KR101102667B1

KR101102667B1 - 캔디다 알비칸스의 이형전환과 병원성에 관련된 신규의유전자 ＣａＬＡＧ１

Info

Publication number: KR101102667B1
Application number: KR1020040028338A
Authority: KR
Inventors: 김정윤; 전선아; 이병규; 김종균; 최정식; 강희일
Original assignee: 주식회사유한양행
Priority date: 2004-04-23
Filing date: 2004-04-23
Publication date: 2012-01-05
Also published as: KR20050102985A

Abstract

본 발명은 캔디다증을 일으키는 병원성 균주인 캔디다 알비칸스(Candida albicans)의 이형전환(the yeast-to-hypha morphological transition) 및 병원성(virulence)에 관련된 신규의 유전자에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 캔디다 알비칸스에서 이형전환에 관련된 신규의 유전자 CaLAG1 를 발견하고 이 유전자의 이형전환 및 병원성과 관련된 기능을 밝히는 것이다. 따라서 본 발명에 따라 규명되는 신규의 유전자 CaLAG1 또는 단백질 CaLag1p 는 캔디다 알비칸스의 병원성을 저해하는 항진균 물질을 스크리닝하기 위한 표적 유전자 또는 표적 단백질로 활용될 수 있다.

캔디다 알비칸스, CaLAG1, 표적 유전자, 병원성, 항진균

Description

캔디다 알비칸스의 이형전환과 병원성에 관련된 신규의 유전자 ＣａＬＡＧ１ {A gene CaLAG1 related to the yeast-to-hypha morphological transition and virulence in Candida albicans}

도 1은 여러 가지 생물체에 존재하는 Lag1p 유사 단백질들 : HsLag1 (H. sapiens, P27544); HsLASS (H. sapeins, AF177338); ScLag1 (S. cerevisiae, P38703); ScLac1 (S. cerevisiae, NP_012917); CaLag1 (C. albicans) CaLac1 (C. albicans); Yllag1 (Y. lipolytica, AY163241); YlLag2 (Y. lipolytica))의 단백질 서열을 비교하여 나타낸 것이다.

도 2는 CaLAG1 유전자 파쇄용 벡터, 재도입 벡터 및 유전자 파쇄의 상동 재조합 기작을 나타낸 것이다.

도 3은 CaLAG1 유전자 및 CaLAG1 의 대립유전자가 파쇄된 유전자를 써던 블럿팅으로 확인한 것을 나타낸다.

도 4 및 도 5는 야생형 균주 및 CaLAG1 의 대립유전자가 파쇄된 균주의 진균사 형성유무를 여러 고체배지에서 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 야생형 균주 및 CaLAG1 의 대립유전자가 파쇄된 균주의 YPD 완전배지에서의 세포성장 속도를 나타낸 것이다.

도 7은 야생형 균주 및 CaLAG1 의 대립유전자가 파쇄된 균주의 배양액을 정 치한 경우 침강속도를 나타낸 것이다.

도 8 내지 도 9는 야생형 균주 및 CaLAG1 의 대립유전자가 파쇄된 균주의 세포분리에 관한 특성을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

도 10 및 도 11은 야생형 균주 및 CaLAG1 의 대립유전자가 파쇄된 균주를 쥐에 주입한 경우 쥐의 생존률을 나타낸 것이다.

본 발명은 캔디다증을 일으키는 병원성 균주인 캔디다 알비칸스(Candida albicans)의 이형전환(the yeast-to-hypha morphological transition) 및 병원성(virulence)에 관련된 신규의 유전자에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 캔디다 알비칸스에서 이형전환에 관련된 신규의 유전자 CaLAG1 를 발견하고 이 유전자의 이형전환 및 병원성과 관련된 기능을 밝히는 것이다.

캔디다 알비칸스는 면역이 약화된 환자에 감염하여 캔디다증을 일으키는 주요한 병원성 균류이다. 이 균주는 이배수체로 존재하고, 단세포의 효모 형태에서 진균사를 형성할 수 있는 이형전환(the yeast-to-hypha morphological transition)을 할 수 있다. 균사 형태는 효모 형태보다 감염체 조직에 더 쉽게 점착(adherence)과 침투(invasion)를 할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 이형전환은 캔디다 알비칸스가 병원성을 나타내는데 중요한 역할을 하고 있을 것으로 생각되며, 실제로 이형전환에 관련된 많은 유전자들이 병원성에 관련되어 있다는 많 은 실험예들이 있어왔다(Lo 등, Cell, 90, 939-949, 1997; Fidel과 Sobel, Trends Microbiol., 2, 202-205, 1994).

캔디다 알비칸스의 이형전환에 관한 많은 연구는 제빵 효모인 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae) 연구 결과를 활용하여 수행되었다. 사카로마이세스 세레비지아 균주들은 영양분 성분에 따라 이배수체는 위균사 성장 (pseudohyphal growth)을 하고 단배수체는 침투 성장(invasive growth)을 할 수 있다. 특히, 사카로마이세스 세레비지아의 위균사 형성을 조절하는 신호 전달 경로와 전사 조절 인자들에 대해서는 많은 연구가 수행되어 왔다(Gustin 등, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62: 1264-1300, 1998; Lengeler 등, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64, 745-785, 2000; Pan과 Heitman, Mol. Cell. Biol., 19, 4874-4887, 1999).

사카로마이세스 세레비지아에서 위균사 분화를 조절하는 신호 전달 경로는 MAPK, cAMP/PKA 및 pH 또는 RIM101 신호전달경로 등 적어도 세 가지 이상 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 이들 경로에 관여하는 유전자들과 유사한 유전자들을 캔디다 알비칸스에서 찾아서 연구한 결과 이 유전자들이 캔디다 알비칸스의 이형전환에 관련되어 있다는 것이 알려져 있다(Kobayashi 와 Cutler, Trends Microbiol., 6, 92-94, 1998; Lengeler 등, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64, 745-785, 2000; Mitchell, Curr. Opin. Microbiol., 1, 687-92, 1998).

그러나, 상기와 같이 사카로마이세스 세레비지아의 형태변화에 관한 연구가 캔디다 알비칸스의 이형전환 연구에 많은 도움을 주었을지라도, 사카로마이세스 세 레비지아는 근본적으로 진균사가 아닌 위균사만을 형성하며, 위균사의 형성은 진균사의 형성과 적어도 부분적으로 다른 기작 및 경로를 통하여 일어나는 것으로 여겨지고 있으므로(Kobayashi 와 Cutler, Trends Microbiol., 6, 92-94, 1998), 사카로마이세스 세레비지아를 이용한 연구로는 캔디다 알비칸스의 이형전환, 특히 병원성에 관련된 새로운 유전자를 발굴하는데는 그 한계가 있다. 또한 캔디다 알비칸스는 유성 생활사가 잘 알려지지 않은 이배수체이기 때문에 직접적으로 새로운 유전자를 찾고 유전적 또는 분자생물학적인 분석을 하기가 어렵다는 문제점을 갖고 있다.

이에 본 발명자들은 캔디다 알비칸스의 이형전환과 병원성에 관련된 새로운 유전자를 발굴하기 위하여 이형전환 연구의 새 모델 생물체로 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 사용하였으며, 야로위아 리폴리티카부터 이형전환에 관련된 유전자를 분리하고, 캔디다 알비칸스에서 이와 유사한 유전자를 찾아 이 유전자가 캔디다 알비칸스의 이형전환과 병원성에 중요한 역할을 한다는 것을 밝힘으로서 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 캔디다 알비칸스의 이형전환과 병원성에 관련된 신규의 유전자 CaLAG1 를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 캔디다 알비칸스의 이형전환과 병원성에 관련된 신규의 단백질 CaLag1p 를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 CaLAG1 의 대립유전자가 파쇄(knock-out)된 캔디다 알비칸스 균주(기탁번호: KCTC 10624BP)를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 신규의 유전자 CaLAG1 또는 단백질 CaLag1p 의 항진균 물질의 스크리닝을 위한 표적(target)으로서의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 캔디다 알비칸스의 이형전환과 병원성에 관련하는 신규의 유전자 및 단백질을 제공한다.

본 발명자들은 아직까지 기능이 밝혀지지 않은 캔디다 알비칸스의 이형전환과 관련된 신규의 유전자를 발굴하기 위하여, 야로위아 리폴리티카로부터 이형전환에 관련된 새로운 유전자를 찾은 후 그와 유사한 유전자를 캔디다 알비칸스에서 찾고 그 기능을 밝혀 본 발명을 완성하였다.

LAG1 유전자는 사카로마이세스 세레비지아에서 수명에 관련된 유전자로써 처음 분리된 후(D'Mello 등, J. Biol. Chem., 269, 15451-15459), 여러 다른 고등 생물에도 존재함이 밝혀졌다(Jiang 등, Genome Res., 8, 1259-1272, 1998; Brandwagt 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 97, 4961-4966, 2000). LAG1 유전자에 돌연변이가 일어난 사카로마이세스 세레비지아 균주에서는 GPI-결합(GPI-anchored) 단백질의 소포체에서 골지체로의 수송률이 50% 정도 감소되며, 두꺼운 세포벽 구조를 나타내고, 형질전환 효율도 크게 감소하는 것으로 알려져 있다(Barz와 Walter, Mol. Biol. Cell, 10, 1043-1059, 1999; Horvath 등, EMBO J., 13, 3687-3695, 1994). 또한 Lag1p 단백질은 스핑고리피드 대사에 관여하는 세라마이드 합성효소인 것이 최근에 밝혀졌다(Guillas 등, EMBO J., 20, 2655-2665, 2001; Schorling 등, Mol. Biol. Cell, 12, 3417-3427, 2001). 세라마이드 합성효소는 C₂₆(아실)-조효소 A와 다이하이드로스핑고신이나 파이토스핑고신로부터 세라마이드를 합성하는데 관여하며, 이와 같은 반응은 푸모니신 B1 (fumonisin B1)과 어스트랠리펀진(australifungin)과 같은 항진균제에 의해 저해되는 특성을 가지고 있다.

한편, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)는 단배수체와 이배수체에서 모두 진균사를 형성할 뿐만 아니라 사카로마이세스 세레비지아 균주와 같이 유전학적, 분자생물학적 연구가 용이한 이형전환 효모이다. 또한, 야로위아 리폴리티카는 출아방법 등의 형태변환에 관한 연구가 잘 되어 있으며 (Herrero 등, Microbiology, 145, 2727-2737, 1999), 캔디다 알비칸스와 같이 혈청 또는 아세틸 굴루코자민의 존재하는 경우 진균사를 활발하게 형성한다는 것이 알려져 있다.(Kim 등, FEMS Microbiol. Lett., 190, 9-12, 2000).

이에 착안하여, 본 발명자들은 이형전환을 할 수 없는 많은 야로위아 리폴리티카 돌연변이 균주들을 제조하였으며, 상기 돌연변이 균주들 중 한 균주의 형질을 회복시키는 유전자를 클로닝한 결과, 그 유전자가 YlLAG1 유전자(GeneBank Accession No. AY163241)임을 발견하였다.

본 발명자들은 캔디다 알비칸스에서 LAG1 유전자를 찾기 위하여, 상기 야로위아 리폴리티카의 이형전환에 관여하는 YlLAG1 과 상동성을 갖는 유전자를 캔디다 알비칸스의 지노믹 데이터베이스(Genomic Database)로부터 검색하였으며, 그 결과 YlLAG1 과 유사한 서열번호 1의 캔디다 알비칸스 유전자를 발견하였으며, 이를 CaLAG1 라고 명명하였다. 또한, 서열번호 1의 염기서열로부터 서열번호 2의 412개의 아미노산 서열을 갖는 캔디다 알비칸스의 LAG1 단백질을 발견하였으며, 이를 CaLag1p 라고 명명하였다(도 1 참조).

또한, 본 발명자들은 캔디다 알비칸스, 사카로마이세스 세레비지아(S. cerevisiae, NP_012917), 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica, AY163241)를 포함한 하등 진핵생물에서부터 호모 사피엔스(H. sapeins, P27544 및 AF177338) 등과 같은 고등 진핵생물까지의 여러 생물에서 존재하는 LAG1 유전자군들을 찾기 위하여, 상기 생물체들에서 존재하는 LAG1 유사 유전자군들이 암호화하고 있는 단백질 서열을 비교하였으며, 이들 단백질군이 종간에 높은 단백질 서열 동일성을 나타낸다는 것을 발견하였다(도 1 참조). 즉, 캔디다 알비칸스의 CaLag1p 단백질은 사카로마이세스 세레비지아와 야로위아 리폴리티카 등 다른 진균의 것과는 38% - 50% 이상의 높은 동일성을 보였으나, 호모 사피엔스의 것과는 약 20% 정도의 낮은 동일성을 나타내었다. 또한, CaLag1p 단백질은 Lag1p 단백질군에서 보이는 적어도 다섯 개 이상의 트랜스멤브레인 도메인을 가지고 있으며, ER 막에 존재할 수 있는 신호서열을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과로부터 본 발명의 CaLAG1 유전자가 암호화하고 있는 CaLag1p 단백질이 Lag1 단백질군에 속한다는 것을 확인할 수 있었으며, 그 기능은 사카로마이세스 세레비지아와 같이 스핑고리피드 합성에 관여할 것이라는 것을 예상할 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 상기와 같이 발견된 캔디다 알비칸스 유전자 CaLAG1 및 단백질 CaLag1p 의 기능을 밝히기 위하여, 여러가지 실험을 수행하였다.

도 2에 도시된 바와 같이 캔디다 알비칸스 균주로부터 CaLAG1 유전자를 파쇄(knock-out)하여 CaLAG1 유전자가 파쇄된 균주를 제조하였으며, 이렇게 CaLAG1의 대립유전자가 하나 이상 파쇄된 균주를 야생형 균주와 비교하였다.

그 결과, CaLAG1의 두 대립유전자가 모두 파쇄된 균주(Clag1△2-1)는 균사를 형성할 수 없었으며, CaLAG1의 하나의 대립유전자만 파쇄된 균주(Clag1△1-1)는 야생형 균주(SC5314)와 마찬가지로 균사를 형성하였다. 이로부터 CaLAG1 유전자가 캔디다 알비칸스의 이형전환에 매우 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다(도 4 및 도 5 참조).

한편, CaLAG1 의 대립유전자가 파쇄된 균주와 야생형 균주의 세포성장 속도를 비교한 결과, CaLAG1 의 두 대립유전자가 파쇄된 균주(Clag1△2-1)가 야생형 균주(SC5314) 또는 CaLAG1 의 하나의 대립유전자가 파쇄된 균주(Clag1△1-1) 보다 성장 속도가 느리다는 것을 확인하였다. 또한, 상기와 같은 특성들이 CaLAG1 유전자가 파쇄되어서 나타난 형질인지를 확인하기 위하여 야생형 CaLAG1 유전자를 CaLAG1 유전자가 파쇄된 균주(Clag1△2-2)로 재도입하는 실험을 수행하였다. 그 결과 야생형 CaLAG1 유전자를 재도입된 균주의 세포성장이 야생형 균주와 비슷한 정도로 회복된다는 것을 확인하였으며, 이로부터 CaLAG1 유전자가 캔디다 알비칸스의 성장에 중요한 요소임을 알 수 있었다(도 6 참조).

또한, CaLAG1 의 대립유전자가 파쇄된 균주와 야생형 균주의 침강속도를 비 교한 결과, 두개의 CaLAG1 대립유전자가 모두 파쇄된 균주 (Clag1△2-1와 Clag1△2-2)는 액체배양액에서 야생형 균주(SC5314) 또는 CaLAG1 의 하나의 대립유전자가 파쇄된 균주(Clag1△1-1) 보다 상당히 빨리 침강되는 특성을 보였다. 이러한 침강속도는 다시 야생형 CaLAG1 유전자를 재도입하였을 때 야생형 균주와 비슷한 정도로 회복된다는 것을 확인하였으며(도 7 참조), 이로부터 CaLAG1 유전자는 캔디다 알비칸스의 세포성장에 매우 중요한 요소이며, 두 유전자가 모두 결손되면 세포들이 빨리 침강되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, CaLAG1 유전자가 파쇄된 균주와 야생형 균주의 세포분리에 관한 특성을 비교한 결과, CaLAG1 의 두 대립유전자가 모두 파쇄된 균주(Clag1△2-1)는 야생형 균주(SC5314)나 CaLAG1 의 하나의 대립유전자가 모두 파쇄된 균주(Clag1△1-1)와는 달리 대부분의 세포들이 모세포와 딸세포가 떨어지지 않고 붙어 자라며 불규칙성 출아를 하는 현상이 관찰되었으며, 이 결과로부터 CaLAG1 유전자가 캔디다 알비칸스 세포분리와 출아 패턴에 필수적인 유전자라는 것을 확인할 수 있었다(도 8 및 도 9 참조).

CaLAG1 유전자가 캔디다 알비칸스의 병원성에 어떤 영향을 미치는가를 알아 보기 위하여, 쥐의 꼬리 정맥에 야생형 균주와 CaLAG1 의 대립유전자가 파쇄된 균주를 주입하여 전신성 캔디다증을 유발시킨 후 쥐의 생존률을 측정하여 보았다. 그 결과, 상기 균주를 10⁷ cells/mouse 농도로 주입한 경우, 야생형 균주(SC5314)를 주입한 쥐는 2일째 모두 사멸하였고, CaLAG1 의 하나의 대립유전자를 가지고 있는 균 주(Clag1△1-1)를 주입한 쥐는 야생형 균주와 큰 차이를 보이지 않거나 7일째 완전히 사멸하였다. 반면, CaLAG1 의 두 대립유전자가 모두 파쇄된 균주(Clag1△2-1)가 주사된 쥐들은 모두 살아남았다. 따라서, CaLAG1 의 두 대립유전자가 모두 파쇄된 균주는 병원성을 상실하였음을 동물실험을 통하여 확인하였으며, 이로부터 CaLAG1 유전자가 병원성에 중요한 역할을 한다는 것이 최종 밝혀졌다(도 10 및 도 11 참조).

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 우한 것이며, 본 발명이 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. CaLAG1 유전자의 분리

캔디다 알비칸스 LAG1 유전자를 찾기 위하여 이형전환을 할 수 없는 많은 야로위아 리폴리티카 돌연변이 균주를 제조하였으며, 상기 돌연변이 균주들 중 하나의 균주의 형질을 회복시키는 유전자를 클로닝한 결과 그 유전자가 YlLAG1 (GeneBank Accession No. AY163241)임을 발견하였다.

또한, 상기 YlLAG1 와 상동성을 갖는 유전자를 캔디다 알비칸스의 지노믹 데이터베이스(Genomic Database)로부터 검색하였으며, 그 결과 서열번호 1의 염기서열을 갖는 캔디다 알비칸스 유전자를 발견하였으며, 이를 CaLAG1 이라 명명하였다. 또한, 서열번호 1의 염기서열로부터 서열번호 2의 412개의 아미노산 서열을 갖는 캔디다 알비칸스의 Lag1p 단백질을 발견하였으며, 이를 CaLag1p 라고 명명하였다( 도 1 참조).

또한, 캔디다 알비칸스, 사카로마이세스 세레비지아, 야로위아 리폴리티카를 포함한 하등 진핵생물에서부터 호모 사피엔스 등과 같은 고등 진핵생물까지의 여러 생물에서 존재하는 LAG1 유사 유전자군들이 암호화하고 있는 단백질 서열을 비교하였다. 그 결과, 캔디다 알비칸스의 CaLag1p 단백질은 사카로마이세스 세레비지아와 야로위아 리폴리티카 등 다른 진균의 것과는 38% - 50% 이상의 높은 동일성을 보였으나, 호모 사피엔스의 것과는 약 20% 정도의 낮은 동일성을 나타내었다. 또한, CaLag1p 단백질은 Lag1p 단백질군에서 보이는 적어도 다섯 개 이상의 트랜스멤브레인 도메인을 가지고 있으며, 또한 ER 막에 존재할 수 있는 신호서열을 가지고 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명의 CaLAG1 유전자가 암호화하고 있는 CaLag1p 단백질이 Lag1p 단백질군에 속함을 확인하였다.

실시예 2. CaLAG1 유전자 파쇄균주의 제조

2-1. CaLAG1 유전자 파쇄 벡터의 제조

CaLAG1 유전자 파쇄(knock-out)시 선택표지 및 역선택 표지로서 CaURA3 유전자를 사용하였다. 또한, mini-CaURA3 선택 표지 카세트를 함유하고 있는 벡터 pDDB57 (GeneBank Accession No. AF173953)를 변형하여 CaURA3 선택표지를 제조하였다(도 2 참조).

캔디다 알비칸스 표적 유전자 파쇄카세트를 제조하기 위하여, pDDB57 벡터를 제한효소 SacI으로 자른 후 Klenow 효소를 처리하여 단일 주형으로 존재하는 3' 말단부분을 제거하였다. 다음으로, CIAP 효소를 처리하여 탈인산화시킨 후 HindIII linker를 삽입하여 벡터 pDDB57H를 제조하였으며, BglII linker를 삽입하여 벡터 pDDB57B 벡터를 제조하였다.

또한, CaLAG1 유전자 파쇄 카세트를 제조하기 위하여, 캔디다 알비칸스 CAI4 균주의 지노믹 DNA (genomic DNA)를 대상으로 Pfu 폴리머래이즈 (뉴로틱스, 한국)로 PCR을 수행하였다. CaLAG1-1F (ggatccatgtcatcgtcatcatctt)와 CaLAG1-2B (atcgataagcttgatatctcgttacctcctttacca)를 프라이머로 사용하여 416 bp 크기의 N-말단부분을, CaLAG1-3F (gatatcaagcttatcgatttggaatctcccattacc)와 CaLAG1-4B (gtcgacttgttcctttttcttttcatc)를 프라이머로 사용하여 372 bp 크기의 C-말단부분을 증폭하였다. 두개의 DNA 절편을 프라이머 CaLAG1-1F와 CaLAG1-4B 및 Ex Taq 폴리머래이즈(타카라, 일본)를 이용하여 PCR을 수행하여 접합(770 bp) 시킨 후 pGEM T-벡터(프로메가, 미국)에 클로닝하여 벡터 pTCaLAG1D(II)를 제조하였다.

다음으로, 상기에서 제조된 pDDB57H 벡터를 제한효소 HindIII로 절단하여 mini-URA3 선택표지를 얻었으며, 이 절편을 상기 pTCaLAG1D(II) 벡터의 HindIII 사이트에 클로닝하여 CaLAG1 유전자 파쇄 벡터(Calag1::mini-URA3)를 제조하였으며, 이를 pTCaLAG1DUm 라고 명명하였다.

2-2. CaLAG1 유전자가 파쇄된 균주의 제조

CaLAG1 유전자가 파쇄된 균주를 제조하기 위하여 캔디다 알비칸스 CAI4 (ura3::imm434/ura3::imm434) 균주(ACTT MYA-682)를 사용하였다.

첫 번째 CaLAG1 대립유전자를 파쇄시키기 위하여 Calag1::mini-URA3 파쇄 벡터, pTCaLAG1DUm를 BamHI-SpeI으로 절단하여 얻은 DNA 절편(2340 bp)을 야생형 CAI4 균주에 형질전환하여 소비톨(1 M)이 첨가된 SC-URA 선택배지에서 형질전환체를 선별하였고, PCR을 통하여 첫 번째 CaLAG1 대립유전자가 파쇄된 균주 CaLAG1/Calag1::mini-URA3 (이하, "Clag1△1-1"라고 한다)를 확인하였다.

또한, 상기에서 얻은 Clag1△1-1 균주를 5-플로로오르틱 애시드 (5-FOA, 0.675g/liter)가 첨가된 배지에 배양하여 CaURA3 선택표지를 제거함으로써 균주 CaLAG1/Calag1::ura3 (이하 "Clag1△1-2"라고 한다)를 얻었다.

다음으로, Clag1△1-2 균주를 다시 pTCaLAG1DUm로부터 얻은 BamHI-SpeI 절편 (2340 bp)으로 형질전환 하여 두 번째 CaLAG1 대립유전자까지 파쇄된 균주 Calag1::ura3/Calag1::mini-URA3 (이하 "Clag1△2-1"라고 한다)를 얻었다. 상기 균주를 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10624BP (기탁일: 2004년 4월19일)로 기탁하였다.

또한, 상기에서 얻은 균주로부터 다시 URA3 선택표지를 제거하여 균주 Calag1::ura3/Calag1::ura3 (이하 "Clag1△2-2"라고 한다)를 얻었다.

한편, 상기에서 제조한 균주들의 유전자형을 써던 블럿팅으로 확인하였고, 이를 도 3에 도시하였다.

실시예 3. 재도입 벡터 및 재도입 균주의 제조

두 대립유전자가 파쇄된 균주에 야생형 CaLAG1 유전자를 재도입시키기 위한 벡터를 제조하기 위하여 캔디다 알비칸스 CAI4 균주의 지노믹 DNA를 대상으로 Ex Taq 폴리머래이즈(타카라, 일본)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 야생형 CaLAG1 유전자를 모두 포함하는 DNA 절편(2033 bp)을 INLAG1_1F_XhoI (ccgctcgagtgcaaatgttggcaatgtc)와 INLAG1_2B_BamHI (gcgggatccgttactgcaaaatgtatacac) 프라이머를 사용하여 증폭하였으며, CaLAG1 유전자의 하단에 위치하는 DNA 절편(389 bp)을 INLAG1_3F_HindIII (cccaagcttcattttgcagtaacatttccc)와 INLAG1_4B_BamHI (gcgggatccatttagtactgcttccaattc) 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 이 두 절편을 pGEM T-Eazy 벡터에 클로닝하여 pTINLAG1_12와 pTINLAG2_34를 각각 제조하였다. 다음으로 pBluescript KS(+) (스트라타진, 미국) 벡터를 HindIII와 BamHI으로 자른 다음 pTINLAG1_12 벡터의 HindIII-XhoI 절편(2026 bp)과 pDDB57B 벡터의 BglII-HindIII 절편(1566 bp)을 동시에 삽입하여 pBINLAG1U 벡터를 제조하였다. 마지막 단계로 pBINLAG1U를 HindIII-BamHI으로 자른 후 pTINLAG2_34의 HindIII-BamH I 절편(377 bp)을 클로닝하여 CaLAG1::mini-URA3 재도입 벡터를 제조하였으며, 이를 pBINLAG1U2 라고 명명하였다.

상기에서 얻은 재도입 벡터 pBINLAG1U2를 ScaI-SphI 으로 절단하였고, 그 절편(3725 bp)으로 Clag1△2-2 균주를 형질전환하여 야생형 CaLAG1 유전자가 재도입된 균주 Calag1::ura3/CaLAG1-mini-URA3 (이하 "Clag1△3-1"라고 한다)를 제조하였 으며, 상기 균주의 유전자형을 써던 블럿팅으로 확인하였고, 이를 도3에 도시하였다.

실시예 4. CaLAG1 결손 균주의 이형전환성에 관한 시험

CaLAG1 유전자가 균사의 성장에 어떤 영향을 주는지를 알아보기 위하여 CaLAG1 대립유전자가 하나 또는 두개 모두 파쇄된 균주들을 균사형성을 유도하는 여러 고체와 액체 배지에서 배양하면서 그 형태들을 관찰하였다.

10% 혈청만이 첨가된 혈청 고체배지, YP (1% yeast extract, 2% peptone) 배지에 10% 혈청이 첨가된 YPS 고체배지, Lee's 배지 (Lee 등, Sabouraudi, 13, 148-153, 1975)에 10% 혈청이 첨가된 Lee's+serum 고체배지 및 Spider(Liu 등, Science, 266, 1726-1726, 1993; 1%, mannitol; 1%, nutrient broth; 0.2%, K2HPO4 2% agar) 고체배지에 야생형 균주 SC5314 (임상 분리주, ACTT MYA-2876)와 실시예 2에서 얻은 CaLAG1 파쇄 균주들 (Clag1△1-1, Clag1△2-1, Clag1△3-1)을 도말하여 37℃에서 배양하여 그 형태를 관찰하였다. 그 결과, CaLAG1 의 두 대립유전자가 모두 파쇄된 균주(Clag1△2-1)의 경우, 실험한 모든 고체 및 액체배지에서 진균사를 형성할 수 없었다(도 4, 도 5 참조). 그러나, 하나의 CaLAG1 대립유전자만 파쇄된 경우는 야생형 균주와 같이 액체배지나 고체배지에서 진균사를 형성할 수 있었다.

따라서, CaLAG1 유전자는 캔디다 알비칸스의 이형전환에 중요한 역할을 하고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5. CaLAG1 결손 균주의 세포성장과 세포침강에 대한 시험

하나의 CaLAG1 대립유전자만 파쇄된 균주(Clag1△1-2)를 대상으로 나머지 대립유전자를 파쇄하는 실험을 수행하였을 때, SC-URA 선택 배지에서 생성된 형질전환체는 매우 성장 속도가 느렸으며 그 결과 작은 콜로니를 형성하였다. 이 같은 균주들을 대상으로 유전자 파쇄 유무를 PCR이나 써던 블럿팅으로 확인하였을 때 대부분 정확하게 나머지 CaLAG1 유전자가 파쇄되었음을 확인할 수 있었다. 따라서 CaLAG1 유전자는 성장에 매우 중요하다는 것을 예상할 수 있었고 이를 확인하기 위하여 야생형 균주(SC5314)와 CaLAG1 가 파쇄된 균주들(Clag1△1-1, Clag1△1-2, Clag1△2-1, Clag1△2-2)을 대상으로 성장 속도를 비교하여 보았다. 각 균주들을 유리딘이 첨가된 YPD 액체배지에서 배양하면서 6 시간 마다 OD₆₀₀ 값을 측정하여 본 결과, 두 대립유전자가 모두 파쇄된 균주(Clag1△2-1)는 야생형 균주나 CaLAG1 한 대립유전자만 파쇄된 균주 보다 성장속도가 느리고 최종 OD₆₀₀ 값이 2배 이상 작았다. 또한, 이러한 형질은 야생형 CaLAG1 유전자가 재도입된 균주(Clag1△3-1)에서는 야생형 균주와 같이 회복됨을 확인하였다 (도 6 참조).

또한, 두개의 CaLAG1 대립유전자가 모두 파쇄된 균주(Clag1△2-1와 Clag1△2-2)는 액체배양액에서 상당히 빨리 침강되는 특성을 보였다. 이를 좀 더 정확하게 알아보기 위하여 YPD 액체배지에 48 시간동안 키운 배양액 (OD₆₀₀=10)을 플래스틱 시험관에 7 ml 씩 담아 정치하여 그 침강정도를 비교하였다. 배양액을 정 치하기 시작한 후 15 분부터 침강속도의 차이를 구분할 수 있었으며 CaLAG1 두 유전자가 파쇄된 균주는 1~1.5 시간 내에 대부분 가라앉았다. 반면, 다른 균주들은 약 24시간 후에야 완전히 침강됨을 볼 수 있었다. 또한, 이러한 형질은 야생형 CaLAG1 유전자를 재도입하였을 때 회복되었다(도 7 참조).

따라서, CaLAG1 유전자는 캔디다 알비칸스의 성장에 매우 중요한 요소이며, CaLAG1 의 두 대립유전자가 모두 결손되면 세포들이 빨리 침강되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. CaLAG1 결손 균주의 딸세포의 출아패턴과 세포분리에 관한 시험

정상세포보다 침강이 잘 되는 세포들의 경우 모세포와 딸세포가 떨어지지 않고 붙어 자라거나 세포들끼리 서로 결집하기 특성을 보이는 경향이 있다. 따라서 칼코플로 화이트 (Calcoflour white) 염색과 주사전자현미경 (SEM) 이미지로 단일 세포들의 형태와 세포간의 상태를 확인하였다.

칼코플로 화이트는 균류 세포벽의 카이틴 (chitin) 성분에 결합하는 물질로, 카이틴 성분이 많은 세포의 부위, 예를 들어 모세포에서 딸세포가 떨어져 나가는 출아 부위 (budding site)나 떨어져 나간 곳(bud scar)에 많이 결합을 한다. 따라서 야생형 균주와 CaLAG1 유전자 파쇄 균주들을 대상으로 효모형태로 자라는 YPD 액체배지 (30℃) 조건과, 위균사 형성을 유도하는 YPD 액체배지(37℃), 그리고 진균사 형성을 유도하는 YPS와 Lee'S+serum의 액체배지에서(37℃) 3시간 동안 배양한 후 칼코플로 화이트로 염색을 하였다.

그 결과, 효모형태로 자라는 조건에서 야생형 균주는 세포 하나씩, 일반적으로 나타나는 형태인 양극성 출아를 하거나 단극성 출아를 하여 생장하는 것을 살펴볼 수 있었던 반면, Clag1△2-1 균주는 모균주와 딸세포가 떨어지지 않은 형태로 존재하며 불규칙성 출아를 하는 것을 관찰할 수 있었다(도 8 참조). 이와 같은 형태는 야생형 균주가 위균사를 형성하거나 진균사를 형성하는 조건에서도 동일하게 나타남을 확인할 수 있었다. 또한 Clag1△2-1 균주가 야생형 균주와는 달리, 양극성 출아법을 상실하고 불규칙성 출아를 하고 있다는 것은 주사전자현미경 이미지를 통하여 확실하게 관찰할 수 있었다(도 9 참조). 그러나, CaLAG1 의 하나의 대립유전자만 파쇄된 균주들에 있어서는 야생형 균주와 거의 비슷한 양상을 보였다.

이 결과로부터 CaLAG1 유전자는 세포의 분리와 출아 패턴에 필수적인 유전자라는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7. CaLAG1 결손 균주의 병원성에 관한 시험

CaLAG1 유전자가 캔디다 알비칸스의 병원성에 어떤 영향을 미치는가를 알아보기 위하여, 쥐의 꼬리 정맥에 야생형 균주와 CaLAG1 결손 균주를 주입하여 전신성 캔디다증을 유발한 후 쥐의 생존률을 측정하여 보았다.

캔디다 알비칸스 야생형 균주(SC5314)와 Clag1△1-1 (CaLAG1/Calag1), Clag1△2-1 (Calag1/Calag1)와 Clag1△3-1 (Calag1/Calag1/CaLAG1) 균주, 및 음성 대조군으로써 식염 완충용액만을 각각 10 마리의 쥐의 꼬리 정맥에 10⁶ cells/mouse 와 10⁷ cells/mouse 의 양으로 주사한 후 쥐의 생존율을 관찰하였다. 도 10에 도시한 바와 같이 균주 농도를 10⁷ cells/mouse로 주입한 경우, 야생형 균주를 주입한 쥐는 2일째 모두 사멸하였다. 또한, 하나의 CaLAG1 대립유전자를 가지고 있는 균주들을 주입한 쥐는 야생형 균주의 결과와 큰 차이를 보이지 않거나 (Clag1△3-1), 7일째 완전히 사멸하였다(Clag1△1-1). 그러나 CaLAG1 두 대립유전자를 모두 파쇄시킨 Clag1△2-1 균주가 주사된 쥐들은 모두 살아남았다.

또한, 도 11에서 도시한 바와 같이, 균주의 농도를 10⁶ cells/mouse로 낮춘 시험에서도 야생형 균주나 하나의 CaLAG1 대립유전자가 남아있는 균주와는 달리 CaLAG1가 모두 파쇄된 Clag1△2-1 균주가 주사된 쥐는 모두 살아남았다.

결과적으로 Clag1△2-1 균주는 병원성을 상실하였음을 동물실험을 통하여 확인하였으며, 이 사실로부터 CaLAG1 유전자가 캔디다 알비칸스의 병원성에 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다.

본 발명은 캔디다 알비칸스의 이형전환과 병원성에 관련된 신규한 유전자 CaLAG1 및 단백질 CaLag1p 를 제공한다. 따라서 본 발명의 CaLAG1 유전자나 CaLag1p 단백질은 캔디다 알비칸스의 병원성을 저해하는 항진균 물질을 찾기 위한 표적 유전자 또는 표적 단백질로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 새로운 항진균제를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Yuhan Corporation <120> A gene CaLAG1 related to the yeast-to-hypha morphological transition and virulence in Candida albicans <130> 0004 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1239 <212> DNA <213> Candida albicans <400> 1 atgtcatcgt catcatcttc acttggtgtt ccacacgaaa acccaattcg tcatcgttct 60 tcatctgttg gtagaataga cgttggtgac acatctgcat ctttatcaac catgccaacc 120 acgaggtctc tgagaagaag atctattgcc agattgaaag aattacaaga caattcaact 180 acagattcag caattgttca taaattatat gttgggttta gagaattaac ttatagacac 240 acttggatta ttcctttgat tgttttactc atggcttttg gtacatatta tctttcatca 300 ccttcaggaa aagttcatca agtattagaa gatatgatta ttccatctta tcatatccct 360 ggtactgatc aatatggtaa aggaggtaac gatttcaaat ttgttggatt ttatgctatt 420 tttttcactt ttttgagaga attcatgatg tgttgtgttt tacgtccaat tagtgtttgg 480 tttggtatta aaaaagaagc caaacagaag agatttttag aacaaactta tgccatgttt 540 tattatggta ttactggtcc atttggttta tggattatga gaagattacc attatggtat 600 tttaatacca ctcaatttta tataaattat ccacacaaga ctcatgatat ttatttcaaa 660 atttattatc ttggtcaagc agcattttgg gtccaacaat cagtagtttt aattttacaa 720 ttggaaaaac caagaaaaga tttcaaagaa ttagtcttgc atcatattat cactatagcg 780 ttgatttggt gttcttatag attccatttc acttggatgg gattggctgt ttatattact 840 atggatatat ctgatttctt tttggcatta tcgaaaactt tgaattattt ggaatctccc 900 attaccggtc catttttcgt tatatttatt ggcgtttgga tttatttgag acattatatc 960 aatttacaaa tattatggtc ggttttaact gaattcagaa ccgttggtga tttcgaattg 1020 aattggatca ctcaacaata taaatgttgg atctcacagc caatcacttt tttcttgatt 1080 tttgccttac aattagtcaa cttttattgg ttagtattga ttttcagaat tttatacaga 1140 tatgttttca ctggggttag taaagatgaa agaagtgatg atgaagatga agatgaagat 1200 agtgaagatt ctgctgatga aaagaaaaag gaacaatag 1239 <210> 2 <211> 412 <212> PRT <213> Candida albicans <400> 2 Met Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Gly Val Pro His Glu Asn Pro Ile 1 5 10 15 Arg His Arg Ser Ser Ser Val Gly Arg Ile Asp Val Gly Asp Thr Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Ser Thr Met Pro Thr Thr Arg Ser Leu Arg Arg Arg Ser 35 40 45 Ile Ala Arg Leu Lys Glu Leu Gln Asp Asn Ser Thr Thr Asp Ser Ala 50 55 60 Ile Val His Lys Leu Tyr Val Gly Phe Arg Glu Leu Thr Tyr Arg His 65 70 75 80 Thr Trp Ile Ile Pro Leu Ile Val Leu Leu Met Ala Phe Gly Thr Tyr 85 90 95 Tyr Leu Ser Ser Pro Ser Gly Lys Val His Gln Val Leu Glu Asp Met 100 105 110 Ile Ile Pro Ser Tyr His Ile Pro Gly Thr Asp Gln Tyr Gly Lys Gly 115 120 125 Gly Asn Asp Phe Lys Phe Val Gly Phe Tyr Ala Ile Phe Phe Thr Phe 130 135 140 Leu Arg Glu Phe Met Met Cys Cys Val Leu Arg Pro Ile Ser Val Trp 145 150 155 160 Phe Gly Ile Lys Lys Glu Ala Lys Gln Lys Arg Phe Leu Glu Gln Thr 165 170 175 Tyr Ala Met Phe Tyr Tyr Gly Ile Thr Gly Pro Phe Gly Leu Trp Ile 180 185 190 Met Arg Arg Leu Pro Leu Trp Tyr Phe Asn Thr Thr Gln Phe Tyr Ile 195 200 205 Asn Tyr Pro His Lys Thr His Asp Ile Tyr Phe Lys Ile Tyr Tyr Leu 210 215 220 Gly Gln Ala Ala Phe Trp Val Gln Gln Ser Val Val Leu Ile Leu Gln 225 230 235 240 Leu Glu Lys Pro Arg Lys Asp Phe Lys Glu Leu Val Leu His His Ile 245 250 255 Ile Thr Ile Ala Leu Ile Trp Cys Ser Tyr Arg Phe His Phe Thr Trp 260 265 270 Met Gly Leu Ala Val Tyr Ile Thr Met Asp Ile Ser Asp Phe Phe Leu 275 280 285 Ala Leu Ser Lys Thr Leu Asn Tyr Leu Glu Ser Pro Ile Thr Gly Pro 290 295 300 Phe Phe Val Ile Phe Ile Gly Val Trp Ile Tyr Leu Arg His Tyr Ile 305 310 315 320 Asn Leu Gln Ile Leu Trp Ser Val Leu Thr Glu Phe Arg Thr Val Gly 325 330 335 Asp Phe Glu Leu Asn Trp Ile Thr Gln Gln Tyr Lys Cys Trp Ile Ser 340 345 350 Gln Pro Ile Thr Phe Phe Leu Ile Phe Ala Leu Gln Leu Val Asn Phe 355 360 365 Tyr Trp Leu Val Leu Ile Phe Arg Ile Leu Tyr Arg Tyr Val Phe Thr 370 375 380 Gly Val Ser Lys Asp Glu Arg Ser Asp Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp 385 390 395 400 Ser Glu Asp Ser Ala Asp Glu Lys Lys Lys Glu Gln 405 410

Claims

캔디다 알비칸스(Candida albicans)의 이형전환 및 병원성과 관련되는 신규의 유전자로서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자 CaLAG1.
캔디다 알비칸스의 이형전환 및 병원성과 관련되는 신규의 단백질로서, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 CaLag1p.
제1항에 따른 유전자 CaLAG1 의 두개의 대립유전자가 파쇄(knock-out)된 캔디다 알비칸스 균주 (기탁번호: KCTC 10624BP).
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