KR101096417B1

KR101096417B1 - 아사론을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품

Info

Publication number: KR101096417B1
Application number: KR1020090097150A
Authority: KR
Inventors: 양영; 유시용; 윤유식
Original assignee: 숙명여자대학교산학협력단
Priority date: 2009-10-13
Filing date: 2009-10-13
Publication date: 2011-12-21
Also published as: KR20110040028A

Abstract

본 발명은 아사론(asarone)을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물, 아사론을 유효성분으로 함유하는 C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein-α) 및 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor-γ) 발현 저해제 및 아사론을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

C/EBPα, PPARγ, 아디포넥틴, 아사론, 호르몬 민감성 리파아제

Description

아사론을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품{Pharmaceutical composition and functional health food for preventing or treating diabetes mellitus comprising asarone as effective component}

본 발명은 아사론을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 아사론(asarone)을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물, 아사론을 유효성분으로 함유하는 C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein-α) 및 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor-γ) 발현 저해제 및 아사론을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

지방세포의 분화 증강으로 인한 비만은 제 2 형 당뇨병 및 심혈관계 질환의 확립된 위험 인자이기 때문에, 지방형성을 조절하는 분자는 중요한 약학적 표적이 된다. 따라서, 지방형성을 저해하거나 또는 지방분해를 촉진하는 약물의 개발은 비만 조절 전략들 중 하나이다. 지방형성 분화 프로그램의 초기에는, 지방전구세포가 유사분열 클론 확장을 겪게 되며 (Tang 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 2003; 100: 44-49), 이는 전사 인자들인, CCAAT/인핸서 결합 단백질 β 및 δ (C/EBPβ 및 δ)의 발현 유도를 동반한다. 이어서, 상기 인자들은 전사 인자인 C/EBPα 및 페록시좀 증식인자-활성화 수용체 γ(PPARγ)의 발현을, 그들의 프로모터 내 C/EBP 조절 인자들에 대한 결합을 통해 유도한다. 이와 함께, C/EBPα 및 PPARγ 는 지방세포 특이적 유전자 발현을 촉진하며, 그 결과 지방세포 형성을 초래한다. 레스베라트롤 (resveratrol) 및 퀘르세틴 (quercetin)을 포함하는 몇가지 천연 화합물들은 C/EBPα 및 PPARγ 의 발현을 억제하여 항-비만 효과를 나타낸다 (Rayalam 등, Phytother. Res . 2008; 22: 1367-1371). 호르몬-민감성 리파아제 (HSL)는 지방세포에서의 지방분해 촉진에 원인을 제공하는 핵심 효소이다. 이는 트 리아실글리세롤 (TG)의 디아실글리세롤 (DAG) 및 유리 지방산 (FFA)으로의 분해에서 속도 결정 효소이다. 카테콜아민 및 글루카곤과 같은 지방분해 호르몬은 사이클릭 AMP (cAMP)-활성화 단백질 키나아제 A (PKA)에 의한 인산화 및 HSL 의 연합 활성화를 통해 TG 의 가수분해를 촉진한다. 상기 호르몬에 추가하여, 피토에스트로겐, 제니스테인 및 프로시아니딘을 포함하는 몇가지 천연 화합물은 HSL 의 활성화를 통한 지방분해 촉진으로 항-비만 효과를 나타낸다 (Szkudelska 등, J. Steroid Biochem . Mol . Biol . 2000; 75: 265-271).

아사론 (Asarone)은 인도의 천연 식물인 창포 (Acorus calamus)와 같은 특정 식물에서 발견되는 분자로, 아사론을 포함하는 약물 제제는 디프테리아, 장티푸스 및 결핵의 치료에 이용된다. 창포의 뿌리는 당뇨병 치료를 위해, 다코타 및 인도네시아에서 민간 의약에 이용된다 (Acuna 등, Phytother. Res . 2002; 16: 63-65).

한국특허등록 제0515746호에는 석창포 추출물을 함유하는 당뇨병 치료 또는 예방제 그리고 이를 포함하는 약학적 제제가 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2005-0042769호에는 석창포 추출물을 함유하는 당뇨 및 혈당조절 식품 및 사료가 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명은 쥐과동물 3T3-L1 지방전구세포 및 지방세포에서의 지방형성 및 지방분해에 대한 아사론의 영향을 시험하였으며, 아사론을 이용한 병용 치료는 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 현저히 저해했으며, 아사론을 이용한 사후 치료는 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포에서 지방분해를 증가시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 아사론(asarone)을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 아사론을 유효성분으로 함유하는 C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein-α) 및 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor-γ) 발현 저해제를 제공한다.

또한, 본 발명은 아사론을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 당뇨를 비롯한 고혈당증 및 고혈당으로 유발되는 각종 질환을 치료 및 예방하는데 효과적으로 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 아사론은 각종 식품에 첨가하거나, 식품 보조제로 사용함으로써, 혈당 조절체계의 기능 향상으로 성인병, 퇴행성 질환에 보조적인 치료요법으로의 역할 등의 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아사론(asarone)을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

아사론은 지방형성을 저해하며, 3T3-L1 지방세포에서 지방분해를 촉진하며, 구체적으로는 아사론은 전사인자인 C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein-α) 및 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor-γ)의 발현을 저해하여 지방형성을 저해하거나 호르몬 민감성 리파아제 활성 증가를 통해 지방분해를 촉진함으로써 당뇨병을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명은 또한, 아사론(asarone)을 유효성분으로 함유하는 C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein-α) 및 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor-γ) 발현 저해제를 제공한다.

본 발명은 또한, 아사론(asarone)을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 아사론을 0.02 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 아사론을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 아사론을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 아사론을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 아사론에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위을 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 당뇨병의 예방 또는 개선 효과를 나타내는 상기 아사론 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 아사론을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 당뇨병의 예방 또는 개선 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 아사론의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 아사론을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 아사론은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 아사론은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

화합물 및 시약

둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)) 및 우태아 혈청 (FBS)은 HyClone (Logan, UT)에서 구입했다. 덱사메타손, 3-이소부틸-1-메틸크산틴 및 인슐린은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입했다. PKA 저해제인 H-89 는 Stressgen (Ann Arbor, MI)에서 구입했다. C/EBPα, C/EBPβ, PPARγ 및 아디포넥틴 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)로부터 입수했으며, 포스포-HSL, 포스포-ERK 및 ERK 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)에서 구입했다.

석창포 ( Acorus gramineus ( 아라세애 ( Araceae ))의 근경 추출물로부터의 아사론 분리

석창포 (Acorus gramineus)의 말린 근경 (1 kg)을 잘게 조각내어, 실온의 메탄올 (MeOH) 3 L 에 2 주 동안 담구었다. 결과로서 수득한 MeOH 추출물을 코튼볼을 통해 여과하고, 진공에서 농축하여 82 g 의 진한 시럽형 추출물을 수득하여, 4 L 의 증류수에 재현탁시키고 동일 부피의 디클로로메탄을 이용해 2 회 추출했다. 추출물을 모아서, 건조될 때까지 농축하여 32 g 의 디클로로메탄 분획을 수득했다. 이를 실리카 겔 (230-400 메쉬, 300 g) 상에서 크로마토그래피하고, 5 가지 획분 (Fr.A - Fr.E)을 헥산-에틸아세테이트 (15:1 ~ 1:1)로 용출했다. Fr.C (5 g)를 반복 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 헥산-에틸아세테이트 (10:1 ~ 5:1)로 용출했다. 용출물은 1.2 g 의 황색 오일이었으며, 이는 NMR 분광 분석을 근거로 하여 아사론 (α 및 β 이성질체의 1:1 혼합물)으로 밝혀졌다 (데이터는 나타내지 않음).

3 T3 - L1 세포의 분화

쥐과동물 3T3-L1 지방전구세포 세포주는 ATCC 로부터 입수했으며, 상기 세포를 95% 공기/5% CO₂ 의 대기에서 37℃ 로 하여 10% 우태아 혈청 (HyClone, UT)을 함유하는 DMEM 에서 배양했다. 3T3-L1 세포가 컨플루언스에서 성장 정지되었을 때, 0.5 M 3-이소부틸-1-메틸크산틴, 2 μM 덱사메타손 및 1.7 μM 인슐린을 보충한 DMEM 배지 (분화 배지) 첨가로 분화를 유도했다. 상기 배지는 2 일간의 인큐베이션 후 제거하고, 10% FBS 및 1.7 μM 의 인슐린을 보충한 DMEM 으로 2 일 동안 대체하고, 이후 배지는 10% FBS 를 보충한 DMEM 으로 이틀마다 바꿔줬다. 분화된 지방세포 상에서 실험을 수행하는 시점에, 95% 를 초과하는 3T3-L1 세포가 다중적인 지질 방울들로 채워졌다.

오일- 레드 O 염색

완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고, PBS 중의 4% 포름알데히드로 10 분 동안 고정시켰다. 세포를 오일-레드 O 염료와 함께 인큐베이션하는데, 이는 15 분 동안 실온에서 60% 이소프로판올에 최대한 용해시켰다. 염색된 지질 방울들을 이소프로판올에 용해시키고, 490 nm 에서의 흡광도 측정으로 정량했다.

트리글리세리드 수준 및 비- 에스테르화 지방산의 측정

완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 표시된 시간 간격에 대해 62.5 μM 또는 125 μM 아사론과 함께 인큐베이션했다. 세포를 세척하고, 300 ㎕ 의 PBS 중에 수확하고, 이후 이들을 초음파처리했다. 초음파처리한 분해물 중의 트리글리세리드 수준을 Cleantech TG-S 반응 키트 (Asan Pharm, Co., Seoul, Korea)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 측정했다. 성숙 지방세포에서 방출된 비-에스테르화 지방산을 Zen Bio (Research Triangle Park, NC)에서 제조하는 배양 지방세포 지방분해 검정 키트를 이용하여 측정했다.

세포 생존능 검정

지방전구세포 3T3-L1 세포를 5000 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종했다. 세포를 여러가지 농도의 아사론을 이용하여 48 시간 동안 처리한 후, 세포 생존능을 EZ-CyTox 세포 생존능 검정 키트 (Daeil Lab. Service, Seoul, Korea)를 이용하여 측정했다.

역전사 중합효소 연쇄 반응 ( PCR )

전체 RNA 를 TRI 시약 (Molecular Research Center, Inc., Seoul, Korea)을 이용하여, 분화된 3T3-L1 지방세포에서 아사론 처리 후 분리해 냈다. 5 ㎍ 의 RNA 는, 역전사효소 (Promega, Madison, WI)를 사용하여 0.5 ㎍ 의 랜덤 프라이머로 37℃에서 1 시간 동안 전사시켰다. 지방세포 트리글리세리드 리파아제 (ATGL) C/EBPβ 및 C/EBPδ 의 증폭에 하기의 프라이머 서열을 이용했다: ATGL 정방향 프라이머 (5'-cagttccacctgctcagaca-3'; 서열번호 1) 및 ATGL 역방향 프라이머 (5'-ctccgagagagatgtgcaaca-3'; 서열번호 2); C/EBPβ 정방향 프라이머 (5'-ctttcgggacttgatgcaatc-3'; 서열번호 3) 및 C/EBPβ 역방향 프라이머 (5'-aacaaccccgcaggaacat-3'; 서열번호 4); C/EBPδ 정방향 프라이머 (5'-ctcccgcacacaacatactg-3'; 서열번호 5) 및 C/EBPδ 역방향 프라이머 (5'-ggttaagcccgcaaacatta-3'; 서열번호 6). PCR은 PTC-100 thermal cycler (MJ Research Inc., MA)를 이용하여 30 회의 증폭 사이클로 수행했다. 각각의 증폭 사이클은 94℃에서의 30 초간 변성, 55℃ 에서의 30 초간 어닐링, 72℃ 에서의 30 초간 신장으로 이루어졌다. β-액틴의 증폭은 대조군으로서 이용했다. PCR 생성물은 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하여 촬영했다.

웨스턴 블롯 분석

여러가지 농도의 아사론을 처리한 분화된 3T3-L1 지방세포를 PBS 로 2 회 세척하고, 포스파타아제 저해제 (Sigma-Aldrich, Mo)를 함유하는 100 ㎕ 의 1X 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 변성 완충액을 사용하여 세포 분해물을 제조한 후, 15 내지 20 초 동안 초음파처리했다. 초음파처리한 시료를 95℃ 에서 5 분 동안 가열하고, 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동으로 분리했다. 이어서, 0.45 ㎛ 포어 크기의 니트로셀룰로오스 막 (Whatman, Dassel, Germany) 상에 2 시간 동안 단백질을 옮겼다. 이어서, 막을 PPARγ 또는 C/EBPα 항체 (Santa Cruz, CA) 또는 포스포-ERK 및 ERK 항체 또는 포스포-HSL 항체 (Cell Signaling Technology, MA) 또는 β-액틴 항체 (Bethyl Laboratories, Inc., TX)를 1:1000 희석한 것과 함께 밤새 4℃에서 인큐베이션했다. 이어서, 막을 항-토끼 IgG 또는, 고추냉이 퍼옥시다아제 (Stressgen, MI)와 콘쥬게이션된 항-마우스 IgG 2 차 항체를 1:5000 희석한 것과 함께 2 시간 동안 25℃ 에서 인큐베이션했다. 단백질은 증강된 화학발광 기질 (Thermo, IL)을 이용하여 가시화하고, LAS3000 발광 영상 분석기 (Fuji Film, Tokyo, Japan)로 분석했다.

실시예 1: 아사론은 3 T3 - L1 지방전구세포의 지방형성 분화를 저해한다

쥐과동물 지방전구세포 세포주 3T3-L1 의 지방세포로의 분화는, 아사론의 존재 또는 부재 하에 분화 칵테일을 사용한 48 시간 동안의 세포의 인큐베이션으로 개시했다. 지방형성 정도는 세포내 지질 방울 형성의 현미경 관찰로 측정했다. 아사론 처리는 3T3-L1 세포의 지방형성을 현저하게 억제했다 (도 1A). 지방세포 내에서 아사론이 유도하는 지질 방울 형성 저해 수준은 오일-레드 O 염색으로 평가했다. 세포에 혼입된 오일-레드 O 염료의 양은 세포의 이소프로판올 추출물의 흡광도 측정으로 정량했다. 아사론을 이용한 처리는 지질 방울의 형성을 투여량 의존적 방식으로 저해했다 (도 1B). 지방형성의 아사론 매개 억제가 아사론의 세포독성 영향으로 인한 것이 아니라는 점을 확인하기 위해, 세포의 생존능을 EZ-CyTox 세포 생존능 검정 키트로 측정했다. 125 μM 의 아사론을 48 시간 동안 처리한 후, 통계적으로 유의한 세포독성은 발견되지 않았다 (도 1C). 상기 결과는, 분화 칵테일을 이용한 아사론의 병용 처리가 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 억제하며, 지질 방울 형성에 대한 아사론의 저해 효과는 3T3-L1 세포에 대한 세포독성으로 인한 것이 아님을 시사한다.

실시예 2: 아사론은 C/ EBP α 및 PPAR γ 의 발현을 저해한다

아사론의 지방형성 방지 효과를 뒷받침하는 분자적 메카니즘을 설명하기 위해, 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화를, 아사론의 존재 또는 부재 하에 분화 칵테일과 상기 세포를 48 시간 동안 인큐베이션하여 개시했다. C/EBPα 및 PPARγ 전사 인자는 지방형성 진행에 원인을 제공하는데; 그에 따라 C/EBPα 및 PPARγ 의 발현 수준은 아사론의 부재 하에서의 추가적인 8 일간의 배양 후 검정했다. 두 전사 인자의 단백질 수준은 투여량에 비례하여 감소했는데 (도 2A), 이는 아사론이 C/EBPα 및 PPARγ 발현의 하향조절을 통해 지방형성에 대한 그의 저해 효과를 나타낸다는 것을 나타낸다. C/EBPβ 및 C/EBPδ 는 초기 지방형성 과정에서 증가되는데, C/EBPα 및 PPARγ 를 전사적으로 활성화시켜, 지방세포의 완전 분화를 유도한다 (9). 따라서, C/EBPβ 및 C/EBPδ 의 발현에 대한 아사론의 효과를 조 사했다. 지방전구세포인 3T3-L1 세포를 아사론의 존재 하에 분화 칵테일과 함께 8 시간 동안 처리하고, C/EBPβ 및 C/EBPδ mRNA 수준을 RT-PCR 을 이용하여 평가했다. 아사론은 C/EBPδ 발현을 현저하게 저해했으나, C/EBPβ 의 발현에는 영향을 주지 않았다 (도 2B). 상기 데이터는 초기 지방형성에서 C/EBPδ 의 아사론-매개 저해가 지방 형성의 이후 단계에서 C/EBPα 및 PPARγ 의 하향조절과 상관이 있을 수 있다는 점을 시사한다.

실시예 3: 아사론은 호르몬 민감성 리파아제의 활성화를 통해 지방분해를 증진시킨다

완전 분화된 지방세포에 대한 아사론의 효과를 조사했다. 아사론이 분화된 지방세포에서 지방분해에 영향을 주는지 여부를 측정하기 위해, 세포내 트리글리세리드 수준을 125 μM 아사론을 처리한 분화된 3T3-L1 지방세포에서 측정했다. 아사론 처리군에서 트리글리세리드 수준은 시간이 흘러감에 따라 감소하는 것으로 나타났다 (도 3A). 아사론이 지방분해를 증가시키는지 여부를 확립하기 위해, 세포로부터의 유리 지방산 방출을 측정했다. 아사론 처리는 유리 지방산의 방출을 현저히 증가시켰다 (도 3B). HSL 및 ATGL 는 두가지 모두 분리된 성숙 지방 세포에서의 지방분해에 중요한 역할을 한다. 따라서, ATGL mRNA 의 발현 수준은 RT-PCR 분석을 이용하여 분석했고; 아사론 처리가 ATGL 발현에는 현저히 영향을 주지 않음을 관찰했다 (도 4A). 이어서, 아사론이, 트리글리세리드를 가수분해하는 HSL 의 활성에 영향을 주는지 여부를 조사했다. 지방세포에서의 지방분해는 주로 PKA-매개 인산화 및 HSL 의 활성화를 통해 촉진된다. HSL 가 활성화되는지 여부를 검사하기 위해, 인산화된 HSL 의 수준을 항-포스포-HSL 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석으로 측정했다. 분화된 3T3-L1 지방세포를 125 μM 아사론으로 30 분 동안 처리하고, 전체 세포 분해물을 1×SDS 변성 완충액과 함께 초음파처리하여 수득했다. HSL 의 인산화는 아사론 처리에 의해 투여량에 의존하여 증가했다 (도 4B). HSL 인산화의 시간 동역학을 확립하기 위해, 분화된 3T3-L1 세포를 125 μM 아사론으로 처리하고, 전체 세포 분해물을 표시된 시간 간격으로 제조했다. 아사론에 의해 유도된 HSL 의 인산화는 시간의존적인 경향으로 증가했다 (도 4C). PKA 는 HSL 를 인산화시키므로, 아사론이 HSL 의 PKA-의존성 인산화를 촉진할 가능성을 시험했다. 분화된 3T3-L1 지방세포를 선택성이 있는 강력한 cAMP-의존적 PKA 저해제인 H-89 로 1 시간 동안 전처리하고, 125 μM 아사론의 첨가 후 30 분 동안 인큐베이션했다. 아사론-유도성 HSL 인산화는 PKA 저해제의 존재 하에 차단되어 (도 4D), 아사론이 PKA 활성화를 통해 HSL 의 인산화를 실제로 촉진한다는 것을 시사했다. 지방분해에서 속도 결정 효소인 HSL 이 세포외 시그널 조절 키나아제 (ERK)에 의해 활성화될 수 있다는 점이 또한 공지되어 있다. ERK 활성화에 대한 아사론의 효과를 조사하기 위해, 분화된 3T3-L1 지방세포를 표시된 농도의 아사론으로 처리하고, 세포 분해물을 15 분 후에 제조했다. ERK 인산화 수준은 62.5 μM 아사론에서 증가하여 (도 4E), 아사론에 의한 PKA 및 ERK 활성화는 두가지 모두 HSL 활성화에 원인을 제공한다는 점을 시사했다.

실시예 4: 아사론은 아디포넥틴의 생성을 증가시킨다

아디포넥틴 수준 감소는 당뇨병 및 각종 암에 대한 위험 인자이다. 이러한 영향을 조사하기 위해, 지방세포의 아사론 처리가 아디포넥틴 생성에 영향을 주는지 여부를 조사했다. 지방전구세포 3T3-L1 세포의 지방세포로의 분화는, 아사론의 존재 또는 부재 하에 48 시간 동안 세포를 분화 칵테일과 함께 인큐베이션하여 개시했다. 분화 과정은 새로운 배지를 이틀마다 갈아줌으로써 진행했다. 지방세포 형성 8 일째에, 배양 배지를 웨스턴 블롯 분석에 적용하여, 분비된 아디포넥틴의 수준을 측정했다. 아사론을 이용한 전처리는 아디포넥틴의 분비를 현저히 감소시켰다 (도 5A). 분화된 3T3-L1 지방세포는 아사론으로 48 시간 동안 처리하고, 분비된 아디포넥틴 수준을 측정했다. 흥미롭게도, 아사론은 아디포넥틴의 분비를 현저히 증진시켰다 (도 5B). 분화 칵테일과 아사론의 병용처리는 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 저해한다. 다른 한편, 아디포넥틴 분비는 완전히 분화된 지방세포를 아사론으로 처리했을 때 증가했다.

도 1은 분화 칵테일과 아사론의 병용처리는 지방형성을 저해한다는 것을 보여준다. (A) 지방전구세포 3T3-L1 세포의 지방세포로의 분화는 62.5 μM 및 125 μM 아사론을 함유하는 분화 칵테일과 함께한 인큐베이션에 의해 유도했다. 분화 8 일째, 세포의 형태를 검사하여 지방형성 수준을 측정했다. (B) 지방형성은 아사론의 존재 하에 수행되었다. 분화 8 일째, 분화된 세포는 오일-레드 O 를 이용하여 염색하고, 오일-레드 O 혼입 수준은 490 nm 에서의 흡광도 측정으로 정량했다. 데이터는 3 회의 반복실험으로부터의 평균 ± SEM 으로 나타냈다. **, P < 0.01, 비처리 대조군 세포와 비교함. (C) 지방전구세포 3T3-L1 세포를 여러가지 농도의 아사론으로 48 시간 동안 처리한 후, 세포 생존능을 측정했다. 데이터는 3 회의 반복실험으로부터의 평균 ± SEM 으로 나타냈다.

도 2는 아사론은 C/EBPα 및 PPARγ의 발현을 저해한다는 것을 보여준다. (A) 지방전구세포 3T3-L1 세포의 지방세포로의 분화는 62.5 μM 및 125 μM 아사론을 함유하는 분화 칵테일을 이용한 인큐베이션으로 유도했다. 분화 8 일째에, C/EBPα 및 PPARγ 의 수준을 웨스터 블롯 분석으로 측정했다. (B) 지방전구세포 3T3-L1 세포를, 분화 칵테일의 존재 하에 125 μM 아사론으로 정해진 시간 간격에 대해 처리했다. RT-PCR 분석을 수행하여, C/EBPβ 및 C/EBPδ 의 수준을 측정했다.

도 3은 아사론은 분화된 지방세포에서 지방분해를 촉진한다는 것을 보여준다. (A) 지방전구세포 3T3-L1 세포는 분화 칵테일을 이용한 인큐베이션으로 분화시켰다. 분화 8 일째, 분화된 지방세포를 125 μM 아사론으로 정해진 시간 간격에 대해 처리했다. 세포내 트리글리세리드 수준을 측정했다. 데이터는 3 회의 반복실험으로부터의 평균±SEM 으로 나타냈다. **, P < 0.01, 비처리 대조군 세포와 비교. (B) 분화 8 일째, 분화된 지방세포를 표시된 농도의 아사론으로 처리했다. 비-에스테르화 지방산의 수준을 아사론 처리 48 시간 후 측정했다. 데이터는 3 회의 반복실험으로부터의 평균±SEM 으로 나타냈다. **, P < 0.01, 비처리 대조군 세포와 비교.

도 4는 아사론은 PKA 및 ERK 의 활성화를 통해 HSL 의 인산화를 촉진한다는 것을 보여준다. (A) 분화된 3T3-L1 지방세포를 표시된 농도의 아사론으로 24 시간 동안 처리했다. RT-PCR 분석을 수행하여 ATGL mRNA 의 수준을 측정했다. (B) 분화된 3T3-L1 성숙 지방세포를 표시된 농도의 아사론으로 30 분 동안 처리했다. 세포 분해물을 웨스턴 블롯 분석에 적용하고, 포스포-HSL 의 수준을 측정했다. (C) 분화 된 3T3-L1 지방세포를 125 μM 아사론과 함께 여러가지 시간 간격에 대해 처리하고, 포스포-HSL 의 수준을 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 측정했다. (D) 분화된 3T3-L1 지방세포를 10 μM H-89 와 함께 1 시간 동안 처리한 후, 125 μM 아사론과 함께 30 분 동안 인큐베이션했다. 전체 단백질을 분화된 지방세포로부터 추출하고, 포스포-HSL 의 수준을 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 측정했다. (E) 분화된 3T3-L1 성숙 지방세포를 표시된 농도의 아사론과 함께 30 분 동안 처리했다. 세포 분해물을 웨스턴 블롯 분석에 적용하고, 포스포-ERK 및 ERK 의 수준을 측정했다.

도 5는 아사론은 분화된 3T3-L1 지방세포에서 아디포넥틴 생성을 촉진한다는 것을 보여준다. (A) 지방전구세포 3T3-L1 세포의 지방세포로의 분화는 아사론을 함유한 분화 칵테일과의 인큐베이션으로 유도했다. 분화 8 일째, 배양 배지 중의 아디포넥틴의 수준은 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 측정했다. (B) 3T3-L1 세포는 분화 칵테일과의 인큐베이션으로 분화시켰다. 분화 8 일째, 세포를 62.5 μM 또는 125 μM 아사론과 함께 48 시간 동안 처리한 후, 배양 배지 중의 아디포넥틴의 수준을 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 측정했다.

Claims

아사론(asarone)을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 아사론은 전사인자인 C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein-α) 및 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor-γ)의 발현을 저해하여 지방형성을 저해하거나 호르몬 민감성 리파아제 활성 증가를 통해 지방분해를 촉진함으로써 당뇨병을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
삭제
아사론(asarone)을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품.