KR101072249B1 - 레플리킨 펩타이드 및 그의 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 구조적 특성을 공유하는 펩타이드의 종류인 레플리킨(Replikin)의 동정 및 이용에 관한 것이다. 본 발명은 빠른 복제에 관련된 새로운 종류의 펩타이드 및 질병의 진단, 예방 및 치료로의 그의 이용을 제공한다.

Description

레플리킨 펩타이드 및 그의 이용{Replikin peptides and uses thereof}
본 출원은 2001년 7월 9일 제출된 임시출원 60/303,396호의 우선권을 주장한 2001년 10월 26일 제출된 미국특허출원 09/984,056 및 09/984,057호의 부분연속출원인 2002년 3월 26일 제출된 PCT 출원 제PCT/US02/09240호의 부분연속출원이다.
본 발명은 구조적 특성을 공유하는 펩타이드의 종류인 레플리킨(Replikin)의 동정 및 이용에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 바이러스, 박테리아, 진균, 암 관련 단백질, 식물 및 단세포성 기생충에서 발견된 레플리킨 및 질병을 치료 또는 예방하는 방법의 개발에서 타겟으로서의 그들의 이용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 질병의 검출에서의 레플리킨의 이용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 식품에 사용되는 식물의 성장을 자극하기 위한 레플리킨의 이용에 관한 것이다.
빠른 복제는 특정한 박테리아, 바이러스 및 말리그닌(malignin)의 독성의 특성이나 다른 생물체 내에서의 빠른 복제에 대한 어떠한 화학적 공통점이 언급되지 않았다. 본 특허 출원은 빠른 복제에 관련된 단백질 구조의 새로운 종류를 개시한다. 레플리킨(Replikin)이라고 명명된, 보존된 작은 단백질의 새로운 패밀리는 다수의 생물체 및 질병에서의 빠른 복제를 예측하고 조절하고, 식물 및 동물에서 빠른 복제를 유도하는데 사용된다.
우리는 레플리킨의 알고리즘 검색을 구조하였다. 여기서 알고리즘을 적용함에 있어서 에피토프가 밝혀진-빠른 복제의 기능이 발명되었을 뿐만 아니라 기능이 빠른 복제에 관련된 레플리킨으로 명명된 상동체의 전체 패밀리가 발견되었다.
알고리즘은 하기를 근거로 한다 : 1) 면역체계가 인식에 있어서 전체 단백질 보다는 부분에 주의한다는 증거. 단백질 체인은 먼저 면역 방어를 개시하게 하는 외부 구조물 인식의 면역체계의 과정의 일부로서 면역체계에 의해 종종 6∼10 아미노산 길이의 더 작은 조각으로 가수분해된다. 예로서 면역체계는 질병 작용제의 단백질을 더 작은 펩타이드 서열로 절단하고 이들을 판독함으로서 질병의 존재를 인식하다. 이러한 원리는 일단 에피토프의 구조가 알려지면 말리그닌 말리그닌 암 에피토프의 상동체를 검색하는 알고리즘의 기초로 사용된다; 2) 리신(K's)의 3분의 2가 8개 잔기 떨여져 있는 말리그닌 에피토프의 특이적 구조는 상기에 나타난(6-10 아미노산 길이) 인식을 위해 면역체계에 의해 사용된 분명한 '규칙'과 일치한다; 3) 말리그닌 암 에피토프가 매우 강한 항원 즉, 강한 면역 반응의 발생기로 보여졌다는 사실; 10-머(mer) 펩타이드 글리오마(glioma) 레플리킨 내에 3개의 리신(K's)이 있고 K's는 바이러스의 진입을 위한 잠재적인 정박물(anchor)로서 종종 DNA 및 RNA에 결합하는 것으로 알려져 있다; 4) 하나의 히스티딘(H)은 8개 잔기 떨어져 있는 2개의 K's 사이에 말리그닌 에피토프의 서열 내에 포함되고 이는 복제에 에너지를 제공하는데 필요한 산화환원반응 시스템의 금속에 대한 결합을 제안한다.
적당히 놓인 기능적 그룹을 지닌 제작된 결합 포켓을 보유한 설계된 효소 및 촉매 항체가 종종 인상적인 효율로 많은 화학적 변환을 촉매하는데 성공하였다. 특정하고 완전히 다른 기능을 지닌 2 이상의 별개의 단백질이 인식되어 종종 생물체에 의해 함께 합성되고 개별적으로 분열되어 '그들의 개별적 기능을 착수'하는 것과 같이 레플리킨 구조물은 면역체계에 의해 개별적으로 인식되는 것으로 보이는 독특한 기능을 지닌 독특한 단백질이고 합리적으로 설계 즉, 합성되어 기능적 유니트를 생성한다.
단백질적 관점에서 새롭게 결정된 글리오마 펩타이드 서열에 기초한 이러한 주형은 이러한 복제에서 보존된 구조 및 특정한 기능에 관련된 단백질의 넓은 종류의 발견을 이끌었다. 질병의 독성을 지닌 레플리킨 농도의 증가의 예는 인플루엔자, HIV, 암 및 토마토 잎 컬(curl) 바이러스를 포함한 질병에 나타난다. 이러한 구조물의 종류는 효모, 조류, 식물, 게미니(gemini) 컬 잎 토마토 바이러스, HIV 및 암과 같은 다양한 생물체에서의 빠른 복제의 현상에 관련된다.
빠르게 생물체를 복제하는 레플리킨의 존재를 검출하는 것에 더하여 우리는 1) 레플리킨 농도(100 아미노산 당 레플리킨의 수) 및 2) 빠른 복제에 따라 달라지는 특정한 기능적 상태의 레플리킨 조성은 레플리킨이 그들이 존재하는 생물체의 복제율에 질적으로 뿐만 아니라 양적으로 관련된다라는 발견에 대한 근거를 제공함을 발견하였다. 이러한 기능적 증거의 예는 글리오블라스토마(glioblastoma) 세포 내의 빠른 복제와 독성 사이, 인플루엔자 바이러스 내 레플리킨과 인플루엔자 유행병과 전염병의 예측 사이에서 발견된 관계 및 HIV 내에서 레플리킨 농도와 빠른 복제 사이의 관계를 포함한다.
빠른 복제에서의 레플리킨의 역할에 대한 첫 번째 기능적 근거는 뇌 글리오블라스토마 다형(글리오마)- 250 KD 세포 단백질 내의 말리그닌(Malignin)이라고 불리는 10 KD 펩타이드인 글리오마 레플리킨의 성질에서 발견되었다. 혈청 내 항말리그닌 항체(AMAS) 농도가 증가되었고, 암에 대한 초기 단계 진단 시험에 의해 측정되었고 대부분 또는 모든 세포 타입에 대해 사용되었다. 말리그닌은 조직 배양 내에서 밀리그램 멤브레인 단백질 당 이러한 펩타이드의 발현 및 그의 농도가 단위 시간 당 세포 분열의 증가된 속도에 따라 증가하였기 때문에 그렇게 명명되었다. 세포 수 증가에 비례하여 말리그닌 양의 증가가 있을 뿐만 아니라 말리그닌의 양이 풍성화 즉, 세포 수가 단지 5배 증가하는데 반해 10배 증가한다.
말리그닌 단백질의 구조는 신규한 16 머 펩타이드 서열로 판명되는 것을 나타내는 가수분해 및 질량 분석을 통해 측정되었다. 우리는 건강한 인간 게놈의 데이터베이스 내에서 글리오마 레플리킨 단백질로 명명한 16 머 펩타이드 서열을 검색하였고 이들 데이터베이스 내에 존재하지 않음을 발견하였다.
이와 같이 불변이 필요조건 알고리즘이 글리오마 레플리킨 단백질 또는 그의 상동체에 대한 다른 생물체에 대해 사용되었다. "Pub Med" 데이터베이스 내의 4,000 단백질 서열 이상이 검색되었고 빠른 복제와 특이적으로 관련된 바이러스 및 식물 형태에서 상동체가 발견되었다. 이러한 레플리킨 단백질의 상동체는 그들의 조사자에 의해 '복제 단백질'로 명명된 단백질 내에서 빈번하게 발생하였다.
레플리킨 서열의 상동체는 모든 종양 바이러스(암을 유발하는 바이러스임) 및 조류, 식물, 진균, 바이러스 및 박테리아의 '복제 단백질' 내에서 발견되었다.
말리그닌이 글리오마 세포의 빠른 복제에서 세포 수 및 멤브레인 단백질 농도에서의 5-배 증가에 비교하여 10-배 풍부화된다는 점은 복제에 대한 레플리킨의 전체적 관계를 제안한다. 글리오마 레플리킨이 시험관 내에서 합성되고 합성 백신으로서 토끼로 투여될 때 풍부한 항말리그닌 항체가 생성되었고, 이는 혈청 내 항말리그닌 항체(AMAS) 시험의 항원적 근거를 엄밀하게 성립시키고 첫 번째 잠재적인 합성 암 백신 및 다른 생물체에서의 레플리킨 백신에 대한 원형을 제공한다.
암 레플리킨의 공유된 특이성에 근거한 복제에 대한 레플리킨의 관계 및 암 레플리킨에 대한 자연적 면역 반응(세포 타입 무시)의 증명은 항말리그닌 항체에 따른 면역성의 수동적 증대 및 합성 레플리킨 백신에 따른 능동적 증대를 가능하게 한다.
암 환자로부터의 8,090 혈청 표본 및 대조군의 연구는 집단 내 암 발병률이 증가할 때 항말리그닌 항체의 농도가 건강한 개인의 연령에 따라 증가하고, 세포 타입에 관계없이 초기 말리그넌시(malignancy)의 2∼3-배 더 증가함을 증명하였다. 시험관 내에서 본 항체는 암 세포 당 피코그람(펨토몰)으로 암 세포에 세포독성적이고, 생체 내에서 항말리그닌 항체의 농도는 암 환자의 생존에 양적으로 관련된다. 글리오마 세포에서 나타난 바와 같이 세포가 불멸의 악성 상태로 단지 변이되었으나 정지하거나 휴지한 상태인 암 단계는 레플리킨의 증가된 농도에 의해 특성화된 더욱 능동적인 수명-위협 복제 상태와 구별될 수 있다. 더욱이 암의 바이러스성 발병에 대한 단서는 글리오마 당단백질 10B가 정상적인 10B와 비교될 때 탄수화물 잔기에서의 50% 감소를 지닌다는 사실에서 발견된다. 이러한 감소는 다른 경우에서 바이러스 진입과 관련되고 악성 상태로의 변이 단계로서 글리아 세포의 10B로의 바이러스 레플리킨의 전달에 대한 바이러스 부착의 증거가 된다.
*글리오마에 대한 항말리그닌 항체 및 관련된 암 레플리킨으로 증명된 바와 같이 종류의 다양한 멤버에 의한 면역학적 특이성의 공유는 B 세포 및 그의 생성물 항체가 유사한 인식 '언어'에 의해 레플리킨을 인식함을 제안한다. 레플리킨의 발견으로 이러한 공유된 면역학적 특이성은 이전에 이해하기 어려웠던 것을 설명한다 : 왜 항말리그닌 항체가 모든 암 세포 내에서 증가되고 암 세포에 세포 독성적이고 대부분 또는 모든 세포 타입의 암 환자의 생존에 관련되는지. 따라서 항말리그닌 항체는 암 레플리킨 대해 생성되고, 이는 면역학적 특이성을 공유하고 세포 타입이 아닌 빠른 복제의 현상에 관련된다.
빠른 복제에서의 레플리킨의 역할의 두 번째 기능적 근거는 인플루엔자 바이러스 헤마그글루티닌(hemagglutinin) 단백질 서열 및 인플루엔자 유행병 및 전염병의 유행병학에 대한 지난 100년간의 데이터의 연구이다. 현재 혈청학적 헤마그글루티닌 및 항체 분류만이 있고 어떠한 스트레인-특이적 보존된 펩타이드 서열도 인플루엔자에서 앞서 기술된바 없었고, 유행병학적으로 기록된 유행병 또는 빠른 복제에 관련된 어떤 스트레인-특이적 펩타이드 서열의 농도 및 조성의 어떠한 변화도 앞서 기술된바 없었다.
4개의 주요 스트레인, 인플루엔자 B, (A)H1N1, (A)H2N2 및 (A)H3N2 중의 하나에서 인플루엔자 레플리킨의 농도의 4∼10배 증가가 발견되었고, 이러한 레플리킨 농도의 증가가 1902년부터 2001년까지 각 스트레인에 의해 특이적으로 유발된 인플루엔자 유행병에 관련되었다. 이들 농도의 증가는 그의 소멸 후 1년부터 64년 까지 적어도 하나 이상의 특이적 레플리킨 조성물의 재등장과 이에 더하여 신규한 스트레인-특이적 레플리킨 조성물의 출현에 기인한 것으로 보였다. 이전에는 도래하는 인플루엔자 시즌에 어떤 스트레인이 우세할지를 예측하는데 어떠한 스트레인-특이적 화학적 구조도 알려지지 않았고, 백신에 대한 전체-바이러스 스트레인의 매년용 혼합물을 고안하지 않았다. H3N2의 히스토리 중 가장 큰, H3N2 레플리킨 농도의 최근 급격한 증가(1997년∼2000년) 및 1968년의 높은 사망률 H3N2 전염병 및 1975년 및 1977년의 2개의 높은 사망률 유행병에서 마지막으로 나타났으나 20∼25년 동안 존재하지 않았던 특이적 레플리킨 조성물의 재등장이 함께 도래하는 유행병의 경고가 된다.
합성 레플리킨은 신규한 백신이다. 어떻게 동일한 구조가 100년 동안 유지될 수 있고 또는 1년부터 64년까지의 부재 후 재등장하는지 관찰된 이러한 레플리킨 구조의 높은 보존 정도는 이전에 인플루엔자 단백질 내 아미노산의 무작위 치환에 기인하여 독성이 변한다고 여겨졌던 것이 레플리킨의 보존의 조직화된 과정에 기인하여 변하는 것으로 보임을 나타낸다. 실제로 각각의 아미노산의 무작위 치환이 발생하면 평균 길이 인플루엔자 레플리킨 서열에 대한 1년 동안 보존될 가능성은 1에 대한 2 내지 27번째 파워의 순서로 계산된다.
레플리킨의 유의적인 보존은 인플루엔자 바이러스에 유일한 것이 아니고 소맥 뿐만 아니라 아구창(foot and mouth disease) 바이러스 타입 O 및 HIV에도 존재한다.
빠른 복제에서의 레플리킨의 역할의 세 번째 기능적 근거는 HIV에서의 빠른 복제에 관련된 것으로 보이는 레플리킨 농도의 증가이다. 초기 단계 감염에서 우세한 HIV의 느린-생장 낮은-역가 스트레인(NS1, "Bru")의 레플리킨 농도는 후기 단계 HIV 감염에서 우세한 빠른-생장 높은-역가 스트레인(SI, "Lai")의 레플리킨 농도의 1/6임이 발견되었다.
다른 예는 빠른 복제에 대한 레플리킨의 관계에 나타난다. 예를 들어 토마토 농작물을 황폐화시키는 토마토 컬 잎 게미니 바이러스에서 DNA에 결합하는 것으로 보인 '복제 단백질'의 첫 번째 161 아미노산은 5개의 레플리킨을 포함한다.
빠른 복제의 전설인 말라리아에서 트리파노솜(trypanosome)이 하나의 트리파노솜으로부터 10,000개로 간으로부터 방출된다. 다수의 신규한, 100 아미노산 당 36개까지 겹치는 레플리킨의 농도를 지닌 거의 '불타오르는 듯한' 레플리킨 구조가 여기서 발견되었다.
인플루엔자 유행병에서의 레플리킨 농도의 증가는 악성 글리오마 세포의 빠른 복제 동안 글리오마 레플리킨의 농도 증가와 기능적으로 비교가능하고 HIV 및 다른 생물체의 다양한 범위 내에서의 빠른 복제에 비교가능하다. 따라서 레플리킨은 다른 생물체에서의 빠른 복제의 구조적 근거와 관련되고 그의 일부로 보인다.
따라서 레플리킨 농도 및 조성물은 복제 과정을 검출하고 조절하는 신규한 방법을 제공하고, 이는 각각의 생물학적 집단의 생존 및 우세의 중심이다. 빠른 복제에 관련된 이들 신규한 단백질의 발견은 1) 레플리킨의 질적 및 양적 측정에 의한 병원균의 검출, 2) 고유의 레플리킨을 타겟팅하고 백신으로서 합성 레플리킨을 사용함으로서 빠른 복제가 중요한 인자인 광범위한 질병의 조절 및 3) 조류 및 식물 식량의 양육 생장에 대한 레플리킨의 이용에 대한 새로운 기회를 제공한다
검출하고 치료하는데 어려운 것으로 판명되고 어떠한 효과적인 백신도 없는 유의적으로 많은 질병 및 병원균이 있다. 따라서 각각의 혼란에 대해 이들 질병 및 병원균을 검출하고, 치료하고 또는 예방하는 효과적인 방법을 제공할 타겟을 개발할 필요가 있다.
본 발명이 해결하려는 과제는 검출하고 치료하는데 어려운 것으로 판명되고 어떠한 효과적인 백신도 없는 질병 및 병원균에 대한 치료 또는 예방을 위한 효과적인 방법을 개발코자 한 것이다. 따라서 이들 질병 및 병원균을 검출하고, 치료하고 또는 예방하는 효과적인 타겟을 개발코자 한 것이다.
본 발명의 목적은 1) 펩타이드의 하나의 말단은 리신 잔기이고 펩타이드의 또 다른 말단은 리신 잔기 또는 히스티딘 잔기를 지닌 7 내지 50개의 아미노산 잔기로 이루어지고 ; 2) 첫 번째 리신 잔기로부터 6 내지 10 번째 떨어진 두 번째 리신 잔기를 지니고 ; 3) 하나 이상의 히스티딘 잔기를 지니고 ; 및 4) 아미노산 잔기의 6% 이상은 리신 잔기로 구성된 분리되거나 합성된 펩타이드에 있어서, 상기 펩타이드는 글리오마 종양세포로부터 유래되지 않음을 특징으로 하는 분리되거나 합성된 펩타이드를 제공하는 것이다.
이때 상기 펩타이드는 7 내지 25개의 아미노산 잔기로 구성되어 있음을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 7 내지 16개의 아미노산 잔기로 구성되어 있음을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 간염 바이러스 펩타이드임을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 줄무늬 바이러스 펩타이드임을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 헤르페스 바이러스 펩타이드임을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 소 헤르페스 바이러스 펩타이드임을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 멜레아그리드(meleagrid) 헤르페스 바이러스 펩타이드임을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 고양이 면역결핍 바이러스 펩타이드임을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 아구창 바이러스 펩타이드임을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 라우스 육종 바이러스 펩타이드임을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 조류 육종 바이러스 펩타이드임을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 뉴로블라스토마 RAS 바이러스 종양유전자 펩타이드임을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 폴리오마 바이러스 펩타이드임을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 신드비스(sindbis) 펩타이드임을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 인간 유두종 바이러스 펩타이드임을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 골수성단구성(myelmonocytic) 종양 바이러스 펩타이드임을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 쥐 급성 백혈병 펩타이드임을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 인간 T-세포 임파친화성(lymphotropic) 바이러스 펩타이드임을 특징으로 한다.
이때 상기 펩타이드는 토마토 잎 컬 바이러스 펩타이드임을 특징으로 한다.
본 발명은 레플리킨 서열을 포함한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 확인하는 방법을 제공한다. 본 방법은 여기서 3-포인트-인식 방법으로 표기된다. 즉, "3-포인트-인식" 방법을 이용함으로서 (1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기; (2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및 (3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기(레플리킨)-신규한 종류의 펩타이드로 구성-를 포함한 약 7∼50 아미노산으로 구성된 펩타이드가 복제, 형질전환 또는 산화환원 기능을 지닌 조류, 효모, 진균, 아메바, 박테리아, 식물 및 바이러스 단백질에서 나타났다.
본 발명의 하나의 관점에서 레플리킨 서열을 포함한 분리된 또는 합성된 펩타이드가 제공된다. 펩타이드는 (1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기; (2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및 (3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기를 포함한 약 7∼50 아미노산으로 구성된다.
또한 본 발명은 :
(1) 신체 표본 또는 환경적 표본으로부터 핵산을 분리하고;
(2) 레플리킨 구조의 존재에 대해 핵산을 스크린하고;
(3) 레플리킨 구조의 존재와 오염 생물체의 존재를 연관시키는 것으로
구성된 신체 표본 또는 환경적 표본 내 오염 생물체의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 관점에서 적어도 하나 이상의 레플리킨 펩타이드로 구성된 조성물의 효과적인 투여량을 피험체에 투여하는 것으로 구성된, 레플리킨 서열에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하도록 피험체의 면역체계를 자극하는 방법이 제공된다. 하나의 실시태양은 이러한 신규한 스트레인이 출현하면 출현 스트레인 내에 존재하는 적어도 하나 이상의 펩타이드로 구성된다.
또한 본 발명은 레플리킨에 특이적으로 결합하는 다수의 항체를 포함한 항체 칵테일뿐만 아니라 여기서 정의된 레플리킨에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서 레플리킨에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체들 및 약제적으로 수용가능한 담체로 구성된 조성물이 제공된다.
본 발명의 하나의 관점에서 다른 단백질로부터 분리된, 재조합 또는 합성된 펩타이드 또는 바이러스성 레플리킨 서열을 포함한 다른 방법이 제공된다. 바이러스성 레플리킨 펩타이드는 (1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기; (2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및 (3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기를 포함한 약 7∼50 아미노산으로 구성된다.(바이러스성 레플리킨)
또한 본 발명은 :
(1) 신체 표본 또는 환경적 표본으로부터 핵산을 분리하고;
(2) 바이러스성 레플리킨 구조의 존재에 대해 핵산을 스크린하고;
(3) 바이러스성 레플리킨 구조의 존재, 그의 농도 및 조성물과 오염 생물체의 존재를 연관시키는 것으로
구성된 신체 표본 또는 환경적 표본 내 오염 생물체의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 관점에서 적어도 하나 이상의 레플리킨 펩타이드로 구성된 조성물의 효과적인 투여량을 피험체에 투여하는 것으로 구성된, 바이러스성 레플리킨 서열에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하도록 피험체의 면역체계를 자극하는 방법이 제공된다. 하나의 실시태양은 이러한 신규한 스트레인이 출현하면 출현 스트레인 내에 존재하는 적어도 하나 이상의 펩타이드로 구성된다.
또한 본 발명은 바이러스성 레플리킨에 특이적으로 결합하는 다수의 항체를 포함한 항체 칵테일뿐만 아니라 여기서 정의된 바이러스성 레플리킨에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서 바이러스성 레플리킨에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체들 및 약제적으로 수용가능한 담체로 구성된 조성물이 제공된다.
또한 본 발명은 (1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기; (2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및 (3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기 및 약제적으로 수용가능한 담체로 구성된 약 7∼50 아미노산을 지닌 하나 이상의 분리된 바이러스 펩타이드로 구성된 치료 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 관점에서 (1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기; (2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및 (3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기로 구성된 약 7∼50 아미노산을 의미하는 바이러스 레플리킨 mRNA 서열에 상보적인 안티센스 핵산 분자가 제공된다.
본 발명의 또다른 관점에서 (1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기; (2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및 (3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기로 구성된 약 7∼50 아미노산을 지닌 적어도 하나 이상의 바이러스 레플리킨 펩타이드의 효과적인 양을 투여하는 것으로 구성된, 바이러스에 대한 항체를 생성하도록 피험체의 면역체계를 자극하는 방법이 제공된다.
또다른 관점에서 :
(1) 바이러스의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체를 수득하고;
(2) 레플리킨 서열의 존재 및 농도에 대해 바이러스의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체의 아미노산 서열을 분석하고;
(3) 바이러스의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체의 아미노산 서열 내 레플리킨 서열의 농도를 적어도 하나의 초기 한 시기 기간이 단계 (1)에 앞선 적어도 약 6개월 내지 3년 내일 때 적어도 두 시기 기간 동안 레플리킨의 농도를 제공하기 위해 적어도 초기 한 시기 기간에 각 스트레인의 아미노산 서열 내에서 관찰된 레플리킨 서열 농도와 비교하고;
(4) 적어도 두 시기 기간 동안 레플리킨 서열 농도의 가장 높은 증가를 지닌 바이러스 스트레인을 확인하고;
(5) 바이러스 백신 내에 함유되기 위한 펩타이드로서 단계 (4)에서 확인된 바이러스 펩타이드의 스트레인 내에 존재하는 적어도 하나 이상의 레플리킨 서열을 선택하는 것으로
구성된 예방 또는 치료 바이러스 백신 내에 함유되기 위한 바이러스 레플리킨 펩타이드를 선택하는 방법이 제공된다.
또한 본 발명은 :
(1) 출현 스트레인로서 바이러스의 스트레인을 확인하고;
(2) 바이러스 백신 제조를 위한 펩타이드 주형으로서 출현 스트레인 내 존재하는 적어도 하나 이상의 레플리킨 서열을 선택하고;
(3) 단계 (2)에서 선택된 적어도 하나 이상의 레플리킨 서열의 아미노산 서열을 지닌 펩타이드를 합성하고;
(4) 치료적으로 효과적인 양의 단계 (3)의 펩타이드를 약제적으로 수용가능한 담체 및/또는 보조제(adjuvant)에 결합하는 것으로
구성된 예방 또는 치료 바이러스 백신을 제조하는 방법을 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 :
(1) 바이러스의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체를 수득하고;
(2) 레플리킨 서열의 존재 및 농도에 대해 바이러스의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체의 아미노산 서열을 분석하고;
(3) 적어도 하나의 초기 한 시기 기간은 단계 (1)에 앞선 적어도 약 6개월 내지 3년 내이며 적어도 두 시기 기간에 레플리킨의 농도를 제공하기 위해 바이러스의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체의 아미노산 서열 내 레플리킨 서열의 농도를 적어도 초기 한 시기 기간에 각 스트레인의 아미노산 서열 내에서 관찰된 레플리킨 서열 농도와 비교하고;
(4) 적어도 두 시기 기간 동안 레플리킨 서열 농도의 가장 높은 증가를 지닌 바이러스 스트레인을 확인하는 것으로
구성된 예방 또는 치료 목적을 위한 바이러스의 출현 스트레인을 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 관점에서 바이러스의 출현 스트레인의 단백질 내에 존재하는 적어도 하나 이상의 레플리킨 및 약제적으로 수용가능한 담체 및/또는 보조제로 구성된 예방 또는 치료 바이러스 백신이 제공된다.
또한 본 발명에 의해 바이러스의 출현 스트레인의 단백질 내에 존재하는 적어도 하나 이상의 분리된 레플리킨 및 약제적으로 수용가능한 담체 및/또는 보조제로 구성된 예방 또는 치료 바이러스 백신을 필요한 환자에 투여하는 것으로 구성된 바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 효과는 검출하고 치료하는데 어려운 것으로 판명되고 어떠한 효과적인 백신도 없는 질병 및 병원균에 대한 치료 또는 예방을 위한 효과적인 방법을 제공하는 것이다. 따라서 이들 질병 및 병원균을 검출하고, 치료하고 또는 예방하는 효과적인 타겟을 제공하는 것이다.
도 1은 다양한 생물체 내 레플리킨의 빈번한 발생을 나타내는 막대 그래프이다.
도 2는 글리오블라스토마(glioblastoma) 세포의 혐기성 복제 동안 총 멤브레인 단백질 밀리그램 당 말리그닌(malignin)의 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 레코닌(recognin) 16-머(mer)로의 노출에 반응하여 생성된 항말리그닌 항체의 양을 나타내는 막대 그래프이다.
도 4a는 일반적인 형광 빛으로 취해진 혈액 도말 표본의 사진이다. 도 4b는 2개의 백혈구 세포의 존재를 나타내는 일반적인 형광 빛으로 취해진 혈액 도말 표본 사진이다. 도 4c는 항말리그닌 항체의 존재시 글리오마(glioma)의 조밀층의 사진이다. 도 4d 및 도 4e는 항말리그닌 항체의 첨가가 뒤따르는 30 및 45분에 취해진 도 4c의 세포층의 사진이다.
도 4f는 항말리그닌 항체에 의해 시험관 내에서 작은 세포 허파 암종 세포의 성장 억제를 나타내는 막대 그래프이다.
도 5는 양성 또는 악성 유방 질환 전- 및 후- 수술 환자의 혈청 내 존재하는 항말리그닌 항체 양의 도면이다.
도 6은 컴퓨터가 레플리킨 서열을 확인하는 3-포인트-인식 방법을 수행하는데 사용되는 본 발명의 실시태양을 나타내는 박스 도식이다.
도 7은 1918년부터 2001년까지 매년 인플루엔자 B 및 인플루엔자 A 스트레인, H1N1의 헤마그글루티닌 내에서 관찰된 레플리킨의 농도를 나타내는 그래프이다.
도 8은 1950년부터 2001년까지 매년 H3N2(R)로 명명된 레플리킨 성분에 의해 정의된 출현 스트레인뿐만 아니라 인플루엔자 A 스트레인, H2N2 및 H3N2의 헤마그글루티닌 내에서 관찰된 레플리킨 농도의 그래프이다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
인플루엔자
인플루엔자는 세계적으로 중요한 급성 호흡기 질환이다. 예방접종을 통한 인플루엔자 바이러스 아웃브레이크를 조절하기 위한 국제적인 시도에도 불구하고 인플루엔자 감염은 질병률과 사망률의 중요한 원인으로 남아있다. 전세계의 인플루엔자 유행병 및 전염병은 불규칙적이고 역사를 걸쳐 미리 예측할 수 없는 간격으로 발생하였고 이는 미래에도 계속될 것으로 예측된다. 전염성 및 유행성 인플루엔자 모두의 충격은 질병률, 사망률 및 경제적 비용의 측면에 실질적인 것이다.
인플루엔자 백신은 인플루엔자 바이러스에 대한 가장 효과적인 방어로 남아있으나 바이러스의 돌연변이 능력 및 비-인간 숙주 저장소의 유용성 때문에 인플루엔자는 출현 또는 재출현 감염으로 남을 것으로 예측된다. 세계적인 인플루엔자 감시는 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자 시즌 동안 국가 내에서 국가 사이에서 대륙 사이에서 변화한다는 것을 나타낸다. 바이러스학적 감시는 항원적 교체(shift) 및 표류(drift)를 감시하는데 중요하다. 또한 질병 감시는 유행병의 충격을 평가하는데 중요하다. 정보의 타입 모두는 백신 조성물 및 항바이러스의 정확한 이용의 기초를 제공하였다. 그러나 현재 출현 인플루엔자 바이러스 스트레인의 증가 수의 매년 포스트 호크(post hoc) 혈액학적 분류만이 있고 바이러스의 어떠한 특이적 화학 구조도 인플루엔자 유행병 또는 전염병에 접근하는 지표로서 확인되지 않았다. 현재, 주어진 년도에 활성적, 불활성적 또는 우세한 인플루엔자 바이러스의 매년 분류에 대한 기초만이 바이러스 헤마그글루티닌 및 뉴라미니다제(neuraminidase) 단백질의 활동이다. 어떠한 인플루엔자 바이러스성 화학 구조도 유행병 또는 전염병의 양적인 경고에 사용될 수 있고 더욱 효과적이고 안전한 백신을 고안하는데 사용될 수 있는 본 출원 전에 확인되지 않았다.
인플루엔자 백신의 매년 투여 및 백신이 투여될 수 있을 때 시기의 짧은 기간 때문에 백신 적용 범위를 증가시키도록 지시된 전략이 매우 중요하다.
본 발명의 하나의 관점에서 레플리킨 서열을 포함한 분리되거나 합성된 인플루엔자 바이러스 펩타이드가 제공된다. 인플루엔자 레플리킨 바이러스 펩타이드는 (1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기; (2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및 (3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기로 구성된 약 7∼50 아미노산으로 구성된다.(인플루엔자 레플리킨).
본 발명의 또다른 관점에서 적어도 하나 이상의 레플리킨 펩타이드로 구성된 조성물의 효과적인 투여량을 피험체에 투여하는 것으로 구성된, 바이러스 레플리킨 서열에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하도록 피험체의 면역체계를 자극하는 방법이 제공된다. 바람직한 실시태양에서 조성물은 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인 내에 존재하는 적어도 하나 이상의 펩타이드로 구성된다.
또한 본 발명은 인플루엔자 바이러스 레플리킨에 특이적으로 결합하는 다수의 항체를 포함한 항체 칵테일뿐만 아니라 여기서 정의된 인플루엔자 바이러스 레플리킨에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서 인플루엔자 레플리킨에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체들 및 약제적으로 수용가능한 담체로 구성된 조성물이 제공된다.
또한 본 발명은 :
(1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기;
(2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및
(3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기 및 약제적으로 수용가능한 담체로
구성된 약 7∼50 아미노산을 지닌 하나 이상의 분리된 인플루엔자 바이러스 펩타이드로 구성된 치료 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 관점에서 :
(1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기;
(2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및
(3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기로
구성된 약 7∼50 아미노산을 지닌 인플루엔자 바이러스 헤마그글루티닌 레플리킨 mRNA 서열에 상보적인 안티센스 핵산 분자가 제공된다.
본 발명의 또다른 관점에서 :
(1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기;
(2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및
(3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기로
구성된 약 7∼50 아미노산을 지닌 적어도 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 레플리킨의 효과적인 투여량을 투여하는 것으로 구성된, 인플루엔자 바이러스에 대한 항체를 생성하도록 피험체의 면역체계를 자극하는 방법이 제공된다.
또다른 관점에서 :
(1) 인플루엔자 바이러스의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체를 수득하고;
(2) 레플리킨 서열의 존재 및 농도에 대해 인플루엔자 바이러스의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체의 헤마그글루티닌 아미노산 서열을 분석하고;
(3) 인플루엔자 바이러스의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체의 헤마그글루티닌 아미노산 서열 내 레플리킨 서열의 농도를 적어도 하나의 초기 한 시기 기간이 단계 (1)에 앞선 적어도 약 6개월 내지 3년 내일 때 적어도 두 시기 기간 동안 레플리킨의 농도를 제공하기 위해 적어도 초기 한 시기 기간에 각 스트레인의 헤마그글루티닌 아미노산 서열 내에서 관찰된 레플리킨 서열 농도와 비교하고;
(4) 적어도 두 시기 기간 동안 레플리킨 서열 농도의 가장 높은 증가를 지닌 인플루엔자 바이러스 스트레인을 확인하고;
(5) 인플루엔자 바이러스 백신 내에 함유되기 위한 펩타이드로서 단계 (4)에서 확인된 인플루엔자 바이러스 펩타이드의 스트레인 내에 존재하는 적어도 하나 이상의 레플리킨 서열을 선택하는 것으로
구성된 예방 또는 치료 인플루엔자 바이러스 백신 내에 함유되기 위한 인플루엔자 바이러스 레플리킨 펩타이드를 선택하는 방법이 제공된다.
또한 본 발명은 :
(1) 출현 스트레인로서 인플루엔자 바이러스의 스트레인을 확인하고;
(2) 인플루엔자 바이러스 백신 제조를 위한 펩타이드 주형으로서 출현 스트레인 내 존재하는 적어도 하나 이상의 레플리킨 서열을 선택하고;
(3) 단계 (2)에서 선택된 적어도 하나 이상의 레플리킨 서열의 아미노산 서열을 지닌 펩타이드를 합성하고;
(4) 치료적으로 효과적인 양의 단계 (3)의 펩타이드를 약제적으로 수용가능한 담체 및/또는 보조제(adjuvant)에 결합하는 것으로
구성된 예방 또는 치료 인플루엔자 바이러스 백신을 제조하는 방법을 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 :
(1) 인플루엔자 바이러스의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체를 수득하고;
(2) 레플리킨 서열의 존재 및 농도에 대해 인플루엔자 바이러스의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체의 헤마그글루티닌 아미노산 서열을 분석하고;
(3) 적어도 하나의 초기 한 시기 기간은 단계 (1)에 앞선 적어도 약 6개월 내지 3년 내이며 적어도 두 시기 기간에 레플리킨의 농도를 제공하기 위해 인플루엔자 바이러스의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체의 헤마그글루티닌 아미노산 서열 내 레플리킨 서열의 농도를 적어도 초기 한 시기 기간에 각 스트레인의 헤마그글루티닌 아미노산 서열 내에서 관찰된 레플리킨 서열 농도와 비교하고;
(4) 적어도 두 시기 기간 동안 레플리킨 서열 농도의 가장 높은 증가를 지닌 인플루엔자 바이러스 스트레인을 확인하는 것으로
구성된, 진단, 예방 또는 치료 목적으로 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인을 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 관점에서 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인의 헤마그글루티닌 단백질 내에 존재하는 적어도 하나 이상의 분리된 레플리킨 및 약제적으로 수용가능한 담체 및/또는 보조제로 구성된 예방 또는 치료 인플루엔자 바이러스 백신이 제공된다.
또한 본 발명에 의해 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인의 헤마그글루티닌 단백질 내에 존재하는 적어도 하나 이상의 분리된 레플리킨 및 약제적으로 수용가능한 담체 및/또는 보조제로 구성된 예방 또는 치료 바이러스 백신을 필요한 환자에 투여하는 것으로 구성된 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다.
트리파노솜
본 발명의 하나의 관점에서 레플리킨 서열을 포함한 분리되거나 합성된 트리파노솜 펩타이드가 제공된다. 트리파노솜 레플리킨 펩타이드는 (1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기; (2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및 (3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기를 포함한 약 7∼50 아미노산으로 구성된다.(트리파노솜 레플리킨).
말라리아
치료하기에 어려운 것으로 판명되었고 어떠한 효과적인 백신도 없는 하나의 트리파노솜 장애가 말라리아이다. 말라리아는 열대 지역에서 사망 및 육체적 경제적 결핍을 유발한다. 말라리아는 주로 치료에 매우 저항적인 것으로 판명된 플라스모듐 팔시라룸(Plasmodium falciparum)에 의해 유발되고, 현재 말라리아 백신은 알기 어려운 것으로 남아있다. 따라서 효과적인 말라리아 백신 및 본 질병을 치료하거나 예방하는 방법에 대한 요구가 있다. 본 출원은 이러한 백신 및 치료 및 예방 방법의 기초를 제공한다. 레플리킨 바이러스 백신 및 레플리킨 인플루엔자 바이러스 백신의 생산 및 치료를 위한 상기 기술된 모든 방법은 레플리킨 말라리아 백신의 생산 및 치료에 적용가능하다.
본 발명에서 말라리아를 예방하거나 치료하는 백신 및 방법이 제공된다. 말라리아 백신은 적어도 하나 이상의 분리된 플라스모듐 팔시파룸 레플리킨으로 구성된다. 또한 본 발명은 적어도 하나 이상의 분리된 플라스모듐 팔시파룸 레플리킨으로 구성된 효과적인 양의 예방 또는 치료 백신을 환자에 투여하는 것으로 구성된 말라리아를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명에 의해 플라스모듐 팔시파룸의 말라리아 항원 내에 존재하는 레플리킨 또는 레플리킨들에 특이적으로 결합하는 항체로 구성된 항체, 항체 칵테일 및 조성물이 제공된다.
말라리아의 경우와 같이 본 발명 하에 치료되는 트리파노솜의 또다른 예인 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum)(매독)의 레플리킨이 매독의 검출, 예방, 치료를 위해 이용될 수 있다.
박테리아
본 발명의 하나의 관점에서 레플리킨 서열을 포함한 분리되거나 합성된 박테리아 펩타이드가 제공된다.(박테리아 레플리킨) 박테리아 펩타이드는 (1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기; (2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및 (3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기를 포함한 약 7∼50 아미노산으로 구성된다.(박테리아 레플리킨). 2002년 3월 26일 제출된 미국 특허 출원번호 제10/105,232호가 박테리아 서열 목록 및 정보를 포함하나 이에 한정적이지는 않게 참고문헌에 의해 통합된다.
또한 본 발명은 :
(1) 신체 표본 또는 환경적 표본으로부터 핵산을 분리하고;
(2) 레플리킨 구조의 존재에 대해 핵산을 스크린하고;
(3) 레플리킨 구조의 존재와 오염 생물체의 존재를 연관시키는 것으로
구성된 신체 표본 또는 환경적 표본 내 오염 박테리아 생물체의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 관점에서 적어도 하나 이상의 박테리아 레플리킨 펩타이드로 구성된 조성물의 효과적인 투여량을 피험체에 투여하는 것으로 구성된, 박테리이성 레플리킨 서열에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하도록 피험체의 면역체계를 자극하는 방법이 제공된다. 하나의 실시태양은 이러한 신규한 스트레인이 출현하면 박테리아 생물체의 출현 스트레인 내에 존재하는 적어도 하나 이상의 박테리아 펩타이드로 구성된다.
또한 본 발명은 박테리아 레플리킨에 특이적으로 결합하는 다수의 항체를 포함한 항체 칵테일뿐만 아니라 여기서 정의된 박테리아 레플리킨에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서 박테리아 레플리킨에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체들 및 약제적으로 수용가능한 담체로 구성된 조성물이 제공된다.
또한 본 발명은 :
(1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기;
(2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및
(3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기; 및
(4) 약제적으로 수용가능한 담체로
구성된 약 7∼50 아미노산을 지닌 하나 이상의 분리된 박테리아 펩타이드로 구성된 치료 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 관점에서 :
(1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기;
(2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및
(3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기로
구성된 약 7∼50 아미노산을 의미하는 박테리아 레플리킨 mRNA 서열에 상보적인 안티센스 핵산 분자가 제공된다.
본 발명의 또다른 관점에서 :
(1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기;
(2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및
(3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기로
구성된 약 7∼50 아미노산을 지닌 적어도 하나 이상의 박테리아 레플리킨의 효과적인 투여량을 투여하는 것으로 구성된, 박테리아에 대한 항체를 생성하도록 피험체의 면역체계를 자극하는 방법이 제공된다.
또다른 관점에서 :
(1) 박테리아의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체를 수득하고;
(2) 박테리아 레플리킨 서열의 존재 및 농도에 대해 박테리아의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체의 아미노산 서열을 분석하고;
(3) 박테리아의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체의 아미노산 서열 내 레플리킨 서열의 농도를 적어도 하나의 초기 한 시기 기간이 단계 (1)에 앞선 적어도 약 6개월 내지 3년 내일 때 적어도 두 시기 기간 동안 박테리아 레플리킨의 농도를 제공하기 위해 적어도 초기 한 시기 기간에 또는 박테리아를 빠르게 돌연변이하는 초기에 각 스트레인의 아미노산 서열 내에서 관찰된 박테리아 레플리킨 서열 농도와 비교하고;
(4) 적어도 두 시기 기간 동안 박테리아 레플리킨 서열 농도의 가장 높은 증가를 지닌 박테리아 스트레인을 확인하고;
(5) 박테리아 백신 내에 함유되기 위한 펩타이드로서 단계 (4)에서 확인된 박테리아 펩타이드의 스트레인 내에 존재하는 적어도 하나 이상의 박테리아 레플리킨 서열을 선택하는 것으로
구성된 예방 또는 치료 박테리아 백신 내에 함유되기 위한 박테리아 레플리킨 펩타이드를 선택하는 방법이 제공된다.
또한 본 발명은 :
(1) 출현 스트레인으로서 박테리아의 스트레인을 확인하고;
(2) 박테리아 백신 제조를 위한 펩타이드 주형으로서 출현 스트레인 내 존재하는 적어도 하나 이상의 박테리아 레플리킨 서열을 선택하고;
(3) 단계 (2)에서 선택된 적어도 하나 이상의 박테리아 레플리킨 서열의 아미노산 서열을 지닌 펩타이드를 합성하고;
(4) 치료적으로 효과적인 양의 단계 (3)의 펩타이드를 약제적으로 수용가능한 담체 및/또는 보조제에 결합하는 것으로
구성된 예방 또는 치료 박테리아 백신을 제조하는 방법을 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 :
(1) 박테리아의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체를 수득하고;
(2) 박테리아 레플리킨 서열의 존재 및 농도에 대해 박테리아의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체의 아미노산 서열을 분석하고;
(3) 박테리아의 다수 스트레인의 각 스트레인의 적어도 하나 이상의 분리체의 아미노산 서열 내 레플리킨 서열의 농도를 적어도 하나의 초기 한 시기 기간이 단계 (1)에 앞선 적어도 약 6개월 내지 3년 내일 때 적어도 두 시기 기간 동안 박테리아 레플리킨의 농도를 제공하기 위해 적어도 초기 한 시기 기간에 각 스트레인의 아미노산 서열 내에서 관찰된 박테리아 레플리킨 서열 농도와 비교하고;
(4) 적어도 두 시기 기간 동안 박테리아 레플리킨 서열 농도의 가장 높은 증가를 지닌 박테리아 스트레인을 확인하는 것으로
구성된 예방 또는 치료 목적을 위한 박테리아의 출현 스트레인을 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 관점에서 박테리아의 출현 스트레인의 단백질 내에 존재하는 적어도 하나 이상의 박테리아 레플리킨 및 약제적으로 수용가능한 담체 및/또는 보조제로 구성된 예방 또는 치료 박테리아 백신이 제공된다.
미코박테리아(mycobacteria)로 분류된 박테리아의 2가지 중요한 하위-종은 30-s 리보솜 단백질이 C-말단 레플리킨을 지닌 미코박테리움 레프레(Mycobacterium leprae)(나병) 및 ATPase가 3개의 레플리킨을 지닌 미코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)(결핵)이다.
미코박테리움 레프레(나병)의 30s 리보솜 단백질 s6 내의 레플리킨 : kvmrtdkh ; 미코박테리움 튜베르쿨로시스의 ATPase 내 레플리킨 : hprpkyaaalkdsyrlk ; hprpkvaaalk ; ksaqkwpdkflagaaqvah ; E. coli의 B-D-갈락토시다제 내 레플리킨 : hawqhqgktlfisrk ; hqgktlfisrk ; 아그로박테리움 튜메파시엔스 내 레플리킨 :
Figure 112010015382330-pat00001

Figure 112010015382330-pat00002

또한 본 발명에 의해 박테리아의 출현 스트레인의 단백질 내에 존재하는 적어도 하나 이상의 분리된 박테리아 레플리킨 및 약제적으로 수용가능한 담체 및/또는 보조제로 구성된 예방 또는 치료 백신을 필요한 환자에 투여하는 것으로 구성된 박테리아 감염을 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다.
진균
본 발명의 하나의 관점에서 레플리킨을 포함한 분리되거나 합성된 진균 펩타이드가 제공된다. 진균 레플리킨 펩타이드는 (1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기; (2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및 (3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기를 포함한 약 7∼50 아미노산으로 구성된다.(진균 레플리킨).
박테리아 레플리킨 백신의 생산 및 치료를 위해 상기 기술된 모든 방법이 진균 레플리킨 백신의 생산 및 치료에 적용가능하다.
본 발명의 또다른 관점에서 적어도 하나 이상의 진균 레플리킨 펩타이드로 구성된 조성물의 효과적인 투여량을 피험체에 투여하는 것으로 구성된, 진균 레플리킨 서열에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하도록 피험체의 면역체계를 자극하는 방법이 제공된다.
또한 본 발명은 진균 레플리킨에 특이적으로 결합하는 다수의 항체를 포함한 항체 칵테일뿐만 아니라 여기서 정의된 진균 레플리킨에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서 진균 레플리킨에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체들 및 약제적으로 수용가능한 담체로 구성된 조성물이 제공된다.
또한 본 발명은 :
(1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기;
(2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및
(3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기; 및
(4) 약제적으로 수용가능한 담체로
구성된 약 7∼50 아미노산을 지닌 하나 이상의 분리된 진균 펩타이드로 구성된 치료 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 관점에서 :
(1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기;
(2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및
(3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기로
구성된 약 7∼50 아미노산을 의미하는 진균 레플리킨 mRNA 서열에 상보적인 안티센스 핵산 분자가 제공된다.
본 발명의 또다른 관점에서 적어도 하나 이상의 레플리킨 펩타이드로 구성된 조성물의 효과적인 투여량을 피험체에 투여하는 것으로 구성된, 진균 레플리킨 서열에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하도록 피험체의 면역체계를 자극하는 방법이 제공된다.
레플리킨 증가
본 발명의 또다른 관점에서 적어도 하나 이상의 레플리킨 구조를 지닌 생물체 내에서 복제 기능을 지닌 효소 또는 다른 단백질을 인코드하는 유전자를 형질전환하는 것으로 구성된 생물체의 복제율을 증가시키는 방법이 제공된다.
정의
여기서 사용된 "펩타이드" 또는 "단백질"이라는 용어는 하나의 카르복실 그룹이 또다른 아미노 그룹과 결합되어 펩타이드 결합을 형성하는 2 이상의 아미노산의 화합물을 나타낸다. 또한 펩타이드라는 용어는 이러한 화합물을 인코드하는 아미노산 서열을 의미하는데 사용된다. 여기서 사용된 바와 같이 "분리된" 또는 "합성된" 펩타이드 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분은 펩타이드가 유도된 세포 또는 조직으로부터의 세포 물질 또는 오염 펩타이드가 실질적으로 없거나 또는 어떤 방법에 의해서도 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없거나 또는 재조합 유전자 기술에 의해 합성될 때 오염 펩타이드가 실질적으로 없는 것을 나타낸다.
여기서 사용된 레플리킨 펩타이드 또는 레플리킨 단백질은 :
(1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기;
(2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및
(3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기로
구성된 약 7∼50 아미노산을지닌 아미노산 서열이다.
유사하게는 레플리킨 서열은 이러한 펩타이드 또는 단백질을 인코드하는 아미노산 서열이다.
여기서 사용된 "출현 스트레인"은 생물체의 다른 스트레인의 레플리킨 농도에 대한 하나 이상의 그의 단백질 서열 내 레플리킨 서열의 증가된 농도를 지닌 것으로 확인된 바이러스, 박테리아, 진균 또는 다른 생물체의 스트레인을 나타낸다. 레플리킨의 농도 증가는 예를 들어 인플루엔자 바이러스 내에서 적어도 약 6개월의 기간에 걸쳐, 바람직하게는 적어도 약 1년의 기간에 걸쳐, 더욱 바람직하게는 적어도 약 3년의 기간에 걸쳐 발생하나 박테리아 및 다른 생물체의 경우 훨씬 더 짧은 기간이 된다.
여기서 사용된 "돌연변이"는 아미노산의 치환에 의해 유발된 생물체의 구노 및 성질의 변화를 나타낸다. 반대로, 여기서 사용된 "보존"은 치환의 부재에 의한 특정 아미노산의 보존을 나타낸다.
여기서 레플리킨으로 표기된 빠른 복제 현상에 관련된 작은 펩타이드의 새로운 패밀리의 확인은 백신 개발을 포함하여 표본 내 병원균의 검출을 위한 타겟 및 개발 치료요법 개발을 제공한다. 일반적으로 본 펩타이드 패밀리의 지식 및 확인은 레플리킨을 잠복시키는 어떠한 생물체에 있어서 효과적인 치료요법 및 백신의 개발을 가능하게 한다. 본 펩타이드 패밀리의 확인은 또한 바이러스의 검출 및 바이러스 백신 개발을 제공한다.
예를 들어 본 펩타이드 패밀리의 확인은 인플루엔자 바이러스에 대한 검출을 제공하고 인플루엔자 치료에 대한 새로운 타겟을 제공한다. 또한 본 펩타이드 패밀리의 확인은 예를 들어 말라리아에 대한 검출을 제공하고 말라리아 백신 개발에 대한 새로운 타겟을 제공한다. 본 펩타이드 패밀리의 확인에 의해 제공된 추가적인 예는 감염성 질명 레플리킨, 암 면역 레플리킨 및 구조적 단백질 레플리킨에 대한 검출을 포함한다.
빠른 복제는 특정한 박테리아, 바이러스 및 말리그넌시의 독성의 특성이나 다른 생물체 내에서의 빠른 복제에 대한 어떠한 화학적 공통점도 기술되지 않았다. 우리는 빠른 복제에 관련된 보존된 작은 단백질 서열의 패밀리를 발견하였고, 이를 레플리킨으로 명명하였다. 이러한 레플리킨은 효과적인 검출 방법 및 치료요법을 개발하기 위한 새로운 타겟을 제공한다. 발견된 첫 번째 레플리킨은 글리오마 레플리킨이었고, 이는 말리그닌으로 불리는 뇌 글리오블라스토마 다형(글리오마) 세포 단백질로 확인되었다.
말리그닌의 가수분해 및 질량 분석은 글리오마 레플리킨을 포함한 신규한 16 머 펩타이드 서열을 나타내었다. 이러한 레플리킨은 정상적인 건강한 인간 게놈의 데이터베이스에서 발견되지 않았고 따라서 신체 외부의 일부 출처로부터 유도되는 것을 보였다.
우리는 글리오마 레플리킨 또는 그의 상동체를 검색하기 위한 알고리즘을 고안하였다. 상동체는 4,000 단백질 서열 내에서 공통적이지 않았으나 놀랍게도 모든 종양 바이러스 및 조류, 식물, 진균, 바이러스 및 박테리아의 복제 단백질 내에서 발견되었다.
우리는 1) 레플리킨 농도(100 아미노산 당 레플리킨의 수) 및 2) 레플리킨 조성물 모두가 빠른 복제의 기능적 현상과 연관됨을 확인하였다. 이들 관계는 레플리킨이 복제율과 질적으로 뿐만 아니라 양적으로 관련된다라는 결정에 대한 기능적 근거를 제공한다.
빠른 복제에서의 레플리킨의 역할에 대한 첫 번째 기능적 근거는 글리오마 복제에서 나타난다. 글리오마 세포의 빠른 복제시 세포수 및 멤브레인 단백질 농도가 5-배 증가하는 것과 비교하여 글리오마 말리그닌은 10-배 증가된다는 사실은 레플리킨 복제의 전체적 관계를 제안한다. 글리오마 레플리킨이 시험관 내에서 합성되고 합성 백신으로서 토끼로 투여되었을 때 풍부한 항말리그닌 항체가 생성되었다. 이는 혈청 내 항말리그닌 항체(AMAS) 시험의 항원적 근거를 엄밀하게 성립시키고 첫 번째 잠재적인 합성 암 백신 및 다른 생물체에서의 레플리킨 백신에 대한 원형을 제공한다. 세포 타입을 무시하고 암 레플리킨 및 빠른 복제의 공유된 특이성에 기초한, 복제에 대한 레플리킨의 자연적 면역 관계 및 암 레플리킨에 대한 자연적 면역 반응의 증명으로, 항말리그닌 항체에 따른 면역성의 수동적 증대 및 합성 레플리킨 백신에 따른 능동적 증대를 가능하게 한다.
환자의 항말리그닌 항체와 생존 사이의 관계는 암 환자로부터의 8,090 혈청 표본 및 대조군의 연구에서 나타났다. 본 연구는 집단 내 암 발병률이 증가할 때 항말리그닌 항체의 농도가 연령에 따라 증가하고, 세포 타입에 관계없이 초기 말리그넌시가 2∼3-배 더 증가함을 나타내었다. 시험관 내에서 항말리그닌 항체는 암 세포 당 피코그람(펨토몰)으로 암 세포에 세포독성적이고, 생체 내에서 항말리그닌 항체의 농도는 암 환자의 생존에 양적으로 관련된다. 글리오마 세포에서 나타난 바와 같이 세포가 불멸의 악성 상태로 단지 변이되었으나 정지하거나 휴지한 상태인 암 단계는 레플리킨의 증가된 농도에 의해 특성화된 더욱 능동적인 수명-위협 복제 상태와 구별될 수 있다. 더욱이 암의 바이러스성 발병에 대한 단서는 글리오마 당단백질 10B가 정상적인 10B와 비교될 때 탄수화물 잔기에서의 50% 감소를 지닌다는 사실에서 발견된다. 이러한 감소는 다른 경우에서 바이러스 진입과 관련되고 악성 상태로의 변이 단계로서 글리아 세포의 10B로의 바이러스 레플리킨의 전달에 대한 바이러스 부착의 증거가 된다.
인플루엔자 바이러스 헤마그글루티닌 단백질 서열 및 지난 100년 간의 인플루엔자 유행병학에 관한 연구는 빠른 복제에 대한 레플리킨의 관계에 대한 두 번째 기능적 근거를 제공하였다. 혈청학적 헤마그글루티닌 및 항체 분류만이 있고, 어떠한 스트레인-특이적 보존된 펩타이드 서열도 인플루엔자에서 앞서 기술되지 않았다. 또한 어떤 스트레인-특이적 펩타이드 서열에서의 농도 및 조성의 어떠한 변화도 유행병학적으로 기록된 유행병 또는 빠른 복제에 연관된다고 앞서 기술되지 않았다. 본 연구에서 4개의 주요 스트레인, 인플루엔자 B, (A)H1N1, (A)H2N2 및 (A)H3N2 중의 하나에서 스트레인-특이적 인플루엔자 레플리킨의 농도의 4∼10배 증가는 1902년부터 2001년까지 각 스트레인에 의해 유발된 인플루엔자 유행병에 관련된 것으로 나타났다.
우리는 이들 농도의 증가가 그의 소멸 후 1년부터 64년까지 적어도 하나 이상의 특이적 레플리킨 조성물의 재등장과 이에 더하여 신규한 스트레인-특이적 레플리킨 조성물의 출현에 기인한 것임을 나타내었다. 이전에는 도래하는 인플루엔자 시즌에 어떤 스트레인이 우세할지를 예측하는데 어떠한 스트레인-특이적 화학적 구조도 알려지지 않았고, 백신에 대한 전체-바이러스 스트레인의 매년용 혼합물을 고안하지 않았다. H3N2의 히스토리 중 가장 큰, H3N2 레플리킨 농도의 최근 급격한 증가(1997년∼2000년) 및 1968년의 높은 사망률 H3N2 전염병 및 1975년 및 1977년의 2개의 높은 사망률 유행병에서 마지막으로 나타났으나 20∼25년 동안 존재하지 않았던 특이적 레플리킨 조성물의 재등장이 함께 도래하는 유행병의 경고가 된다. 어떻게 동일한 구조가 100년 동안 유지될 수 있고 또는 1년부터 64년까지의 부재 후 재등장하는지 관찰된 레플리킨 구조의 높은 보존 정도는 이전에 인플루엔자 단백질 내 아미노산의 무작위 치환에 기인하여 독성이 변한다고 여겨졌던 것이 레플리킨의 보존의 조직화된 과정에 기인하여 변하는 것으로 보임을 나타낸다.
레플리킨의 보존은 인플루엔자 바이러스에 유일한 것이 아니고 예를 들어 아구창 바이러스 타입 0, HIV 태트(tat) 및 소맥 내 다른 출처에서도 관찰된다.
빠른 복제에서의 레플리킨의 역할에 대한 세 번째 기능적 근거는 HIV 내의 빠른 복제의 증가에서 나타난다. 레플리킨 농도는 HIV 내 빠른 복제에 관련된 것을 나타났다. 초기 단계 감염에서 우세한 HIV의 느린-생장 낮은-역가 스트레인(NS1, "Bru")의 레플리킨 농도는 빠른-생장 높은-역가 스트레인(SI, "Lai")(후기 단계 HIV 감염에서 우세)의 레플리킨 농도의 1/6임이 발견되었다.
추가적인 예는 빠른 복제에 대한 레플리킨의 관계를 증명한다. 토마토 농작물을 황폐화시키는 토마토 컬 잎 게미니 바이러스의 "복제 단백질"에서 DNA에 결합하는 것으로 나타난 첫 번째 161 아미노산이 5개의 레플리킨을 함유하는 것으로 나타났다. 빠른 복제의 전설인 말라리아에서 트리파노솜이 하나의 트리파노솜으로부터 10,000개로 간으로부터 방출될 때 다수의 신규한, 거의 '불타오르는 듯한' 레플리킨 구조가 100 아미노산 당 36개까지 겹치는 레플리킨의 농도를 지닌 것으로 발견되었다.
어떤 구조의 보존은 구조가 공격하고 파괴하거나 자극하는 안전한 불변성 타겟을 제공하는지 여부에 중요하다. 구조가 생물체의 기본 생존 메카니즘의 일부 방법으로 결합될 때 구조는 보존되는 경향이 있다. 변화하는 구조는 변하기 쉬운 타겟을 제공하고, 이는 이전 구조에 대해 특이적으로 생성되었던 항체와 같은 공격자를 피하여 변형된 형태에 대해 비효과적이 되는 좋은 전략이다. 이러한 전략은 예를 들어 인플루엔자 바이러스에 의해 사용되어 이전 백신이 현재 독성적인 바이러스에 대해 매우 비효과적이 된다.
치료를 위한 안정한 타겟으로서의 레플리킨
박테리아와 HIV 모두 레플리킨과 비-레플리킨 아미노산을 지닌다. 예를 들어 HIV에서는 돌연변이 즉, 비-레플리킨 아미노산의 치환에 의한 9∼13%의 약물-저항성이 최근 증가하였다(여기서 논의된 HIV의 TAT 단백질의 상세한 분석 참조). 박테리에서는 '저항성 스트레인'의 개발은 유사한 메카니즘에 기인한다. 그러나 우리는 레플리킨 구조가 비-레플리킨 아미노산과 동일한 정도로 돌연변이하거나 변하지 않았음을 발견하였다(여기서 논의된 레플리킨의 아구창 바이러스 보존의 논의 참조). 비-레플리킨 구조와 반대로 레플리킨 구조는 보존되고 따라서 치료의 새로운 일정한 타겟을 제공한다.
생존 기능에 너무 밀접하게 관련된 특정한 구조는 분명히 일정하게 변할 수 없다. 레플리킨 구조의 필수적인 성분은 산화환원 효소 내 금속 그룹으로의 빈번한 결합이고 복제에 필요한 에너지의 원천으로 알려진 히스티딘(d)이고, 이러한 히스티딘 구조가 일정하게 유지되기 때문에 이러한 구조는 파괴 또는 자극에 대한 더욱 흥미로운 타겟이다.
단백질의 관점으로부터, 새롭게 측정된 글리오마 펩타이드 서열에 기초한 주형의 발명자 구조(construction)는 이러한 복제의 경우 보존된 구조 및 특정한 기능에 관련된 광대한 단백질 종류의 발견을 이끌었다. 질병의 독성에 따른 레플리킨 농도 증가의 예는 인플루엔자, HIV, 암 및 토마토 잎 컬 바이러스를 포함한다. 이러한 새롭게 인식된 구조의 종류는 효모, 조류, 식물, 게미니 컬 잎 토마토 바이러스, HIV 및 암과 같이 다양한 생물체 내에서의 빠른 복제 현상에 관련된다.
레플리킨 농도 및 조성물은 각각의 생물학적 군의 생존 및 우세에 중요한 복제 과정을 검출 및 조절하는 신규한 양적인 방법을 제공한다. 글리오마 및 관련된 암 레플리킨에 대한 항말리그닌 항체에서 논의된 바와 같이 본 종류의 다양한 멤버에 의한 면역학적 특이성의 공유는 B 세포 및 그의 생성물 항체가 유사한 인식 언어에 의해 레플리킨을 인식함을 제안한다.
암 레플리킨 또는 레플리킨을 함유한 것 즉, 글리오마 펩타이드, kagvaflhkk의 상동체의 펩타이드 서열의 예는 폐, 뇌, 간, 연조직, 침샘, 비인강, 식도, 위, 콜론, 직장, 담낭, 유방, 전립선, 자궁, 경부, 방광, 눈의 암, 흑색종 형태, 임파종, 백혈병 및 신장암에서 발견되나 이에 한정적인 것은 아니다.
레플리킨은 : 1) 레플리킨의 질적 및 양적 측정에 의한 병원균 검출; 2) 빠른 복제가 고유 레플리킨을 타겟팅하고 백신으로서 합성 레플리킨을 이용함으로서 중요한 인자가 되는 광범위한 질병의 치료 및 조절; 및 3) 조류 및 식물 식량의 성장률을 촉진시키는 것을 제공한다.
확인되는 첫 번째 레플리킨 서열은 글리오블라스토마 다형(글리오마)의 빠른 혐기성 복제 동안 10-배 증가되는 것으로 논증된, 뇌암 단백질, 말리그닌 내에서 발견된 암 세포 레플리킨이었다(도 2). 말리그닌은 글리오블라스토마 다형(글리오마) 세포의 멤브레인으로부터 생체 내 및 시험관 내에서 분리된 250 KDa 당단백질 10B의 10 KDa 부분이다. 말리그닌의 가수분해 및 질량 분석은 16-머 펩타이드 서열, ykagvaflhkkndide(서열번호: 4)을 나타내었고, 이는 여기서 글리오마 레플리킨으로 나타나고, 더 짧은 펩타이드, kagvaflhkk(서열번호: 1)을 포함하고 이 둘은 분명히 정상 사람 게놈에는 존재하지 않는다.
Figure 112010015382330-pat00003
16-머 글리오마 레플리킨이 합성되고 합성 백신으로서 토끼에 투여될 때 많은 항말리그닌 항체가 생성되었다(Bogoch et al., Cancer Detection and Prevention, 26(Suppl.1):402(2002)). 생체 내에서 혈청 내 항말리그닌 항체의 농도가 암 환자의 생존에 양적으로 관련됨이 나타났다(Bogoch et al., Protides of Biological Fluids, 31:739-747(1984)). 시험관 내에서 항말리그닌 항체는 암 세포 당 피코그램(펩토몰) 농도에서 암 세포에 세포독성적임이 나타났다(Bogoch et al., Cancer Detection and Prevention, 26(Suppl.1):402(2002)).
본 발명자들에 의해 수행된 연구는 글리오마 레플리킨이 정상적인 건강한 인간 게놈 내에서 나타나지 않음을 나타내었다. 따라서 레플리킨 서열의 기원 및 가능한 상동체에 대한 검색이 다양한 생물체의 공표된 서열의 분석에 의해 수행되었다.
주형으로서 16-머 글리오마 레플리킨 서열을 이용하고 일부 다른 생물체 단백질의 핵산 서열을 시각적으로 스캔하도록 인식 단백질 시스템을 구성함으로서 새로운 클래스의 펩타이드, 레플리킨이 확인되었다. 본 발명은 레플리킨 서열을 포함한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 확인하는 방법을 제공한다. 본 방법은 여기서 3-포인트-인식 방법으로 표기된다. 본 3-포인트-인식 방법은 : (1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기; (2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및 (3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기(레플리킨)를 포함한 약 7∼50 아미노산 펩타이드로 구성된다. 이들 펩타이드 또는 단백질은 복제, 형질전환 또는 산화환원 기능을 지닌 조류, 효모, 진균, 아메바, 박테리아, 식물, 바이러스 및 암 단백질을 포함한 신균한 펩타이드 종류로 구성된다. 레플리킨 펩타이드는 더 큰 "복제" 및 "형질전환" 단백질 내에 집중되어 있음이 발견되었다(이들 연구자들에 의해 명명됨 표 2 참조). 어떠한 서열도 말리그닌 16-머 펩타이드와 동일한 것으로 나타나지 않았다.
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레플리킨 또는 레플리킨를 포함한 것 즉, 글리오마 펩타이드, kagvaflhkk의 상동체의 아미노산 서열의 확인은 하기 3가지의 필요조건을 충족시키는 것을 필요로 한다. 3 포인트 인식 시스템에 따라 서열은 세가지 요소를 지닌다 (1) 또다른 리신 잔기로부터 6∼10번 잔기에 위치한 하나 이상의 리신 잔기; (2) 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및 (3) 약 7∼50개 잔기의 아미노산 서열 내에 적어도 6% 이상의 리신 조성.
데이터베이스는 레플리킨 서열을 포함한 단백질 서열용 National Libary Medicin 키워드 "PubMed" 기술자(descriptor)를 이용하여 검색되었다. 4,000 단백질 서열에 걸쳐 상동체에 대해 시각적으로 조사되었다. PubMed-분류된 단백질의 각 군 내의 모든 개별적인 단백질의 서열이 상기-목로된 필요조건을 충족시키는 펩타이드에 대해 시각적으로 스캔되었다. 상동체의 드문 발생은 전체(1.5%)로서 "바이러스 펩타이드" 내에서 관찰되었고 다른 펩타이드에서 "뇌 펩타이드" 및 "신경 펩타이드"(함께 8.5%)(N=845)와 같은 악성 형질전환 또는 복제와 관련된 것으로 지정되지 않았다. 그러나 놀랍게도 상동체는 박테리아, 조류 및 바이러스 내 복제에서 확립된 기능을 지닌 것으로 확인된 큰 "복제 단백질" 내에서 유의적으로 더 자주 확인되었다. 더욱 놀라운 것은 레플리킨 상동체가 "종양 바이러스"의 100%(N=250), "암 단백질"(N=401)의 97% 및 "형질전환 바이러스"(N=248)의 85%에서 발견되었다는 것이다. 이들 결과는 세포 타입에 관계없이 암 발병의 공유된 성질이 있음을 제안하고 발암의 바이러스의 역할 즉, 세포의 형질전환되었으나 잠복 상태에서 더욱 악성의 활성적으로 복제하는 상태로의 전환을 제안한다.
3 포인트 인식 방법에 의해 정의된 바와 같이 하기 아미노산 서열, kagvaflhkk의 상동체는 아데노바이러스, 렌티바이러스, a-바이러스, 레트로바이러스, 아데노-관련 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 옥수수 줄무늬(streak) 바이러스, 헤르페스 바이러스, 소 헤르페스 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 아구창 바이러스, 천연두 바이러스, 라우스육종 바이러스, 뉴로블라스토마 RAS 바이러스 종양 유전자, 폴리아마바이러스, 신드비스(sindbis), 인간 유두종 바이러스, 골수성단구 종양 바이러스, 쥐 급성 백혈병, T-세포 임파추향성 바이러스 및 토마토 잎 컬 바이러스와 같은 바이러스 또는 바이러스성 펩타이드 내에서 발견되었으나 이에 한정적인 것은 아니다.
레플리킨은 아세토박터, 아크로모박터, 악티노마이세스, 에어로박터, 알칼리게네스, 아트로박터, 아조토박터, 바실러스, 브레비박테리움, 차이니아, 클로스트리듐, 코리네박테리움, 얼위니아, 에스케리아, 레브시엘라, 락토바실러스, 헤모필러스, 플라보박테리움, 메틸로모나스, 마이크로코커스, 미코박테리움, 미코놈스포라, 미코플라스마, 네이세리아, 노카르디아, 프로테우스, 슈도모나스, 리조비움, 살모넬라, 세라티아, 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 스트렙토마이세스, 스트렙토스포란지움, 스트렙토비티실리움, 비브리오, 펩타이드 및 크산토마스와 같은 박테리아 내에 존재하나 이에 한정적인 것은 아니다.
레플리킨은 페니실리움, 디세울라, 오피오스토마 노보-우림, 미코피코프타, 피토프토라 인페스탄스, 압시디아, 아스퍼질러스, 칸디다, 세파로스포리움, 퓨사리움, 한세눌라, 뮤코, 페시로마이세스, 피키아, 리조퍼스, 토룰롭시스, 트리코더마 및 에리시페와 같은 진균에 존재하나 이에 한정적인 것은 아니다.
레플리킨은 사카로마이세스, 크립토코커스 네오폴마스를 포함한 크립토코커스, 스키조사카로마이세스 및 오리자와 같은 효모에 존재하나 이에 한정적인 것은 아니다.
레플리킨은 칼도페라, 이소레피스프롤리페라, 콘드러스, 그라실라리아, 겔리디움, 카울레르파, 라우렌시아, 클라도펙사, 사가슘, 페니실로스, 할리메다, 라미나리아, 퓨커스, 아스코필럼, 운다리, 로디메니아, 마르코시스티스, 유케우마, 안펠티아 및 테로클라시아와 같은 조류 내에 존재하나 이에 한정적인 것은 아니다.
레플리킨은 엔타메바(엔타메바 인바덴스 포함), 아메비데, 아칸타메바 및 네글레리아를 포함한 아메바 내에 존재하나 이에 한정적인 것은 아니다.
레플리킨은 아라비돕시스, 소맥, 쌀 및 옥수수 내에 존재하나 이에 한정적인 것은 아니다.
보조적인 명시
레플리킨의 서브타입의 분류를 가능하게 하기 위해 기본적인 "3-포인트-인식" 필요조건에 대해 추가적이거나 "보조적인 명시"가 첨가된다 : (a) 구조적 기초 상에서 암 세포 단백질(즉, 형질전환 단백질 P21B(K-RAS2B), 폐, 표 2, 서열번호: 89) 내 인접 디(di)- 및 폴리리신 및 TOLL-유사 수용체 내 인접 디-아미노산의 일반적인 발생과 같은 또는 (b) 기능적인 기초 상에서 표 2에 나타난 바와 같은 전시 ATPase, 티로신 키나제 또는 산화환원 활성과 같은.
기능적 유도체
여기서 기술된 레플리킨의 "기능적 유도체"는 레플리킨에 특이적인 항체와의 면역적 교차 반응성의 적어도 일부를 보유한 레플리킨의 단편, 변이체 또는 화학적 유도체이다. 레플리킨 펩타이드의 단편은 어떠한 분자 서브세트도 나타낸다. 변이체 펩타이드는 예를 들어 당 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 직접적인 화학 합성에 의해 제조된다. 비-천연 단백질에 대한 레플리킨의 아날로그는 전체 단백질 또는 그의 단편과 유사하다. 레플리킨의 화학적 유도체는 펩타이드 또는 펩타이드 단편의 정상적인 일부가 아닌 부가적 화학 모이어티(moiety)를 포함한다.
도 2에 나타난 바와 같이 혐기성 복제동안 세포 복제 속도가 증가할 때 말리그닌은 증가한다. 즉, 말리그닌은 세포 수 및 총 멤브레인 단백질의 증가에 단순히 비례하여 증가하지 않고 휴지기에서의 총 멤브레인 단백질의 3%에서 시작하여 30%까지 도달하는 10배 농도만큼 증가한다. 글리오마 세포 복제에 따른 레플리킨 농도의 두드러진 증가의 이러한 분명한 증거는 다양한 생물체 내의 3-포인트-인식 방법으로 확인된 레플리킨의 존재와 일치한다. 예를 들어 레플리킨은 "사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 복제 결합 단백질" (hsikrelgiifdk)(서열번호: 2); "옥수수 스테이크 바이러스의 복제 관련 단백질 A" (kyivcareahk(서열번호: 8) 및 kekkpskdeimrdiish(서열번호: 9); "스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 복제-관련 단백질" (kkektthnk)(서열번호: 10); "소 헤르페스 바이러스 4의 DNA 복제 단백질" (hkinitngqk)(서열번호: 11); 및 "밀리그리드(Mealigrid) 헤르페스 바이러스 1 복제 결합 단백질" (hkdlyrllmk)(서열번호: 12)과 같은 단백질 내에서 확인되었다. 토마토 잎 컬 게미니 바이러스의 연구는 바이러스 축적의 조절이 바이러스 복제 동안 바이러스의 "복제 단백질"의 1-160 아미노산을 잎 단백질 및 다른 복제 단백질 분자에 결합시키는 것을 포함하는 것으로 보임을 나타내었다. 이러한 서열의 분석은 이러한 "복제 단백질"의 1-163 아미노산이 5개의 레플리킨 즉, kfrinaknyfltyph(서열번호: 13), knletpvnklfiricrefh(서열번호: 14), hpniqaaksstdvk(서열번호: 15), ksstdvkaym dkdgdvldh(서열번호 : 16) 및 kasalnilrekapkdfvlqfh(서열번호: 17)을 포함함을 나타내었다.
표 2는 레플리킨-함유 단백질이 세포 복제뿐만 아니라 산화환원반응 기능 및 단백질 합성 또는 신장에 빈번하게 관련됨을 나타낸다. 금속-기본 산화환원반응 기능과의 관련성, 혐기성 복제 동안 레플리킨-함유 글리오마 말리그닌 농도의 증가 및 낮은 농도(피코그램/세포)에서의 항말리그닌의 세포독성(도 4c-f) 모두 레플리킨이 중추 호흡 기능에 관련되고 이는 더욱 표면적인 위치 또는 덜 중심적인 생존 기능의 단백질의 돌연변이 특성을 덜 자주 겪게된다.
특히, 100 아미노산 당 적어도 하나 이상의 레플리킨이 조사된 인플루엔자 바이러스의 거의 모든 개별적인 스트레인의 헤마그글루티닌 단백질 내에 존재하는 것으로 나타남이 관찰되었다. 아미노산 서열 데이터가 이용가능한(1902-2001) 각각의 년도에 있어서 4개의 유행하는 인플루엔자 바이러스의 각 스트레인인 인플루엔자 B, H1N1, H2N2 및 H3N3의 분리체의 헤마그글루티닌 단백질 내에서 발생하는 것으로 관찰된 레플리킨 서열이 하기 표 3, 4, 5 및 6에 나타나 있다.
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농도 및 타입 모두 즉, 관찰된 레플리킨의 조성물은 인플루엔자 유행병 및 전염병의 발생에 관련되는 것으로 나타났다. 인플루엔자 바이러스 내의 레플리킨의 농도는 지닌 세기에 걸쳐 매년 즉, 1900년부터 2001년까지 전세계의 인간 및 동물 저장기로부터 분리된 인플루엔자 스트레인에 대한 National Libarary of Medicine "PubMed" 데이터베이스에 공표된 헤마그글루티닌 아미노산 서열을 시각적으로 스캐닝함으로서 조사되었다. 이들 레플리킨 농도(100 아미노산 당 레플리킨의 수, 평균 +/- SD)가 각 스트레인에 대해 플롯되었다.
레플리킨의 농도는 인플루엔자의 유행병 및 전염병 발생에 직접적으로 관련된 것으로 나타났다. 인플루엔자 B 헤마그글루티닌 및 인플루엔자 A 스트레인, H1N1 내에서 발견된 레플리킨의 농도는 도 7에 나타나 있고, 2개의 다른 일반적인 인플루엔자 A 스트레인, H2N2, 및 H3N2 내에서 발견된 레플리킨의 농도는 도 8에 나타나 있다(H2N2, H3N2). 또한 도 8 내의 데이터는 이의 성분 레플리킨(H3N2(R))에 의해 정의된 바와 같은 인플루엔자 바이러스의 새로운 출현 스트레인도 나타낸다.
인플루엔자 A 각 스트레인은 각각 1918년, 1957년, 1968년의 유행병의 원인이었다. 도 7 및 8 내의 데이터는 100 아미노산 당 적어도 하나 이상의 레플리킨이 조사된 일반적인 4개의 인플루엔자 바이러스의 모든 분리체의 인플루엔자 헤마그글루티닌 단백질 내에 각각 존재함을 나타내고 복제의 생존 레벨의 유지에 있어서의 레플리킨의 기능을 제안한다. 1990년대에 H3N2 스트레인의 감소 동안 H3N2의 많은 분리체 내에 어떤 레플리킨도 존재하지 않았으나 높은 농도의 새로운 레플리킨이 H3N2에 나타나서 H3N2(R) 스트레인의 출현을 정의하였다.
레플리킨 농도의 일부 성질이 4개의 모든 인플루엔자 바이러스 스트레인에 일반적인 것으로 도 7 및 도 8에 나타나있다. 첫 번째로, 농도는 2∼30년의 기간에 걸쳐 발생하는 상승 및 하락의 단일 사이클을 지닌 시대에 걸쳐 주기전이다. 이러한 상승 및 하락은 헤마그글루티닌 및 뉴라미니다제 분류에 의해 개별적이 인플루엔자 바이러스 스트레인 지배의 알려진 왁싱(waxing) 및 웨이닝(waning)과 일치한다. 두 번째로, 유행병에 원인이 되는 것으로 앞서 나타난 인플루엔자 바이러스 각 스트레인의 레플리킨 최대 농도는 유행병의 각 3년에 특이적이고 개별적으로 관련되는 것으로 관찰되었다. 예를 들어 인플루엔자 바이러스 스트레인, H1N1이 원인인 것으로 판명되었던 1918년의 유행병의 경우 H1N1 내의 레플리킨의 최대 농도(P1)가 독립적으로 발생하였고; H2N2가 출현하여 원인인 것으로 판명되었던 1957년의 유행병의 경우 H2N2 내의 레플리킨의 최대 농도가 발생하였고(P2); H3N2가 출현하여 유행병의 원인으로 판명되었던 1968년의 유행병의 경우 H3N2 내의 레플리킨의 최대 농도가 발생하였다(P3). 세 번째로, 상기 3가지 유행병을 바로 뒤따르는 년도에서 특정한 레플리킨 농도는 급격히 감소하였고, 아마도 각 경우에서 생성된 넓게 분포된 면역성을 반영하였다. 따라서 이러한 후-유행병 감소는 원인이 되고 그 때 모든 스트레인의 일반적인 특성은 아닌 유행병(P1)을 바로 뒤따르는 H1N1에 특이적이다. 인플루엔자 B에서의 레플리킨 농도의 증가는 H1N1 즉, 가장 높은 사망률을 지닌 인플루엔자 B 전염병과 관련된 1951년의 EB1 및 1976년의 EB2 내의 레플리킨 농도의 감소와 동시에 발생하였다(Stuart-Harris, et al., Edward Arnold Ltd.(1985)). 네 번째로, 농도에서 초기 최대 농도 증가를 초과하는 두 번째 최대 농도는 3개 유행병의 15년 후 발생하였고, 이러한 두 번째 최대점은 전염병에 의해 동반되었다: H1N1 '전염성' 년도의 1918년 유행병 15년 후(E1); H2N2 '전염성' 년도의 1957년 유행병 8년 후(E2); H3N2 '전염성' 년도의 1968년 유행병 7년 후(E3). 이들 특이적인 레플리킨의 두 번째 최대 농도는 스트레인의 회복을 반영한다. 다섯 번째로, 각 스트레인의 특이적인 레플리킨 최대 농도는 종종 하나 또는 다른 두 스트레인 모두의 레플리킨 농도의 감소와 관련되는 것으로 보이고 두 스트레인 사이에서 숙주 사이트에 대한 경쟁을 제안한다. 여섯 번째로, 각 스트레인의 레플리킨 농도의 35년(H2N2) 내지 60년(인플루엔자 B)의 기간에 걸친 감소의 분명한 총체적 경향이 있다. 이러한 감소는 인플루엔자 백신의 일반적인 사용에 앞서 1901년부터 1964년까지 인플루엔자 B의 경우 명백하였기 때문에 백신의 작용에 탓으로 돌릴 수 없다. 인플루엔자 B의 경우 감소로부터의 레플리킨 회복은 1965년 후 발생한 것으로 나타났으나 1997년과 2000년 사이에 다시 레플리킨 농도가 감소하였고(도 7), 이는 최근 경우 분리체에서의 인플루엔자 B의 낮은 발생과 관련된다. H1N1 레플리킨 농도는 H1N1 스트레인의 재등장 및 유행과 함께 1978-1979년에 최대였고(도 7) 이후 H1N1 전염병과 일치하여 1996년에 최대였다(도 7). 또한 H1N1 레플리킨 농도는 1997년과 2000년 사이에 감소하였고, H1N1 스트레인의 존재는 이들 동안 수득된 분리체에서 감소하였다. H2N2 레플리킨의 경우 35년 감소로부터의 회복은 발생하지 않았고(도 8), 이는 최근 분리체로부터의 H2N2의 부재와 관련된다(도 8). H3N2의 경우 많은 분리체의 레플리킨 농도는 1996년부터 2000년까지의 기간 동안 0으로 떨어졌으나 다른 H3N2 분리체는 레플리킨 농도에 있어서 유의적이고 가파른 증가를 나타내었다. 이는 여기서 H3N2(R)로 명명된 H3N2 하위-스트레인의 출현을 나타낸다.
도 7 및 8은 종종 1 내지 3년의 단계적인 증가가 레플리킨 농도가 최대에 도달하기 전에 관찰됨을 나타낸다. 이러한 단계적인 증가는 전염병의 발생을 진행시키고 레플리킨 최대점과 동시에 발생한다. 따라서 특정한 스트레인 농도의 단계적인 증가는 특정한 스트레인이 전염병 또는 유행병 원인의 가장 유력한 후보가 된다는 신호이다.
따라서 인플루엔자 바이러스의 H3N2(R) 스트레인의 레플리킨 농도는 증가하고 있다(도 8, 1997년부터 2000년까지). H3N2 레플리킨 농도에서의 앞선 3개의 유사한 최대점은 스트레인이 처음 출현한 1968년의 H3N2-기본 유행병(도 8) 및 1972년 및 1975년의 H3N2-기본 유행병에서 발생하였다(도 8). 이들 유행병 및 전염병은 각각 과도한 사망률과 관련되었다(Ailing et al., Am J. Epidemiol., 113(1):30-43 (1981)). 따라서 1997-2000년에 H3N2 레플리킨의 하위종 H3N2(R) 농도의 빠른 상승은 통계적으로 심각한 전염병 또는 유행병을 접근하는 초기 경고를 나타낸다. H3N2 전염병은 2000년 러시아에서 발생하였고(도 8, E4); 2001년 12월의 CDC 보고서는 현재 H3N2가 전세계적으로 인플루엔자 바이러스의 가장 빈번하게 분리되는 스트레인임을 보고하였다(Morbidity and Mortality Weekly Reports(MMWR), Center for Disease Control; 50(48):1084-68(Dec. 7, 2001).
인플루엔자 바이러스 유행병 또는 전염병의 각 경우에서 새로운 레플리킨이 출현한다. 주어진 분리체 내의 주어진 헤마그글루티닌의 동일한 두 레플리킨의 어떤 관찰도 없었다. 어느 정도의 새로운 레플리킨의 출현이 또다른 동물 또는 조류 풀(pool)로부터 전이된 돌연변이 바이러스를 나타내는지 알려져 있지 않다. 일부의 경우 각 년도의 하나 이상의 최초 레플리킨 구조는 보존되고, 그와 동시에 새로운 레플리킨이 출현하다. 예를 들어 인플루엔자 B 헤마그글루티닌에서 5개의 레플리킨이 1919년과 2001년 사이에 일정하게 보존되었고, 26개의 레플리킨이 동일한 기간동안 오고 갔다(일부 년도 없이 일부 재발). 특정한 레플리킨 구조의 이후의 소멸과 재-출현은 디 노보(de novo) 돌연변이를 통해서 보다는 또다른 바이러스 숙주 풀로부터 레플리킨이 되돌아옴을 나타낸다.
H1N1 레플리킨의 경우 1918년 유행병과 관련된 P1 최대점에 존재하는 2개의 레플리킨은 12개의 새로운 레플리킨을 포함하는 1933년의 E1 최대점에서는 존재하지 않았다. 따라서 일정하게 보존된 레플리킨이 단독으로 또는 결합된 백신에 대한 최상의 선택이다. 그러나 농도의 1년 증가와 동반하는 최근 나타난 레플리킨은 종종 추가적인 1년 이상 동안 지속하고 증가하고 농도 최대점 및 전염병에서 최고점에 이르고 따라서 초기 경고와 합성 레플리킨으로의 예방접종 시간 모두를 제공한다(예를 들어 1990년대 초 H1N1, 도 7).
도 7 및 8의 데이터는 인플루엔자 단백질 서열의 특정한 레플리킨의 존재 및 농도와 인플루엔자의 유행병 및 전염병의 발생 사이의 직접적인 관계를 나타낸다. 따라서 레플리킨의 존재 및 농도에 대한 인플루엔자 바이러스 헤마그글루티닌 단백질의 분석은 인플루엔자 백신 포뮬레이션에 대한 타겟뿐만 아니라 인플루엔자 유행병 및/또는 전염병의 예보자를 제공한다.
인플루엔자 바이러스 B 스트레인 내의 레플리킨 조성물 : 이러한 스트레인 내에서 확인된 총 26개 레플리킨 중에서(표 3) 하기 10개 레플리킨이 1902-2001년 조사된 모든 인플루엔자 B 분리체에 존재한다. 겹치는 레플리킨 서열은 별도로 목록된다. 리신 및 히스티딘은 "3-포인트-인식"과 일치하는 상동성을 나타내기 위해 굵은 글자체이다.
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표 3 및 4는 H1N1 레플리킨과 비교하여 인플루엔자 헤마그글루티닌 내의 레플리킨 구조의 훨씬 더 큰 안정성이 있음을 나타낸다. 인플루엔자 B는 어떤 유행병의 원인도 되지 않았고 동물 또는 조류 저장기를 지니지 않는 것으로 나타난다(Stuart-Harris et al., Edward Arnold Ltd., London(1985)).
인플루엔자 H1N1 레플리킨 : 단 하나의 레플리킨 "hp(v/i)tigecpkyv (r/k)(s/t)(t/a)k"이 서열이 스트레인이 처음 나타났고 그 년도의 유행병을 유발한 1918년으로부터 2000년까지 유용한 모든 H1N1 분리체 내에 존재한다(표 4). ("(v/i)"는 아미노산 v 또는 irk 다른 년도에 동일한 위치에 존재함을 나타냄) H1N1이 단지 하나의 지속적인 레플리킨을 포함하더라도 H1N1은 인플루엔자 B보다 더 다산(prolific)인 것으로 나타난다. H1N1 상의 82년 내 95개의 다른 레플리킨 구조에 반해 인플루엔자 B 분리체의 100년 내에 31개의 다른 레플리킨이 있다(표 4). 새로운 레플리킨 구조 수의 증가는 전염병의 년도에 발생하고(표 3, 4, 5 및 6), 증가된 총 레플리킨 농도와 관련된다(도 7 및 8).
인플루엔자 H2N2 레플리킨 : 인플루엔자 H2N2는 1957년 인간 유행병이 원이이었다. 1957년 본 스트레인 내에서 확인된 20개 레플리킨 중 3개는 1995년까지 PubMed의 조사에 유용한 H2N2 분리체에 보존되었다(표 5).
ha(k/q/m)(d/n)ilekthngk (서열번호 : 232)
ha(k/q/m)(d/n)ilekthngklc(k/r) (서열번호 : 233)
kgsnyp(v/i)ak(g/r)syntsgeqmliiwq(v/i)h (서열번호: 238)
그러나 H1N1과 대조적으로 1961년 단지 13개의 부가적인 레플리킨이 H2N2 시작에서 발견되었다. 이러한 새로운 레플리킨 등장의 소량은 H2N2 레플리킨의 농도 감소 및 년도에 걸쳐 분리체 내의 H2N2의 등장과 관련된다.
인플루엔자 H3N2 레플리킨 : 인플루엔자 H3N2는 1968년 인간 유행병의 원이었다. 1968년에 나타난 5개의 레플리킨이 1977년 후 소멸되었으나 1990년대 재등장하였다(표 6). 22년 동안 지속된 레플리킨 구조는 hcd(g/q)f(q/r)nekwdlf (v/i)er(s/t)k였고, 1997년에 처음 등장하였고 1998년까지 지속되었다. 12개의 1990년대 중반의 새로운 H3N2 레플리킨의 출현은 동시에 레플리킨 농도의 증가 및 최근 분리체 내의 H3N2 스트레인의 보급과 연관되었다. 이들 분리체로부터의 모든 레플리킨의 동시적인 소멸과 함께 이는 새로운 하위스트레인 H3N2(R)의 출현을 나타낸다.
도 1 및 2는 그의 소멸 후 1 내지 59년에 적어도 하나 이상의 레플리킨의 재등장에 기인한 인플루엔자 전염병 및 유행병이 인플루엔자 바이러스 내의 증가된 인플루엔자 레플리킨 농도와 연관됨을 나타낸다. 또한 A 스트레인에서 새로운 스트레인-특이적인 레플리킨 조성물의 출현이 있다(표 4-6). 단일 단백질 내외 개별적인 레플리킨의 반복에 의한 레플리킨 농도의 증가는 인플루엔자 바이러스에서 발생하지 않고 다른 생물체에서 보여짐을 나타낸다.
다른 인플루엔자 스트레인의 활성의 변화가 인플루엔자 헤마그글루티닌의 서열 변화와 관련되고 이는 뒤이어 하나 이상의 2개의 불충분하게 이해된 과정에 의해 효과적인 치환 생성물이 된다 : ⅰ) 헤마그글루티닌 분자 내의 점돌연변이의 연속의 축적에 의한 항원성 드리프트; 또는 ⅱ) 변화가 매우 커서 유전적 재분류가 인간과 비-인간 숙주의 바이러스 사이에서 발생하는 것이 자명한 항원성 쉬프트. 먼저, 본 데이터는 다른 인플루엔자 스트레인의 활성 변화가 비-특이적 서열 변화와 관련되기 보다는 스트레인-특이적 레플리킨의 증가된 농도 및 전염병과 관련된 레플리킨의 스트레인-특이적 증가에 근거를 두거나 관련된다. 더욱이 데이터는 서열 변호가 "드리프트" 또는 "쉬프트"에 의한 것이고, 저장기 내에서의 보존, 보관, 이후의 재등장에 기인한 것이라는 가능성 있는 견지에 대해 조사되었다. 데이터는 레플리킨 농도에서의 전염병-관련된 증가는 헤마그글루티닌 당 존재하는 레플리킨의 복제에 기인하는 것이 아니라 그의 소멸후 1 내지 59년에 적어도 하나 이상의 레플리킨 조성물의 재출현 A 스트레인만의 경우는 새로운 스트레인-특이적 레플리킨 조성물의 출현에 기인한 것이다(표 3-6). 따라서 1951년 및 1977년의 인플루엔자 B 유행병에서의 레플리킨 농도의 증가는 유행병의 년도의 새로운 레플리킨 조성물의 출현과 관련된 것이 아니라 앞선 년도에 나타났다가 이후 소멸된 년도의 레플리킨 조성물의 재등장과 관련된다(표 3). 이와 대조적으로 A 스트레인의 경우 앞서 소멸된 바이러스 레플리킨의 재등장에 더하여 새로운 조성물이 나타난다(즉, 6개 초기 레플리킨의 재등장 이외에 1996년의 유행병의 년도의 H1N1에서 10개 새로운 조성물이 출현됨). 인플루엔자 B가 아닌 A 스트레인만이 비-인간 동물 및 조류 저장기에 접근하기 때문에 전체 새로운 조성물은 "3-포인트-인식"의 기본 요구조건 이외에 어떤 새로운 조성물에 대한 유사점을 지니지 않은 것으로 보이는 현존 인간 레플리킨의 돌연변이보다는 비-인간 숙주 저장기로부터 파생된다(표 2-5). B와 비교하여 H1N1의 더욱 많은 다산성 및 유행병이 B 스트레인에 의해서가 아닌 3개의 A 스트레인에 의해서 생성되었다는 사실 모두는 비-인간 바이러스성 저장기로부터 새로운 레플리킨 조성물을 수용하는 인간 A 스트레인의 능력의 기능이다.
일부 레플리킨은 1년만 나타나고 소멸하고 지금까지 재등장하지 않았다(표 3-6). 다른 레플리킨은 동일한 레플리킨 서열이 재등장할 때 1 내지 81년 동안 소멸하였다. 중요한 레플리킨 "k" 및 "h" 아미노산 및 그들 사이의 공간이 하기 스트레인-특이적 레플리킨에 있어서 표 3-6에 나타난 바와 같이 많은 년도에 걸쳐 부재 후 동일한 레플리킨의 재등장 동안뿐만 아니라 특정한 레플리킨의 일정한 존재 동안 보존된다 : 10개의 인플루엔자 B, H1N1의 단일 레플리킨 및 H2N3의 단일 레플리킨. 헤마그글루티닌 서열 나머지의 내부 및 외부 레플리킨 구조 모두 뛰어난 다른 아미노산 대치 또는 치환 활성에도 불구하고 인플루엔자 레플리킨 히스티딘(h)는 절대로 대치되지 않고 리신(k)은 거의 대치되지 않는다. 이러한 보존의 예는 1918년과 2000년 사이에 일정한 H1N1 레플리킨 "hp(v/i)tigecpkyv(r/k)(s/t) (t/a)k"(서열번호: 135), 1975년과 1998년 사이에 일정한 H3N2 레플리킨 "hcd(g/q)f(q,r)nekwdlf(v/i)er(s/t)k"(서열번호: 277) 및 1975년 처음 나타나고 25년 동안 소멸한 후 2000년에 재등장한 H3N2 레플리킨 "hqn(s/e)(e/q)g(t/s)g(q/v)aad(l/q)kstq(a/n)a(i/l)d(q/g)I(n/t)(g/n)k,(l/v)n(r/s)vi(e/c)k(서열번호: 276)에서 보여진다. 많은 아미노산이 치환되는 반면 2 리신, 5 내지 10 잔기, 하나의 히스티딘의 레플리킨 기본 구조, 약 50개 아미노산 이하 내의 최대 6% 리신이 보존되었다.
전체적인 무작위 치환은 이들 H1N1 및 H3N2의 지속 또는 1902 내지 2001년의 인플루엔자 B에서 10개 레플리킨 구조의 지속 또는 74년의 부재 후 1919년 18-머 레플리킨의 1993년의 재등장을 가능하게 하지 않는다. 무작위 형태의 치환 보다는 불변성이 규칙적으로 조절된 과정 또는 최소한 중요한 레플리킨 잔기의 보호를 나타내어 이들이 어떤 방법으로 고정되거나 결합된다 : 리신은 핵산에 결합되고, 헤스티딘은 호흡 산화환원반응 효소에 결합됨. 이러한 보존을 제어하는 메카니즘은 현재 알려져 있지 않다.
레플리킨 구조의 보존
레플리킨 구조가 보존되는지 또는 광범위한 자연 돌연변이를 하는지 여부가 바이러스의 단백질 내 돌연변이가 수십년간 세계적으로 잘 기록된 아구창 바이러스(FMDV)의 다양한 분리체의 단백질 서열을 스캔함으로서 조사되었다. FMDV 분리체의 단백질 서열은 전체 레플리킨과 특정 레플리킨에서 관찰된 레플리킨 아미노산 성분 각각 모두의 존재에 대해 시각적으로 조사되었다.
이웃 아미노산 내에서 발생하는 것과 같이 시간에 걸쳐 광범위한 치환 보다는 레플리킨 구조를 구성하는 아미노산은 거의 또는 전혀 치환하지 않는다 즉, 레플리킨 구조는 보존된다. 예를 들어 FMDV 타입 0의 VP1 단백질에서 레플리킨 "hkqkivapvk"(서열번호: 3)이 PubMed에서 보고된 236개의 분리체의 78%에서 보존되었음이 판명되었고 각 아미노산은 하기 개별적인 분리체에서 보존되었음이 판명되었다 : h, 95.6% ; k, 91.8%; q 92.3%; k, 84.1%; i, 90.7%; v, 91.8%; a, 97.3%; p, 96.2%; a, 75.4%; and k, 88.4%. 높은 보존율은 레플리킨 구조의 구조적 및 기능적 안정성을 제안하고 치료를 위한 일정한 타겟을 제공한다.
유사하게는, 서열 보존은 레플리킨에 대해 HIV 타입 1 내의 "kcfncgkegh"(서열번호: 5) 또는 "kvylawvpahk"(서열번호: 6) 및 HIV 타입 2 내의 "kcwncgkegh"(서열번호: 7)과 같이 HIV의 다른 분리체 내에서 관찰되었다(표 2). 서열 보존의 또다른 예는 중요한 리신 및 히스티딘 아미노산이 보존된 "hclvcfqkkglgisygrkk"(서열번호: 613)과 같은 HIV tat 단백질에서 발견되었다.
유사하게는, 서열 보존은 예를 들어 소맥 유비퀴틴 활성 효소 E(서열번호 614∼616)와 같이 소맥과 같은 식물 내에서 관찰되었다. 소맥 내 레플리킨은 기술된 바와 같이 식물 생장 자극의 신뢰할만한 타겟도 제공한다. 보존의 다른 예는 글리오마 세포의 10년의 조직 배양에 결쳐 연속적인 세대 내 말리그닌의 일정한 존재 및 미국, 영국, 유럽 및 아시아로부터의 8,090 인간 혈청으로부터 면역흡착에 의해 분리된 항말리그닌 항체에 대한 글리오마 레플리킨의 어피니티의 불변성(즉, 도 5 및 미국 특허 제6,242,875 B1)에 의해 나타난다.
유사하게는 보존은 HIV의 분리체 내 트랜스-활성자(Tat) 단백질 내에서 관찰되었다. Tat(트랜스-활성자) 단백질은 렌티바이러스 전사를 조절하는 초기 RNA 결합 단백질이다. 이들 단백질은 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 같은 모든 알려진 렌티바이러스의 수명 기간 내 필요 성분이다. Tat은 트랜스-활성화 반응 서열(TAR) RNA 요소에 결합함으로서 작용하고 LTR 프로모터로부터 전사 억제 및/또는 신장을 활성화하는 전자 조절자 단백질이다. HIV는 tat 없이는 복제할 수 없으나 이의 화학적 근거는 알려져 있지 않다. 89부터 102까지의 잔기의 HIV tat 단백질 서열에서 우리는 다른 생물체 내 빠른 복제와 관련됨을 발견하였다. 이러한 레플리킨의 아미노산 서열은 "hclvcfqkkglgisygrkk"이다. 사실상, 우리는 이러한 레플리킨이 모든 HIV tat 단백질 내에 존재함을 발견하였다. 일부 tat 아미노산은 표 8에 나타난 바와 같이 대안 아미노산으로 빈번하게 치환된다(가장 빈번한 아미노산 아래에 작은 글자 크기로 늘어선(표 7) 우세 레플리킨 "hclvcfqkkglgisygrkk"의 보존 백분율). 이들 치환은 대부분의 개별적 아미노산에 나타났다. 그러나 레플리킨 구조를 정의하는 레플리킨 서열내 중요한 리신 및 히스티딘 아미노산은 서열 내에서 100% 보존된다; 치환은 레플리킨 내 및 외부 모두의 다른 아미노산의 모든 곳에서 흔한 반면 이들 중요한 리신 아미노산에서는 전혀 발생하지 않는다.
표 7에 나타난 바와 같이 tat 단백질 아미노산 서열 내에서 리신이 치환되지 않는 것은 사실이 아니다. 레플리킨 서열의 외부인 표의 좌측으로부터 바로 옆 서열 내 첫 번째 리신 및 레플리킨 형성에 필수적이지 않은 "여분의" 것인 레플리킨 내부 서열 내 두 번째 리신(k)은 모두 빈번하게 치환된다. 그러나 레플리킨 구조를 함께 설치하는 괄호안의 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 리신 및 하나의 히스티딘은 치환되지 않는다. 따라서 중요한 아미노산 서열은 100% 보존된다. 인플루엔자 바이러스 레플리킨의 경우에 관찰된 바와 같이 무작위 치환은 이러한 선택적 치환 및 선택적 비-치환이 우연히 발생하는 것을 가능하게 하지 않는다.
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레플리킨 구조의 보존은 레플리킨 구조가 저장되거나 보존되어야 하는 HIV 바이러스의 특이적인 생존 기능을 지니고, 항체 및 다른 '공격'을 피하기 위해 크레스트가 있는(crested) 아미노산 치환의 바이러스 '방어' 기동에 희생될 수 없음을 제안한다. 이들 '방어' 기능은 필수적이나 HIV 복제의 바이러스 생존 기능과 '경쟁'할 수 없다.
또한 서열 보존은 레플리킨에 대해 HIV 타입 1 내의 "kcfncgkegh"(서열번호: 5) 또는 "kvylawvpahk"(서열번호: 6) 및 HIV 타입 2 내의 "kcwncgkegh"(서열번호: 7)과 같이 HIV의 다른 분리체 내에서 관찰되었다.
또한 FMVD 및 HIV 레플리킨 내에서 관찰된 높은 보존율은 인플루엔자 레플리킨 내에서 관찰된 보존이 바이러스성 레플리킨의 일반적인 성질임을 나타낸다. 이러한 보존은 글리오마 레플리킨에 대해 설명된 인플루엔자, FMVD 또는 HIV 백신의 경우와 같이 특이적인 레플리킨을 이용함으로서의 파괴 또는 자극에 대해 불변의 신뢰할만하게 타겟이 되게 한다.
유사하게는, 레플리킨 내 높은 보존율이 보존이 바이러스 레플리킨의 일반적인 성질이고 따라서 레플리킨을 파괴 또는 자각에 대한 일정하고 신뢰할만한 타겟이 되게함을 제안하는 인플루엔자 바이러스, FMDV 및 HIV를 포함한 바이러스에서 발견된 예에서 제공된 바와 같이 레플리킨 구조의 보존은 식물에서 발생한다. 예를 들어 소맥 식물에서 레플리킨은 보존되고 자극에 대한 신뢰할만한 타겟을 제공한다. 소맥 식물 유비퀴틴 활성화 효소 E 내서 보존된 레플리킨의 예는 :
E3 hkdrltkkvvdiarevakvdvpeyrrh (서열번호: 614)
E2 hkerldrkvvdvarevakvevpsyrrh (서열번호: 615)
E1 hkerldrkvvdvarevakmevpsyrrh (서열번호: 616)
* * * ** *
HIV tat 단백질 내에서 발견된 보존과 유사하게, 소맥 유비퀴틴 활성화 효소 E 내의 레플리킨이 보존된다. HIV tat 단백질에서와 같이 소맥 유비퀴틴 활성화 효소 E 내 레플리킨 변이체 형태에 인접한 아미노산의 치환('*'로 표시)이 흔하다. 그러나 레플리킨 구조를 형성하는 중요한 k 및 h 아미노산은 변하지 않는 반면 단지 5 아미노산인(좌측 첫 번째 k로부터) '비필수적' k는 치환된다.
항-레플리킨 항체
항-레플리킨 항체는 레플리킨에 대한 항체이다. 또한 항-레플리킨 항체 데이터는 레플리킨 클래스 통일성을 지지한다. 항-레플리킨 항체 반응은 고정된 말리그닌에 대한 혈청 항말리그닌 항체의 면역흡착에 의해 정량화되었다(Methods in U.S. Patent #5,866,690 참조). 서열이 탄수화물 또는 다른 군이 없는 말리그닌으로부터 유도된 16-머 펩타이드의 합성 버전의 토끼로의 투여에 의해 항말리그닌 항체의 많은 생성은 엄밀하게 이러한 펩타이드 단독이 에피토프이라는 것, 즉, 이러한 면역 반응의 충분한 기초라는 것을 확립하였다(도 3). 16-머 펩타이드는 항체의 IgM 및 IgG 모두를 생성하였다. 항말리그닌 항체는 감염 후 15 내지 25년에 발달하는 간암의 일반적인 관찰 훨씬 전에 감염 후 첫 번째 5년에 먼저 간염 B 및 C의 미국 및 아시아의 79가지 경우의 37% 내 혈청에서 농도가 증가됨이 판명되었다. 전염성 간염 및 HIV 감염 모두에 관련하여 형질전환된 세포는 바이러스에게 안전한 형태의 하나이다 : 세포 수명을 연장시키고 바이러스 축출을 방지하여 바이러스가 항-바이러스성 치료에 어렵게 됨.
레플리킨의 투여는 세포독성 효과를 지닌 항체를 생성하도록 면역체계를 자극하기 때문에 주어진 시간 기간에 걸쳐 가장 농축되는 것으로 관찰된 특정한 인플루엔자 바이러스 레플리킨 또는 레플리킨 그룹에 근거한 펩타이드 백신은 주어진 인플루엔자 시즌에서의 아웃브레이크를 유발하기 쉬운 특정한 인플루엔자 스트레인 즉, 출현 스트레인 또는 재-출현 스트레인에 대한 보호를 제공한다. 예를 들어 1년 또는 2년을 기초로 한 인플루엔자 바이러스 헤마그글루티닌 아미노산 서열의 분석은 그 년도에 대한 특정하게 타겟된 인플루엔자 백신을 포뮬레이트하는데 유용한 데이터를 제공한다. 이러한 분석은 지역단위로 또는 원하는 시간 기간에 수행되어 전세계를 통틀어 다른 지역 내에서 출현한 스트레인이 검출될 수 있고 각 지역에 대해 특이적으로 타겟된 백신이 포뮬레이트될 수 있다는 것이 이해된다.
인플루엔자
현재 백신 포뮬레이션은 국제 WHO 및 CDC 미팅에서 매년 2번 변화된다. 백신 포뮬레이션은 주어진 지역 내 인플루엔자 바이러스의 가장 유행하는 우세성의 혈청학적 증가에 근거가 된다. 그러나 본 발명에 앞서 인플루엔자 바이러스 스트레인 특이적 아미노산 서열 변화와 인플루엔자 전염병 또는 유행병의 발생 사이의 어떤 연관도 없었다.
특이적인 레플리킨의 관찰 및 인플루엔자 바이러스 단백질 농도는 유행병 및 전염병의 첫 번째 정량적 초기 화학적 연관성을 제공하고, 세계의 특정 지역 내 인플루엔자 바이러스의 유행하는 출현 또는 재-출현 스트레인을 치료하도록 특이적으로 맞춰진 인플루엔자 백신의 생성 및 적절한 투여를 제공한다. 레플리킨의 존재, 농도 및/또는 보존에 대해 헤마그글루티닌 단백질 서열과 같은 인플루엔자 바이러스 스트레인의 분리체의 단백질 서열을 분석함으로서 인플루엔자 바이러스 유행병 및 전염병은 예측될 수 있다. 더욱이 이러한 인플루엔자의 아웃브레이크의 심각성이 가장 풍부한 것으로 판명되거나 약 1 내지 3년과 같이 주어진 시간 기간에 걸쳐 바이러스 분리체 내에서 감소중인 것으로 나타난 레플리킨 서열에 근거한 인플루엔자 펩타이드 백신을 투여함으로서 유의적으로 감소될 수 있다.
본 발명의 인플루엔자 펩타이드 백신은 단일 레플리킨 펩타이드 서열을 포함하거나 인플루엔자 바이러스 스트레인 내에서 관찰된 다수의 레플리킨 서열을 포함한다. 바람직하게는 펩타이드 백신은 주어진 기간에 걸쳐 농도가 증가하고 적어도 그 기간에 보존된 것으로 나타난 레플리킨 서열(들)에 근거한다. 그러나 백신은 새로운 레플리킨(들) 펩타이드와 결합하여 보존된 레플리킨 펩타이드(들)를 포함하거나 새로운 레플리킨 펩타이드 서열에 근거한다. 레플리킨 펩타이드는 단지 레플리킨 서열만을 함유한 펩타이드에 근거한 백신이 바람직하더라도 화학적 합성 또는 재조합 유전자 기술을 포함한 어떠한 방법에 의해서도 합성될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 백신 조성물은 약제적으로 수용가능한 담체 및/또는 보조제도 포함한다.
본 발명의 인플루엔자 백신은 단독으로 또는 간시클로버; 인터페론; 인터루킨; 아만타딘, 리만타딘과 같은 M2 억제자; 자나미버 및 오셀타미버와 같은 뉴라미다제와 같은 항바이러스성 약물과 결합하여 투여될 수 있다.
말라리아 내 레플리킨 디코이(decoy)
메로조이트 표면 및/또는 파라시토포러스 액포 내에 위치한 플라스모듐 팔시파룸 말라리아 항원의 초기 구조의 분석은 인플루엔자 바이러스와 같이 이러한 생물체가 많은 레플리킨을 포함함을 나타내었다(표 8). 그러나 플라스모듐 팔시파룸과 인플루엔자 바이러스 분리체의 관찰 사이에는 일부 차이점이 있다. 예를 들어 플라스모듐 팔시파룸은 여기서 "레플리킨 디코이(decoy)"로 표기된 일분 부분적인 레플리킨을 포함한다. 이러한 디코이 구조는 많은 리신 잔기를 포함하나 레플리킨 구조에 필요한 히스티딘이 없다. 특히 이드 디코이는 실제 말라리아 인식과 유사한 중복 형태로 떨어진 많은 6∼10 리신 잔기를 포함하나 히스티딘 잔기는 없다. 디코이 구조는 항-말라리아 항체 또는 다른 약제가 호흡 효소 내의 레플리킨과 같은 레플리킨 내에 존재하는 히스티딘에 결합하여 트리파노솜의 파괴를 초래할 수 있기보다는 리신을 포함한 비교적 덜 중요한 구조에 결합하는 가능성을 극대화시키는 것으로 이해된다. 예를 들어 레플리킨 구조에 대한 특이성을 지닌 들어온 항체는 레플리킨 디코이 구조에 부착되어 실제 레플리킨 구조를 접촉되지 않은 상채로 둔다.
따라서 말라리아의 항-레플리킨 치료는 2가지 상태를 요구한다(이중 치료) : ⅰ) 레플리킨 디코이를 분열시키는 단백질 분해성 효소로의 초기 치료는 특이적인 항-레플리킨 치료의 '안전 통과'를 가능케하고, ⅱ) 특이적 항체나 합성 말라리아 레플리킨 백신에 의해 설계된 세포 면역성으로 또는 말라리아 레플리킨을 타겟팅하는 유기적 방법으 말라리아 레플리킨을 공격함.
레플리킨 구조의 반복 및 중복
플라스모듐 팔시파룸 내에 나타나는 또다른 차이점은 인플루엔자 바이러스에서는 관찰되지 않는 단일 단백질 내에서의 개별적인 레플리킨 구조의 빈번한 반복이다. 반복은 (a) 레플리킨들 사이에서 리신을 공유하고, (b) 또다른 레플리킨 서열 내에서의 레플리킨 서열 부분의 반복에 의해 발생한다.
인플루엔자 바이러스 분리체와 플라스모듐 팔시파룸에서 관찰된 레플리킨 구조 사이의 세 번째 유의적인 차이점은 말라리아 단백질 전체에 걸친 레플리킨 구조의 뚜렷한 중복 즉, 서열번호 393(레플리킨 농도 = 23.1/100아미노산)의 39개 아미노산 서열 내에서 9개의 중복; 및 서열번호 467(레플리킨 농도 = 36.6/100 아미노산)의 41개 아미노산에서 15개의 중복 레플리킨이다. 이들 중복 레플리킨 구조 모두 혈액 단계 트로포조이트 및 스키존트 내에서 발생한다. 이와 대조적으로 인플루엔자 바이러스 레플리킨은 단백질에 걸쳐 더욱 산포되고 최대 레플리킨 농도는 약 7.5/100 아미노산이고(도 7); 중복 레플리킨을 지닌 것으로 관찰된 토마토 잎 컬 게미니 바이러스는 단지 약 3.1/100 아미노산을 지닌다.
이러한 다수의 리신의 메카니즘은 위암 형질전환 단백질, ktkkgnrvsptmkvth(서열번호: 88)과 같은 암 단백질의 레플리킨 및 폐의 형질전환 단백질 P21B(K-RAS 2B) khkekmskdgkkkkkk(서열번호: 89)에서도 나타난다.
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구조 단백질 내 레플리킨
또한 일부 구조 단백질이 레플리킨 구조를 포함함이 측정되었다. 구조 단백질은 피부 내 콜라겐과 같은 조직 및 기관 지지대 및 예를 들어 뇌 내 아밀로이드(amyloid) A4 전구체 단백질(APP)와 같은 연결 조직 및 멤브레인 구조에 포함된 분자이다. 이들 단백질의 과다생성은 질병 특히, 피부 내 콜라겐의 과다생성의 경우 피부경화증(표 9) 및 뇌 내 APP의 과다생성의 경우 알츠하이머병과 관련된다(표 10).
피부경화증 및 말리그넌시와의 관련은 최근 동안 논쟁의 원인이었다. 상호관계의 일부 메카니즘은 이전 보고서에서 제안되었다. 최근 장-기간 연구는 피부경화증과 말리그넌시의 증가된 관련-비율을 나타낸다. 그러나 근원적인 메카니즘은 아직 알지 못한다(Wenzel, J. Eur. J. Dermatol. 2002 May-Jun; 12(3) 296-300).
피부경화증에서 단백질의 과도한 생성과 연관된 일부 단백질은 레플리킨 구조를 포함하는 것으로 나타났다. 따라서 이들은 과도한 콜라겐 생성의 억제 또는 중단에 대한 비인식된 타겟의 또다른 예이다. 표 9는 피부경화증의 단백질 및 관련된 레플리킨의 목록을 제공한다.
APP는 뇌 내 외부 세포외 공간 내에서 과도한 양으로 플락크(placque)를 형성하는 아밀로이드 베타 A4 단백질의 원료이고 알츠하이머병에서 신경 세포 손실과 관련된 독성 효과를 생성한다. 현재 대부분의 연구는 A4의 과도한 침적을 제거할 수 없음에 초점을 맞추었으나 폐기물 제거 문제라기 보다는 실제로 전구체 단백질 APP의 과다생성의 문제임이 고려되지 않았다. APP 높은 농도의 레플리킨(100 아미노산 당 3.3 레플리킨)은 과다생성이 알츠하이머병의 원인임을 강하게 제시한다. 따라서 표 10에 포함된 레플리킨은 글리오마 레플리킨에서 상세히 설명된 바와 같은 동일한 방법에 의해 차단되거나 억제될 수 있다.
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수동 면역성
본 발명의 또다른 실시태양에서 분리된 레플리킨 펩타이드는 개인에게 수동 면역성을 제공하는데 사용되는 항체를 생성하는데 사용된다. 미래의 인플루엔자 감염의 가장 가능성 높은 원인으로 본 발명의 방법에 의해 확인된 인플루엔자 스트레인에 대한 수동 면역성은 필요한 환자에게 확인된 인플루엔자 바이러스 스트레인의 레플리킨 서열에 대한 항체를 투여함으로서 수득된다. 유사하게는, 말라리아에 대한 수동 면역은 플라스모듐 팔시파룸 레플리킨(들)에 대한 항체를 투여함으로서 수득된다.
당 분야에 알려진 다양한 절차가 레플리킨 서열에 대한 항체 생성에 사용된다. 이러한 항체는 폴리클론, 모노클론, 키메릭(chimeric), 인간화된, 단일 체인, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 세포독성제에 결합되는 항체도 생성된다. 또한 항체는 항바이러스제와 조합하여 투여된다. 더욱이 다른 레플리킨에 대한 항체의 조합은 항체 칵테일로서 투여된다.
항체 생성에 있어서, 토끼, 마우스, 래트 및 더 큰 포유류를 포함하나 이에 한정적이지 않은 다양한 숙주 동물 또는 식물은 레플리킨 펩타이드 또는 레플리킨 펩타이드들이 조합을 주사함으로서 면역된다.
레플리킨에 대한 모노클론 항체는 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 이용하여서도 제조된다. 이들은 Kohler and Milstein(Nature, 1975, 256:495-497)에 의해 처음 기술된 하이브리도마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV 하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 더욱이 키메릭 항체 생성을 위해 개발된 기술(Morrison et al., 1984, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855) 또는 다른 기술이 사용된다. 대안으로, 단일 체인 항체 생성(미국 특허 제4,946,778호)에 대해 기술된 기술이 레플리킨-특이적 단일 체인 항체를 생성하는데 개조될 수 있다.
본 발명의 특히 유용한 항체는 인플루엔자 바이러스의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 내에 포함된 레플리킨 서열에 특이적으로 결합하는 것이다. 예를 들어 인플루엔자 바이러스의 출현 또는 재-출현 스트레인 내에 존재하는 것으로 관찰된 펩타이드에 대한 항체 및 이러한 항체의 조합이 인플루엔자의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 유사하게는 말라리아 항원 내에 존재하는 레플리킨에 대한 항체 및 이러한 항체의 조합은 말라리아의 예방 및 치료에 유용하다.
레플리킨에 대한 결합 사이트를 포함한 항체 단편은 알려진 기술에 의해 생성된다. 예를 들어 이러한 단편은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편 및 F(ab')2 단편의 이황 결합을 치환함으로서 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 대안으로, Fab 발현 라이브러리는 원하는 특이성을 지닌 모노클론 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인이 가능하도록 생성될 수 있다(Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281).
항말리그닌 항체가 암 세포 타입에 관계없이 인간 말리그넌시 내에서 농도가 증가한다는 사실(도 5) 및 이러한 항체가 세포 타입에 관계없이 말리그넌트 세포에 결합한다는 사실은 대부분의 말리그넌시 내에 존재하는 것으로 여기서 판명된 레플리킨 구조의 존재에 의해 설명된다(도 1 및 표 2). 연구 집단은 항말리그닌 항체가 연렬에 따라 건강한 성인에서 농도가 증가하고, 암의 빈도가 증가하는 것고 같이 역시 높은-위험 패밀리에서 더 많이 증가함을 나타내었다. 초기 말리그넌시에서 발생한 2-배 이상의 부가적인 항체 증가는 1∼10 mm 크기의 유방암에서 97%의 민감도로 독립적으로 확인되었다. 생체 내 말리그넌트 세포에 우선적으로 배치된 것으로 나타났고 항체는 정상 세포에 조직화학적으로 결합하는 것이 아니라 시험과 내에서 형질전환 세포에 선택적으로 결합하고(도 4a, b), 매우 세포독성적이다. 이들 예에서 동일한 항체는 일부 세포 타입 즉, 뇌 글리오마, 조혈세포(백혈병) 및 폐의 작은 세포 암종에 의해 결합되기 때문에 말리그넌트 레플리킨 종류 집합은 다시 증명된다.
항말리그닌은 증식의 시작과 함께 증가하는 것이 아니라 생체 내 유방 내에서의 말리그넌트 형질전환 및 복제와만 함께 특이적으로 증가되고, 말리그넌트 세포의 제거되면 증가된 수치에서 정상 수치로 돌아온다(도 5). 항말리그닌 항체 농도는 암 환자의 생존에 양적으로 관련 즉, 항체가 더 많을수록 더 오래 생존함을 나타내었다. 이와 함께 이들 결과는 항-레플리킨 항체가 세포 형질전환 및 복제의 조절 메카니즘의 일부임을 나타낸다. 이러한 면역반응의 증가는 백신으로서의 합성 레플리킨으로의 능동적으로 또는 항-레플리킨 항체의 투여 또는 레플리킨을 특이적으로 타겟하도록 유사하게 고안된 탄수화물, 지질 등과 같은 비-면역 기초 유기 약제의 도입에 의해 수동적으로 복제 조절에 유용하다.
본 발명의 또다른 실시태양에서 하나 이상의 레플리킨에 노출된 개인으로부터 수득된 하나 이상의 레플리킨에 대한 항체를 함유한 면역 혈청은 또다른 개인 또는 동물에서 수동적 면역성을 유도하는데 사용된다. 면역 혈청은 i.v.를 통해 치료가 필요한 피험체에게로 투여된다. 또한 수동적 면역성은 미리 형성된 하나 이상의 레플리킨에 대한 항체를 수용자에게 주사함으로서 달성될 수 있다. 수동적 면역화는 감염성 생물체에 노출된 개인에게 즉각적인 보호를 제공하는데 사용된다. 면역 혈청 또는 미리 형성된 항체의 투여는 일반적인 것이고 숙련된 종사자는 원하는 효과를 달성하는데 필요한 혈청 또는 항체의 양을 용이하게 확정할 수 있다.
합성 레플리킨 백신(능동적 면역성)
글리오마 레플리킨 "kagvaflhkk"(서열번호: 1) 또는 간염 C 레플리킨 "hyppkpgcivpak"(서열번호: 18) 또는 "kcfncgkegh"(서열번호: 5) 또는 "kvylawvpahk"(서열번호: 6)와 같은 HIV 레플리킨과 같은 레플리킨에 근거한 합성 레플리킨 백신 또는 바람직하게는 주어진 기간에 걸쳐 보존된 및/또는 출현 또는 재-출현 레플리킨(들)에 근거한 인플루엔자 백신이 각각의 바이러스 감염된 세포를 용해시키고 화학적 치료가 효과적인 세포외로 바이러스를 방출시키기 위해 항체 농도를 증가시키는 사용된다. 유사하게는 메로조이트 표면 위 또는 파리시토포러스 액포 내의 플라스모듐 팔시파룸 말라리아 항원 내에서 관찰된 레플리킨에 근거한 말라리아 백신은 예를 들어 말라리아에 대한 세포독성적 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.
레코닌 및/또는 레플리킨 펩타이드는 피험체가 항-레플리킨 항체를 생성하도록 면역체계를 유도하도록 피험체에게 투여된다. 일반적으로 각 펩타이드의 0.5∼2.0 mg, 바람직하게는 1 mg 투여량이 면역 반응을 유도하도록 피험체에게 투여된다. 뒤이은 투여량은 원하는 경우 투여된다.
레플리킨 서열 구조는 복제 기능과 관련된다. 따라서 예를 들어 본 발명의 레플리킨이 진단적 확인의 목적으로 레플리킨을 포함한 서열을 타겟팅하거나 복제를 증가시키거나 복제를 억제 또는 공격하는데 사용되던지 간에 레플리킨의 구조-기능 관계는 기본적인 것이다.
레플리킨 단편을 인식하고 부착될 항체를 유도하여 세포의 파괴를 유발하고자 할 때 특이적 레플리킨 구조만을 사용하는 것이 바람직하다. 더 큰 단백질 서열이 "복제 관련 기능"을 지닌 것으로 당 분야에 알려져 있으나 더 큰 단백질을 이용한 백신은 종종 실패하거나 비효과적인 것으로 판명되었다.
본 발명자들은 단일 이론을 유지하고 싶지 않으나 여기서 연구는 선행기술 백신은 더 큰 단백질 서열 이용에 기초하기 때문에 비효과적임을 나타낸다. 더 큰 단백질 서열 일정하게 하나 이상의 에피토프(특이적 항체 형성을 유도할 수 있는 독립적 항원 서열)를 지니고; 레플리킨 구조는 일반적으로 이들 잠재적 에피토프의 하나로 구성된다. 더 큰 단백질 내의 다른 에피토프의 존재는 레플리킨 항원을 선취하고(항원 탁월(primacy)의 잘-알려진 현상의 논의를 위해 Webster, R.C., J. Immunol., 97(2):177-183(1966); Webster et al., J. Infect. Dis., 134:48-58, 1976; Klenerman et al., Nature 394:421-422(1998) 참조) 이에 의해 다른 펩타이드 에피토프가 동시에 전시되더라도 첫 번째 펩타이드 에피토프가 전시되고 면역체계에 의해 인식된 후 압도하여 이에 대해 항체가 형성되는 부적절한 항원 자극으로 면역체계를 "범람"시킴으로서 레플리킨 대한 항체의 적절한 형성을 방해한다. 이는 백신 포뮬레이션에서 생물체로부터 다른 에피토프를 전시하기 전에 먼저 면역체계에 일정한 레플리킨 펩타이드를 전시하여 레플리킨이 선취되지 않고 면역학적 기억에 머무르게 하는 것이 중요한 또다른 이유이다.
비-레플리킨 에피토프에 대한 항체 형성은 세포에 결합하는 것을 가능하게 하나 항상 세포 파괴를 이끌 필요는 없다. 말라리아 단백질의 C-말단 상의 구조적 "디코이"의 존재는 디코이 에피토크가 많은 리신 잔기를 지니나 히스티딘 잔기가 없기 때문에 효과적인 항-레플리킨 항체의 결합을 방해하는 다른 에피토프의 능력의 또다른 관점이다. 따라서 디코이 에피토프는 항-레플리킨 항체에 결합하나 항체를 히스티딘-결합된 호흡 효소로부터 떨어뜨린다. 따라서 치료는 2가지 단계에서 가장 효과적이다 : 1) 디코이를 하이브리다이즈하는 프로테아제; 2) 항-레플리킨 항체 또는 다른 항-레플리킨 약제
"외부" 단백질에 대한 항체 생성의 과정에서 단백질은 먼저 더 작은 단편으로 가수분해된다고 당 분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로 6∼10 아미노산을 포함한 단편은 항체 형성에 선택된다. 따라서 단백질의 가수분해가 레플리킨-함유 단편을 초래하지 않으면 항-레플리킨 항체는 생성되지 않을 것이다. 이점에 있어서, 리신 잔기가 멤브레인에 결합하는 것으로 알려져 있기 때문에 레플리킨이 6∼10 아미노산 떨어져 위치한 리신 잔기를 포함함은 흥미롭다.
더욱이 레플리킨 서열은 적어도 하나 이상의 히스티딘 잔기를 포함한다. 히스티딘은 산화환원 중심으로의 결합에 종종 포함된다. 따라서 레플리킨 서열을 특이적으로 인식하는 항체는 아직까지 기술된 아마도 가장 세포독성적인 항-암 항체이고 세포 당 피코그램으로 활성적인 항말리그닌 항체에서 나타난 바와 같이 레플리킨이 배치된 세포를 불활성화시키거나 파괴시키는 더 좋은 가능성을 지닌다.
질병 유발 약제의 특정한 단백질 항원으로 지시된 백신(VP1 단백질 또는 VP1 단백질의 더 큰 세그먼트에 대해 개발된 아구창 백신과 같은)이 질병에 대한 보호를 충분히 효과적으로 제공하지 않은 이유 중 하나는 최상의 항원이 생성되지 않는다는 즉, 레플리킨에 대한 항체가 생성되지 않기 쉽다라는 것이다. 레플리킨은 생성되지 않는다. 즉, 더 큰 단백질 단편 내에 전시된 레플리킨 이외의 레플리킨이 상기 표현된 항원 탁월의 현상에 따라 방해되고/또는 항체를 생성하는 과정 동안 더 큰 단백질 서열의 더 작은 서열로의 가수분해가 전시된 레플리킨의 전체의 손실이 초래 즉, 레플리킨이 둘로 절단되고/또는 히스티딘 잔기가 가수분해성 과정에서 손실되기 때문이다. 본 연구는 생성되는 효과적인 백신에 있어서 어떤 다른 에피토프가 없는 레플리킨 서열이 백신으로서 사용되어야 함을 제안한다. 예를 들어 본 발명의 백신은 3 포인트 인식 시스템에 의해 확인된 레플리킨 펩타이드의 어느 하나를 이용하여 생성될 수 있다.
특히 바람직한 펩타이드 - 예를 들어 - 인플루엔자 백신은 1년 이상, 바람직하게는 3년 이상의 기간 동안 보존되는 것으로 증명되고/또는 다른 인플루엔자 바이러스 스트레인 즉, 출현 스트레인 내 레플리킨 농도에 대한 레플리킨의 농도의 가장 높은 증가를 지님을 나타낸 인플루엔자 바이러스 스트레인 내 존재하는 펩타이드를 포함한다. 레플리킨 농도의 증가는 바람직하게는 적어도 약 6개월 내지 1년, 더욱 바람직하게는 약 2년 이상, 가장 바람직하게는 약 3년 이상의 기간 동안 발생한다. 이중에서 인플루엔자 바이러스 백신에 사용되기 위한 바람직한 레플리킨 펩타이드는 1년 이상 동안 헤마그글루티닌 아미노산 서열로부터의 부재 후 "재-출현"한 것으로 관찰된 것이다.
본 발명의 레플리킨 펩타이드 단독 또는 다양한 조합이 펩타이드에 대하 항체를 생성하도록 피험체의 면역체계를 자극하기 위해 바람직하게는 i.v. 또는 근육내 주사에 의해 피험체에게 투여된다. 일반적으로 펩타이드의 투여량은 약 0.1 ㎍ 내지 10 mg, 바람직하게는 약 10 ㎍ 내지 1 mg, 가장 바람직하게는 약 50 ㎍ 내지 500 ㎍의 범위이다. 숙련된 종사자는 효과적인 면역 반응을 생성하는데 필요한 투여량과 투여 횟수를 용이하게 결정할 수 있다.
레플리킨 백신에 대한 초기 반응(들)의 양적 측정
레플리킨 백신에 대한 수일 내 또는 수주 내 초기 특이적 항체 반응을 양적으로 측정하는 능력은 수개월 또는 수년 후에만 임상적 반응이 측정될 수 있는 다른 백신보다 주요한 실용적 장점이 있다.
보조제
Freund's(완전 및 불완전), 수산화알루미늄과 같은 광물 겔, 리소레시틴(lysolecithin)과 같은 표면활성물질, 플루로닉폴리올, 폴리어나이온, 펩타이드, 오일 에멀젼, 중요한 림펫 헤모시아닌, 딘트로페놀 및 BCG 및 코리네박테리움 바르붐과 같은 잠재적으로 유용한 인간 보조제를 포함한 다양한 보조제가 숙주 종에 따라 다르게 면역 반응을 강화시키는데 사용된다.
레플리킨 뉴클레오타이드 서열
레플리킨 DNA 또는 RNA는 바이러스, 박테리아 또는 레플리킨 인코딩 약제의 감염에 의한 질병 진단에 많이 이용된다. 예를 들어 레플리킨 뉴클레오타이드 서열은 조직 표본 또는 환경적 표본 내의 특정한 생물체의 존재를 진단하기 위해 인 시츄(in situ) 하이브리디제이션 에세이를 포함한 생체검사된 조직 또는 혈액의 하이브리디제이션 에세이 즉, 서던 또는 노던 분석에 사용된다. 또한 본 발명은 특정한 목적 병원균 내에 존재하는 특정한 레플리킨에 특이적인 항체를 포함하거나 특정한 레플리킨에 특이적으로 하이브리다이즈하는 핵산 분자(센스 또는 안티센스)를 포함하고 선택적으로는 진단에 필요한 다양한 완충액 및/또는 시약을 포함한 키트를 예상한다.
또한 본 발명의 범위 내에서 안티센스 RNA 및 DNA 분자를 포함한 올리고사카라이드 서열 및 레플리킨- 또는 레코닌-함유 mRNA의 번역을 억제하는 기능인 리보자임이 있다. 안티센스 RAN 및 DNA 분자 및 리보자임 모두 당 분야에 알려진 방법에 의해 제조된다. 안티센스 분자는 피험체로의 전달을 위해 다양한 벡터 내로 통합될 수 있다. 숙련된 종사자는 일반적으로 i.v. 또는 i.m. 전달이 일반적이나 최상의 전달 루트를 용이하게 결정할 수 있다. 투여량도 용이하게 확정될 수 있다.
특히 바람직한 안티센스 핵산 분자는 레플리킨이 (1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기; (2) 적어도 하나 이상의 히스티딘; 및 (3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기를 포함한 약 7∼50개 아미노산으로 구성됨을 특징으로 하는, 인플루엔자 바이러스 폴리펩타이드를 인코딩하는 mRNA 내에 포함된 레플리킨 서열에 상보적인 것이다. 안티센스 핵산 분자가 6개월 내지 1년 이상의 기간에 걸쳐 보존된 레플리킨를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 상보적임을 특징으로 하는, 인플루엔자 바이러스 헤마그글루티닌 단백질을 인코딩하는 유전자의 코딩 스트랜드 또는 mRNA에 상보적이고, 다른 인플루엔자 바이러스 스트레인 내 레플리킨 농도에 관련하여 증가된 레플리킨 농도를 나타낸 인플루엔자 바이러스 스트레인 내에 존재하는 안티센스 핵산 분자가 더욱 바람직하다. 레플리킨 농도의 증가는 바람직하게는 적어도 6개월 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 1년 이상, 가장 바람직하게는 2∼3년 이상의 기간에 걸쳐 발생한다.
유사하게는 (1) 두 번째 리신 잔기로부터 6∼10 아미노산 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 리신 잔기; (2) 적어도 하나 이상의 히스티딘; 및 (3) 적어도 6% 이상의 리신 잔기를 포함한 약 7∼50개 아미노산으로 구성된 레플리킨 서열로 구성된 바실러스 안트라시스 폴리펩타이드를 인코딩하는 mRNA에 상보적인 mRNA에 상보적인 안티센스 핵산. 박테리아의 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 코딩 서열에 상복적인 안티센스 핵산 분자 더욱 바람직하다.
진단 적용
규조 플랑크톤, 아구창 바이러스, 토마토 잎 컬 게미니 바이러스, 간염바이러스 B 및 C, HIV, 인플루엔자 바이러스와 같은 생물체 및 말리그넌트 세포에 있어서 확인된 구성적 레플리킨이 백신으로서 유용하고 또한 진단 목적으로 유용하게 타겟된다. 예를 들어 수혈을 위해 수집된 혈액이 오염 생물체에 특이적인 것으로 나타난 레플리킨의 존재에 대해 스크린함으로서 HIV와 같은 생물체의 오염에 대해 스크린되었다. 또한 특정한 병원균 생물체에 특이적인 레플리킨 구조의 스크린은 신체 조직 또는 환경 내 생물체의 진단 검출을 이끈다.
성장의 레플리킨 자극
본 발명의 또다른 실시태양에서 레플리킨 구조가 세포, 조직 또는 기관의 복제율을 증가시키는데 사용된다. 복제율 및 산출량을 증가시키기 위해 세포, 조직 또는 기관에 대해 당 분야에 알려진 세포 분열하도록 적당히 자극을 시키는 것을 동반하거나 동반하지 않으면서 더 빠르게 복제하고자 하는 다른 세포, 조직 또는 기관에 대해 특이적인 레플리킨 구조를 첨가함으로서 복제율을 증가시키는 방법이 유용하다. 이는 예를 들어 적어도 하나 이상의 레플리킨 구조를 지닌 생물체 내에서 복제 기능을 지닌 단백질 또는 효소를 인코딩하거나 관련된 유전자를 변형시키거나 형질전환시킴으로서 당 분야에 알려진 방법에 의해 달성된다.
본 발명의 또다른 관점에서 레플리킨 구조는 생물체의 복제를 증가시키는데 사용된다. 본 발명은 예를 들어 인플루엔자 바이러스에서 전염병과 관련된 증가된 복제가 레플리킨의 증가된 농도와 관련됨을 증명한다. 증가는 1) 전년도에 존재했으나 1년 이상 동안 소멸된 특정한 레플리킨 구조의 재등장; 및/또는 2) 새로운 레플리킨 조성물의 등장에 기인한다. 더욱이 말라리아 레플리킨에서 단일 단백질 내의 동일한 레플리킨의 반복이 발생한다.
따라서 본 발명은 생물체의 복제 증가를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 유사하게는, 다른 생물체의 레플리킨가 어떠한 생물체의 복제를 억제하도록 타겟될 수 있는 방식으로 레플리킨이 어떠한 생물체의 복제를 증가시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어 전세계를 통틀어 큰 집단에게 식량을 공급하는데 중요한 쌀, 옥수수 및 소맥 농작물의 생산이 예를 들어 쌀의 특정한 스트레인의 농도(레플리킨의 수/100 아미노산 잔기)를 증가시킴으로서 증가될 수 있다.
예를 들어 쌀의 오리자 사티바 스트레인에서 미성숙 종자로부터 분리된 카탈라제는 단백질의 491개 아미노산 서열 내에 하기의 다른 레플리킨을 포함한다.
Figure 112010015382330-pat00031

따라서 당 분야에 잘 알려진 재조합 유전자 클로닝 기술을 이용함으로서 식량 농작물 식물과 같은 생물체 내에서의 레플리킨 구조의 농도가 증가될 수 있고 이는 생물체의 증가된 복제를 증가시킬 것이다. 예를 들어, 당 분야에 잘 알려진 방법에 의해 오리자 사티바 카탈라제 유전자 내로 상기 확인된 레플리킨과 같은 부가적인 레플리킨 서열을 삽입하는 것은 생물체의 복제를 증가시킬 것이다.
유사하게는, 오리자 사티바의 NBS-LRR 단백질(자포니카 재배종 그룹) 내에서 하기 레플리킨이 발견되었다 :
Figure 112010015382330-pat00032

또한 아스파르틱 프로테인아제(aspartic proteinase) 오리자 1 전구체 단백질 내에서 하기 레플리킨이 발견되었다 :
Figure 112010015382330-pat00033

유사하게는, 오리자 사티바(인디카 재배종-그룹) MADS-박스 단백질 FDRMADS3 전사 인자 내에서 하기 레플리킨가 발견되었다 :
Figure 112010015382330-pat00034

유사하게는, LONI MAIZE(ATP-결합 산화환원 관련 가수분해효소; 세린 프로테아제; 멀티유전자 패밀리; 미토콘드리아) 내에서 하기 레플리킨이 발견되었다.
Figure 112010015382330-pat00035

유사하게는, 글리세랄데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제 A, 엽록체 전구체에 대해서 하기 레플리킨이 발견되었다 :
Figure 112010015382330-pat00036

또한 발견된 녹병균-유사 단백질 RP1-4(Zea mays)의 예는 하기 레플리킨을 포함한다 :
Figure 112010015382330-pat00037

Figure 112010015382330-pat00038

앞서서 논의된 바와 같이 소맥 유비퀴틴 활성화 효소 E(서열번호: 614∼616) 내 레플리킨이 보존된다. 이러한 레플리킨 구조의 보존은 식물 생장의 자극을 위한 신뢰할만한 타겟을 제공한다.
또한 산화환원 효소에 대한 레플리킨의 밀접한 관계가 소맥 내 본 구조 내에서 명백히 나타났다. 따라서 본 소맥 유비퀴틴 활성화 효소 E는 APT로 그의 카르복실-말단 글리신 잔기를 먼저 아데닐화하고 이후 E1(서열번호: 614) 내 시스테인 잔기의 사이드 체인에 본 잔기를 결합시키고 유비퀴틴-E1 티오레스터(thiolester) 및 자유 AMP를 산출함으로서 유비퀴틴을 활성화한다.
산화환원 효소에 대한 소맥 레플리킨의 관계의 또다른 예는 식빵 중국 스프링 소맥 엽록체 트리티컴 에스티붐(Triticum aestivum)으로부터 분리된 광계I P700 엽록소 A 아포단백체 A2(PsaB)(PSI-B)인 PSAB 소맥 단백질 내에서 발견되었다. 본 단백질은 하기와 같은 기능을 한다 : PsaA 및 PsaB는 전자 수용체 A0, A1 및 FX 뿐만 아니라 P700, 광계I(PSI)의 초기 전자 도너에 결합한다. PSI는 플라스토시아닌/시토크롬 c6-페레독신 산화환원효소로서 기능한다. 보조인자 P700은 엽록소 A 이량체이고 A0은 엽록소 A이고, A1은 필로퀴논이고 FX는 4Fe-4S 철-황 중심이다. 서브유니트 A psaA/S 이형이량체는 P700 엽록소 특정 쌍 및 하위 전자 수용체에 결합한다. 고등 식물 및 조류의 PSI 반응 중심은 적어도 11 서브유니트 이상의 것으로 구성된다. 이는 엽록체 피라코이드(thylakoid) 멤브레인의 전체 멤브레인 단백질이다. h가 결합된 4Fe-4S 철-황 "중심"이 중요하다; 따라서 레플리킨 구조 내 'h'의 유의성. 박테리아 레플리킨 다음으로 이들 소맥 레플리킨 및 식물 레플리킨이 복제에 대한 레플리킨 구조 및 복제에 필요한 에너지 원천의 중요성의 가장 원시적인 진화 예증이다. 이러한 기본 관계는 조류, 바이러스 레플리킨, 박테리아, 암 세포 및 복제에 관련된 모든 생물체를 통해 유지된다.
레플리킨의 또다른 예는 폭스 소맥 생장에 중요한 PSAB 소맥 단백질에서 발견되었다. 이들은 하기를 포함한다 :
Figure 112010015382330-pat00039

산화환원에 대한 소맥 레플리킨의 관계의 또다른 예는 하기를 포함한 PSAA_WHEAT 광계I P700 엽록소 A 아포단백체 A1에서 제공된다 :
Figure 112010015382330-pat00040

레플리킨 확인을 위한 컴퓨터 소프트웨어
본 발명은 또한 아미노산 또는 핵산 서열 내 레플리킨 서열을 확인하는 방법을 제공한다. 4,000개 이상 서열의 시각적 스캐닝은 본 3-포인트-인식 방법을 개발하는데 수행되었다. 그러나 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열로 구성된 데이터 뱅크는 또한 3-포인트-인식 필요조건을 충족시키는 서열의 존재에 대해 컴퓨터에 의해 스캔될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시태양에 따라 여기서 기술된 3-포인트-인식 방법이 컴퓨터에 의해 실행된다. 도 6은 본 발명의 앞서 기술된 실시태양으로 사용하기에 유용한 컴퓨터 블록선도이다. 컴퓨터는 프로세서, 입력/출력 장치 및 전술된 실시태양의 3-포인트-인식 방법을 나타내는 실행가능 프로그램 인스트럭션을 보관하는 메모리를 포함한다. 메모리는 정적 메모리, 휘발성 메모리 및/또는 비휘발성 메모리를 포함한다. 정전기적 메모리는 통상적으로 자기적 또는 전기적 또는 선택적 보관 미디엄 상에 제공된 판독만 하는 메모리("ROM")이다. 휘발성 메모리는 통상적으로 무작위 접근 메모리("RAM")이고 프로세서 내에 캐쉬로서 통합되거나 별도의 통합된 서킷으로서 프로세서의 외부에 제공된다. 비휘발성 메모리는 전기적, 자기적 또는 선택적 보관 미디엄이다.
단백질의 관점으로부터 새로운 글리오마 펩타이드 서열에 근거한 "3-포인트-인식" 주형은 관련된 구조 및 기능을 지닌 단백질의 생물학적 분류의 확인을 직접적으로 이끈다. 3-포인트-인식 방법의 시행은 "키워드" 검색의 사용에 의한 확인과 유사하나; 대신에 전형적인 서열 상동성 검색 또는 아미노산의 뉴클레오타이드시 명시시 키워드 "kagvaflhkk"(서열번호: 1)의 정확한 스펠링을 이용하는 대신에 "3-포인트-인식" 파라미터에 의해 범위가 정해진 키워드의 추상작용이 사용된다. 이러한 범위가 정해진 추상작용은 단일의 비교적 짧은 아미노산 서열로부터 유도되더라도 동일한 명기에 의해 정의된 구조로 단백질의 클래스를 확인하도록 이끈다. 구조에 더하여 형질전환 및 복제의 경우 특정한 기능은 또한 이들 구조 및 기능은 노출된 클래스의 멤버에 의해 공유된 것으로 드러났고 이는 이들 구조 및 기능이 관련됨을 나타낸다. 따라서 이러한 새롭게 확인된 짧은 펩타이드 서열로부터 분자적 인식 "언어"가 포뮬레이트되고 이는 앞서 기술되지 않았다. 또한 암 레플리킨에 대해 여기서 논의된 바와 같이 다양한 클래스의 멤버에 의한 면역적 특이성의 공유는 B 세포 및 그들의 생성물 항체가 유사한 인식 언어에 의해 레플리킨을 인식함을 나타낸다.
3-포인트-인식 방법의 다른 이용
"3-포인트-인식"이 특정한 단백질 클래스를 명시하는 단백질적 방법이기 때문에 다른 펩타이드에 대한 3 이상의 인식 포인트를 이용하는 것은 다른 단백질 클래스에 관한 유용한 정보를 유사하게 제공해야 한다. 또한 "3-포인트-인식" 방법은 다른 인식 예를 들어 생물체의 리포폴리사카라이드의 TOLL '본질적' 인식에 적용가능하다. 또한 3-포인트-인식 방법은 다른 공유결합된 아미노산, 뉴클레오타이드, 탄수화물, 지질 또는 이들의 조합을 포함한 공유결합된 유기 분자의 다른 유용한 화합물을 확인하도록 변형된다. 본 발명의 이러한 실시태양에서 서열이 3 이상의 원하는 구조 특성을 포함한 서열에 대해 스크린된다. 공유결합된 아미노산, 지질 또는 탄수화물로 구성된 스크리닝의 경우, 약 7∼50 공유결합된 유니트의 하위서열은 (1) 첫 번째 아미노산, 탄수화물 또는 지질 잔기의 두 번째로부터 7∼10 잔기에 위치한 적어도 하나 이상의 첫 번째 아미노산, 탄수화물 또는 지질 잔기; (2) 적어도 하나 이상의 두 번째 아미노산, 탄수화물 또는 지질 잔기를 인코딩; 및 (3) 적어도 6% 이상의 첫 번째 아미노산, 탄수화물 또는 지질 잔기를 포함해야 한다. 뉴클레오타이드 서열의 스크리닝의 경우, 약 21∼150 뉴클레오타이드의 하위 서열은 (1) 첫 번째 아미노산 잔기를 인코딩하는 두 번째 코돈으로부터 18∼30 뉴클레오타이드 내에 위치한 첫 번째 아미노산을 인코딩하는 적어도 하나 이상의 코돈; (2) 적어도 하나 이상의 두 번째 아미노산 잔기; 및 (3) 적어도 6% 이상의 상기 첫 번째 아미노산 잔기를 포함해야 한다.
본 발명의 일부 실시태양 여기서 특정하게 예증되고 기술된다. 그러나 본 발명의 변형 및 변화는 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어남 없이 부가된다.
(실시예 1)
레플리킨의 추출, 분리 및 확인 방법 및 레플리킨-함유 생물체를 타겟하거나 표식하거나 파괴하기 위한 레플리킨의 이용
a) 조류
하기 조류는 버뮤다 워터 사이트로부터 수집되었고 동일한 날짜에 추출되거나 -20℃에서 동결되고 다음날 추출되었다. 조류는 중성 완충액 예를 들어 100 cc의 0.005 M 인산 완충액, pH 7("인산 완충액")의 1 그램 알리쿼트 내 콜드 룸(0∼5℃)에서 15분간 Waring 블랜더로 균질화되었고, 3000 rpm에서 원심분리되었고 차가운 인산 완충액에 대해 완전증발에 의해 상청액이 농축되었고 차가운 인산 완충액에 대해 투석되어 약 15 ml의 부피를 생성하였다. 이러한 추출 용액의 부피는 기록되었고 알리쿼트는 단백질 분석을 위해 취해졌고 나머지는 1과 4 사이의 pK 범위를 지닌 단백질 프랙션을 수득하기 위해 프랙션화되었다.
프랙션화의 바람직한 방법은 하기와 같은 크라마토그래피이다 :
추출 용액은 0.005 인산 완충액으로 평형화된 DEAE 셀룰로서(Cellex-D) 컬럼 2.5 ×11.0 cm 상에서 콜드 룸(4∼10℃)에서 프랙션화되었다. 단계적인 용출 용매 변화가 하기 용액으로 이루어졌다 :
용액 1 - 4.04 g의 NaH2PO4 및 0.5 g NaH2PO4이 증류수 15 리터 내에 용해되고(0.005 몰랄, pH 7);
용액 2 - 8.57 g의 NaH2PO4이 2,480 ml의 증류수에 용해되고;
용액 3 - 17.1 g의 NaH2PO4이 2480 ml의 증류수에 용해되고(0.05 몰랄, pH 4.7);
용액 4 - 59.65 g의 NaH2PO4이 2470 ml의 증류수에 용해되고(0.175 몰랄);
용액 5 - 101.6 g의 NaH2PO4이 2455 ml의 증류수에 용해되고(pH 4.3);
용액 6 - 340.2 g의 NaH2PO4이 2465 ml의 증류수에 용해되고(1.0 몰랄, pX-i 4.1);
용액 7 - 283.63 g의 80% 인산(H3P04)이 2460 ml의 증류수 내에서 제조됨(1.0 몰랄, pH 1.0).
6∼10 ml 부피 내의 추출 용액은 컬럼을 통과하고 용액 1로 씌워지고, 300 ml의 용액 1의 저장기가 부착되고 컬럼 상으로 중력에 의해 떨어지게 된다. 용액 1로 제거되는 모든 단백질이 컬럼으로부터 제고될 때까지 용출액의 3 ml의 알리쿼트가 수집되고 OD 280에서 단백질 함량이 분석되었다. 각각의 용액으로 제거될 수 있는 모든 단백질이 컬럼으로부터 제거될 때까지 용액 2가 컬럼에 투입되고 이어서 용액 3, 4, 5, 6 및 7이 뒤따랐다. 용액 7로부터의 용출액은 결합되고, 인산 완충액에 대해 투석되었고, 단백질 함량이 투석잔여물(dialysand) 및 투석물 모두에 대해 측정되었고 모두 전기영동으로 분석되었다. 3,000과 25,000 달톤 사이의 분자량의 하나 또는 2개의 펩타이드 또는 단백질 밴드가 용액 7에서 수득되었다. 예를 들어 용액 7 내에서 조류 Caulerpa mexicana, Laurencia obtura, Cladophexa prolifera, Sargassum natans, Caulerpa verticillata, Halimeda tuna, and Penicillos capitatus가 상기 추출 및 처리 후 어떤 오염도 없이 이러한 분자량 구역으로 뚜렷한 펩타이드 밴드를 용출하였다. 이들 용액 7 단백질 또는 그들의 용출된 밴드는 하이브리다이즈되고 아미노산 조성이 측정되었다. 6% 이상의 리신 조성을 지닌 이렇게 수득된 펩타이드는 레플리킨의 전구체이다. 이들 레플리킨 펩타이드 전구체는 아미노산 서열이 측정되었고 레플리킨은 미국 특허 제6,242,578 B1에 상세하게 나타나 바와 같이 가수분해 및 질량분석에 의해 측정되었다. "3-포인트-인식" 방법에 의해 정의된 기준을 충족시키는 것은 레플리킨으로 확인된다. 이러한 전구체는 또한 효모, 박테리아 및 다른 식물 레플리킨에도 적용될 수 있다.
b) 바이러스
조류와 동일한 추출 및 컬럼 크로마트 그래피 분리 방법을 이용하여 바이러스-감염된 세포 내의 레플리킨이 분리되고 확인된다.
c) 생체 내 및 시험관 내 조직 배양의 종양 세포
조류와 동일한 추출 및 컬럼 크로마트 그래피 분리 방법을 이용하여 종양 세포 내 레플리킨이 분리되고 확인된다. 예를 들어 상기와 같이 처리된 악성 뇌 종양으로부터 분리된 아스트로시틴(Astrocytin)의 레플리킨 전구체, 조직 배양 내 글리오블라스토마 종양 세포, 조직 배양 내 MCF7 포유류 암종 세포 및 조직 배양 내 P3J 림포마 세포부터 분리된 말리그닌(Aglyco 1OB)는 각각 9.1%, 6.7%, 6.7% 및 6.5%의 리신 함량을 지닌 레플리킨 전구체를 산출하였다. 아글리코 1OB의 가수분해 및 질량분석은 실시예 10 미국 특허 제6,242,578 B1 내에 기술된 바와 같이 16-머 레플리킨 ykagvaflhkkndiide 아미노산 서열을 생성하였다.
(실시예 2)
레플리킨 진단적 이용의 예로서 : 미국 특허 제6,242,578 B1의 도 2, 3, 4 및 7에 나타난 바와 같이 아글리코 1OB 또는 16-머 레플리킨이 포획하고 진단 목적을 위한 혈청 내 존재하는 상응하는 항체를 정량화하는데 사용된다.
표식, 영양적 또는 파괴적 목절을 위한 레플리킨로의 부착 작용제의 생성의 예로서 : 16-머 레플리킨에 대한 특이적 항체를 생성하도록 토끼에게 16-머 레플리킨을 주사하는 것이 미국 특허 제6,242,578 B1의 실시예 6 및 도 9A 및 9B에 나타나 있다.
레플리킨을 표식하는 작용제의 이용의 예로서 : 이러한 레플리킨을 포함한 특이적 세포를 표식하는 16-머 레플리킨에 대한 항체의 이용은 미국 특허 제6,242,578 B1의 도 5 및 실시예 6에 나타나 있다.
레플리킨을 파괴하는 작용제의 이용의 예로서 : 이러한 레플리킨을 포함한 특이적 세포를 억제하거나 파괴하는 16-머 레플리킨에 대한 항체의 이용은 미국 특허 제6,242,578 B1의 도 6에 나타나 있다.
(실시예 3)
레플리킨의 존재 및 농도에 대한 인플루엔자 바이러스 헤마그글루티닌 단백질 또는 뉴라미다제 단백질의 분리체의 서열 데이터 분석은 서열의 스캐닝 또는 여기서 기술된 3-포인트-인식 시스템에 근거한 컴퓨터 프로그램의 이용에 의해 수행된다. 인플루엔자 바이러스의 분리체가 수득되고 인플루엔자 헤마그글루티닌 및/또는 뉴라미다제 단백질의 아미노산 서열이 헤마그글루티닌 또는 뉴라미다제 유전자를 서열화하고 그로부터의 단백질 서열을 유추하는 것과 같이 당 분야의 알려진 방법에 의해 수득된다. 서열은 각 분리체 내에서 새로운 레플리킨의 존재, 레플리킨의 시간에 따른 보존 및 레플리킨의 농도에 대해 스캔된다. 레플리킨 서열 및 농도와 약 6개월 내지 3년 먼저와 같은 더욱 초기 시간에서의 분리체로부터 수득된 아미노산 서열의 비교는 다가오는 독감 시즌에서 인플루엔자의 원인이 되기에 가장 유력한 스트레인의 출현을 예측하는데 사용되고 인플루엔자 펩타이드 백신 또는 핵산 기초 백신의 기초를 형성하는 데이터를 제공한다. 농도의 증가 특히 약 6개월 내지 3년 이상의 기간 동안 인플루엔자 바이러스의 주어진 스트레인 내의 단계적인 농도 증가의 관찰은 미래의 인플루엔자 전염병 또는 유행병의 유력한 원인으로서 스트레인 출현의 예측장치이다.
출현 스트레인 내에서 관찰된 레플리킨에 기초한 펩타이드 백신 또는 핵산-기본 백신이 생성된다. 출현 스트레인은 그 기간 동안 헤마그글루티닌 및/또는 뉴라미다제 서열 내 레플리킨 서열 농도의 가장 높은 증가를 지닌 인플루엔자 바이러스 스트레인으로서 확인된다. 바람직하게는, 본 펩타이드 또는 핵산 백신은 출현 스트레인 내에서 보존된 것으로 관찰된 레플리킨 서열에 기초하거나 유도한다. 보존된 레플리킨은 바람직하게는 약 2년 동안 더욱 바람직하게는 더 긴 기간 동안 헤마그글루티닌 또는 뉴라미다제 단백질 서열 내에 존재하는 레플리킨 서열이다. 백신은 출현 스트레인 내에서 확인된 레플리킨 서열의 어떤 조합도 포함한다.
백신 생성을 위해 효과적인 백신으로 유용한 것으로 확인된 레플리킨 펩타이드 또는 펩타이드들이 화학합성 및 클로닝, 숙주 세포 내에서의 발현 및 그로부터의 정제를 포함한 분자생물학 기술을 포함한 어떤 방법으로도 합성된다. 펩타이드는 바람직하게는 치료적 항체 반응을 유도하도록 결정된 양으로 약제적으로 수용가능한 담체와 혼합된다. 일반적으로 투여량은 약 0.1 ㎍ 내지 10 mg이다.
인플루엔자 백신은 바람직하게는 "독감 시즌"의 착수 전에 필요한 환자에게 투여된다. 인플루엔자 독감 시즌은 일반적으로 10월 말에서 4월 말 사이에 발생한다. 그러나 백신을 그 기간 동안 어떤 때에도 투여된다. 바람직하게는 인플루엔자 백신은 1년에 한번 투여되고, 존재하는 것으로 관찰된 레플리킨 서열에 근거하고, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인 내에 보존된다. 인플루엔자 바이러스의 함유물로서 또다른 바람직한 레플리킨은 1년 이상 부재 후 인플루엔자의 스트레인 내에 재-출현한 레플리킨이다.
(실시예 4)
레플리킨의 존재 및 농도에 대한 플라스모듐 팔시파룸 항원 분리체의 서열 데이터 분석이 서열 스캐닝 또는 여기서 기술된 3-포인트-인식 시스템에 근거한 컴퓨터 프로그램의 이용에 의해 수행된다. 플라스모듐 팔시파룸의 분리체는 수득되고, 유전자를 서열화하고 그로부터의 단백질 서열을 유추하는 것과 같은 알려진 방법에 의해 단백질의 아미노산 서열이 수득된다. 서열은 각 분리체 내에서 새로운 레플리킨의 존재, 레플리킨의 시간에 따른 보존 및 레플리킨의 농도에 대해 스캔된다. 이러한 정보는 항-말라리아 펩타이드 백신 또는 핵산 기본 백신에 대한 기초를 형성하는데 사용되는 데이터를 제공한다.
말라리아 유발 생물체 내에서 관찰된 레플리킨에 근거한 펩타이드 백신 또는 핵산-기본 백신이 생성된다. 바람직하게는 펩타이드 또는 핵산 백신은 생물체의 표면 항원 상에 존재하는 레플리킨 서열에 근거하거나 이를 포함한다. 백신은 말라리아 유발 스트레인에서 확인된 레플리킨 서열의 어떠한 조합도 포함한다.
백신 생성을 위해 효과적인 백신으로 유용한 것으로 확인된 레플리킨 펩타이드 또는 펩타이드들이 화학합성 및 클로닝, 숙주 세포 내에서의 발현 및 그로부터의 정제를 포함한 분자생물학 기술을 포함한 어떤 방법으로도 합성된다. 펩타이드는 바람직하게는 치료적 항체 반응을 유도하도록 결정된 양으로 약제적으로 수용가능한 담체와 혼합된다. 일반적으로 투여량은 약 0.1 ㎍ 내지 10 mg이다.
말라리아 백신은 바람직하게는 그 기간 동안 특히 열대 환경을 여행하기 전에 필요한 환자에게 투여된다.
또다른 실시태양은 안티센스 핵산 분자가 생물체를 포함한 복제의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 바이러스, 트리파노솜, 박테리아, 진균, 조류, 아메바 및 식물을 포함하나 이에 한정적이지 않은 생물체 내 복제를 위한 유전자 또는 mRNA 인코딩 유전자의 코딩 서열에 상보적인 안티센스 핵산 분자를 포함한다.
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  22. 서열번호: 5의 아미노산 서열을 지니는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 분리되거나 합성된 바이러스 펩타이드.
  23. 서열번호: 6의 아미노산 서열을 지니는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 분리되거나 합성된 바이러스 펩타이드.
  24. 서열번호: 7의 아미노산 서열을 지니는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 분리되거나 합성된 바이러스 펩타이드.
  25. 서열번호: 613의 아미노산 서열을 지니는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 분리되거나 합성된 바이러스 펩타이드.
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