물, 해수 적조 완화용 살조 조성물 및 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 주시켈라 루비더스의 배양추출물을 해수에 살포하는 단계를 포함하는 해수 적조의 살조방법에 관한 것이다. 본 발명은 적색색소를 생산하는 신규한 주시켈라 루비더스 S1-1을 제공하며, 본 발명의 주시켈라 루비더스의 배양액 또는 배양 추출물은 항암 작용, 항균 작용, 직물의 기능성 천연 염색 과정 및 해수 적조의 완화 작용에 유용하게 이용될 수 있다.

주시켈라 루비더스, 프로디지오신, 사이클로프로디지오신, 프로디지오신 유도체, 적조살상, 항균, 항암, 천연 염색

Description

적색색소를 생산하는 신규 미생물 종 주시켈라 루비더스 및 이로부터 생산되는 적색 색소{New Bacterial Species Zooshikella rubidus Producing Red Pigments and Red Pigments Produced from It}

본 발명은 적색 색소를 생산하는 신규한 미생물 주시겔라 루비더스 및 이로부터 생산되는 유용 적색 색소의 성분인 프로디지오신, 사이클로프로디지오신 및 프로디지오신 유도체, 그리고 이들의 용도에 관한 것이다.

프로디지오신(prodigiosin)과 그 유도체들은 피롤(pyrrole)형 화합물로써 지금까지 세라티아(Serratia), 악티노마루다(Actinomadura), 하헬라(Hahella), 스트렙토마이스(Streptomyces), 노카르디아(Nocardia), 슈도모나스(Pseudomonas), 비브리오(Vibrio), 알터로모나스(Alteromonas), 클라도포라(Cladophora), 베넥키아(Beneckea) 등의 종에서 생산되는 것으로 보고되었으며, 생물학적 항균활성, 백혈병 치료효과, 항 말라리아, 당뇨병과 류마티스 관절염 치료효과 등 넓은 범위의 활성을 가지는 것으로 밝혀져 있을 뿐만 아니라 최근 국제공개특허 제 2004-099391 호 및 제 2007-073011호를 통해 적조 살상효과가 있음이 밝혀졌다. 사이클로프로디지오신은 알터로모나스(Alteromonas), 슈도알토로모나스(Pseudoalteromonas), 베넥키아(Beneckea)의 종에서만 생산되는 것으로 보고되었고, 항균, 항진균, 면역억제효과와 동맥경화, 골다공증 및 백혈병 치료에도 효과가 있음이 보고되어 있다.

한편, 최근에는 비브리오 균주에서 생산된 프로디지오신을 포함하는 항균색소 혼합물을 이용한 섬유 염색에 관한 연구가 보고된바 있다(Farzaneh Alihosseini et al. Biotechnol Prog 24:742-747(2008)).

염색은 천연염료를 이용하는 천연염색과 합성염료를 사용하는 인공염색으로 구분되는데, 다양한 색상과 우수한 염색결과를 얻기 위하여 대부분 합성염료가 사용되어왔다. 특히, 수천 년에 걸쳐 이용되어 온 천연염료는 원료의 채취가 제한적이고, 염료의 추출과정이 복잡하며 염색방법도 공정이 복잡하여 노동력이 많이 들기 때문에 합성염료가 개발된 이후 점차 사용량이 감소되었다. 그러나 자연과 환경오염 문제가 대두되면서, 합성염료의 사용은 무엇보다도 다양한 오염 물질의 배출로 인한 환경오염의 폐해가 크고, 합성염료를 사용한 섬유제품의 경우 아토피성 피부염을 유발하는 등 인체에도 좋지 않은 영향을 주는 것이 밝혀지고 있다. 세계 의류 염색분야에서도 환경 친화적인 천연염색에 대한 관심이 고조되고 있고 이를 산업적으로 활용하기 위한 기술이 다방면으로 개발되고 있다. 의류 분야에서 EU집행위원회에서 창설한 La Fleur등은 2005년부터 시행된 FTA이후 실제로 자국의 의류산업을 보호하기 위한 수입 규제책으로 활용되고 있다. 섬유 염색에 사용되는 화학염료 중 43개의 아조계통의 유독성 물질은 이미 염료로 사용할 수 없다. 이에 따라 천연염색이 친환경적인 저공해 공정을 가질 뿐만 아니라 인체에 무해한 친환경적 특성을 가지므로 천연염색용 자원에 대한 관심이 높아지고 있다. 아울러 천연염색은 제품의 고부가가치화에 활용할 수 있으며 특히 섬유를 염색할 시 항균성, 소취성, 항알러지성 부여 등의 많은 생리기능적 장점을 갖고 있는 것으로 알려지고 있다. 따라서 유용한 천연염료의 개발에 대한 관심이 높아지게 되었고 다양한 천연염재의 연구가 계속되고 있다.

천연염료의 재료에는 식물, 동물, 광물 등으로 분류할 수 있으며, 식물성 재료에는 식물의 잎과 꽃, 열매, 수피, 심재, 뿌리 등에 포함된 색소를 포함할 수 있으며, 동물성 재료에는 보라조개, 오배자, 코치닐, 커미즈 등을 들 수 있고, 광물로서는 각종 돌가루나 황토, 머드, 숯, 화산재 등의 흙과 각종 광물질 등을 들 수 있다. 이중 천연염색의 염재로는 주로 식물에서 얻은 재료를 사용하는데 문제점은 재배지, 기후 등의 조건에 따라서 색소생산량이 다르고 염색시 반복재현성이 없어서 산업적 대량생산은 불가능하다는 점이다.

미생물을 이용한 제품은 라이신, 항생제 등이 제품관리가 될 정도로 대형 발효조에서 공업적 생산을 하고 있고 일부 식품색소는 미생물을 이용해서 생산되고 있다. 최근, 천연염료의 생산에 미생물을 이용하는 연구가 다수 진행되고 있으며, 대표적으로 인디고의 생산에 미생물을 이용한 연구가 보고된 바 있다(미국등록특허 제 6303354호 ; Chinese Journal of Biotechnology 24(6):921-926(2008)).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 해수의 적조를 완화할 수 있고, 항균 및 항암 작용을 나타내며, 그리고 기능성 천연 염료로 이용될 수 있는 적색색소의 생산능력이 우수한 신규 미생물을 분리하기 위하여 연구하였다. 그 결과 다른 2차 대사산물을 생산하지 않으면서 높은 효율로 적색 색소를 생산하는 신규 균주를 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 적색 색소를 생산하는 주시켈라 루비더스 또는 상기 주시켈라 루비더스와 동일한 RFLP DNA 프로파일을 갖는 주시켈라 루비더스를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 적색색소의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 주시켈라 루비더스에 의해 동시에 생산되는 프로디지오신, 사이클로프로디지오신 및 프로디지오신 유도체의 혼합물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 프로디지오신 유도체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 항암용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 항균조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 천연염료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 해수 적조 완화용 살조 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 해수 적조의 살조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 적색색소를 생산하는 신규한 주시켈라 루비더스(Zooshikella rubidus) 또는 상기 주시켈라 루비더스와 동일한 RFLP DNA 프로파일을 갖는 주시켈라 루비더스를 제공한다.

본 발명자들은 해수의 적조를 완화할 수 있고, 항균 및 항암 작용을 나타내며, 그리고 기능성 천연 염료로 이용될 수 있는 적색색소의 생산능력이 우수한 신규 미생물을 분리하기 위하여 연구하였다. 그 결과 다른 2차 대사산물을 생산하지 않으면서 높은 효율로 적색 색소를 생산하는 신규 균주를 발견하였다.

본 발명에 따르면, 갯벌 시료로부터 분리한 미생물 중 적색색소 생산능이 우수한 신규의 미생물을 탐색한 결과 우수한 적색 색소 생산능력을 나타내는 균주를 최종적으로 선별하여, 이에 대한 16S rRNA 유전자의 염기서열 결정 및 분석과 DNA-DNA 상동성 실험 등을 수행하였다. 그 결과, 주시켈라 속(Genus Zooshikella)에 속하는 신규의 미생물로 동정됨으로써 “Zooshikella rubidus S1-1”이라 명명하고 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2008년 12월 31일자로 기탁하였고, 기탁번호 KCTC 11448BP를 부여받았다.

본 발명의 신규한 균주는 주시켈라 루비더스(Zooshikella rubidus)뿐만 아니라 주시켈라 루비더스와 동일한 RFLP DNA 프로파일을 갖는 주시켈라 루비더스를 포함한다.

본 명세서에서 신규한 균주 주시켈라 루비더스를 언급하면서 사용되는 표현 “동일한 RFLP DNA 프로파일을 갖는 주시켈라 루비더스"는 기탁된 주시켈라 루비더스의 계대배양 또는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 생산되는 기탁된 주시켈라 루비더스의 자손(descendents)을 포함하는 주시켈라 루비더스의 복제물(replicates) 또는 기탁된 주시켈라 루비더스의 RFLP DNA 프로파일과 실질적으로 동일한(substantially equivalent) RFLP를 가지는 미생물을 의미한다. 상기 ”실질적으로 동일한 또는 동일한 RFLP를 갖는다“는 것은, Tenover 등에 의해 제시된 방법(Tenover, F. C. et al. Interpreting Chromosomal DNA Restriction Patterns Produced by Pulsed-Field Gel Electrophoresis: Criteria for Bacterial Strain Typing. J. Clin . Microbiol . 33:2233-2239(1995))에 따라 유기체 사이의 변이성(variability)을 나타내기 위하여 사용된 표현이다. Tenover 등은, 동일한 파생 유기체(identical propagated organisms)의 지놈을 제한효소 절단하고 전기영동한 경우 나타나는 패턴에서 변이성의 수용가능한 레벨을 제시하고 있다. Tenover 등이 제시한 기준에 따라 동일한 RFLP DNA 프로파일을 갖는 미생물은 본 발명의 주시켈라 루비더스와 동일한 미생물로 취급될 수 있다.

한편, Wayne 등이 제시한 방법(Wayne et al. Int . J. Syst . Bacteriol 37:463(1987))에 따라 DNA-DNA 혼성화(hybridization)를 한 경우, 70% 이상의 관련 성(relatedness)을 나타내고 5℃ 이하의 ΔTm 값을 나타내는 미생물도 본 발명의 주시켈라 루비더스에 포함되는 것으로 해석된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 주시켈라 루비더스는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 16S rRNA를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 주시켈라 루비더스는 주시켈라 루비더스(Zooshikella rubidus) S1-1(KCTC 11448BP)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 주시켈라 루비더스에 의해 생산되는 적색 색소는 프로디지오신, 사이클로프로디지오신, 프로디지오신 유도체 또는 이들의 혼합물이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 주시켈라 루비더스는 종전의 미생물과 달리 프로디지오신, 사이클로프로디지오신 및 프로디지오신의 유도체를 동시에 생산한다. 다른 적색색소-생산 미생물들과 다르게, 본 발명의 주시켈라 루비더스는 프로디지오신과 함께 사이클로프로디지오신을 주성분으로 생산한다. 또한, 본 발명의 주시켈라 루비더스는 알킬 사슬의 길이가 차이나는 프로디지오신 유도체들을 생산한다. 본 명세서에서 용어 “프로디지오신 유도체”는 프로디지오신의 4번 탄소에 결합된 알킬 사슬의 길이가 서로 다른 유도체를 의미하며, 도 3에 화학구조식이 예시되어 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 주시켈라 루비더스를 배양하는 단계를 포함하는 적색색소의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 주시켈라 루비더스의 배양 과정은 당업계에 공지된 다양한 해양 미생물 배양 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 펩톤, 효모 추출물, 구연산철, 염화나트륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화칼륨, 중탄산나트륨, 브롬화칼륨, 염화스트론튬, 붕산, 규산나트륨, 플루오르화 나트륨, 질산암모늄 및 디소듐포스페이트을 포함하는 액체 배양액에 본 발명의 주시켈라 루비더스를 접종하고 적합한 온도(예컨대 30℃)에서 진탕배양 한다.

이어, 배양 결과물로부터 적색색소를 수집(collect) 하여 적색색소를 얻는다. 예를 들어, 배양 결과물을 원심분리하여 배지 상등액과 미생물로 분리한다. 그런 다음, 배지 상등액을 적합한 추출용매로 추출한다. 이 경우 사용되는 용매는 비극성 용매가 바람직하고, 보다 바람직하게는 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 또는 THF가 이용되며, 보다 더 바람직하게는 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트 또는 메틸 아세테이트이고, 가장 바람직하게는 에틸 아세테이트이다.

배지 상등액에 비극성 용매를 처리하여 적색색소를 얻는 경우, 비극성 용매 가용부가 적색색소 분획이다.

한편, 배지 상등액뿐만 아니라 미생물 자체로부터도 적색색소를 얻을 수 있다. 예를 들어, 주시켈라 루비더스를 적합한 추출용매로 추출한다. 이 경우 사 용되는 용매는 비극성 용매가 바람직하고, 보다 바람직하게는 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 또는 THF가 이용되며, 보다 더 바람직하게는 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트 또는 메틸 아세테이트이고, 가장 바람직하게는 아세톤이다.

배양된 주시켈라 루비더스에 비극성 용매를 처리하여 적색색소를 얻는 경우, 비극성 용매 가용부가 적색색소 분획이다.

상기 추출 과정을 통하여 얻은 적색색소는 감암 농축, 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 공정을 통해 처리될 수도 있다.

또한, 상기 추출 과정을 통해 수득한 적색색소는 통상적인 정제 과정을 거쳐 순수하게 분리할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 적색색소가 순수하게 분리될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 수득되는 적색 색소는 프로디지오신, 사이클로프로디지오신, 프로디지오신 유도체 또는 이들의 혼합물이다.

본 발명의 방법에 따르면, 적색색소를 생산하는 주시켈라 루비더스가 다른 2차 대사산물을 생산하지 않으면서 적색색소만을 2차 대사산물로 생산하기 때문에 매우 높은 효율로 적색색소를 얻을 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 주시켈라 루비더스가 생산하는 적색 색소의 구성 성분의 하나로써 다음 화학식 3의 프로디지오신 유도체를 제공한다:

화학식 3

상기 화학식에서 R은 -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃(옥틸기) 또는 -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃(노닐기)이다.

프로디지오신의 IUPAC(International Union of Pure and Applied Chemistry)명칭은 4-메톡시-5-[(Z)-(5-메틸-4- 펜틸-2H-피롤-2-일라이덴)메틸]-1H,1′H-2,2′-비피롤이고, 이들의 각 유도체는 C₄에 결합된 알킬체인의 길이가 다양한 형태이며, 현재까지 분자량이 각각 365(m/z 366) 및 379(m/z 380)인 유도체는 알려져 있지 않 다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 신규 균주 주시켈라 루비더스는 C₄에 각각 옥틸(octyl)기와 노닐(nonyl)기가 결합되어 각각 분자량 366 및 380을 가지는 신규한 프로디지오신 유도체들을 생산한다. 이들의 화학식 및 IUPAC명칭은 아래와 같다:

화학식 4

4-메톡시-5-[(Z)-(5-메틸-4- 옥틸-2H-피롤-2-일라이덴)메틸]-1H,1′H-2,2′-비피롤

화학식 5

4-메톡시-5-[(Z)-(5-메틸-4-노닐-2H-피롤-2-일라이덴)메틸]-1H,1′H-2,2′-비피롤

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 주시켈라 루비더스의 배양 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

본 발명의 항암 조성물은 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 주시켈라 루비더스의 배양 추출물을 유효성분으로 포함한다.

본 명세서에서 용어 “주시켈라 루비더스의 추출물”은 주시켈라 루비더스에 적합한 추출용매를 처리하여 얻은 추출물을 의미한다. 상기 추출용매는 상술한 본 발명의 적색색소의 제조방법에서 기재한 추출용매와 동일하다.

본 명세서에서 용어 “주시켈라 루비더스의 배양 추출물”은 주시켈라 루비더스를 배양하여 얻은 배양결과물(배양 상등액 및/또는 배양된 주시켈라 루비더스)에 적합한 추출용매를 처리하여 얻은 추출물을 의미한다. 상기 추출용매는 상술한 본 발명의 적색색소의 제조방법에서 기재한 추출용매와 동일하다.

유효성분인 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 주시켈라 루비더스의 배양 추출물에는 적색색소, 바람직하게는 프로디지오신, 사이클로프로디지오신, 프로디지오신 유도체 또는 이들의 혼합물이 포함되어 있어, 우수한 항암 활성을 나타낸다.

프로디지오신은 다양한 인간 종양세포주에 아폽토시스를 촉진시킨다. 이 물질은 정상 림프구나 암이 아닌 세포주에는 큰 독성을 보이지 않아 면역억제제 또는 항암제로 활용가치가 매우 높다. 프로디지오신의 항암기전은 리소솜성 알킬화에 의해 세포내 pH를 변화시키거나(Sato T, et al. Prodigiosins as a new group of H+/Cl-symportersthat uncouple proton translocators. J Biolchem 273(34):21455-62(1998)), 세포주기에서 G1-S 이행을 중지시켜 세포증식을 억제하며(PR, Montaner B. Effects of the proapoptotic drug prodigiosin on cell cycle-related proteins in Jurkat T cells. Histol Histopathol 18(2):379-85(2003)), DNA에 손상을 일으켜 세포독성을 나타내는 것으로 보고되고 있다(Melvin MS, et al. Copper-nuclease efficiency correlates with cytotoxicity for the 4-methoxypyrrolic natural products. J Inorg Biochem 87(3):129-35(2001)).

하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 신규균주 주시켈라 루비더스가 생산하는 적색색소는 다양한 인체유래 암세포(SW620(대장암), MDA-MB-231(유방암), SKMEL-28(흑색종) 및 A375P(흑색종))에 대하여 세포독성(cytotoxicity)을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 예를 들어, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암을 포함하며, 보다 바람직하게는 대장암, 유방암 및 피부암이고, 가장 바람직하게는 피부암이다.

본 발명의 항암용 조성물은 약제학적 조성물 및 식품 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 항암용 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우 추가적으로 약제학적으로 허용되는 담체가 포함된다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 주시켈라 루비더스의 배양 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 주시켈라 루비더스의 배양 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 주시켈라 루비더스의 배양 추출물을 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 주시켈라 루비더스가 생산하는 적색 색소의 주요 성분인 사이클로프로디지오신은 프로디지오신보다 미생물의 종류에 따라 1.33-2.08배 더 높은 미생물 성장저해 활성을 갖는다(참조: 실시예 7).

본 발명의 조성물에서 항균성분은 그대로 사용되거나 용매 또는 고체 담체와 배합될 수 있다. 적합한 용매는 예를 들어, 물, 글리콜, 글리콜 에테르, 알코올, 케톤, 에스테르, 카보네이트 및 이들의 혼합물을 포함한다. 적합한 고체 담체는 예를 들어 사이클로덱스트린, 실리카, 규조토, 왁스, 셀룰로오스 물질, 알칼리 및 알칼리토류, 금속염 및 목탄을 포함한다.

항균 성분을 용매에 배합할 때, 배합물은 임의로 계면활성제를 함유할 수 있다. 이러한 배합물이 계면활성제를 함유할 때, 이들은 일반적으로 유제성 농축물, 에멀젼, 마이크로에멀시브 농축물, 또는 마이크로에멀젼의 형태로 존재한다.

또한 살균 성분이 현탁액의 형태로 배합될 수 있다. 현탁액의 용매 성분은 유기 용매 또는 물일 수 있다. 이러한 현탁액은 부형제, 예를 들어, 공용매, 증점제, 부동액, 분산제, 충진제, 안료, 계면활성제, 생분산제, 설포숙시네이트, 테르펜, 푸라논, 폴리케이션, 안정화제, 스케일 억제제 및 방부 첨가제를 함유할 수 있다.

본 발명의 항균 조성물은 비경구로 투여되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 경피 투여 방식으로 투여된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항균 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 주시켈라 루비더스의 배양 추출물을 포함하는 천연염료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 직물에 대해 항균성, 소취성, 항알러지성 등의 효과를 갖는 기능성 천연염색의 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 천연염료 조성물이 적용될 수 있는 섬유는 특별하게 제한되지 않으며, 천연섬유, 합성 섬유, 반합성 섬유 및 재생 섬유 모두에 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 천연염료 조성물은 면, 실크 및 울(wool)과 같은 천연섬유, 아크릴릭 및 나일론 66과 같은 합성 섬유, 아세테이트와 트리아세테이트와 같은 반합성 섬유, 그리고 비스코즈(Viscose)와 같은 재생섬유에 적용될 수 있다.

천연염료 조성물에는 적색색소 추출물 이외에 착색 및 항균효과를 보조하기 위한 성분으로서 당업계에 공지된 다양한 성분들이 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 주시켈라 루비더스, 상기 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 상기 주시켈라 루비더스의 배양 추출물을 포함하는 해수 적조 완화용 살조 조성물을 제공한다.

본 발명의 살조 조성물에는 주시켈라 루비더스 균주를 생물학적으로 허용 가능한 담체에 흡착한 것을 사용할 수 있으며, 상기 담체는 셀룰로오스(Cellulose), 셀카시(CellCaSi), 제올라이트(Zeolite), 활성탄, 폴리비닐알코올(Polyvinyl alcohol) 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한 계면활성제, 보존제, 습윤제, 공급촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제 및 완충제, 희석제(diluent) 또는 각종 첨가제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 추가로 첨가하여 제조될 수 있다. 상기 살조 조성물 성분으로 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 그 배양 추출물 이외의 성분은 상기 나열한 물질에 한정되지 않고 적조의 살조 활성을 촉진시킬 수 있는 것으로 당업계에 공지된 다양한 성분이 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 주시켈라 루비더스, 상기 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 상기 주시켈라 루비더스의 배양 추출물을 해수에 살포하는 단계를 포함하는 해수 적조의 살조 방법을 제공한다.

살조세균의 살조기전은 (a) 살조세균이 적조생물의 표면에 부착하여 적조생물을 용조하는 접촉에 의한 기전(Imai et al. Mar . Biol . 116:527-32(1993)) 및 (b) 살조세균이 살조물질을 세포외로 분비하여 적조생물의 생장을 억제 또는 용조하는 기전으로 나눌 수 있다. 본 발명의 살조 방법은 두 번째 기전에 포함되며, 이에 의한 조류의 감소는 대부분의 살조세균을 살포한 후, 몇 시간에서　며칠 이내에 나타난다.

상기 살조방법에는 주시켈라 루비더스의 배양 및 배양액의 보존단계, 생물학적으로 허용 가능한 담체와 흡착시키는 단계, 계면활성제, 습윤제, 완충제, 희석제등을 첨가하는 단계가 바람직하게 포함될 수 있다. 본 발명의 살조방법은 상기 나열한 단계에 한정되지 않고 미생물 활성 및 해수 적조 완화를 촉진하는 과정으로써 당업계에 공지된 다양한 단계가 포함될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 적색 색소를 생산하는 주시켈라 루비더스(Zooshikella rubidus) 또는 상기 주시켈라 루비더스와 동일한 RFLP(Restriction fragment length polymorphism) DNA 프로파일을 갖는 주시켈라 루비더스를 제공한다.

(b) 본 발명의 신규한 미생물은 2차 대사산물로서 매우 높은 효율로 적색색소를 생산한다.

(c) 본 발명의 주시켈라 루비더스가 생산하는 적색 색소는 항암작용, 항균작용, 기능성 천연 염색 및 해수 적조의 완화작용에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 갯벌 시료로부터 적색 색소를 생산하는 미생물의 분리

적색 색소를 생산하는 미생물을 분리하기 위하여 서해 새만금으로부터 갯벌 시료를 채취하여, 그 중 1g 을 0.85 % NaCl 용액 10ml에 현탁하고 그 중 1 ml 을 분리용 배지로 사용된 마린 아가(펩톤 5 g, 효모 추출물 1.0 g, 구연산철 0.1 g, 염화나트륨 19.45 g, 황산마그네슘 3.24 g, 염화마그네슘 5.9 g, 염화칼슘 1.8 g, 염화칼륨 0.55 g, 중탄산나트륨 0.16 g, 브롬화칼륨 0.08 g, 염화스트론튬 34.0 mg, 붕산 22.0 mg, 규산나트륨 4.0 mg, 플루오르화 나트륨 2.4 mg, 질산암모늄 1.6 mg, 인산디나트륨 8.0 mg)에 평판 도말하고 25 ℃에서 배양하였다. 10일 후 고체 배지 상에서 적색을 강하게 나타내는 미생물 집락을 선별하여 순수 분리하였다. 선별된 균주의 적색색소를 액체크로마토그래피 질량분석법(LC-MS/MS)을 이용하여 분석하였으며, 적색색소의 주성분으로 프로디지오신(m/z 324, [M+H]⁺)과 사이클로프로디지오신(m/z 322, [M+H]⁺)을 생산함을 질량분석 스펙트럼(MS)과 탠덤 질량분석 스펙트럼(MS/MS)으로 확인하였다(도 2). 상기와 같은 실험을 수행한 후 생산성이 가장 우수한 한 균주 S1-1을 확인하였다. S1-1의 경우 다른 2차대사산물의 생산은 확인되지 않았고, 적색 색소만 생산되어 생산효율성이 매우 높음을 확인하였다.

실시예 2 : 적색색소 생산성을 가지는 균주의 동정

실시예 1에서 분리된 S1-1 균주를 영양 배지(Marine agar, Difco)에서 30℃에서 2-3일 동안 배양한 다음 형태 및 생리,생화학적 특성, 화학분류학적 특성 및 분자생물학적 특성을 조사하였다.

(a) 형태 및 생리,생화학적 특성

S1-1 균주의 형태 및 생리생화학적 특성은 윤 등(Yoon, et al. Int . J. Syst . Bacteriol 47:933(1997)), 유코브 등(Yurkov, et al. Int . J. Syst . Bacteriol 44:427(1994))의 방법과 API ZYM 키트(바이오메리오사 제품)를 사용하여 결정하였다. 탄수화물부터 산의 생성은 레이프손(Leifson, J. Bacteriol 85: 1183,(1963))의 방법을 이용하였다. 한편, 이소프레노이드 퀴논의 종류, 지방산의 종류 및 구아닌시토신의 조성 등의 균주의 화학분류학적 특성은 윤 등(Yoon, et al. Int . J. Syst . Bacteriol 47:933(1997))의 방법을, 16S rRNA 유전자의 염기 서열 결정 및 분석은 윤 등(Yoon, et al. Int . J. Syst . Evol . Microbiol 53:449 (2003))의 방법을 사용하였다. 또한, DNA-DNA 상동성 실험을 위해서 S1-1과 주시켈라 강화엔시스(Zooshikella ganghwensis)의 표준균주의 DNA를 윤 등(Yoon, et al Int . J. Syst . Bacteriol 46:502(1996))의 방법을 이용하여 추출하였고, 이들 DNA들은 에자키 등(Ezaki, et al. Int . J. Syst . Bacteriol 39:224-229(1989))의 방법을 이용하여 서로의 결합 정도(상동성)를 측정하였다.

S1-1의 형태 및 성장 조건을 조사한 결과, S1-1는 그람양성의 호기성 세균이며 30-37 ℃와 pH 7에서 가장 잘 생장하였다. 선별된 균주인 S1-1의 일반적인 생리학적 생리생화학적 특성 및 탄소원(에너지원) 이용 특성은 다음의 표 1에 나타내었다.

특 성	선별된 균주( R33 )
효소활성( API ZYM )
알칼리 포스파타제	양성
에스터라제(C4)	음성
에스터라제 리파제(C8)	양성
리파제(C14)	음성
루이신 아릴아미다제	양성
발린 아릴아미다제	음성
시스테인 아릴아미다제	음성
트립신	음성
알파-키모트립신	음성
엑시드 포스파타제	양성
나프톨-AS-BI	음성
알파-갈락토시다제	음성
베타-갈락토시다제	음성
알파-글루코시다제	음성
알파-글루쿠로니다제	음성
베타-글루코시다제	음성
알파-만노시다제	음성
알파-푸코시다제	음성
N-아세틸-베타-글로코사미니다제	음성
양성 효소활성 있음; 음성 효소활성 없음
가수분해
한천	-
카제인	+
CM-셀룰로스	-
녹말	W
DNA	-
젤라틴	-
자일란	-
타이로신	-
트윈 20	-
트윈 40	+
트윈 60	+
트윈 80	+
하이퍼산틴	-
산틴	-
+ 분해 가능; - 분해 불가능; W약함
탄소원이용
D-글루코스	+
D-프럭토스	+
D-갈락토스	-
D-셀로비오스	-
D-만노스	+
D-트레할로스	+
D-자일로스	-
L-아라비노스	-
수크로스	+
말토스	+
초산	-
구연산	-
숙신산	+
벤조산	-
L-사과산	+
피루브산	+
살리신	-
포름산	-
L-글루타메이트	-
+ 탄소원 이용 가능; - 탄소원 이용 불가능

표 1에 나타난 바와 같이, S1-1의 생리학적 특징으로는 옥시다제(oxidase) 양성, 카탈라제(catalase)양성이며, 나이트레이트(nitrate)를 나이트리트(nitrite)로 환원시키는 능력을 갖고 있었다. 또한, 효소활성은 알칼리포스파타제(alkaline phosphatase), 에스터라제 리파제(esterase lipase), 루이신 아릴아미다제(leucine arylamidase), 엑시드 포스파타제(acid phosphatase)는 양성이며, 에스터라제(esterase), 리파제(lipase), 발린 아릴아미다제(valine arylamidase)등은 음성으로 나타났다. 카제인(casein), 트윈 40(tween 40), 트윈 60(tween 60), 트윈 80(tween 80)을 분해하며, 에스쿨린(esculin), 요소(urea), 한천(agar), CM-셀룰로오스(CM-cellulose), 젤라틴(gelatin), 자일란(xylan), 타이로신(tyrosine), 하이포잔틴(hypoxanthine), 잔틴(xanthine)은 분해하지 못하였다. 또한 S1-1의 당 종류에 따른 균체의 생육여부를 관찰하여 탄소원 및 에너지원으로서 당이용성 실험을 수행한 결과, D-글루코스(D-glucose), D-프럭토스(D-fructose), D-만노스(D-mannose), D-트레할로스(D-trehalose), 수크로스(sucrose), 말토스(maltose), L-사과산(L-malate), 피루브산(pyruvic acid)을 탄소원 및 에너지원으로 이용할 수 있으나, D-갈락토스(D-galactose), D-셀로비오스(D-cellobiose), D-자일로스 (D-xylose), L-아라비노스(L-arabinose), 구연산(citric acid), 초산(acetic acid), 벤조산(benzoic acid), 숙신산(succinic acid), 살리신(salicin), 포름산(formic acid), L-글루타메이트(L-glutamate)는 탄소원 및 에너지원으로 이용하지 못하였다.

(b) 화학분류학적 특성 및 16S rRNA유전자의 염기서열 분석

S1-1의 화학분류학적 특성을 조사한 결과, S1-1에 존재하는 주요 퀴논은 유비퀴논-9이며 주요 지방산은 C_{16 :0}과 C_{16 :1} ω7c 또는 iso-C_{15 :0} 2-OH의 형태로서 상세한 정보는 표 2에 나타난 바와 같다. 이러한 특성은 S1-1과 상동성을 보여주는 주시켈라 속(Genus Zooshikella)의 유일한 종인 주시켈라 강화엔시스(Zooshikella ganghwensis)의 특징과 유사하였다(Yi, et al. Int . J. Syst . Evol . Microbiol 53: 1013 (2003)). S1-1의 DNA에 대한 구아닌 및 시토신의 조성은 66%로 확인되었다.

주시켈라 루비더스 S1-1의 지방산 조성

지방산 종류	조성 (%)
C10 :0	3.3
C14 :0	4.9
C16 :0	33.1
C16 :1 ω5c	0.4
C18 :1 ω7c	9.8
C10 :0 3-OH	3.3
C12 :0 3-OH	5.2
C12 :1 3-OH	0.7
C16 :1 ω7c 및/또는 iso-C15 :0 2-OH	37.3

S1-1의 16S rRNA 유전자의 염기 서열을 분석한 결과, 서열목록 제1서열의 염기 서열을 가짐을 확인하였고, 미국 진뱅크 (GenBank)에 수탁 번호 FJ217962 로서 등록되었다.

16S rRNA 유전자 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석에서 S1-1은 주시켈라 속(Genus Zooshikella)에 속하는 균주로서 이 속의 유일한 종인 주시켈라 강화엔시스(Zooshikella ganghwensis)의 표준균주와 비교했을 때, 99.4 % 의 상동성을 보여주었으며 DNA-DNA 혼성화(hybridization) 결과 28.9 % 의 상동성을 보여주었다. 따라서 현재의 세균 분류학 분야에서 균주간의 DNA-DNA 상동성 값이 70% 이하일 경우 서로 다른 종으로 분류된다는 기준(Wayne et al. Int. J. Syst . Bacteriol 37:463(1987))에 의해서 S1-1은 기존에 알려지지 않은 새로운 종으로서 동정되었다.

이상의 형태, 생리, 생화학적 특성, 화학분류학적 특성 및 16S rRNA 염기서열 분석 및 분자생물학적 특성에 근거하여, 선별된 균주는 기존의 주시켈라 속에 존재하지 않는 새로운 종으로서 동정되었으므로, 상기 선별된 균주를 “Zooshikella rubidus S1-1”로 명명하였으며, 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2008년 12월 31일자로 기탁하였고, 기탁번호 KCTC 11448BP를 부여받았다.

실시예 3 : 주시켈라 루비더스 S1 - 1으로부터 적색색소 추출물의 제조

실시예 1 및 실시예 2에서 분리동정한 주시켈라 루비더스 S1-1 으로부터 생산된 적색색소 추출물을 제조하기 위해서, 실시예 1의 분리용 액체배지를 이용하여 30℃에서 120 rpm 으로 48시간동안 왕복진탕배양 하였다. 배양액을 7000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 배지상등액과 미생물로 분리하였다. 배지 상등액은 동량의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 진탕 추출하여 에틸아세테이트 가용부를 추출하였고, 미생물은 동량의 아세톤으로 진탕 추출하여 아세톤 가용부를 추출하여 얻은 다음 두 추출물을 혼합한 추출액을 50℃의 수조에서 감압 농축하였다. 상기의 방법으로 얻어진 적색색소 추출물의 생산량은 약 175 mg/L 로 확인되었다.

실시예 4 : 주시켈라 루비더스 S1 -1의 적색색소 추출물의 구성성분 확인

실시예 3에서 제조된 주시켈라 루비더스 S1-1의 적색색소 추출물의 구성성분을 확인하기 위해서 LC-MS/MS분석법을 이용하여 분석하였다. LC-MS/MS분석 조건은 이동상으로 0.1 % 포름산이 포함된 아세토니트릴과 물을 이용하여 0.3 ml/min 의 속도로 LC를 수행하면서, 질량분석기는 이온 트랩(ion trap)(Finnigan LCQ Advantage MAX)장비와 ESI(electrospray ionzation) 이온화 방법을 사용하여 수행하였다.

상기 적색색소의 LC-MS/MS 분석을 통하여 최대 흡수파장은 산성 조건에서 535 nm 로 확인되었으며, 동일한 최대 흡수파장을 나타내는 두 개의 주성분 피크를 확인하였다. 두 개의 주성분 피크는 질량분석법을 통하여 각각의 기초피크 및 그 단편화 패턴(MS/MS)이 각각 프로디지오신(7.11 min; m/z 324, [M+H]⁺)과 사이클로프로디지오신(6.59 min; m/z 322, [M+H]⁺)과 일치함을 확인하였다(도 2). 상기 적색색소의 구성성분 분석을 통해 지금까지 보고되어진 다른 프로디지오신 생산균주와는 달리 사이클로프로디지오신이 주성분으로 생산됨을 확인하였고, 이는 주시켈라 루비더스 S1-1만의 고유한 특성임을 확인하였다.

또한 LC-MS/MS 분석법을 이용하여 프로디지오신으로부터 알킬체인의 길이가 차이나는(C3-C7) 6개의 프로디지오신 유도체[m/z 296, 310, 324(프로디지오신), 338, 352, 366, 380]들을 확인하였다(도 3)(Kim et al. J. Appl . Microbiol . 102 :937(2007)). 특히, 도 3의 프로디지오신 유도체중 m/z 366과 m/z 380 화합물은 지금까지 학계에 보고된 적이 없는 신규물질로 확인되었다.

실시예 5 : 주시켈라 루비더스 S1 -1의 적색색소 추출물의 피부암세포 성장저해활성 검색

실시예 3에서 제조된 주시켈라 루비더스 S1-1 적색색소 추출물이 피부암세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 대장암(SW620), 유방암(MDA-MB-231), 흑색종(SKMEL-28), 흑색종(A375P) 세포에 추출물을 농도별로 48시간 처리하여 추출물에 의한 암세포의 증식억제를 관찰하였다(도 4-a). 상기 암 세포주는 ATCC에서 분양받은 것이고, 10% 우태아 혈청(Gibco BRL)이 함유된 RPMI(Roswell park memorial institute)1640 (Gibco BRL) 배양액을 사용하여 5 % CO₂, 37℃ 습식 배양기에서 배양하였다. 암세포의 성장저해 활성을 측정하기 위해서 96 웰 플레이트에 SW620, MDA-MB-231, SKMEL-28 및 A375P 세포들을 5× 10³ cells/well 로 접종하여 18-24 시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 적색색소 추출물을 농도별로 희석하여 1.5 ㎖ 튜브에서 새로운 배지 1 ㎖에 섞은 후 그 중 100 ㎕ 씩 처리하였다. 추출물을 48시간 동안 처리한 후에 암세포의 성장을 확인하기 위해 세포증식시약 WST-1(Roche Biochemicals)을 각각의 웰마다 10 ㎕ 씩 넣고 2시간동안 더 배양한 다음 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 리더(Bio-Rad)를 이용하여 450 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다.

적색색소 추출물 처리에 의한 암세포의 형태 변화를 관찰하기 위해서 SKMEL-28, A375P의 암세포들을 24 웰 세포 배양 접시에 3×10⁴ cells/well 로 접종하였다. 18-24시간 후 배지를 제거하고 새로운 배지 500 ㎕ 에 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹여진 추출물 0.5 ㎕ 를 넣어 흔들어 혼합한 다음 각 웰에 넣어 주었다. 추출물을 48시간 동안 처리한 후에 현미경(Nikon, Japan)을 이용하여 세포의 형태를 관찰하고 현미경에 장착되어 있는 카메라로 사진을 촬영하였다(도 4b).

주시켈라 루비더스 S1-1 추출물을 처러한 후 SW620, MDA-MB-231, SKMEL-28 및 A375P 네 가지 암세포에 대한 주시켈라 루비더스 S1-1 추출물의 GI(Growth Inhibition)₅₀ 값이 각각 13, 50, 22 및 26 ㎍/㎖ 이었다(표 3).

주시켈라 루비더스 S1-1 적색색소 추출물의 인간 암세포에 대한 성장저해 활성

암세포주	GI 50 (㎍/㎖)
대장암(SW620)	13
유방암(MDA-MB-231)	50
흑색종(SKMEL-28)	22
흑색종(A375P)	26

주시켈라 루비더스 S1-1 추출물은 다양한 암세포들의 증식을 농도에 의존적으로 강력히 저해하는 것을 확인하였다(도 4a). 특히 적색색소 추출물의 주성분인 프로디지오신과 사이클로프로디지오신 색소는 대장암인 SW620 암세포에 대한 세포증식 억제효과와 함께 특히, 인간의 피부 암세포인 SKMEL-28과 A375P 암세포의 증식을 저해하는 항암효과를 가지고 있는 것으로 나타나 상기 적색색소 추출물을 이용한 기능성 천연염색시 피부암 예방에 효과적임을 확인하였다. 또한, 주시켈라 루비더스 S1-1 적색색소 추출물을 5, 10, 20 ㎍/㎖ 의 농도로 피부암세포인 SKMEL-28과 A375P 세포주에 처리하여 암세포의 형태 변화를 관찰하였다. 주시켈라 루비더스 S1-1 적색색소 추출물을 10 ㎍/㎖ 를 처리한 시점부터 암세포들은 세포수가 감소함을 확인하였으며, 일부 세포가 배양 접시 바닥으로부터 떨어지는 것을 볼 수 있었고, 20 ㎍/㎖ 처리된 세포의 대부분이 배양 접시에 대한 부착력이 약화되어 세포의 형태가 원형으로 바뀐 것을 확인할 수 있었다(도 4b). 이러한 암세포의 수축을 통해 주시켈라 루비더스 S1-1의 적색색소 추출물에 의해 세포 사멸의 특성을 보여주는 것을 확인하였다.

실시예 6: 주시켈라 루비더스 S1 - 1으로부터 적색색소 추출물로부터 적색색소의 단리

상기 실시예 3에서 얻은 적색색소 추출물 0.7 g 을 메탄올 5 ml 에 용해시킨 후 분리정제용 HPLC 컬럼(XBridge Prep C18(10 um, 19x250 mm, Waters)을 이용한 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 다음과 같은 두 개의 색소성분(화학식 1 및 2)을 분리하였다.

화학식 1

ⅰ) 물질 성상: 암적색 분말, ⅱ) 분자량: 323, ⅲ) 분자식: C₂₀H₂₅N₃O, ⅳ) 질량분석치: m/z 324 ([M+H]⁺).

또한, 고분해능 질량분석(HR-MS) 스펙트럼 분석결과, 질량 분석치 324.2068 (계산치; 324.2076, 오차 2.5 ppm )으로 상기 화학식 1로 표시되는 프로디지오신 화합물로 판명되었다.

화학식 2

ⅰ) 물질 성상: 암적색 분말, ⅱ) 분자량: 321, ⅲ) 분자식: C₂₀H₂₃N₃O, ⅳ) 질량분석치: m/z 322 ([M+H]⁺)

또한, 고 분해능 질량분석(HR-MS) 스펙트럼 분석결과, 질량 분석치 322.1891 (계산치; 322.1919, 오차 8.7 ppm )으로 상기 화학식 2로 표시되는 사이클로프로디지오신 화합물로 판명되었다.

실시예 7 : 주시켈라 루비더스 S1 - 1으로부터 단리된 적색색소의 주성분인 프로디지오신과 사이클로프로디지오신의 항균활성 비교

상기 실시예 6에 따른 S1-1으로부터 추출 분리된 적색색소인 프로디지오신과 사이클로 프로디지오신에 대해서 다양한 미생물 성장저해 활성을 종이 원판확산법(paper disk diffusion method)을 사용하여 조사하였다. 그 결과 상기 색소물질(프로디지오신, 사이클로프로디지오신)을 각각 페이퍼 디스크당 50 ㎍ 의 농도에서 표 4와 같은 미생물 성장저해 범위를 나타내었다.

본 발명의 종이 원판확산법에서 항균력 측정에 사용된 미생물은 대장균(Escherichia coli , KCTC 1924), 살모넬라 티피모리움(Salmonella typhimurium , KCTC 1926), 스테피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus KCTC 1916), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis , KCTC 1914), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans, KCTC 1940)이다.

주시켈라 루비더스 S1-1 으로부터 분리된 프로디지오신과 사이클로프로디지오신의 항균활성 비교

시 료	저해 환의 넓이(mm2)
	E. coli	S. typhimurium	S. aureus	B. subtilis	C. albicans
Control (DMSO)	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00
카나마이신 (3mg/ml)	84.82	104.46	172.79	226.19	226.19
프로디지오신(PDG)(5mg/ml)	104.46	84.82	84.82	50.27	50.27
사이클로프로디지오신(5mg/ml)	172.79	125.66	125.66	104.46	66.76

상기 표 4에 따르면, S1-1 적색색소 추출물에서 분리된 프로디지오신과 사이클로프로디지오신은 다양한 미생물 저해활성 스펙트럼을 나타냄을 확인하였다. 또한, 미생물의 성장저해활성 비교에서 사이클로프로디지오신이 프로디지오신보다 미생물의 종류에 따라 1.33-2.08배 더 높은 성장저해활성을 나타나내는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 다른 프로디지오신 생산균주와 달리 상기 주시켈라 루비더스 S1-1은 주성분으로 프로디지오신보다 미생물저해 활성이 우수한 사이클로프로디지오신을 생산하고 있어 항균활성 차원에서 더욱 유용한 균주임을 알수 있다. 또한 상기 적색색소 추출물을 이용한 천연염색시 항균활성이 뛰어난 기능성섬유의 제작에 유용함을 확인하였다.

실시예 8 : 주시켈라 루비더스 S1 -1 적색색소 추출물을 이용함 천연염색

상기 실시예 3에서 제조된 적색색소 추출물을 이용한 천연염색은 한국의료시험연구원에서 시판하고 있는 13가지 종류의 시험 염색포로 구성된 다섬교직포 #43 (Warp Strip 13 Fiber Style #43, Testfabrics, Inc. USA)을 수세하여 시험에 사용하였으며, 추출물의 농도 200 ㎍/㎖, 욕비 1:100, 염색온도 60℃조건에서 다섬교직포를 염색한 후 수세하여 건조한 포를 시험포로 하였다. 제조된 적색색소 추출물은 코튼(Cotton), 실크(Silk), 울(Wool)의 천염섬유 뿐만 아니라 아크릴, 나일론 66과 같은 합성 섬유, 비스코스와 같은 재생섬유, 아세테이트와 트리아세테이트와 같은 반합성섬유에도 염색이 잘 되어 다양한 섬유에 적용이 가능한 염료로서의 좋은 특성을 보여주었다(도 5).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 주시켈라 루비더스 S1-1의 분자 분류학적 위치를 보여주는 분자계통수를 나타내는 그림이다.

도 2a-2b는 주시켈라 루비더스 S1-1이 생산하는 적색색소의 주성분의 구조를 확인한 것이다. LC-MS/MS를 이용하여 사이클로프로디지오신 (b-a) 과 프로디지오신(b-b)의 구조를 결정한 결과로서, 위는 크로마토그램(도 2a)결과이고, 아래는 각각의 기초피크( 6.59분, 7.11분)의 질량분석 스펙트럼과 MS/MS 스펙트럼(도 2b) 패턴을 나타낸 것이다.

도 3은 적색색소 추출물에 포함된 프로디지오신 유도체들을 LC-MS/MS를 이용하여 구조를 확인한 것이다.

도 4a-4b는 적색색소 추출물의 서로 다른 종류의 암세포에 대한 성장 저해효과(도 4a)와 피부암(흑색종)세포주의 형태에 미치는 영향(도 4b)을 농도별로 나타내는 그림이다.

도 5는 적색색소 추출물의 다섬교직포 #43에 대한 염색성을 나타내는 그림이다.

<110> Korea Research institute of Bioscience and Biotechnology <120> New Bacterial Species Zooshikella rubidus Producing Red Pigments and Red Pigments Produced from It <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1462 <212> DNA <213> Zooshikella rubidus <400> 1 attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgggc ggtaacagga gagcttgctc 60 ttgctgacga gcggcggacg ggtgagtaac gcataggaat ctgcccatgg gtgggggata 120 gcccggagaa atccggatta ataccgcata tgccctgagg ggtaaagcag gggatcttag 180 gaccttgcgc cgatggatga gcctatgtcg gattagctag ttggtagggt aaaggcctac 240 caaggcgacg atccgtagct ggtctgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg 300 gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggggc aaccctgatc 360 cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggcttt cgggttgtaa agcactttca gcagggagga 420 aaggttgcgg gttaatacct cgtagctgtg acgttacctg cagaagaagc accggctaac 480 tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt 540 aaagcgtgcg taggcggttt actaagctgg atgtgaaatc cccgggctta acctgggaac 600 tgcattcata actggtaggc tagagtatgg cagaggcgag tggaatttcc tgtgtagcgg 660 tgaaatgcgt agatatagga aggaacacca gtggcgaagg cgactcgctg ggtcaatact 720 gacgctgagg tacgaaagcg tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgct 780 gtaaacgatg agaactagcc gttggaaccc atgtaggttt tggtggcgca gctaacgcac 840 taagttctcc gcctggggag tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc 900 ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttacctggcc 960 ttgacatcct gcgaacactt tagagatgaa gtggtgcctt cgggagcgca gagacaggtg 1020 ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgt aacgagcgca 1080 acccttgtcc ttagttacca gcatgtaatg gtggggactc taaggagact gccggtgaca 1140 aaccggagga aggtggggac gacgtcaagt catcatggcc cttacggcca gggctacaca 1200 cgtgctacaa tggggcgaac agagggttgc caagctgcga agtggagcta atctcttaaa 1260 acgtctcgta gtccggattg gagtctgcaa ctcgactcca tgaagtcgga atcgctagta 1320 atcgcgaatc agaatgtcgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380 accatgggag tgggttgcac cagaagtagc tagtctaacc ttcgggagga cggttaccac 1440 ggtgtgattc atgactgggg tg 1462

Claims (12)

1. 사이클로프로디지오신 및 다음 화학식 3의 프로디지오신 유도체를 생산하는 주시켈라 루비더스(Zooshikella rubidus) 또는 상기 주시켈라 루비더스와 동일한 RFLP(Restriction fragment length polymorphism) DNA 프로파일을 갖는 주시켈라 루비더스:

   화학식 3

   

   상기 화학식에서 R은 -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂ 또는 -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃이다.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 주시켈라 루비더스는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 16S rRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 주시켈라 루비더스.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 주시켈라 루비더스는 주시켈라 루비더스(Zooshikella rubidus) S1-1(KCTC 11448BP)인 것을 특징으로 하는 주시켈라 루비더스.
4. 삭제
5. 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 주시켈라 루비더스를 배양하는 단계를 포함하는 적색 색소의 제조방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 적색 색소는 프로디지오신, 사이클로프로디지오신, 프로디지오신의 유도체 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
7. 주시켈라 루비더스(Zooshikella rubidus)가 생산하는 다음 화학식 3의 프로디지오신 유도체:

   화학식 3

   

   상기 화학식에서 R은 -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃ 또는 -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃이다.
8. 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 상기 주시켈라 루비더스의 배양 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
9. 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 상기 주시켈라 루비더스의 배양 추출물을 포함하는 항균 조성물.
10. 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 상기 주시켈라 루비더스의 배양 추출물을 포함하는 천연염료 조성물.
11. 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 주시켈라 루비더스, 상기 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 상기 주시켈라 루비더스의 배양 추출물을 포함하는 해수 적조 완화용 살조 조성물.
12. 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 주시켈라 루비더스, 상기 주시켈라 루비더스의 추출물 또는 상기 주시켈라 루비더스의 배양 추출물을 해수에 살포하는 단계를 포함하는 해수 적조의 살조 방법.

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