KR101131615B1 - 버섯 갈반병을 유발하는 톨라신 저해제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 버섯 갈반병을 유발하는 톨라신 저해제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 톨라신 저해물질의 스크리닝 방법 및 소르비톨레익산(sorbitololeic acid)를 유효 성분으로 하는 톨라신 저해제에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명에 따르면, P.tolaasii에 의한 갈반병의 빈번한 발생을 방지하여, 느타리버섯 재배를 증가시킬 수 있다.
버섯, 갈반병, 톨라신, 저해제, 소르비톨레익산

Description

버섯 갈반병을 유발하는 톨라신 저해제{Inhibitor of tolaasin causing bacterial brown blotch of mushroom}
본 발명은 버섯 갈반병을 유발하는 톨라신 저해제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 톨라신 저해물질의 스크리닝 방법 및 소르비톨레익산(sorbitololeic acid)를 유효 성분으로 하는 톨라신 저해제에 관한 것이다.
전체 버섯 생산량의 70% 이상을 차지하고, 단위 면적당 소득이 가장 높은 느타리버섯의 재배에 있어서, 슈도모나스 톨라시(Pseudomonas tolaasii)는 세균성 갈색무늬병(갈반병, bacterial brown blotch)으로 심각한 피해를 입힌다. 세균성 갈색무늬병은 버섯재배 경험이 많은 재배 농가부터 최근에 버섯재배를 시작하는 농가까지 전체적으로 많은 피해를 주고 있다.
이러한 세균성 갈색무늬병은 병 발생의 예측이 어렵고, 병 발생 후에는 치료가 거의 불가능하며, 한번 발생하면 재배사 전체로 급속히 전염되는 특성이 있다. 또한 느타리버섯뿐만 아니라 양송이, 팽이, 표고버섯에도 병을 일으키며, 생육중인 버섯뿐 아니라 저장 및 유통과정 중의 버섯에도 품질저하의 원인으로 보고되고 있다. 그러나 피해가 심각함에도 불구하고 세균성 갈색무늬병의 방제는 매우 어렵 다(Cho and Kim, FEMS Microbiology Letters 221:221, 2003).
일부 항생제, 오존, 목초액 등을 이용한 화학적 방제 및 길항균, 박테리오파지 등을 이용한 생물학적 방제 모두 만족할 만한 효과를 거두지 못하고 있다. 최근 일반 소독제인 염소가 효과적임이 알려져 느타리버섯 재배에 사용되기도 하나, 현재 느타리버섯 재배 규정에 의하면, 염소를 사용하여 재배한 느타리버섯은 유기농산물로 인정을 받을 수 없다. 버섯의 병 방제법에 있어서 가장 효과적인 방제법은 저항성 품종을 재배하는 것이지만, 느타리버섯에서 세균성 갈색무늬병에 대한 저항성 연구는 거의 이루어지지 않은 상태이며, 저항성을 정확하게 측정할 수 있는 방법도 최근에 이르러서야 개발되었다(Cho et al. J. Agr. Sci, 23:49, 2007).
이러한 갈반병은 버섯의 자실체 형성 초기에 Pseudomonas tolaasii의 감염과 이 균에 의해서 생성되는 독소 톨라신(tolaasin)의 작용에 의하여 발생하는 것으로 알려져 있다(Coraiola et al. Biochimica et Biophysica Acta 1758:1713, 2006).
이에, 본 발명자들은 톨라신(tolaasin) 저해물질을 스크리닝하고자 예의 노력을 기울인 결과 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (1) 저분자 화합물 라이브러리에서 in silico docking으로 톨라신과 결합하는 물질을 검색하는 단계; (2) 상기 방법을 이용하여, 찾아낸 톨리신과 결합하는 물질과 톨라신의 결합 정도를 in vitro 핵자기공명분광법으로 측정하는 단계; (3) 상기 방법을 이용하여, 확인된 톨라신 결합 물질이 톨라신의 활성 저해여부를 in vitro 용혈활성 방법으로 측정하는 단계를 포함하는 톨라신 저해물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (1) 저분자 화합물 라이브러리에서 in silico docking으로 톨라신과 결합하는 물질을 검색하는 단계; (2) 상기 방법을 이용하여, 찾아낸 톨리신과 결합하는 물질과 톨라신의 결합 정도를 in vitro 핵자기공명분광법으로 측정하는 단계; (3) 상기 방법을 이용하여, 확인된 톨라신 결합물질이 톨라신의 활성 저해여부를 in vitro 용혈활성 방법으로 측정하는 단계를 포함하는 톨라신 저해물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 톨라신과 결합하는 물질은 소르비톨레익산(sorbitololeic acid)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 소르비톨레익산(sorbitololeic acid)를 유효 성분으로 하는 톨라신 저해제를 제공한다.
본 발명은 또한, 소르비톨레익산(sorbitololeic acid)를 유효 성분으로 하는 버섯 갈반병 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 버섯은 상기 버섯은 느타리버섯, 양송이버섯, 팽이버섯 및 표고버섯으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 소르비톨레익산(sorbitololeic acid)를 유효 성분으로 하는 톨라신 저해제를 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따르면, P.tolaasii에 의한 갈반병의 빈번한 발생을 방지하여, 느타리버섯 재배를 증가시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
톨라신은 아미노산 18개로 구성된 분자량 1,985 Da의 lipodepsipeptide로, N-말단이 β-hydroxy-octanoic acid와 아실화되어 있으며, C-말단의 lysine은 14번째의 threonine과 락톤 링을 형성하여 환상결합을 하고 있는 이차대사 산물이다. 톨라신에 의한 갈반병의 발생은 버섯 세포막에 유입된 톨라신 분자의 이온통로 형성과 물질이동 및 이에 따른 세포내 삼투압의 교란을 통한 세포막의 파괴, 조직의 괴사 등의 과정을 통하여 이루어짐이 밝혀졌다. 최근 P. tolaasii에 대하여 감수성이 높은 버섯에는 P. tolaasii의 생장을 촉진할 수 있는 물질이 존재하고, 감수성이 낮은 버섯은 P.tolaasii의 생장을 억제하는 물질이 존재할 것이라는 가정 하에서, 여러 가지 버섯 추출물에 대하여 P.tolaasii의 생장과 용혈활성, 버섯세포독성에 미치는 영향에 대한 연구가 진행되고 있다(Cho et al. J. Agr. Sci, 23:133, 2007).
본 발명자들은 느타리버섯의 갈반병에 대한 저해제를 개발하기 위하여, 컴퓨터 가상실험(in silico) 기법으로 톨라신과 결합하는 소르비톨레익산 [sorbitololeic acid, 도 1 참조]을 선별하였고, 선별된 소르비톨레익산과 톨라신이 실제로 결합하는지의 여부를 확인하기 위하여 핵자기공명분광법(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)을 이용하여 결합 여부를 측정하였으며, 톨 라신과 결합이 확인된 소르비톨레익산이 보이는 톨라신의 용혈활성에 대한 저해능력을 시험하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 소르비톨레익산을 선별
톨라신과 결합하는 저해제를 찾기 위하여, in silico 결합 실험으로 LeadQuest database(Tripos사)에 포함된 저분자 화합물들을 톨라신에 결합(docking)시켰다. 이 과정은 SYBYL 7.3(Tripos사)을 이용하였으며, 이때 사용된 톨라신의 3차 구조는 이미 논문에 발표된 결과를 이용하였다(Jourdan et al. PROTEINS: Structure, Function, and Genetics, 52:534543, 2003). 사용된 저분자 화합물은 약 3만개 정도로, 하나의 화합물 당 약 30회씩 결합을 시도하였다. 톨라신의 구조 전체를 결합부위(binding site)로 간주하고, 결합한 결과에서 결합성적(binding score)이 좋은 화합물을 분석하여 최종적으로 소르비톨레익산이 선발하였다.
도 1은 컴퓨터 가상 실험에서 소르비톨레익산과 톨라신의 결합상태를 나타낸 사진으로, 소르비톨레익산(우측)과 톨라신(좌측)이 결합한 것을 확인할 수 있다.
하기, 화학식 1은 소르비톨레익산의 구조식이다.
Figure 112009059370917-pat00001
실시예 2: 소르비톨레익산과 톨라신을 반응시킨 후 결합 여부를 측정
상기 실시예 1에서 톨라신의 저해제로 밝혀진, 소르비톨레익산을 구입(Sigma, S3386-250㎖)하여 1 ㎎을 정확히 중수소메탄올(MeOH-d4)에 녹여 5 ㎜의 NMR 튜브에 넣은 후, 핵자기공명분광기(Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer; Bruker, Advance 400, 독일)를 이용하여 수소핵자기공명분광법(1H-NMR, 400㎒) 실험을 하였고, 별도로 3 ㎎의 톨라신을 100 ㎕의 중수소메탄올에 녹인 것을 20 ㎕씩 상기 시료가 들어있는 NMR 튜브에 첨가하면서, 톨라신의 증가에 따른 소르비톨레익산의 수소핵자기공명스텍트럼 변화에 대한 분석을 실시하였다. 톨라신 첨가시 나타나는 시료의 스펙트럼의 변화로부터 소르비톨레익산이 톨라신과 결합하고 있음을 알 수 있다(도 2 참조).
실시예 3: 소르비톨레익산의 톨라신 저해 효과
적혈구의 분리 및 용혈 활성의 측정은 이미 논문에 발표된 방법에 따랐다 (Cho et al. J. Kor. Soc. Agricul. Chem. Biotechnol, 43:190, 2000; Rainey et al. Physiol. Mol. Plant Pathol, 39:57, 1991). 쥐(Sprague-Dawley rat, Samtoko, Korea)로부터 채취한 혈액을 glass bead로 진탕하여 섬유소 제거(defibrination) 후, 4℃에 보관하였으며, 실험에 사용하기 직전 HBS 완충액(HEPES-buffered saline; 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgSO4, pH 7.4)으로 10배 희석하였고, 필요시 원심분리하여 파괴된 적혈구 세포들을 세척하였다. 적혈구 희석액은 용혈 활성 측정을 위한 최종 반응용액의 10%를 사용하였다. 즉, 적혈구의 농도는 최종용액의 1%로 사용하였다. 톨라신은 최종용액에 10% 농도로 첨가하였다. 여기에 여러 농도별로 준비한 소르비톨레익산을 첨가하였다. 이렇게 준비한 최종반응 용액을 37℃의 항온수조에서 30분간 배양한 후, 분광광도계(U-2000, Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 600 ㎚에서의 흡광도 감소를 측정하여 톨라신의 용혈활성에 대한 저해능력을 평가하였다.
도 3은 톨라신에 의한 세포 용혈활성에 대한 소르비톨레익산의 저해작용을 나타낸 그래프이다. 가로축은 소르비톨레익산의 농도를 p-함수로 나타낸 것으로 5라고 표시한 것은 10-5 M 농도로 처리하였음을 의미하고, 세로축은 적혈구의 용혈현상은 나타낸 것으로 100이라 함은 모든 적혈구가 용혈현상을 보이고 있음을 의미한다.
상기 도 3에서 나타난 바와 같이, 소르비톨레익산을 10-8 M 농도를 처리한 경우는 용혈현상이 100%에 이르고 있으나 10-5 M로 농도를 높여서 처리하면 용혈현상이 60% 수준으로 감소하여 농도와 용혈현상이 서로 상관관계를 보이며, 소르비톨레익산의 농도가 증가함에 따라서 용혈현상이 감소함으로써 톨라신을 효과적으로 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 컴퓨터 가상 실험에서 소르비톨레익산과 톨라신의 결합상태를 나타낸 사진이다.
도 2는 소르비톨레익산과 톨라신의 결합상태를 나타낸 수소핵자기공명(1H-NMR) 스펙트럼이다.
도 3은 톨라신에 의한 세포 용혈활성에 대한 소르비톨레익산의 저해작용을 나타낸 그래프이다.

Claims (5)

  1. 하기의 단계를 포함하는 톨라신 저해물질의 스크리닝 방법:
    (1) 저분자 화합물 라이브러리에서 in silico docking으로 톨라신과 결합하는 물질을 검색하는 단계;
    (2) 상기 (1)단계의 검색에 의해 찾아낸 톨리신과 결합하는 물질인 소르비톨레익산(sorbitololeic acid)과 톨라신의 결합정도를 in vitro 핵자기공명분광법으로 측정하는 단계;
    (3) 상기 (1)단계의 검색에 의해 찾아낸 소르비톨레익산(sorbitololeic acid)의 톨라신 활성저해 여부를 in vitro 용혈활성 방법으로 측정하는 단계.
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