KR101090169B1

KR101090169B1 - 치아크레모논 화합물을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101090169B1
Application number: KR1020090068715A
Authority: KR
Inventors: 윤도영; 김은진; 반정옥; 홍진태; 정헌상
Original assignee: 충북대학교 산학협력단; 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2009-07-28
Filing date: 2009-07-28
Publication date: 2011-12-06
Also published as: KR20110011187A

Abstract

본 발명은 마늘에서 분리한 치아크레모논(thiacremonone) 화합물을 함유하는 비만 등의 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 치아크레모논은 지방세포에서 특이적으로 PPARγ 및 FAS의 활성을 억제하고 AMPK의 발현을 증가시켜 지방세포에서의 지방생성을 억제하고 인슐린에 의한 당의 흡수를 개선하는 효능을 보임으로써 비만, 당뇨병, 심장혈관질환 및 고지혈증을 포함한 각종 대사성 질환 등의 예방 또는 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

비만, 마늘, 지방세포, 대사성 질환, 치아크레모논(thiacremonone) 화합물

Description

치아크레모논 화합물을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic disease comprising thiacremonone compound as effective component}

본 발명은 치아크레모논 화합물을 유효성분으로 포함하는 비만, 당뇨 등의 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

비만은 제2형 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 동맥경화와 같은 성인병이나 암을 유발하기도 하는 대사성 질환의 일종으로, 서구화된 식습관과 생활패턴으로 비만인구가 증가하면서 비만은 더 이상 미국과 유럽만의 문제가 아닌 전 세계적으로 해결해야 하는 질병의 하나이다. 최근에, 비만에 의해 야기되는 여러 대사성 질환의 치료제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 천연물질로부터 항비만 효능의 생리활성물질 탐색 및 생물학적 기전분석에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다 [Hwang et al., Biochem Biophys Res Commun, 2007. 364(4): p.1002-8]. 대사성 질환(metabolic disease 또는 metabolic syndrome)은 비만(obesity), 제 2형 당뇨병(type 2 diabetes), 고혈압(hypertension), 심장혈관 질환(cardiovascular disease) 및 고지혈증 등의 특징을 나타내면서 급격히 확산되고 있다. 이들 대사성 질환은 과도한 지질 섭취와 운동 부족으로 인한 지질 항상성의 이상과 깊은 연관이 있다.

퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체(peroxisom proliferator activated receptor; 이하 "PPAR"이라고 약칭함)는 일종의 핵 전사인자 수용체(nuclear receptor) 단백질로 알려져 있다. 먼저, 퍼옥시좀(peroxisome)은 세포내 미세기관으로서 산화 작용에 관여하고 간과 신장에 풍부하게 존재하며 세포 내 지방산을 산화시키고 과산화수소를 만들어 독성물질을 중화시킨다. 또한, 산화효소인 카탈라제(catalase)를 이용하여 과다하게 생성된 과산화수소를 물과 산소로 분해하는 기능도 가진다. 활성화된 PPARγ는 지방 생성과정(lipogenesis)에서 중요한 유전자들의 발현을 증가시키고, 지방세포의 분화와 관련된 유전자들의 발현도 증가시키면서 지방세포의 지질방울들을 증가시킨다. AMPK 경로는 당 및 지질 항상성, 체중, 음식섭취, 인슐린 signaling에 중요한 역할을 수행하므로, 대사성 질환 조절제 개발의 타깃이 된다 [Nam et al., Arch Biochem Biophys, 2008. 479(1): p.74-81]. 따라서 비만 당뇨 등의 대사성 질환 치료를 위해선 AMPK와 PPARγ 경로 조절제 개발이 필요하다.

PPAR은 세포 내에서 파트너인 RXR과 결합하여 헤테로다이머를 이루면서 특이적인 유전자 결합부위인 PPRE (PPAR response elements)에 부착한다. 이러한 PPAR 복합체는 전사조절인자 또는 활성보조인자(transcriptional factor 또는 co-activator)들과 복잡하게 결합하여 목적 유전자의 전사를 촉진시키는 전사활성 조절자(transcriptional regulator)로 작용한다. 이와 같은 기작은 PPAR과 특이적으 로 결합하는 친지질 소분자 리간드(hydrophobic low molecule 또는 angonist)의 존재 유무에 따라 그들의 전사 활성이 조절되는 것이다. 실제로 PPAR 단백질이 현재 알려져 있는 리간드인 불포화지방산, 예를 들어 리놀렌산(linoleic acid) 또는 Wy14,643 등의 물질들과 결합하는 경우 PPAR 단백질 자체의 형태 전환으로 인해 그의 활성 보조 인자인 스테로이드 수용체 SRC-1 (steroid receptor co-activator-1), 전사 인자 TIF-2 (transcriptional intermediary factor-2) 및 p300 단백질들과의 결합력이 강해진다. 이들 리간드들은 PPAR 단백질의 세포 내 생명력(half life)을 증가시킬 뿐만 아니라 이러한 활성보조인자들과의 결합을 촉진하여 목적 유전자의 전사를 더욱 더 상승시킨다. 이와 같이 PPAR 단백질과 전사활성의 보조단백질들 간의 결합력을 향상시킬 수 있는 물질들은 PPAR의 아고니스트(agonist) 또는 리간드(ligand)라고 일컫는데, 현재 비만, 당뇨 및 고지혈증 등을 포함한 각종 대사성 질환의 개선제, 항염증제 그리고 항암제 등으로 사용될 수 있는 가능성이 있으므로 주목받고 있다 [Furuyashiki et al., Biosci Biotechnol Biochem, 2004. 68(11): p. 2353-9].

지방전구세포가 지방세포로의 분화과정에는 당, 지질 대사에 있어 중요한 역할을 하는 PPARγ의 활성화 및 에너지 대사를 조절함으로써 대사성 질환의 핵심요인이 되는 AMPK 신호전달 체계가 관여한다. 지방세포로 분화시키면서 지방세포 분화억제인자를 처리하면 세포질 내의 지방방울형성 및 PPARγ의 발현이 저해되는 것을 확인할 수 있다. 또한, PPARγ와 함께 지방세포의 분화에 핵심전사조절 인자로 작용하는 C/EBPα의 발현 역시 감소된다. 지방세포 분화의 초기단계에 활성화되며 PPARγ와 C/EBPα를 활성화시키는 인자인 C/EBPβ와 C/EBPδ, 그리고 Pref-1 역시 발현이 감소된다. 이들 전사인자의 발현억제는 다양한 특이적인 지방세포분화 마커 유전인자(aP2, SREBP-1, FAS)의 발현에도 영향을 끼친다. 지방세포 분화과정에서 AMPK 역시 활성화인자의 경우, AMPK활성화에 관련된 GLUT-4와 Leptin의 발현뿐만 아니라 당의 흡수도 증가한다.

예로부터 한국, 중국, 일본을 포함한 아시아 국가에서는 마늘이 식량으로 재배되어 왔으며, 마늘의 항염증, 항암효과에 대해서는 이미 밝혀진 바가 많다 [Yin et al., Endocr Metab Immune Disord Drug Targets, 2008. 8(2): p. 99-111]. 치아크레모논(thiacremonone)은 최근 마늘로부터 새로이 분리된 유황화합물로서, 지방세포의 분화와 관련된 생물학적 활성에 대해 보고된 바 없기에, 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화과정에 있어서 치아크레모논의 생물학적 기전에 대해 조사하였다.

한국특허등록 제10-0900453호에는 마늘에서 기능성 물질인 치아크레모논의 함량증가 방법이 개시되어 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 대사성 질환을 개선 또는 치료하는 의약 후보 물질을 개발하기 위하여 계속 노력한 결과, 마늘로부터 분리한 황함유 화합물인 치아크레모논이 지방세포에서 특이적으로 PPARγ 및 AMPK의 활성을 조절하여 중성지방 축적억제 및 당뇨조절을 유도함으로써 대사성 조절 효능을 갖는다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 치아크레모논(thiacremonone) 화합물 또는 이를 함유하는 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 치아크레모논(thiacremonone) 화합물 또는 이를 함유하는 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 지방세포에서 특이적으로 PPARγ, FAS 및 AMPK의 활성을 조절하여 지방축적억제 및 당뇨조절을 유도함으로써 대사성조절 효능을 갖는 치아크레모논을 유효성분으로서 함유함으로써 대사성 질환의 예방 또는 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 치아크레모논(thiacremonone) 화합물 또는 이를 함유하는 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

본 발명의 약학 조성물에서, 상기 대사성 질환은 비만, 당뇨병, 고혈압, 심장혈관 질환 또는 고지혈증일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 치아크레모논(thiacremonone) 화합물 또는 이를 함유하는 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품에서, 상기 대사성 질환은 비만, 당뇨병, 고혈압, 심장혈관 질환 또는 고지혈증일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

마늘의 항염증, 항암 효과에 대해서는 이미 밝혀진 바가 많지만 본 발명은 마늘로부터 새로이 분리된 물질인 치아크레모논의 지방전구 세포의 지방세포로의 분화과정에 있어서 치아크레모논의 생물학적 활성에 관한 것이다. 지방전구세포가 지방세포로의 분화과정에는 당, 지질 대사에 있어 중요한 역할을 하는 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체 (peroxisom proliferator activated receptor; 이하 "PPAR"이라고 약칭함)의 활성화 및 에너지 대사를 조절함으로써 대사성 질환의 핵심요인이 되는 AMPK 신호전달 체계가 관여한다. 지방전구세포를 지방세포로 분화시키면서 치아크레모논을 함께 처리한 결과, 세포질 내의 지방방울형성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 지방세포의 분화에 핵심전사조절 인자로 작용하는 PPAR 및 C/EBPα의 발현 및 다양한 특이적인 지방세포분화 마커 유전인자(aP2, SREBP-1, FAS)의 발현도 감소시킬 뿐만 아니라 치아크레모논은 지방세포 분화과정에서 AMPK 역시 활성화시켰으며, 이와 연관된 GLUT-4와 Leptin의 발현이 증가하고 당흡수를 도와주는 효과를 나타낸다. 이와 같은 대사성 질환 등을 개선 또는 치료하는 식의약 후보물질의 용도에 관한 것이다.

지방전구세포가 지방세포로의 분화과정에는 당, 지질 대사에 있어 중요한 역할을 하는 PPARγ의 활성화 및 에너지 대사를 조절함으로써 대사성 질환의 핵심요인이 되는 AMPK 신호전달 체계가 관여한다. 지방전구세포를 지방세포로 분화시키면서 치아크레모논을 함께 처리한 결과, 세포질 내의 지방방울형성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다. PPARγ의 발현 정도를 확인해 본 결과, 치아크레모논을 처리한 군에서 농도 의존적으로 PPARγ의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, PPARγ와 함께 지방세포의 분화에 핵심전사조절 인자로 작용하는 C/EBPα의 발현 역시 감소함을 확인하였다. 지방세포 분화의 초기단계에 활성화되며 PPARγ와 C/EBPα를 활성화시키는 인자인 C/EBPβ와 C/EBPδ, 그리고 Pref-1 역시 발현이 감 소하는 것을 확인할 수 있었다. 이들 전사인자의 발현억제는 다양한 특이적인 지방세포분화 마커 유전인자(aP2, SREBP-1, FAS)의 발현에도 영향을 끼치는 것을 확인하였다. 치아크레모논은 지방세포 분화과정에서 AMPK 역시 활성화시켰으며, 이와 연관된 GLUT-4와 Leptin의 발현뿐만 아니라 당의 흡수도 증가되는 것을 확인하였다. 또한, db/db동물모델을 이용한 실험결과, 치아크레모논을 투여한 그룹의 체중증가량이 대조군과 비교하였을 경우 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 간 조직 관찰 결과에서도 지방의 축적이 감소된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 연구는 치아크레모논이 비만뿐만 아니라 이로 인해 야기되는 당뇨, 지방간과 같은 대사성 질환에 대한 치료제로서 유용하게 작용할 것으로 사료된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 치아크레모논(thiacremonone) 화합물 또는 이를 함유하는 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 조절용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명자들은 천연물로부터 대사성 질환 조절효능을 갖는 화합물을 찾기 위해 연구 노력한 결과, 마늘로부터 분리한 황함유 화합물인 치아크레모논이 지방세포에서 특이적으로 PPARγ 및 AMPK의 활성을 조절하여 중성지방 축적을 억제하고 당 수송인자 (GLUT-4)의 발현을 유도함으로써 지방세포 특이적인 대사성 질환 조절 효능을 갖는다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 "치아크레모논"은 가열 처리한 마늘의 즙으로부터 분획된 항산화 활성을 갖는 분획으로부터 분리된 화합물이다 [Hwang et al., Food Science and Biotechnology, 2007. 16(6): p. 963-66]. 치아크레모논 화합물은 균류인 Acremonium sp. 균주 HA33-95가 생성할 수 있는 것으로도 알려져 있으며 동물세포의 분화를 유도할 수 있다고도 보고되어 있다 [Gehrt et al., Nat Prod Lett . 2000; 14: 281284].

본 발명은 치아크레모논 화합물의 대사성 질환 조절제로서의 효능에 관한 새로운 용도를 제공한다. 본 발명의 조성물의 유효성분인 치아크레모논은 정상세포에는 영향을 미치지 않고 지방세포에서만 특이적으로 PPARγ 및 AMPK의 활성을 조절하여 중성지방 축적을 억제하고 당의 흡수개선을 유도한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 대사성 질환 조절제로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명은 (a) 약학 유효량의 치아크레모논; 및 (b) 약학으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 의한 개선, 예방 또는 치료 대상 질병인 "비만(obesity)"은 지방세포가 분화하면서 중성 지방이 축적되는 특성, 이로 인한 아디포카인의 생성, 아디포카인에 의한 인슐린 내성에 의한 질병을 총칭하는 의미이다.

바람직하게는, 본 발명의 조성물은 비만 당뇨 등의 대사성 질환의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어“치료”는 (ⅰ) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (ⅱ) 질환 또는 질병의 경감; 및 (ⅲ) 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.

본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약학으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다양한 방법으로 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.01-1000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분인 치아크레모논의 농도는 치료목적, 환자의 상태, 필요기간, 질환의 위중도 등을 고려하여 결정하며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품, 특히 기능성 식품조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품조성물은 식품제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 치아크레모논 화합물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클 로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 기능성 식품 조성물은 비만 당뇨 등의 대사성 질환의 예방 및 치료에 매우 유용하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

샘플 준비

마늘(Allium sativum L.)을 2006년 6월에 충청북도 농수산물 시장에서 구입하여 -20℃에서 보관하였다. 열처리는 온도 및 압력 조절 장치(Jisico, 서울, 대한민국)를 사용하여 행하였다. 샘플들은 120, 130 및 140℃에서 2시간 동안 열처리하였다. 가열한 마늘 샘플의 즙을 만들고 이를 진공 하에서 부흐너(B) 깔때기 상에서 No. 2 와트만 필터 페이퍼를 통해 여과하였다. 마늘 즙을 분석 시까지 -20℃에서 보관하였다.

용매층의 선택

가열된 마늘 즙(heated garlic juice, HGJ)를 극성의 세기가 다른 용매: n-헥산(n-hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄 올(butanol) 및 물(water)을 사용하여 분리 깔때기에서 연속적으로 분획하였다. 용매는 로터리 증발기(Eyela N-1000, Tokyo, Japan)을 사용하여 40℃에서 증발시켰다.

박층 크로마토그래피( TLC )

추출물, 분획물 및 분리된 화합물들의 TLC 분석은 실리카겔 60 F254 글래스 플레이트(0.25 mm 두께, 20 x 20 cm; Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하여 각 샘플에 대해 적합한 용매, 예를 들어 상이한 혼합비율의 디클로로메탄:메탄올 혼합물로 수행하였다. 생성된 밴드들의 위치 확인은 자외선광(254 및 365 nm) 및 10% 바닐린/에탄올 내에서의 20% 황산용액 분무 후에 110℃에서 10분간 오븐에서 가열에 의해 행하였다. 라디칼 소거 화합물의 질적 검출을 위해, TLC 플레이트를 자주빛 백그라운드 상에서 노란색 점을 생성하는 DPPH의 1 mM 메탄올 용액으로 분무하였다.

오픈 컬럼 크로마토그래피 ( open column chromatography )

130℃에서 2시간 동안 처리된 HGJ의 에틸아세테이트 층으로부터의 활성성분 분획을 실리카겔 상에서 컬럼크로마토그래피를 수행하였다. HGJ (2 kg)을 다양한 용매를 사용하여 연속적으로 분획하였다. 에틸아세테이트 추출물(4.8 g)을 실리카겔(Kiesel gel 60, 70-230 mesh; Merck)을 사용하여 오픈-컬럼(500 x 35 mm, i.d.) 크로마토그래피를 행하였고, 용출은 메탄올의 양을 증가시킨 디클로로메탄:메탄올 (20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 0:1, v/v)의 혼합물로 행하였다. 5개의 분획을 얻어 항산화제 활성을 분석하거나, 하나의 주요 분획 A1으로 통합함으로써 TLC에 사용하였다. 활성분획 A1(1.6g)을 실리카겔을 사용하여 추가의 오픈 크로마그래피(300 x 10 mm, i.d.)를 행하였고, 용출은 메탄올의 양을 증가시킨 다양한 디클로로메탄:메탄올(20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 0:1, v/v)의 혼합물을 사용하여 행하였다. 총 24 분획을 얻었고, 이를 항산화제 활성을 분석하거나 4개의 주요 분획, B4-B6으로 통합함으로써 TLC 분석을 하는데 사용하였다. 분획으로부터 용매의 제거는 로터리 증발기를 사용하여 40℃에서 행하였다.

준-분획용 HPLC ( semi - preparative HPLC )

활성분획 B4-B6은 분획용 RP-HPLC (DiscoveryC18 column; 250 x 10 mm, i.d., 5, Supelco, Bellefonte, USA)를 사용하여, UV 검출기가 장착된 Younglin SP930D 기기(Younglin Instrument, Anyang, Korea) 상에서 365 nm, 상온 및 유속 3.5㎖/분의 조건에서 행하였다. 용출의 농도구배는 최초 11분에 대해 물:아세토니트릴 상(phase)의 95:5 (v/v)에서 행하고, 이후 29 분 동안 95:5 로부터 50:50으로 연속적으로 변화시키면서 행하였다. 순수 화합물은 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증발시킨 후에 얻었다.

분리된 화합물의 구조 확인

분리한 화합물의 구조는 다양한 분광방법을 사용하여 결정하였다. 메탄올에 서의 UV 스펙트럼을 분광기(UV-1650; Shimadzu, Kyoto, Japan) 상에서 기록하였다. 적외선(infrared, IR) 스펙트럼은 FT-IR 분광기(IFS-66/FRA106S; Brucker, Karlsruhe, Germany) 상에서 기록하였다. 가스크로마토그래피-질량 분광분석(GC-MS)을 행하였다(Agilent 6890 gas chromatograph/5973N; Agilent, Palo Alto, CA, USA). ¹H NMR (500 MHz), ¹³C NMR (125 MHz), DEPT, HMBC, 및 HMQC 스펙트럼은 용매로서 CD₃OD을 사용하여 분광기(Avance 500, Bruker, Karlsruhe, Gemary) 상에서 수행하였다. 화합물은 무색의 오일형태이었다 (23); [α]²⁵D ± 0 (c 0.1, 메탄올); UV λ_max (메탄올) 365 nm; IR (KBr) ν_max 3350, 2981, 1679, 1601, 1395, 1360, 1252, 1188, 1104, 921, 845, 및 563 cm^-1; GC-MS m/z 160 [M]⁺; ¹H-NMR (CD₃OD, 500 MHz) 및 ¹³C NMR (CD₃OD, 125 MHz).

세포 배양

3T3-L1 지방전구세포는 American Type Culture Collection (Cryosite, Lane Cove NSW, Australia)로부터 구입하였다. 세포는 10% 송아지 혈청 (Bovine calf serum), 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함한 DMEM 배지를 사용하여 5% CO₂로 습화된 공기 중에서 배양하였다. 세포는 80-90% 정도 가량 자랐을 때 계대 배양하였다. 평균적으로 이틀 간격으로 배양하였으며, 총 계대횟수가 20회 를 넘기지 않은 세포를 사용하였다.

세포 생존 분석 ( MTS assay )

3T3-L1 지방전구세포를 100㎕ 배지당 96웰 플레이트 내에서 10⁵ 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 그 뒤 치아크레모논을 농도별로 (6.25, 12.5, 25, 50, 100㎍/㎖) 처리하고, 24, 48, 72시간 동안 배양된 세포들을 이용하여 세포독성 효과를 평가하였다. 간략하게 설명하면, MTS 용액(Promega) 25㎕를 배양한 세포에 첨가한 뒤, 플레이트를 인큐베이트 내에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 발색된 색깔을 마이크로 플레이트 흡광도 리더 (Apolo LB9110, Bertgold Technologies GmbH, Germany)를 사용하여 492nM의 흡광도에서 분석하였다. 각 분석은 세 번 반복 수행하였다.

지방세포 분화유도 및 억제 효과 확인

3T3-L2 지방전구세포를 6웰 플레이트에 2.5x10⁵ 세포/웰로 플레이팅하였다. 세포가 가득찬 포화상태가 될 때까지 약 3-4일을 배양하고, 그 뒤 배지를 제거하고 PBS를 이용하여 세척한 다음 지방세포로의 분화를 유도하는 분화유도물질인 인슐린(10㎍/㎖), 덱사메타손(1μM), 그리고 이소부틸메틸산틴(IBMX, 0.5mM)이 혼합된 분화유도배지(MDI)로 배지를 교환하였다. 이때, 대조군을 제외한 실험군의 경우 치아크레모논을 50, 100㎍/㎖ 의 농도로 처리하였다. 이틀 뒤, 배지를 제거하고 인슐 린(1㎍/㎖)이 들어간 배지로 갈아주고 치아크레모논을 이전과 동일한 농도로 처리하였다. 이틀 뒤, 배지를 제거하고 새로운 배지로 갈아주면서 샘플을 함께 처리하였고, 이러한 방식으로 8일 동안 분화를 유도한 뒤 지방 특이적 염색약(Oil Red O)을 이용하여 지방세포 내의 지방방울 축적 정도를 확인하였다.

루시퍼레이즈 어세이를 이용한 PPAR γ의 활성 정도 확인

HEK293 인간 신장세포주(1.5 x 10⁵ 세포/㎝²)를 24-웰 플레이트에 플레이팅하고, 제조자(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 설명서에 따라 플라스미드와 LIPOFECTAMINE²⁰⁰⁰ 혼합물을 사용하여 PPRE와 PPARγ를 일시적 형질전환(transient transfection)시켰다. 형질전환된 세포들을 PPARγ의 활성유도제인 troglitazone과 함께 또는 단독으로 서로 다른 농도의 치아크레모논을 처리하였다. 24시간 뒤 세포를 수확하여 용해시키고 세포 내의 루시퍼레이즈의 활성을 측정하였다. 루시퍼레이즈 활성은 제조자(WinGlow, Bad Wildbad, Germany)의 지시에 따라 루시퍼레이즈 분석 키트(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 측정하였다.

중합 연쇄 반응 실험 ( RT - PCR & real time PCR )

분화유도를 마친 세포를 PBS를 이용하여 2번 세정하고, 1ml의 PBS를 첨가하여 세포들을 회수하였다. 회수한 세포는 Easy BLUE를 1ml 첨가하여 세포를 용해시키고, 클로로포름을 첨가한 뒤 원심분리시켜, 상층액을 회수하고, 회수한 용액에 이소프로판올을 첨가한 뒤 다시 원심분리시켜 RNA를 침전시켰다. 세포로부터 분리된 RNA를 주형으로 역전사효소(reverse transcrpitase)와 Oligo dT를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 각각의 특이적 프라이머를 통해 중합연쇄반응단계를 거쳐, 그 유전자의 발현 정도를 아가로즈 젤에 전기영동하여 확인하였다. 또한, real time PCR을 통해 유전자의 발현정도의 차이를 수치화하여 확인하였다.

웨스턴 블랏 분석

배양한 세포를 1X PBS로 2회 세정하고, 1 ㎖의 PBS를 첨가한 후, 세포들을 회수하였다. 세포들을 용해 버퍼[50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.02% 소디엄 아지드(sodium azide), 0.2% SDS, 1mM PMFS, 10㎕/㎖ 아프로티닌, 10 mM NaF, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 및 0.5% 소디엄 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate)]로 1시간 동안 균질화하고, 12,000 rpm에서 30 분간 원심분리 하였다. 단백질 농도는 Bradford 방법(Bio-Rad Protein Assay; Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA)에 의해 측정하고, 동일한 양의 단백질(50㎍)을 SDS/폴리아크릴아마이드 겔 상에서 분리한 후, Hybond ECL 니트로셀룰로오스 멤브레인(Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA)으로 이동시켰다.

블롯을 0.05% Tween-20을 포함하는 트리스버퍼염수용액(Tris buffered saline) [10 mM Tris (pH 8.0) 및 150 mM NaCl]에 녹인 5%(w/v) 건조 탈지유로 상온에서 2시간 동안 블록킹하였다. 멤브레인을 하기의 특정 항체와 함께 상온에서 5 시간동안 인큐베이션하였다: PPARγ 항체, C/EBPα 항체, SREBP-1 항체, (Santa Cruz) FAS 항체, AMPK 항체, 그리고 인산화된 AMPK 항체 (Cell Signaling). 희석 배율은 5% 건조 탈지유에 1000:1 로 희석하였다.

이어서, 블롯을 대응하는 컨쥬게이트된 항-레빗 및 항-마우스 면역글로불린 G-호오스 래디쉬 퍼옥시다아제와 함께 인큐베이션 시켰다(1:3,000 희석, Santa Cruz Biotechnology Inc.). 면역반응성 단백질을 ECL 웨스턴 블롯팅 검출시스템으로 측정하였다.

당 흡수 측정( Glucose Transport Assay )

10% FBS를 함유하는 DMEM에 배양한 3T3-L1 지방세포에 치아크레모논을 2시간 처리 후 포도당(5mM)과 소혈청알부민(BSA; 1 g/l)을 함유하는 Krebs Ringer phosphate buffer (KRP) 3.0 ml로 세척하고 20mM cytochalasin B 존재 하에 37℃에서 배양하였다. 인슐린(100 nM)을 처리하고 [³H]2-deoxyglucose (0.2mM, 0.2m Ci)로 10 분간 더 처리하였다. 차가운 PBS로 세척하여 당 흡수를 멈추고 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS)로 세포를 용해한 후 radioactivity를 측정하였다.

치아크레모논의 인 비보( in vivo )에서의 항비만 효과

인 비보에서의 치아크레모논의 체중, 지방간, 중성지방 및 당 조절기능 효과를 알아보기 위해, db/db 마우스에 치아크레모논을 처리한 후 마우스 혈청에서의 중성지방 및 당 변화량을 측정하였다. 치아크레모논은 3주 동안 음용수에 10, 30 mg/kg 농도로 희석되어 처리되었다. 마우스의 간 조직 내에 지방의 축적을 관찰하기 위해 헤마톡실린&에오신으로 염색을 하여 관찰하여, 치아크레모논을 처리한 군에서 간 조직 내의 지방의 축적이 감소여부를 확인하였다. 또한 3주 동안 치아크레모논 처리 후 중성지방 및 당 변화량을 생화학적 지표 측정방법을 이용하여, 치아크레모논을 처리한 군의 혈청에서의 중성지방 및 당 수치 등을 측정하였다.

실시예 1: 용매 분획물의 항산화제 활성 및 가열처리 마늘로부터의 활성 화합물의 분리

마늘의 최적 가열 조건은 130℃에서 2시간 동안 가열하는 것으로 결정하였다. 120, 130, 및 140℃에서 2시간 동안 열처리한 HGJ로부터 활성 화합물을 분리하고 헥산(hexane), 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물에서 연속적으로 분획하였다. 자유 라디칼(DPPH 및 ABTS 라디칼)의 소거에 대한 화합물의 능력에 기초한 화학 분석을 사용하였다.

에틸아세테이트 분획의 항산화제 활성이 헥산, 클로로포름, 부탄올 및 물 분획의 것에 비해 우수하였다. 130℃에서 2시간 동안 열처리한 HGJ의 에틸아세테이트 분획이 다른 가열 조건의 것보다 강한 항산화제 활성을 나타내었다. 따라서 130℃에서 2시간동안 열처리한 HGJ의 에틸아세테이트 분획에서 활성 화합물을 분리 및 정제하였다.

2 kg의 130℃에서 2 시간 동안 가열된 마늘의 4.8g의 에틸아세테이트 분획을 실리카겔 상에서 활성-가이드된(activity-guided) 반복 분획법을 수행하였고, 디클 로로메탄내에서 메탄올의 농도를 증가시키면서 용출시켰다. 실리카겔 크로마토그래피에 의해 하나의 활성분획 A1을 얻었다. 활성분획 A1을 실리카겔 크로마토그래피(디클로로포름메탄:메탄올)를 사용하여 재정제하여 3개의 활성 분획, B4-B6을 얻었다. 이어서 B4-B6으로부터 C18 컬럼상에서 준-분획용 HPLC를 사용하여 활성 화합물을 분리하였다. 분리한 화합물의 화학구조는 분광학적 방법으로 확인하였다.

실시예 2: 분리 화합물의 확인

얻어진 화합물은 무색 오일의 형태이었다. GC-MS 스펙트럼에 의해 m/z 160에서 분자 이온 피크를 나타내었는데, 이는 분자식 C₆H₈O₃S에 해당하는 것이다. 화합물의 UV 및 IR 스펙트럼 분석에 의해 a 위치에 산소로 치환된 β-불포화 케톤 및 β위치에 황이 존재함을 확인하였다 [Hwang et al., Food Science and Biotechnology, 2007. 16(6): p. 963-66]. ¹H NMR 스펙트럼에 의해 d 1.63 및 d 2.18에 2개의 4차 메틸기에 대응하는 시그널을 얻었다. ¹³C NMR 및 DEPT 스펙트럼에 의해 화합물 분자가 d 14.9 및 d 27.1 위치에서 2개의 메틸기로 이루어지는 6개의 탄소원자, d 139.8 및 d 148.3 위치에서 2개의 올레핀 탄소, d 199.1 위치에서 케톤 시그널, 및 d 85.7 위치에서 4차 산소-함유 탄소를 갖는다는 것을 확인하였다. 이는 화합물이 3-티페논환(3-thiphenone ring)을 갖는다는 것을 암시한다. d 2.18와 d 148.3 (C-4) 및 d 138.8 (C-5)에서의 다른 메틸 시그널 사이뿐만 아니라, d 1.63 및 d 85.7 (C-2) 및 d 199.1 (C-3)에서의 메틸 시그널 사이의 HMBC 상관관계 에 기초하여, 2개의 메틸기는 C-2 및 C-5에 위치하는 것으로 확인하였다.

최종적으로, 130℃에서 2시간 동안 열처리한 HGJ로부터 분리한 활성 화합물은 치아크레모논(thiacremonone, 2,4-dihydroxy-2,5-dimethyl-thiophene-3-one)으로 확인하였다. HPLC 분석에 의하면, 치아크레모논은 가공하지 않은 마늘의 즙으로부터는 검출되지 않았으며 가열된 마늘즙에서만 검출되었다. 또한, 치아크레모논은 균류(fungus)인 Acremonium sp . 균주 HA33-95으로 부터 분리되었고 동물세포의 분화 유도자로 알려져 있다 [Gehrt et al., Nat Prod Lett . 2000; 14: 281284].

실시예 3: 화합물

마늘로부터 분리한 본 발명의 조성물의 유효 성분인은 치아크레모논(thiacremonone)임을 확인하였다(화학식 1 참조). 상기 치아크레모논 화합물을 0.1% DMSO에 용해시켜 30-150 ㎍/㎖의 용량으로 치료에 사용하였다.

실시예 4: 치아크레모논은 지방세포의 분화와 지방의 축적을 억제하였다.

3T3-L1은 쥐의 줄기세포의 일종인 지방전구세포로, 지방세포로의 분화와 관련되어 비만연구에 많이 사용되고 있다. 치아크레모논이 지방세포의 분화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 우선, 치아크레모논의 세포독성을 확인하였다. 그 결과 치아크레모논은 지방세포의 생존률에는 아무런 영향을 끼치지 못하였다 (도 1a). 분화유도배지(MDI)를 이용하여 지방세포의 분화를 유도하면서 농도별로 치아크레모논을 처리하여 지방세포로의 분화정도를 관찰하였다. 분화를 유도한 지 8일 째, 배지 를 제거한 뒤, PBS 로 2회 세정해 주고 0.5% 글루타르알데하이드를 이용하여 상온에서 1시간 동안 세포를 고정시켰다. 다시 상층액을 제거하고 PBS로 2회 세정한 뒤, 지방세포 내의 지방방울을 특이적으로 염색하는 염색시약(Oil Red O)을 이용하여 상온에서 1시간 동안 염색하였다 (도 1b). 그 결과 치아크레모논이 농도 의존적으로 지방세포의 분화를 억제하는 것을 관찰하였다. 지방세포 내의 염색된 지방방울을 100% 이소프로파놀을 처리하여 녹여 낸 뒤, 그 정도를 스펙트로미터를 이용하여 흡광도 510nm에서 측정하여 그 정도를 수치화하였다. 그 결과 치아크레모논 100㎍/㎖을 처리한 군의 지방방울 축적률이 대조군에 비해 약 40.3% 가량 감소하는 것을 확인하였다(도 1c). 이러한 결과는 치아크레모논이 지방세포자체의 수를 감소시키지는 않지만, 지방세포로의 분화를 억제함으로써 비만을 예방하거나 억제하는데 효과적인 물질임을 나타낸다.

실시예 5: 치아크레모논은 PPAR γ의 전사활성과 유전자 발현을 억제하였다.

PPARγ는 지방세포의 분화에 있어 잘 알려진 표지인자이다. 그렇기 때문에, 치아크레모논이 지방세포의 분화를 억제하는 기작에 있어 PPARγ의 활성에 영향을 미치는지를 확인하기 위하여, PPARγ에 의해 조절되어지는 루시퍼레이즈 리포터 컨스트럭트(Construct)와 PPARγ가 들어간 벡터를 HEK293 세포에 일시적으로 형질전환시키고, 이어서 형질전환된 세포들은 PPARγ의 활성제로 잘 알려진 Troglitazone과 치아크레모논을 단독 또는 함께 처리하였다. 그 결과 치아크레모논은 단독으로 처리한 경우에는 PPARγ의 전사활성에 있어 아무런 영향을 미치지 않았지만, 함께 처리한 경우 Toglitazone에 의해 활성화되었던 PPARγ를 농도 의존적으로 억제시키는 것을 확인할 수 있었다 (도 2a). RT-PCR을 통한 결과에서도 치아크레모논이 대조군에 비해 PPARγ의 mRNA 발현 정도를 억제하는 것을 확인할 수 있었다 (도 2b). 이러한 결과는 치아크레모논의 항비만 효과가 지방세포의 분화에 있어 중요한 역할을 하는 PPARγ의 발현을 조절함으로써 일어난 것을 나타낸다.

실시예 6: 치아크레모논은 지방세포의 분화 초기 단계에 영향을 미친다.

치아크레모논에 의한 지방세포의 분화 억제가 지방세포 분화 중 어느 단계에서 일어나는지를 확인하기 위하여, Real time PCR 방법을 이용하였다. 지방세포의 분화 과정은 다양한 전사인자들이 순차적으로 발현되면서 진행된다. 지방전구세포가 분화유도물질에 의해 자극을 받으면 C/EBPβ와 C/EBPδ가 활성화되고, 이들은 지방세포의 분화 초기 단계에 관여하여 C/EBPα와 PPARγ의 활성을 유도한다. 지방세포의 분화를 유도하면서 치아크레모논을 처리한 세포들을 초기단계(분화 유도 2일)에서 수확하여 전사인자의 발현 정도를 Real time PCR 로 분석해 본 결과, C/EBPβ와 C/EBPδ가 치아크레모논에 의해 그 발현 정도가 감소하는 것이 관찰되었다. 또한, 이들에 의해 조절되는 C/EBPα와 PPARγ의 발현 역시 감소하는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 지방전구세포의 표지인자인 Pref-1은 지방세포로 분화되면서 그 발현이 감소하는데, 치아크레모논을 처리한 그룹에서 이 인자의 발현이 다시 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3). 이러한 결과는 치아크레모논이 지방세포의 분화를 초기단계에 관여함으로써 지방세포분화를 억제하는 것을 나타낸다.

실시예 7: 치아크레모논은 지방세포 분화 관련 인자의 발현을 조절하였다.

C/EBPα와 PPARγ는 지방세포분화와 지방대사, 당대사에 있어 중요한 핵심인자이다. 이들은 지방세포분화에 영향을 미치는 다른 표지인자들의 활성을 조절한다. 치아크레모논에 의한 지방세포의 분화억제에 있어 지방세포분화 관련 인자들의 발현 정도를 mRNA 수준과 단백질 발현수준에서 알아보았다. 치아크레모논은 C/EBPα와 PPARγ 뿐만 아니라 aP2, SREBP-1, FAS와 같은 표지인자의 발현을 저해시켰다 (도 4a). 이러한 결과는 단백질 발현 수준에서도 유사하게 나타났다 (도 4b). 반면, 당대사와 식욕조절에 관여하는 GLUT4와 렙틴의 경우 그 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4a). 이러한 결과는 치아크레모논이 지방세포로의 분화 관여 인자는 그 발현을 감소시켜 항비만 효과를 나타낼 뿐 만 아니라, 당대사에 관련된 인자의 발현은 증가시킴으로써 당뇨와 관련된 대사성 질환의 치료를 향상시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 8: 치아크레모논은 AMPK 를 활성화시켰다.

AMPK는 비만과 당뇨와 같은 대사성 질환에서 중요한 인자로써 잘 알려져 있다. AMPK의 활성화는 당의 수송과 지방산의 산화 등을 유도한다. 앞선 실험에서 치아크레모논이 당 수송관련 인자인 GLUT-4와 에너지 항상성에 관련된 렙틴의 발현을 증가시켰기에, 치아크레모논이 AMPK의 활성에 영향을 미치는지를 확인하였다. 그 결과 치아크레모논은 지방세포에서 억제되었던 AMPK의 활성을 증가시켰다 (도 5a). 또한, AMPK 억제제를 처리한 경우 억제되었던 AMPK의 활성 역시, 치아크레모논 처리 시 회복되는 것을 관찰할 수 있었다 (도 5b). 이러한 결과는 치아크레모논이 AMPK를 조절함으로써 지방세포의 분화를 억제한다는 것을 나타낸다.

실시예 9: 치아크레모논은 인슐린에 의한 당 흡수를 활성화시켰다.

앞선 실험에서 치아크레모논이 당 수송관련 인자인 GLUT-4와 에너지 항상성에 관련된 렙틴의 발현을 증가시켰기에, 치아크레모논이 당 흡수의 활성에 영향을 미치는지를 확인하였다. 그 결과 치아크레모논은 지방세포에서 인슐린과 함께 처리 시 인슐린에 의한 당 흡수의 활성을 증가시켰다 (도 6).

실시예 10: 치아크레모논은 인 비보( in vivo )에서도 항비만 효과를 나타냈다.

인 비보에서의 치아크레모논의 항비만 효과를 알아보기 위해, db/db 마우스에 치아크레모논을 처리한 후 마우스의 체중 변화량을 측정하였다. 치아크레모논은 3주 동안 음용수에 10, 30mg/ml의 농도로 희석되어 처리되었다. 3주 동안의 체중 변화량을 관찰한 결과, 대조군은 지속적으로 체중이 증가하는 반면 치아크레모논을 처리한 군은 체중의 증가량이 대조군에 비해 적거나, 거의 증가하지 않았다 (도 7a). 마우스의 간 조직 내에 지방의 축적을 관찰하기 위해 헤마톡실린&에오신으로 염색을 하여 관찰한 결과 역시, 치아크레모논을 처리한 군에서 간 조직 내의 지방의 축적이 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (도 7b). 이러한 결과는 치아크레모논 이 세포수준에서의 결과와 동일하게 동물모델에서도 지방의 축적을 억제한다는 것을 보여주는 것이다.

실시예 11: 치아크레모논은 인 비보( in vivo )에서 중성지방( Triglycerol ) 억제 및 당 흡수 개선효과를 나타냈다.

인 비보에서의 치아크레모논의 중성지방 억제 및 당 조절기능 효과를 알아보기 위해, db/db 마우스에 치아크레모논을 처리한 후 마우스 혈청에서의 중성지방 및 당 변화량을 측정하였다. 치아크레모논은 3주 동안 음용수에 10, 30mg/ml 의 농도로 희석되어 처리되었다. 3주 동안의 중성지방 및 당 변화량을 관찰한 결과, 대조군에 비해 치아크레모논을 처리한 군은 혈청에서의 중성지방 및 당 수치가 감소하였다 (도 8).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 치아크레모논이 3T3-L1 세포의 생존률과 지방세포분화에 미치는 영향을 실험한 결과를 보여준다.

도 1a: 세포 생존능(viability)에 대한 실험결과를 보여준다. 24시간 동안 치아크레모논을 농도별 (6.25-100 ㎍/㎖)로 3T3-L1 세포에 처리한 다음 MTS 용액을 첨가하여 그 생존률을 측정하였다.

도 1b: 치아크레모논이 지방세포분화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 3T3-L1 세포의 분화를 유도한 뒤 세포 내에 축적된 지방방울을 Oil Red O 염색약을 이용하여 염색하여 그 분화 정도를 나타내었다. 상위 그림은 현미경하에서 관찰(확대비율, x 200)한 결과이며, 아래는 염색 정도의 차이를 나타내기 위해 스캔을 한 것이다. 대조군은 분화를 유도하지 않은 지방전구세포이다.

도 1c: 세포 내의 지방방울을 염색한 시약을 이소프로판올로 녹여낸 뒤, 그 흡광도를 스펙트로미터를 이용하여 측정하였다.

도 2는 치아크레모논이 PPARγ의 전사인자 수준에서의 활성과 mRNA 수준에서의 발현에 미치는 영향을 실험한 결과를 보여준다.

도 2a: 치아크레모논에 의한 PPARγ의 전사인자 수준에서의 활성을 측정하기 위하여 인간 신장세포주인 HEK293을 PPARγ와 리포터 유전자가 들어간 벡터(PPRE-Luc)를 일시적으로 형질전환시킨 뒤, 치아크레모논과 트로글리타존을 단독 또는 함께 24시간 동안 처리하였다.

도 2b: mRNA 수준에서의 PPARγ의 발현을 확인하기 위해 분화유도를 마친 3T3-L1 세포를 수확한 뒤 RNA를 분리 정제하여 PPARγ 에 대한 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 사용된 RNA의 농도는 10㎍이며, GAPDH는 내부 대조군으로 사용되었다.

도 3은 치아크레모논이 지방세포의 분화단계에 있어 초기단계에 관여하는 전사인자의 발현을 조절한다는 실험결과를 보여준다. 지방세포로 분화를 유도하는 과정에서 초기단계(분화유도 2일)에 세포를 수확한 다음 RNA를 분리 정제하였다. real time PCR 용 프라이머를 제작하여, 분화 초기단계에 영향을 미치는 전사인자들의 발현 정도를 확인하였다.

도 4는 지방세포의 표지인자들이 치아크레모논에 의해 조절되는 결과를 보여준다.

도 4a: 지방세포 표지인자들의 mRNA 수준에서의 발현을 보여준다. 분화유도를 마친 3T3-L1 세포를 수확한 뒤, RNA를 분리 정제하였다. 각각의 특이적 표지인자들에 대한 프라이머를 이용하여 RT-PCR 을 수행하였다. GAPDH는 내부 대조군으로 사용되었다.

도 4b: 지방세포 표지인자들의 단백질 수준에서의 발현을 보여준다. 3T3-L1 세포를 수확한 뒤, 용해제를 이용하여 단백질을 분리하였다. 총 단백질의 동등한 양 (100㎍/레인)의 농도를 사용하였고, 각각의 특이적인 항체를 5% 탈지분유에 1000:1로 희석하여 반응시켜 웨스턴 블롯팅으로 측정하였다. β-tubulin은 내부 대조군으로 사용하였다.

도 5는 치아크레모논이 AMPK의 활성에 미치는 영향을 보여준다.

도 5a: 지방세포에서 치아크레모논에 의해 AMPK의 활성이 농도 의존적으로, 시간 의존적으로 증가되는 것을 보여준다. 총 AMPK는 대조군으로 사용되었다.

도 5b: AMPK 억제제에 의해 억제되었던 AMPK의 활성이 치아크레모논에 의해 복구되는 것을 보여준다. AMPK 억제제(Compound C)를 20μM 전 처리한 뒤, 치아크레모논을 6시간 동안 처리하였다. 총 AMPK는 대조군으로 사용되었다.

도 6은 인슐린에 의한 당 흡수 활성에 미치는 영향을 보여준다.

인슐린 처리한 지방세포에서 치아크레모논에 의해 당 흡수의 활성이 농도 의존적으로 증가되는 것을 보여준다.

1. 대조군, 2. 인슐린(100nM), 3. 치아크레모논(0.1mg/mL), 4. 치아크레모논(0.1mg/mL)+인슐린(100nM), 5. 치아크레모논(0.2mg/mL), 6. 치아크레모논(0.2mg/mL)+인슐린(100nM), 7. 치아크레모논(0.4mg/mL), 8. 치아크레모논(0.4mg/mL)+인슐린(100nM)

도 7은 치아크레모논이 인 비보( in vivo ) 에서의 비만 억제 효과를 보여준다.

도 7a: 치아크레모논을 10, 30 mg/ml의 농도로 음용수에 희석하여 db/db 마우스에 3주간 처리하였다. 몸무게의 변화량은 겉보기 대조군 그룹(식염수 투여)과 비교하여, 상대적으로 치아크레모논을 처리한 그룹에서 체중 증가량이 감소하는 것을 보여준다.

도 7b: 마우스의 간 조직을 파라핀에 고정하여 표본을 만든 뒤, 헤마톡실린&에오신 시약으로 염색을 하였다. 조직 내의 노란 부분은 간 조직 내에 축적된 지방 을 나타내며, 대조군에 비해 치아크레모논을 처리한 그룹에서 간 조직 내의 축적된 지방량이 감소하는 것을 보여준다.

도 8은 치아크레모논을 10, 30 mg/kg의 농도로 음용수에 희석하여 db/db 마우스에 3주간 처리한 결과이다. 중성지방 및 당의 변화량은 대조군 그룹(식염수 투여)과 비교하여, 상대적으로 치아크레모논을 처리한 그룹의 혈청에서 중성지방 및 당의 수치가 감소하는 것을 보여준다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 치아크레모논(thiacremonone) 화합물 또는 이를 함유하는 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.

[화학식 1]
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하기 화학식 1로 표시되는 치아크레모논(thiacremonone) 화합물 또는 이를 함유하는 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능식품.

[화학식 1]
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