KR101046934B1 - 신규한 오메가―코노톡신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다음의 일반식 I로 표시되는 ω-코노톡신 펩타이드의 시스테인 잔기 2번 및 3번 사이의 이차 루프에서 11번 및/또는 12번 아미노산 잔기를 각각 Ile 및 Ala이 위치하도록 ω-코노톡신 펩타이드를 제조하는 단계를 포함하는 ω-코노톡신 펩타이드의 N-타입 칼슘 채널에 대한 결합 가역성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 N-타입 칼슘 채널에 대한 차단 활성 및 특이성 그리고 N-타입 칼슘 채널에 대해 현저히 증가된 결합 가역성을 가지는 우수한 특성을 지닌 신규 ω-코노톡신 펩타이드 및 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 오메가―코노톡신{Novel Omega―Conotoxins}

본 발명은 신규한 ω-코노톡신에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 ω-코노톡신 펩타이드의 N-타입 칼슘 채널에 대한 결합 가역성을 증가시키는 방법, 그리고 신규한 ω-코노톡신 펩타이드에 관한 것이다.

청자고둥(cone snail)은 해양 연체동물로서 다양한 패밀리를 포함하며 외부 적으로부터 방어 또는 먹이를 포획하기 위하여 독소를 이용한다. 청자고둥 각각의 종의 독소는 100 펩타이드 종 이상의 독특한 어레이를 포함하며, 이들의 약제학적 효능은 대부분 규명되어 있지 않다. 어류, 연체동물 또는 충류를 성공적으로 포획하기 위하여 이온 채널과 수용체를 타깃팅 하는 데, 코노톡신(conotoxins)의 여러 클래스들이 진화되었다[1-6].

코노톡신의 중요한 클래스 중 하나로서, 피사이버러스(piscivorous) 종으로부터 분리된 ω-코노톡신은 포유동물의 신경 전압-민감성 칼슘 채널(VSCC)를 억제한다. ω-코노톡신은 N-타입 또는 P/Q-타입 VSCCs에 대하여 선택성을 나타내며, 신경성 VSCCs의 분포 및 기능을 연구하는 실험도구로서 널리 이용되고 있다[7]. 실험도구로서의 ω-코노톡신의 용도 이외에, N-타입 VSCCs를 타깃팅하는 ω-코노톡신은 허혈성 뇌손상 및 통증에 대한 임상 적용가능성을 가지고 있다.

그러나 현재까지 공지된 ω-코노톡신들은, 그들의 선택성 및 효능 그리고 척수에서 외상수용 정보를 운반하는 시냅스에서의 N-타입 VSCCs의 주요한 작용에도 불구하고, 이상적인 의약은 아니다.

예를 들어, 강력한 N-타입 선택적 블록커인 GVIA는 N-타입 VSCCs로부터 낮은 속도로 해리되며, 이에 임상적인 셋팅에서 투여하는 것이 어렵다[8]. 다른 ω-코노톡신인 MVIIA는 미국 FDA에서 진통제로서 허가된 것임에도 불구하고 많은 신경학적 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있다[9-11]. MVIIA는 말초신경보다는 중추신경의 N-타입 이소폼에 보다 높은 특이성을 나타내는데, 말초신경 쪽의 N-타입 이소폼이 통증 시그널링에 직접적으로 작용한다. CVID는 중추신경의 이소폼보다는 말초신경의 이소폼에 보다 높은 선택성을 나타내며, 이에 MVIIA보다 부작용이 적다[12-14]. 기타 다른 ω-코노톡신들은 N-타입 VSCCs에 대하여 보다 낮은 선택성을 나타내기 때문에, N-타입 VSCCs를 타깃으로 한 의약 후보물질로서 유용하지 않다.

N-타입 VSCCs 블록커에 대한 아미노산 잔기 스캐닝 실험에서, Tyr¹³, Lys², Arg¹⁰, Leu¹¹, Arg²¹ 및 N-말단과 C-말단 아미드기가 차례로(중요잔기의 순서대로 나열함), 채널에 대한 친화도를 결정하는 데 중요한 잔기라는 것이 규명되었다[7, 15]. 최근에, Arg¹⁰이 코노톡신의 결합 가역성에 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌고, Arg¹⁰을 Lys¹⁰로 치환한 경우 결합 가역성이 증가하고, Arg¹⁰을 Hyp¹⁰(hydroxyproline)으로 치환한 경우 가역성이 감소하였다는 사실도 보고되었다[14]. 결합 가역성은 친화도와 밀접하게 관련되어 있지만, 이 두 성질은 분리될 수 있다[16]. 또한, 결합 가역성에 있어서의 개선은 보다 우수한 통증완화제를 제공할 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 종래의 ω-코노톡신의 문제점, 특히 N-타입 칼슘 채널에 대한 낮은 특이성(specificity) 및 낮은 가역성(reversibility)에 따른 문제점을 해결하기 위하여 신규의 ω-코노톡신을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 대한민국에 서식하는 청자고둥(Conus Flavidus)으로부터 상기한 두 가지 측면의 문제점을 완전하게 해결하면서도 N-타입 칼슘 채널에 대한 차단제(blocker)로서의 활성은 높은 신규한 ω-코노톡신을 분리하였다. 그리고 신규한 ω-코노톡신에 대한 구조적 및 기능적 연구를 하였으며, 결국 ω-코노톡신의 가역성에 중요한 역할을 담당하는 아미노산 잔기를 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 ω-코노톡신 펩타이드의 N-타입 칼슘 채널에 대한 결합 가역성을 증가시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 분리, 합성 또는 재조합 ω-코노톡신 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 ω-코노톡신 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 N-타입 칼슘 채널 이상(disorder)-관련 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 N-타입 칼슘 채널 이상(disorder)-관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 N-타입 칼슘 채널 이상(disorder)-관련 질환의 치료 또는 예방용 약제를 제조하기 위한 ω-코노톡신 펩타이드의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 일반식 I로 표시되는 ω-코노톡신 펩타이드의 시스테인 잔기 2번 및 3번 사이의 이차 루프에서 11번 및/또는 12번 아미노산 잔기를 각각 Ile 및 Ala이 위치하도록 ω-코노톡신 펩타이드를 제조하는 단계를 포함하는 ω-코노톡신 펩타이드의 N-타입 칼슘 채널에 대한 결합 가역성을 증가시키는 방법을 제공한다:

일반식 I

Cys-Lys-Xaa₁-Xaa₂-Gly-Xaa₃-Xaa₄-Cys-Xaa₅-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Tyr-Xaa₉-Cys-Cys-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Cys-Xaa₁₃-Xaa₁₄-Xaa₁₅-Xaa₁₆-Cys

상기 일반식에서, Xaa₁ - Xaa₁₆은 아미노산 잔기를 나타낸다.

본 발명자들은 종래의 ω-코노톡신의 문제점, 특히 N-타입 칼슘 채널에 대한 낮은 특이성(specificity) 및 낮은 가역성(reversibility)에 따른 문제점을 해결하기 위하여 신규의 ω-코노톡신을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 대한민국에 서식하는 청자고둥(Conus Flavidus)으로부터 상기한 두 가지 측면의 문제점을 완전하게 해결하면서도 N-타입 칼슘 채널에 대한 차단제(blocker)로서의 활성은 높은 신규한 ω-코노톡신을 분리하였다. 그리고 신규한 ω-코노톡신에 대한 구조적 및 기능적 연구를 하였으며, 결국 ω-코노톡신의 가역성에 중요한 역할을 담당하는 아미노산 잔기를 규명하였다.

본 명세서에서, 본 방법은 ω-코노톡신의 N-타입 칼슘 채널에 대한 결합 가역성을 증가시키는 방법으로 표현되고 있지만, N-타입 칼슘 채널에 대한 결합 가역성을 증가시키는 ω-코노톡신를 제조하하는 방법으로도 표현될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “가역성(reversibility)" 또는 “결합 가역성”은 N-타입 칼슘 채널에 결합된 ω-코노톡신이 해리되는 정도를 나타내는 것이다. ω-코노톡신의 가역성은 일반적으로 하기의 실시예에 기재된 바와 같이 워싱-아웃 실험을 통하여 분석된다. 용어 “가역성”은 “회복(recovery)"과 동일한 의미로 본 명세서에서 혼용된다.

N-타입 칼슘 채널을 강력하게 차단하는 ω-코노톡신들은 이미 개발되어 있지만, 이 ω-코노톡신들은 결합 가역성이 나쁘기 때문에 부작용을 유발할 위험성이 매우 크며 이에 임상적으로 적용하는 데 한계가 있다.

본 발명은 이러한 종래의 ω-코노톡신(예컨대, GVIA 및 MVIIA)의 문제점을 해결한 것으로서, 결합 가역성이 매우 우수하다.

또한, 본 발명의 ω-코노톡신은 N-타입 칼슘 채널에 대한 차단 활성 및 특이성도 매우 우수하다. 이와 같이, 본 발명의 ω-코노톡신이 이온 채널 억제 활성 및 가역성이 모두 우수한 이유는, 결합 가역성이 친화도와 밀접하게 관련되어 있기는 하지만 이 두 성질은 분리될 수 있기 때문이다[16].

본 발명자들에 의해 규명된 ω-코노톡신의 가역성에 중요한 역할을 담당하는 아미노산 잔기는 상기 일반식 I로 표시되는 ω-코노톡신에서 11번 및 12번 아미노산 잔기이다. 하기의 실시예에서 증명된 바와 같이, ω-코노톡신에서 11번 및 12번 아미노산 잔기가 Ile 및 Ala인 경우에 N-타입 칼슘 채널에 대한 가역성이 우수하다. 예를 들어, Ile 및 Ala을 각각 R-기가 유사한 Leu 및 Met으로 치환한 경우에 가역성이 크게 감소한다.

한편, 종래 기술에 따르면, ω-코노톡신에서 11번째 잔기는 Leu이 위치하여야 이온 채널 억제 활성이 크다는 보고가 있다. 그러나 본 발명에 따르면 11번째 잔기에 Leu 대신에 Ile이 위치하며, 이 경우에 N-타입 칼슘 채널에 대한 억제 활성이 종래의 강력한 블록커들의 활성과 유사한 활성이 발휘될 뿐만 아니라, 가역성이 크게 개선된다. 따라서, 본 발명은 종래의 기술상식에 반대되는 획기적인 것이다.

상기 일반식 I에서, 6개의 Cys 잔기는 ω-코노톡신에서 독특한 것이다. 또한, Lys², Gly⁵ 및 Tyr¹³은 ω-코노톡신의 이온 채널 억제 활성에서 중요한 잔기들이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 6개의 Cys 잔기는 총 3개의 이황화결합을 형성한다. 보다 바람직하게는, 각각 첫 번째 Cys과 네 번째 Cys, 두 번째 Cys과 다섯 번째 Cys, 그리고 세 번째 Cys과 여섯 번째 Cys이 이황화결합을 형성한다. 이와 같은 이황화결합은 ω-코노톡신의 전형적인 패턴이라 할 수 있으며, ω-코노톡신의 활성에 중요한 영향을 미친다.

ω-코노톡신의 구조는 전형적으로 네 개의 루프를 가진 것으로 나타낸다:

C_______C_______CC____C____C

1 2 3 4

네 개의 루프는 밑줄 처리되어 있다. 본 발명은 시스테인 잔기 2번 및 3번 사이에 형성되는 두 번째 루프내의 11번 및/또는 12번 아미노산 각각에 위치한 Ile 및/또는 Ala 잔기가 N-타입 칼슘 채널에 대한 ω-코노톡신의 가역성에 관여한다는 흥미로운 발견을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, ω-코노톡신에서 가역성을 가장 크게 하기 위해서는 11번 및 12번째 아미노산 잔기에 Ile 및 Ala이 위치하여야 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 일반식 I에서, Xaa₁는 Gly, Ala 또는 Ser이고, Xaa₂는 Thr, Ala, Lys 또는 Arg이며, Xaa₃는 Lys 또는 Ala이고, Xaa₄는 Ser, Pro, 하이드록시프롤린 또는 Lys이며, Xaa₅는 Ser 또는 Arg이고, Xaa₆는 Arg 또는 Lys이며, Xaa₉는 Asn 또는 Asp이고, Xaa₁₀은 Thr 또는 Ser이며, Xaa₁₁은 Gly, Ala 또는 Ser이고, Xaa₁₂는 Ser, Gly, Ala 또는 Thr이며, Xaa₁₃은 Arg 또는 Gly-Arg이고, Xaa₁₄는 Ser 또는 Arg이며, Xaa₁₅는 Gly, Ala 또는 Ser이고, Xaa₁₆은 Lys 또는 Arg이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 일반식 I에서, Xaa₆는 Arg이며, Xaa₁₃은 Arg이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 일반식 I에서, Xaa₁는 Gly 또는 Ser이고, Xaa₂는 Thr 또는 Lys이며, Xaa₃는 Lys 또는 Ala이고, Xaa₄는 Ser 또는 Lys이며, Xaa₅는 Ser 또는 Arg이고, Xaa₆는 Arg 이며, Xaa₉는 Asn 또는 Asp이고, Xaa₁₀은 Thr이며, Xaa₁₁은 Gly이고, Xaa₁₂는 Ser이며, Xaa₁₃은 Arg이고, Xaa₁₄는 Ser이며, Xaa₁₅는 Gly이고, Xaa₁₆은 Lys 또는 Arg이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 일반식 I에서, Xaa₂는 Thr 또는 Lys이며, Xaa₃는 Lys 또는 Ala이고, Xaa₄는 Ser 또는 Lys이며, Xaa₅는 Ser 또는 Arg이고, Xaa₆는 Arg 이며, Xaa₉는 Asn 또는 Asp이고, Xaa₁₀은 Thr이며, Xaa₁₁은 Gly이고, Xaa₁₂는 Ser이며, Xaa₁₃은 Arg이고, Xaa₁₄는 Ser이며, Xaa₁₅는 Gly이고, Xaa₁₆은 Lys 또는 Arg이다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 N-타입 칼슘 채널에 대한 결합 가역성이 증가된 ω-코노톡신 펩타이드는 서열목록 제1서열 내지 제3서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.

서열목록 제2서열은 종래의 ω-코노톡신인 MVIIA의 11 및 12번째 잔기를 본 발명의 방법에 따라 Ile 및 Ala으로 치환한 것인데, 이 변이체는 칼슘 채널 억제 활성도 우수하지만 회복도도 MVIIA와 비교하여 거의 2배 정도 증가되어 있다(참조: 실시예).

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 N-타입 칼슘 채널에 대한 결합 가역성이 증가된 ω-코노톡신 펩타이드는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 일반식 I의 ω-코노톡신은 아마이드-변형 C-말단(Cys 잔기)을 갖는다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 ω-코노톡신 펩타이드의 시스테인 잔기 2번 및 3번 사이의 두 번째 루프에서 다음 일반식 Ⅱ의 펩타이드를 포함하는 분리, 합성 또는 재조합 ω-코노톡신 펩타이드를 제공한다.

일반식 Ⅱ

Xaa₅-Xaa₆-Ile-Ala-Tyr-Xaa₉

상기 일반식에서, Xaa₅ - Xaa₆ 및 Xaa₉ 는 아미노산 잔기를 나타낸다.

본 발명의 ω-코노톡신은 두 번째 루프에 있는 Ile 및 Ala 잔기가 N-타입 칼슘 채널에 대한 결합 가역성을 증가시키는데 필수적이라는 발견에 기초한다.

바람직하게는, 본 발명의 ω-코노톡신의 첫 번째, 세 번째 및 네 번째 루프 각각은 자연의 ω-코노톡신 펩타이드의 루프에 해당하는 것이다.

바람직한 구현예에 따르면, Xaa₅는 Ser 또는 Arg이고, Xaa₆는 Arg 또는 Lys이며, Xaa₉는 Asn 또는 Asp이다. 보다 바람직한 구현예에 따르면, Xaa₅는 Ser이고, Xaa₆는 Arg이며, Xaa₉는 Asn이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 ω-코노톡신 펩타이드는 다음의 일반식 Ⅱ로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다:

일반식 Ⅲ

Cys-Lys-Xaa₁-Xaa₂-Gly-Xaa₃-Xaa₄-Cys-Xaa₅-Xaa₆-Ile-Ala-Tyr-Xaa₉-Cys-Cys-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Cys-Xaa₁₃-Xaa₁₄-Xaa₁₅-Xaa₁₆-Cys

상기 일반식에서, Xaa₁은 Gly 또는 Ser이며, Xaa₂ - Xaa₆ 및 Xaa₉ - Xaa₁₆은 아미노산 잔기를 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 일반식 Ⅲ에서 6개의 Cys 잔기는 총 3개의 이황화결합을 형성한다. 보다 바람직하게는, 각각 첫 번째 Cys과 네 번째 Cys, 두 번째 Cys과 다섯 번째 Cys, 그리고 세 번째 Cys과 여섯 번째 Cys이 이황화결합을 형성한다. 이와 같은 이황화결합은 ω-코노톡신의 전형적인 패턴이라 할 수 있으며, ω-코노톡신의 활성에 중요한 영향을 미친다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa₂는 Thr, Ala, Lys 또는 Arg이며, Xaa₃는 Lys 또는 Ala이고, Xaa₄는 Ser, Pro, 하이드록시프롤린 또는 Lys이며, Xaa₅는 Ser 또는 Arg이고, Xaa₆는 Arg 또는 Lys이며, Xaa₉는 Asn 또는 Asp이고, Xaa₁₀은 Thr 또는 Ser이며, Xaa₁₁은 Gly, Ala 또는 Ser이고, Xaa₁₂는 Ser, Gly, Ala 또는 Thr이며, Xaa₁₃은 Arg 또는 Gly-Arg이고, Xaa₁₄는 Ser 또는 Arg이며, Xaa₁₅는 Gly, Ala 또는 Ser이고, Xaa₁₆은 Lys 또는 Arg이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa₆는 Arg이며, Xaa₁₃은 Arg이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa₂는 Thr 또는 Lys이며, Xaa₃는 Lys 또는 Ala이고, Xaa₄는 Ser 또는 Lys이며, Xaa₅는 Ser 또는 Arg이고, Xaa₆는 Arg 이며, Xaa₉는 Asn 또는 Asp이고, Xaa₁₀은 Thr이며, Xaa₁₁은 Gly이고, Xaa₁₂는 Ser이며, Xaa₁₃은 Arg이고, Xaa₁₄는 Ser이며, Xaa₁₅는 Gly이고, Xaa₁₆은 Lys 또는 Arg이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa₂는 Thr 또는 Lys이며, Xaa₃는 Lys 또는 Ala이고, Xaa₄는 Ser 또는 Lys이며, Xaa₅는 Ser 또는 Arg이고, Xaa₆는 Arg 이며, Xaa₉는 Asn 또는 Asp이고, Xaa₁₀은 Thr이며, Xaa₁₁은 Gly이고, Xaa₁₂는 Ser이며, Xaa₁₃은 Arg이고, Xaa₁₄는 Ser이며, Xaa₁₅는 Gly이고, Xaa₁₆은 Lys 또는 Arg이다.

본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 ω-코노톡신 펩타이드는 서열목록 제1서열 내지 제3서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 ω-코노톡신 펩타이드는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 ω-코노톡신의 하나 이상의 아미노산은 변형된 측쇄를 가질 수 있다. 측쇄 변형의 예는 환원 알킬화 반응; 메틸아세티미데이트에 의한 아미디화; 아세틱 언하이드라이드에 의한 알킬화; 시아네이트에 의한 아미노 그룹의 카르바모릴레이션; 2,4,6-트리니트로벤젠 술포닉산(TNBS)에 의한 아미노산의 트리니트로벤질레이션; 숙신 언하이드라이드에 의한 아미노 그룹의 알킬화; 및 피리오살-5-포스페이트 처리후 NaBH₄로 환원된 피리도실레이션과 같은 아미노그룹의 변형을 포함한다.

아르기닌 잔기의 구아니딘 그룹은 2,3-부탄디온, 페닐글리옥살 및 글리옥살과 같은 시약에 의한 헤테로고리 축합물의 형성으로 변형될 수 있다. 카르복실 그룹은, O-아킬소우레아 형성에 의하여 카르보디이미드 활성을 하고 이어 유도체화, 예컨대, 아마이드화로 유도체화 하여 변형시킬 수 있다.

설프히드릴 그룹은 요오드아세트산 또는 요오드아세트아마이드에 의한 카르복실메틸레이션; 시스테인산에로의 퍼폼산 산화; 다른 티올 화합물에 의한 혼합된 다이설파이드의 형성; 말레이미드, 무수말레인산 또는 다른 치환 말레이미드에 의한 반응; 4-클로로머큐리벤조에이트, 4-클로로머큐리페닐술폰산, 페닐머큐릴 클로라이드, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀 및 다른 수은제를 사용한 수은 유도체의 형성; 염기 pH에서 시아네이트에 의한 카르바모일레이션과 같은 방법에 의해 변형될 수 있다. 시스테인 잔기의 어떠한 변형도, 펩타이드가 필요로 하는 이황화 결합을 형성하는데 영항을 주지 않아야 한다. 또한, 시스테인의 설프히드릴 그룹은 셀레니움 등가물로 대체할 수 있으며, 이에 의해 펩타이드에는 하나 이상의 이황화 결합 위치에 다이셀레니움 결합이 형성될 수 있다.

트립토판 잔기는 예컨대, N-브로모숙신이미드에 의한 산화 또는 2-히드록시-5-니트로벨질브로마이드 또는 술퍼닐 할라이드에 의한 인돌 고리의 알킬화에 의해 변형될 수 있다. 한편, 타이로신 잔기는 테트라니트로메탄을 이용한 니트로화에 의해 변형되어 3-니트로타이로신 유도체를 형성시킬 수 있다.

히스티딘 잔기의 이미다졸 고리의 변형은 요오도아세트산 유도체에 의한 알킬화 또는 디에틸피로카르보네이트에 의한 N-카르베톡실레이션에 의해 수행될 수 있다.

프롤린 잔기는 예컨대, 4-위치에서의 히드로실레이션에 의해 변형될 수 있다.

본 발명의 N-타입 칼슘 채널에 특이적으로 결합하여 상기 이온 채널을 차단하는 작용을 한다. 채널 차단제(blocker)의 기전은 동공(pore) 차단 및 게이트 변형 작용으로 나눌 수 있는 데, 본 발명의 ω-코노톡신은 동공 차단제이다.

본 발명의 ω-코노톡신 펩타이드는 다양한 방법을 통해 제조될 수 있다. 대표적으로, 유전자 클로닝 방법 및 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 ω-코노톡신 펩타이드를 제조할 수 있다.

유전자 클로닝 방법에 따르면, ω-코노톡신 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 적합한 숙주세포에 형질전환하고 발현하여 ω-코노톡신 펩타이드를 다량으로 제조할 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

또한, 본 발명의 ω-코노톡신 펩타이드는 당업계에 공지된 고상 합성 기술에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 일반식 I의 ω-코노톡신은 아마이드-변형 C-말단(Cys 잔기)을 갖는다.

본 발명의 ω-코노톡신 펩타이드는 N-타입 칼슘 채널에 대한 차단 활성 및 특이성이 매우 우수할 뿐만 아니라, 결합 가역성도 매우 우수하다.

본 발명의 ω-코노톡신은 염증 및 신경성 통증에 대해서 우수한 치료효능을 가지고 있다. 이와는 다르게, 본 발명의 ω-코노톡신은 침해성 통증에 대하여 진통효과 측면에서 보다 덜 관련되어 있다.

침해성 통증은 외부의 해로운 자극에 대한 반응 메카니즘의 하나이기 때문에, 과도하게 침해성 통증을 억제하는 것은 바람직하지 않다. 우수한 진통약의 후보물질은 선택적으로 병리적 동통의 일종인 염증 및 신경성 통증에 대하여 완화 효능을 나타낸다는 것은 당업자에게 일반적으로 알려진 사실이다.

이러한 관점에서, 본 발명의 ω-코노톡신은 유망한 진통제의 후보물질로써 주목받을 수 있다.

또한, 본 발명의 ω-코노톡신은 실시예에서 기재된 바과 같이, N-타입 칼슘 채널에 상당히 개선된 가역성을 가지면서, 심혈관계에는 덜 영향을 주는 측면에서, 거의 부작용을 나타내지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 ω-코노톡신 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 ω-코노톡신-코딩 핵산 분자는 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 ω-코노톡신 펩타이드를 코딩하는 상술한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

원핵 세포에 사용되는 종래의 많은 벡터들은 당업자에게 알려져 있으며, 적절한 벡터를 선택할 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 종래의 벡터는 pSC101, pGV1106, pACY177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19, λgt4?λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다. 상업적으로 판매되는 바이러스-근거 벡터의 예는 pcDNA 3 (Invitrogen; 시토메갈로 바이러스 프로모터 및 폴리아데닐화 서열을 포함), pSI (Promega; SV 40 프로모터 및 폴리아데닐화 서열을 포함), pCI (Promega; 시토메갈로 바이러스 프로모터 및 폴리아데닐화 서열을 포함), 및 pREP7 (Invitrogen; RSV 프로모터 및 SV 40 폴리아데닐화 서열을 포함)을 포함한다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 ω-코노톡신의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 소망하는 ω-코노톡신을 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 ω-코노톡신을 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 ω-코노톡신 펩타이드의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 N-타입 칼슘 채널 이상(disorder)-관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 ω-코노톡신 펩타이드의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 N-타입 칼슘 채널 이상(disorder)-관련 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 치료가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 N-타입 칼슘 채널 이상(disorder)-관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 N-타입 칼슘 채널 이상(disorder)-관련 질환의 치료 또는 예방용 약제를 제조하기 위한, 본 발명의 ω-코노톡신의 용도를 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 ω-코노톡신 펩타이드를 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 N-타입 칼슘 채널에 이상(disorder)이 발생하여 초래되는 다양한 질환 또는 질병의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다. N-타입 칼슘 채널 이상(disorder)-관련 질병, 질환 또는 상태는 N-타입 칼슘 채널의 이상(disorder) 또는 바람직하지 않은 활성에 의해 초래된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 질병, 질환 또는 상태는 신경병성 통증, 당뇨 말초 신경장애, 포진후신경통, 삼차신경통,AIDS-관련 신경병증, 암 통증, 염증 통증, 골관절염 통증, 류마티스 관절염 통증 및 섬유근통과 같은 만성적 통증; 급성 통증; 수술 후 통증; 기분 장애; 일반적 불안장애, 사회불안장애, 공황장애, 강박신경장애와 외상후스트레스장애와 같은 불안장애; 우울증; 코카인 의존 및 금단, 오피오이드 의존 및 금단, 알코올 의존 및 금단 및 니코틴 의존 및 금단과 같은 중독 장애; 염증성 창자병 및 과민성 대장증후근과 같은 위장관계 질환; 요실금, 침입형 대장염 및 성기능장애와 같은 비뇨기계 질환; 그리고, 발작, 뇌혈관 이상, 뇌 또는 척수의 상해, 심근경색, 물리적 상해, 질식, 분만시 질식, 주기기 가사 또는 저혈당 이상과 관련된 신경독성(neurotoxic)과 같은 저산소증, 산소결핍증 또는 허혈에 따른 신경독성(neurotoxic)을 포함한다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 통증의 완화(또는 경감)에 이용된다. 특히, 약제학적 조성물은 침해성 통증 보다는 염증 또는 신경병증 통증에 투여된다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 척수 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏(체중)이다. 본 명세서에서 용어 “치료학적 유효량”은 상술한 N-타입 칼슘 채널 이상-관련 질환을 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 N-타입 칼슘 채널에 대한 차단 활성 및 특이성이 매우 우수할 뿐만 아니라, 결합 가역성도 매우 우수하다. 더욱이, 본 발명의 약제학적 조성물은 N-타입 칼슘 채널 이상(disorder),바람직하게는 통증-관련 다양한 질환의 치료에 매우 유효하다. 또한 본 발명의 약제학적 조성물은 N-타입 칼슘 채널에의 결합 가역성을 상당히 증가시키면서 실시예에 기재된 바와 같이 심혈관계에 덜 영향을 주는 점에서 부작용이 적다.

이러한 관점에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제 후보물질 특히, 진통제 후보약물로 각광받을 수 있다.

위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따르면, 가역성이 불량하여 임상적 적용에 한계가 있었던 종래의 ω-코노톡신의 가역성을 크게 개선시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 ω-코노톡신 펩타이드는 N-타입 칼슘 채널에 대한 차단 활성 및 특이성이 매우 우수할 뿐만 아니라, 결합 가역성도 매우 우수하며, 이에 부작용의 우려 없이 임상적으로 인체에 적용할 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물은 N-타입 칼슘 채널 이상(disorder)-관련 질환의 치료에 매우 유효하며, 특히, 통증 완화 또는 경감에 탁월한 효능을 발휘한다.

도 1A 및 1B는 선형, 환형화(도 1A) 및 정제 FVIA(도 1B)의 역상 HPLC 크로마토그래피를 나타낸다. 환형화 조건: 선형 펩타이드 0.02 mM, GSSS 0.1 mM, GSH 1 mM, 1 mM EDTA, 50 mM NH₄OAc, 및 1 M(NH₄)₂SO₄(pH 7.8)
도 2A-2B는 본 발명의 FVIA(2A) 및 아날로그 펩타이드(2B)의 CD 스펙트럼이다. 5개의 주요한 이차구조(α-헬릭스, 반대평행 β-쉬트, 평행 β-쉬트, β-턴 및 랜덤 구조)에 대한 이차구조 스펙트럼에 기초하여, FVIA는 β-턴 구조 또는 반대평행 β-쉬트 구조를 가지고 있음을 알 수 있다. FVIA의 이차구조는 산화적 폴딩에 의해 적합하게 형성되었다[18]. 도. 2B에서, D 아날로그, LM 아날로그, FM 키메라 및 MF 키메라는 표 4에서의 FVIA[N14D], FVIA[I11L, A12M], 키메라-FMFF 및 키메라-MFMM과 각각 일치한다.
도 3은 MVIIA(패널 A) 및 FVIA(패널 B)의 처리량-억제 곡선이다. 처리량의 범위는 0.1 nM 내지 1 μM이다. 곡선의 모양은 S자형이며, 0.1 μM부터 포화되는 경향을 보인다. MVIIA 및 FVIA의 IC₅₀ 값은 각각 7.96 ± 1.59 nM 및 11.5 ± 1.4 nM이었다.
도 4는 MVIIA(패널 A) 및 FVIA(패널 B)의 전류-전압 곡선이다. 이는 수평적 곡선 쉬프팅 없이 전류 차단을 나타낸다.
도 5은 FVIA 및 MVIIA의 회복(recovery) 곡선이다. 실선 화살표는 1 μM의 코노톡신 주입을 나타내고, 점선 화살표는 완충액으로 세척(washing-out)을 나타낸다.
도 6은 FVIA에서 관찰되는 연속적 및 미디엄 범위 NOE 연계성(connectionvities), ³J_NH-CαH 커플링 및 천천히 교환되는 백본 양성자를 요약한 도면이다. 구조적 변수들은, ω-코노톡신 FVIA의 서열 특이적 지정 및 2차 구조 요소의 규명에 이용되었다. NOEs는, 채워진 막대의 높이에 따라 강, 중간, 약 및 극약으로 나뉜다. ³J_NH-CαH 커플링 상수의 값은 채워진 원(≥ 8 Hz) 및 비어있는 원(≤5.5 Hz)로 기재되어 있다. 화학적 변위는 -1, 0 및 +1의 값으로 3원의 인덱스로 나타나 있다. -1 및 +1은 각각 0.1 p.p.m. 업필드 및 다운필드 보다 큰 랜덤-코일 값으로부터의 변위 편차를 나타낸다. 랜덤-코일 값의 범위 내는 0으로 표시되어 있다.
도 7A 및 7B는 FVIA 및 MVIIA 백본 구조간의 비교(7A) 및 가역성에 있어서 FVIA 및 MVIIA의 유효한 잔기 위치를 나타낸다. 도 7B에서, 박스는 활성에 있어서 MVIIA의 필수 잔기를 나타낸다.
도 8A 및 8B는 테일-플릭 시험(8A), 플랜타르 시험(8B)에 대한 FVIA의 진통 효과를 나타낸다. 회피반응을 나타내는 시간을 측정하였다.
도 9A-9C는은 글루타메이트(9A)와 서브스탠스피(9B)의 척수주입, 아세트산의 복강 투여(9C)로 유도된 통증 반응에 대한 FVIA의 진통효과 시험결과를 보여주는 그래프이다. 정점의 막대는 평균의 표준오차를 나타내고 *는 대조군과 비교한 P값을 나타낸다. (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001)
* 도 10A 및 10B는 발바닥 내 5% 포르말린 주입으로 유도된 통증에 대한 FVIA의 진통 효과를 보여주는 그래프이다. 도 10B는 FVIA의 농도 의존적인 시험 결과를 보여준다. 정점의 막대는 평균의 표준오차를 나타내고 *는 대조군과 비교한 P값을 나타낸다. (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001)
* 도 11A 및 11B는 왼쪽 다리로 통하는 신경의 부분 손상에 의해 유도된 신경병증성 통증 모델에서 0.1 ng의 척수 투여 FVIA의 진통 작용에 대한 그래프이며 도 11B의 그래프는 도 11A의 결과에 대응되는 %MPE를 나타낸다.
도 12A-12C는 꼬리로 통하는 신경의 부분 손상에 의해 유도된 신경병증성 통증 모델에서 FVIA의 진통 작용에 대한 그래프이다. 신경 손상 14일 후 기계적 이질통에 대한 FVIA의 효과(12A), 냉이질통에 대한 FVIA의 효과(12B) 및 온이질통에 대한 FVIA의 효과(12C)를 나타낸다. *은 FVIA 투여 직전 수치와 비교하여 P < 0.05일 때 표기한다. 오른쪽 그래프는 도 12A-12C의 결과에 대응되는 %MPE 그래프이다.
도 13은 100μg의 FVIA와 MVIIA를 정맥 투여한 후의 평균 동맥압(MAP)를 나타내는 그래프이다. 정점의 막대는 평균의 표준오차를 나타내고 *는 대조군과 비교한 P값을 나타낸다(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

독소물질 추출 및 시퀀싱

청자고둥(Conus Flavidus)을 대한민국 제주도의 해안에서 수집하였다. 독소관, 치설낭 및 벌브 내용물을 30% 아세트산/물로 추출하고 원심분리하였다. 상등액을 동결건조시키고 사용 전에 -20℃에서 저장하였다. 독소 조추출물의 일부를 반-정제 RP-HPLC 컬럼(25 x 250 mm C18, shimpack)에 로딩하고, 1% 용매 B의 선형 농도구배(용매 A 100% H₂O, 용매 B 0.1% 트리플루오르아세트산을 포함하는 100% 아세토니트릴)로 14 ml/min의 속도로 65분 동안 용출하여 분획화 하였다. 독소 조추출물이 8개 분획으로 나뉘었고, 3번째 및 5번째 분획을 RP-HPLC로 추가적으로 더 정제하였다. 펩타이드의 분자량은 MALDI-MS (Shimadzu)를 이용하여 결정하였다. α-사이아노-4-하이드록시신남산을 매트릭스로 하여 시료를 준비하였다. 안지오텐신을 이용하여 외부 보정(calibration)을 하였다.

정제된 펩타이드를 40 mM DTT 및 50 mM 암모늄 바이카보네이트 pH 7.5 (50℃, 30 min)의 존재하에서 환원시킨 다음, 1 M 4-비닐피리딘을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 알킬화 반응을 진행시켰다. 알킬화 펩타이드를 RP-HPLC로 재정제한 다음, Procise 491 단백질 시퀀싱 시스템(Applied Biosystems)을 이용하여 Edman 방법에 따라 펩타이드의 아미노산 서열을 결정하였다.

지놈 DNA의 분리

청자고둥의 동결 조직(0.1 g)을 세포 라이시스 완충액 및 구아니듐 티오시아네이트/EDTA/사코실(GES) 시약의 1 ml에 첨가하고, 유리 균질기로 그라인딩 하였다. 혼합물을 실온에서 13,000 rpm으로 15분 동안 원심분리 한 다음, 상등액을 페놀 및 클로로포름으로 추출하였다. 이어, 추출액을 4℃에서 13,000 rpm으로 15분 동안 원심분리 한 다음, 무색의 상부 수용액층을 새로운 튜브로 옮기고 동일 부피의 이소프로판올을 첨가하여 DNA를 침전시키고, 미소원심분리기에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리 하였다. 형성된 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 건조한 다음, 펠릿을 10 mM Tris-HCl(pH 8.5) 50 ㎕로 재현탁하였다.

지놈 DNA의 PCR 증폭

본 발명의 코노펩타이드 유전자를 지놈 DNA를 주형으로 하고, Taq DNA 중합효소를 이용하여 증폭 하였다. 사용된 프라이머 중, 5‘-프라이머는 ω-코노톡신 프리프로펩타이드의 톡신 부위 앞에 있는 보존성 인트론 부분의 3’-말단의 서열을 기초하여 디자인 하였다: 5'-CTCTCTCTCTCTCTGCTGGAC-3'. 3‘-프라이머는 ω-코노톡신 프리프로펩타이드의 3' UTR 서열에 기초하여 디자인 하였다: 5'-CAGAAAAGGATAGAGCACAGAAGG-3'. PCR 온도 사이클링은, 94℃, 30 sec, 55℃, 30 sec 및 70℃, 45 sec의 35 사이클을 포함한다.

상기 PCR 과정에서 수득한 DNA 단편을 High Pure PCR 산물 정제 키트(Roche Diagnostics)를 이용해 정제하였다. 정제한 DNA 단편을 pGEM T-easy 벡터(Promega)에 연결시킨 후 대장균(JM109)에 전기천공법 (electroporation)을 이용해 형질전환 시켰다. 형질 전환 균주를 암피실린이 첨가된 LB 플레이트에 도말하고, 37℃에서 24시간 배양하여 형질전환된 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 배양해 플라스미들 분리하여 EcoRI 제한효소로 절단한 다음, 약 300-400 bp의 DNA 단편을 가지고 있는 플라스미드를 염기 서열 분석에 이용하였다.

염기서열 결정

상기 과정에서 클로닝된 신경독소 cDNA의 염기 서열은 ABI PRISM 377 Automated DNA Sequencer(PERKIN ELMER)를 이용하여 분석하였다. 염기서열 분석 후 벡터와 프라이머 부분을 제거하고 번역(translation) 과정을 통해 아미노산 서열로 전환시킨 후 오메가코노톡신 특유의 시스테인 배열을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 청자고둥의 신경독소 유전자로 결정하였다.

펩타이드 합성

Applied Biosystems model 433A 펩타이드 합성기를 이용하여 펩타이드 합성을 실시하였다. Fmoc-NH₂-알코 레진으로부터 시작하여 다양한 아미노산 보호기를 이용하여 고상 Fmoc 화학에 따라, FVIA의 선형 전구체를 합성하였다. 트리플루오로아세트산으로 절단한 다음, 선형의 펩타이드를 2 M 아세트산으로 추출하고, 0.3 M 암모늄 아세테이트, 0.5 M 구아니딘-HCl 및 2 mM 환원/0.2 mM 산화형 글루타티온의 용액으로서 NH₄OH 수용액으로 pH 8.0으로 조정된 용액으로 최종 농도 20 μM로 희석한 다음, 5일 동안 4℃에서 천천히 교반하였다. 폴딩 반응은 HPLC로 모니터링 하였다. 산화된 산물을 CM-셀룰로오스 CM-52 및 C₁₈ 실리카 컬럼이 장착된 prep HPLC로 정제하였다. FVIA의 순도는 분석용 HPLC 및 MALDI-TOF-MS 측정으로 확인하였다.

CD 측정

1 mm의 패스 길이의 석영 셀이 있는 JASCO J-710 스펙트로폴라리미터를 이용하여 190-250 nm에서 0.05 mM의 농도의 용액(0.01 M 소듐 포스페이트 in H₂O, pH 7.0)으로 20℃에서 CD 스펙트럼을 측정하였다. 20 nm/min의 스캔 속도로 평균 4 스캔으로 스펙트럼을 얻었다. 스펙트럼은 deg.cm².dmol^-1 단위를 가지는 분자 타원율[θ]로 표현된다[18, 19].

칼슘 채널 전류의 전기생리학적 측정

전기생리학적 측정은, 실온에서 전체-셀 패취-클램프 기술을 이용하여 실시하였다. 3-4 MΩ의 저항을 가지는 보로실리케이트 유리 전극을 Sylgard로 코팅 하였다. N-타입 Ca²⁺ 전류를 측정하기 위하여, 표준 전체-셀 패취-클램프 방법을 이용하였다. N-타입 Ca²⁺ 전류를 측정하기 위하여, 내부용액의 조성은 130 mM KCl, 11 mM EGTA, 10 mM Hepes 및 5 mM Mg-ATP (pH 7.4)로 하였고, 외부용액의 조성은 140 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 10 mM 글루코스 및 10 mM Hepes (pH 7.4)로 하였다. 전류 측정은 EPC-9 앰플리파이어 및 Pulse/Pulsefit 소프트웨어 프로그램(HEKA, Germany)을 이용하여 실시하였다[20].

회복(Recovery) 측정

-80 mV의 홀딩 포텐셜로부터 0 mV까지 200-ms 전압 스텝으로 전류를 발생시켰다. 펩타이드는 측정 용액에 희석되어 분당 2 ml의 속도로 퍼퓨젼 되었다. 세척 측정은 5분간 전류가 안정될 때까지 측정되었으며, 세척 동안 전류를 측정하였다. 펩타이드 독소를 첫 번째 트레이스(대조군) 이전에 첨가하였다. 독소의 세척 동안 동일한 셀에서 전류를 측정하였다. 전류 기록은 15-s 간격으로 하였다.

NMR 측정

NMR 스펙트럼은 Bruker AVANCE 600 스펙트로미터를 이용하여 얻었다. NMR 실험을 위한 시료는, pH 3.5의 90% H₂O/10% ²H₂O 또는 99.96% ²H₂O에 용해된 7 mM FVIA이었다. 모든 2차원 NMR 실험들즉, DQF-COSY, E-COSY, HOHAHA 및 NOESY을 표준 펄스 시퀀스 및 페이즈 사이클링을 이용하여 288 K 및 298 K의 온도에서 실시하였다[21, 22]. HOHAHA 스펙트럼을 80 ms 및 100 ms의 믹싱 시간에서 얻었다. NOESY 스펙트럼[23, 24]을 100 ms, 150 ms 및 250 ms의 믹싱 시간에서 얻었다. NOESY 및 TOCSY 측정에서 용매 공명의 제한(constraints)은 WATERGATE 스킴을 이용하여 이루어졌다[25]. DQF-COSY [26] 및 PE-COSY [27] 스펙트럼은, 각각 비틀림각 및 스테레오특이적 어사인먼트에 대한 컨스트레인트를 얻기 위하여 기록되었다. 이 경우, 용매 공명은, 릴랙세이션 지연 시간 동안 선택적 조사에 의해 제한되었다. 어퀴지션을 위한 데이터 크기는 DQF-COSY 및 PE-COSY에 대하여 512 (t1) × 8192 (t2)이었고, 그렇지 않은 경우에는 512 × 2048이었다. 천천히 교환되는 백본 아미드 양성자는 TOCSY 스펙트럼을 통해 분석되었고, 이 스펙트럼은 99.96% ²H₂O에서 2 hr 30 min, 5 hr, 7 hr 30 min, 10 hr 및 24 hr의 시간 스케일로 기록되었다. 내부 표준물질로서 이용된 TSP의 메틸 공명을 참조하여 화학적 변위를 분석하였다. 2차원 스펙트럼의 완전한 세트를 288 K 및 298 K (pH 3.5)에서 기록 하였다.

Bruker XWIN-NMR 소프트웨어를 이용하여 스펙트럼을 프로세싱하고 분석하였다. 상-변위된 사인-스케어드 윈도우 함수를 Fourier 변환 전에 적용하였다. PE-COSY를 제외하고, 최종 매트릭스 크기는 2048 × 2048 리얼 포인트 이었다. 고해상 DQF-COSY 및 PE-COSY 스펙트럼을 1024 × 8192로 스트립 변환하였다.

구조 계산

칸타우어링 레벨에 기초하여 크로스-피크 세기를 정량화 하였다. 관찰된 NOE 데이터는 4개의 디스턴스 범위로 분류 하였다: 1.8-2.7, 1.8-3.5, 1.8-5.0 및 1.8-6.0 Å, 이는 각각 강, 중간, 약 및 극약 NOE 값에 해당한다. 슈도-원자를 메틸 양성자 또는 비-스테레오특이적 어사인먼트 메틸렌 양성자에 대하여 이용하였다. 슈도-원자의 이용에 대한 보정 인자를 디스턴스 제한(constraints)에 추가하였다[28]. 또한, 0.5 Å을 메틸 양성자를 포함하는 디스턴스 제한에 추가하였다[29]. 각각의 이황화 결합에 대하여, 3개의 디스턴스 제한, S(i)-S(j), S(i)-C^β(j) 및 S(j)-C^β(i)를 이용하였고, 이는 각각 2.02(± 0.02), 2.99(± 0.5) 및 2.99(± 0.5) Å의 타깃 값 세트를 갖는다[30].

구조 백본 NH-CαH 커플링 상수를 DQF-COSY 스펙트럼으로부터 결정하였고, 이를 다음의 규칙에 따라 백본 비틀림각 Φ 제한으로 전환하였다: 5.5 Hz 이하의 ³J_NH-CαH에 대하여, Φ 각은 -65 ± 25°의 범위로 제한되며, 8.0 Hz 이상의 ³J_NH-CαH에 대하여, Φ 각은 -120 ± 40°의 범위로 제한된다[31, 32]. 백본 이면각 제한은 5.5-8.0 Hz의 값을 가지는 ³J_NH-CαH 에 대하여는 적용하지 않았다. χ¹ 가지쇄 비틀림각 제한의 범위 및 프로키랄 β-메틸렌 양성자의 스테레오특이적 어사인먼트는, 내부잔기NH-CβH NOEs가 결합된 3J_αβ 커플링 상수를 이용하여 얻었다[33]. 3J_αβ 커플링 상수는 ²H₂O 내 PE-COSY 스펙트럼으로부터 결정하였다. C^α-C^β 결합 주위의 t²g³, g²g³ 및 g²t³ 구조에 대하여, χ¹ 가지쇄 비틀림각을 -60± 30°, 60± 30° 및 180± 30°의 범위로 제한하였다[34]. 천천히 교환되는 아미드 양성자에 대한 수소결합 수용체를, 예비적인 계산된 구조를 분석하여 규명하였다[35, 36]. 수소결합의 거리 제한을, NH(i)-O(j)에 대하여 1.8-2.3 Å의 타깃 값, N(i)-O(j)에 대하여 2.8-3.3Å의 타깃 값으로 추가하였다.

X-PLOR 3.851 프로그램을 이용하는 SGI O2 워크스테이션 상에서 운영되는 X-PLOR 3.1 프로그램을 이용하여 모든 계산을 수행하였다[37]. 랜덤화 백본 Φ 및 Ψ 비틀림각을 가지는 주형 구조로부터 시작하는 동력학적 모조의 어닐링 프로토콜로부터 실험적으로 얻은 거리 및 비틀림각 제한에 기초하여, 3차원 구조를 계산하였다.

구조의 평가

가장 낮은 에너지 및 가장 작은 Lennard-Jones 반데르발스 에너지를 가지는 최소 20개의 구조를 선택하였다. 계산된 구조들의 수렴은 구조 변수들로 평가하였다. 실험적 거리 및 이면각 제한, 에너지 통계(F_NOE, F_tor, F_repel 및 E_L-J) 및 이상화 기하학으로부터 RMS 편차들이 있었다. PROCHECK_NMR [38], PROMOTIF_NMR [39] 및 MOLMOL 프로그램[40]을 이용하여 구조를 분석하였다. 최종 수렴 구조에서 백본 이면각의 분포를, Ramachandran 이면각 패턴으로 평가하였고, 이는 허용 (Φ, Ψ) 각 한계로부터의 편차를 나타낸다. 수렴 구조들에서 각 변이의 정도를 각 순서 변수를 이용하여 평가하였다[5, 41]. 아미노산 잔기들의 가지쇄에 대한 용매 접근성 표면적을 1.4 Å의 용매 반경을 가지고 계산하였다.

FVIA의 부위특이 치환체의 제조, 칼슘 채널 억제 활성 및 회복도 분석

상술한 펩타이드 합성 방법에 따라 하기 표 5의 아미노산 서열을 갖는 FVIA의 부위특이 치환체들을 합성하였다. 제조된 FVIA 치환체들의 칼슘 채널 억제 활성 및 회복도는 상술한 실험 방법과 동일하게 실시하였다.

진통 작용에 대한 동물 실험

*1. 실험동물

체중 23-25 g의 ICR 마우스(IcrTacSam:ICR, MJ Co., 대한민국)를 실험에 사용하였다. 실험동물은 케이지 당 5 마리씩 분배하여 온도(22± 2℃)와 습도(30-50%)를 유지한 상태에서 24시간의 적응시간을 두었으며 물과 사료는 자유급식 하였다. 모든 실험동물은 통증실험 전 환경에 적응하기 위해 최소 2시간의 적응시간을 두었으며 실험의 오차를 줄이기 위하여 낮 동안에(10:00-17:00)만 실험을 하였다.

2. 척수강내 FVIA 주사

척수강내 투여방법은 이전에 기술된 방법[50,51]에따라 실시하였고, 30 게이지 바늘이 장착된 25 ㎕ 해밀톤 주사기를 사용하였다. 척수강내 주사하는 시료의 양은 1% 메틸렌 블루 용액을 주사하여 척수가 염색되는 정도를 보고 결정하였다. 본 발명자들은 척수강내 주사액을 5 ㎕로 정하여 FVIA를 0.01 μg/5 ㎕의 농도로 주사하였다.

3. 테일-플릭 시험(Tail-flick test)

실험하기 5분 전에 마우스에 FVIA 펩타이드(0.01 μg/5 ㎕) 5 ㎕를 척수강내에 처리하였다. 대조군은 생리적 식염수만으로 처리하였다. 테일-플릭 시험은 모델 TF6 테일 플릭 장치(EMDIE Instrument Co., Maidens VA)를 사용하여 실시하였다.

마우스의 몸을 한손으로 고정시킨 후 꼬리를 가지런히 한 다음 강도 3.8 세기의 열의 강도로 꼬리 하단부에 빛을 조사하였다. 빛을 조사하는 시간부터 꼬리가 탁탁 튀듯이 움직일 때까지의 시간을 기록하였다.

4. 플랜타르 시험(Plantar test)

실험하기 5분 전에 마우스에 FVIA 펩타이드(0.01 μg/5 ㎕) 5 ㎕를 척수강내에 처리하였다. 플랜타르 시험은 열 플랜타르 장치(Plantar test 7371, Ugo Basile, 이탈리아)를 사용하여 실시하였고 열 통증역치(thermal pain threshold)를 측정하였다. 실험 전에 마우스를 챔버에 두고 주변 환경에 적응시켰다. 마우스의 좌측 발바닥에 강도 90 mWatt/㎠의 빛을 조사하여 마우스에 열 자극을 주었다. 빛을 조사하는 시간부터 발바닥을 탁탁 튀듯이 움직일 때까지의 시간(latency of paw withdrawal)을 기록하였다.

5. 라이딩 시험(Writhing test, 내장통 재연)

실험하기 5분 전에 마우스에 FVIA 펩타이드(0.01 μg/5 ㎕) 5 ㎕를 척수강내에 처리한 다음, 생리식염수(0.9% NaCl) 내의 1.0% 아세트산 용액250 ㎕를 마우스의 복강내 주사(intraperitoneal injection)하고, 30분 동안 마우스가 몸을 움츠렸다 펴는 동작(writhing)을 한번으로 세어 총 반응횟수를 계수 하였다.

6. 글루타메이트 유도 통증 시험(Glutamate-induced nociceptive test)

실험하기 5분 전에 마우스에 FVIA 펩타이드(0.01 μg/5 ㎕) 5 ㎕를 척수강내에 처리하였다. 이 후, 마우스를 글루타메이트(20 μg/5μl) 주입 전 최소 30분간 관찰 챔버에 적응시켰다. 마우스에 글루타메이트(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, 미국)를 척수 투여한 후, 투명 관찰 챔버(아크릴-플라스틱, 20 cm 높이, 20 cm 직경)에 두고 침해성 통증 행동 반응을 30분간 기록한다. 척수의 허리와 꼬리 부분을 향한 기, 할퀴기, 물기의 누적된 반응 시간을 측정한다.

7. 서브스탠스 P 유도 통증 시험(Substance P-induced nociceptive test)

실험하기 5분 전에 마우스에 FVIA 펩타이드(0.01 μg/5 ㎕) 5 ㎕를 척수강내에 처리하였다. 이 후, 마우스를 서브스탠스 P(0.7 μg/5μl) 주입 전 최소 30분간 관찰 챔버에 적응시켰다. 마우스에 서브스탠스 P(Tocris Cookson Ltd., Bristol, 영국)를 척수 투여한 후, 투명 관찰 챔버(아크릴-플라스틱, 20 cm 높이, 20 cm 직경)에 두고 침해성 통증 행동 반응을 30분간 기록하였다. 척수의 허리와 꼬리 부분을 향한 리킹(licking), 할퀴기, 물기의 누적된 반응 시간을 측정하였다.

8. 포르말린 시험(신경병증성 통증의 기전 연구에 중요)

포르말린 시험은 Hunskaar 등이 제안한 방법에 따라 시행하였다[52]. 요약하면, 실험하기 5분 전에 마우스에 FVIA 펩타이드(0.01 μg/5 ㎕) 5 ㎕를 척수강내에 처리하였다. 이 후, 동물실험 할 때마다 생리식염수(0.9% NaCl)에 5.0% 포르말린 용액을 새로 제조하여 마우스의 왼쪽 뒷발(hindpaw)에 10 ㎕를 피하주사하였다. 주사 후 즉시 아크릴 관찰 챔버(20 cm 높이, 20 cm 직경)의 마우스에 대한, 제1기:0-5분 및 제2기:20-40분(총 40분) 동안 마우스가 하는 행동(왼쪽 뒷발을 물고, 뜯고, 핥고, 떨고 하는 등의 행동) 시간을 스톱-워치 타이머로 측정하였다.

신경병증성 통증에서 진통작용 I. 왼쪽 다리 신경 손상 모델

1. 실험동물 및 신경병증성 통증 유발 모델

이 연구를 위한 동물실험은 세계통증연구학회(International Association for the Study of Pain)의 윤리규정 및 서울대학교 치과대학 동물실험 윤리규정에 의하여 시행되었다. 실험동물은 초기 체중 150-200 g의 웅성 Sprague-Dawley 래트(Orient Bio Co., 한국)를 대상으로 12시간의 광주기성을 유지하며, 4-5 마리씩 깔집이 있는 통에 사육하였다. 통증행동 검사는 일정 온도(20-24℃) 및 일정 습도 (40-60%)를 유지한 환경에서 일정 시간(오전 10시 - 오후 5시)에 시행하였다.

Kim과 Chung의 방법[53]을 이용하여 신경병증성 통증 모델을 제작하였다. 요약하면 래트를 enflurane (2-3 vol%) 흡입마취 하에 척추의 정중선을 절개한 다음 제 5번 및 6번 요척수 신경을 노출시키고 5-0 실크 봉합사로 단단히 결찰하였다. 생리식염수로 관주하고, 지혈한 후 근육과 피부를 다시 봉합하였다. 모델제작 후 1, 4, 7 및 14일에 통증 반응 검사를 시행하여 50% 회피역치가 2.0 g 이하인 통증이 확실히 발생한 래트를 대상으로 척수강 내에 카테터를 삽입하였다.

2. 척수강내 카테터 삽입 (intrathecal catheterization)

카테터 삽입은 Yaksh 등의 방법[54]에 따라 실시하였다. 요약하면, 래트를 흡입마취 유도한 후 입체정위기(stereotaxic frame)에 양측 외이도를 걸어 복와위로 고정시킨 후 마스크를 통하여 enflurane 마취가스를 공급하면서 후두골과 제1경추 사이의 경막을 노출시킨 후 경막을 절개한 후 폴리에틸렌 카테터 (PE-10)를 8 cm 삽입하여 요부팽대부 (lumbar enlargement)까지 삽입한 후 잘 고정한 후 추가로 5 cm 길이를 확보한 후 (추후 hamiltone 주사기를 이용한 약물주입로로 사용) 근육과 피부를 봉합한 후 마취에서 회복시켰다. 카테터 삽입 5일 후 신경학적 결손이 없고, 1% 리도카인 10 μL 주사한 후 뒷다리 운동 마비를 보이는 래트를 대상으로 리도케인 주사 하루 후부터 코노톡신 투여 실험에 사용하였다.

3. 기계적 자극에 대한 통증검사

기계적 자극에 대한 통증회피반응은 철망 위에 놓인 통(8 × 8 × 18 cm) 속에 대상 래트를 넣고, 30분 동안 안정시킨 후 측정하였다. 통증 행동 검사 전 보정한 von Frey 필라멘트들(0.41, 0.70, 1.20, 2.00, 3.63, 5.50, 8.50, 및 15.14 g) 중 2.00 g부터 시작하여 up & down 방법[55,57]으로 철망 사이를 통해 발바닥에 자극을 가하여 통증행동을 관찰하였다. 신경결찰 전 1주일 동안 3회 시행한 통증행동검사에서 3회 모두 50% 회피역치가 15.14 g 이상인 쥐들을 대상으로 하였다.

신경병증성 통증에서 진통작용 II. 꼬리 신경 손상 모델

1. 실험동물 및 신경병증성 통증 유발 수술

래트 (Sprague-Dawley, 150-200 g) 웅성을 실험동물로 사용한다. 실험동물을 한 우리 당 4마리씩 넣고 12시간 간격의 일조 주기(light-dark cycle, 빛은 오전 7시부터) 하에서, 22-25℃를 유지하면서 음식과 물을 자유롭게 주어 사육하였다.

1.1. 신경병증성 통증의 유발

래트 (Sprague-Dawley, 150-200 g) 웅성을 4% enflurane과 95% 산소의 혼합가스로 마취를 유도한 후, 수술 전 과정에 걸쳐 2-3% enflurane과 95% 산소 혼합가스로 마취를 유지시켰다. 꼬리에 신경병증성 통증을 유발하기 위해 쥐꼬리에 분포하는 상, 하미간(superior, inferior caudal trunk)을 노출시키고, 제 1,2 천수신경 사이에서 주변 조직을 조심스럽게 제거 및 절단하였다. 트렁크의 인접 및 말초부의 말단이 서로 결합할 가능성을 막기 위하여, 트렁크의 약 2 mm를 인접 말단으로부터 제거하였다. 이러한 외과 수술은 꼬리쪽 상, 하미간을 통해 꼬리의 제 1 천수신경 자극 전달을 떨어뜨린다[56].

1.2. 신경병증성 통증 행동검사

모든 행동검사는 약제투여 여부를 모르는 연구자에 의해 맹검법(blind study)으로 시행되었다.

1.2.1. 기계적 이질통(mechanical allodynia) 측정을 위한 행동검사

래트를 둥근 아크릴 통(5.5× 15, 6.5× 18 cm, 몸 크기에 따라 맞게 사용)에 넣고 꼬리만 밖으로 빼낸 후, 판 위에 올려놓았다. 기계적 이질통에 대한 측정은 여러 가지 von Frey hair (0.4, 0.6, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 15.0 g)를 이용하여 Up-Down 방식[55,57]으로 꼬리를 자극하여 50% 회피반응을 보이는 von Frey hair의 그램(g)을 산정하는 방식으로 시행하였다. 신경 손상 전과 비교하여 통계적으로 유의하게 회피반응 역치가 감소한 것을 기계적 이질통이 발생한 것으로 판정하였다.

1.2.2. 냉 이질통(cold allodynia) 측정을 위한 행동검사

래트를 둥근 아크릴 통에 넣고 꼬리만 밖으로 꺼내 늘어뜨린 후 4℃ 물 속에 넣어 꼬리가 회피반응을 보일 때까지의 시간을 측정하여 기록하였다. 실험결과는 5분간의 간격을 두고 5회 실시한 평균값으로 하였다. 15초까지 회피하지 않을 때는 꼬리의 민감화를 막기 위해 물 속에서 꼬리를 빼내고 15초를 결과로 한다. 수술 전보다 유의성 있게 빨리 회피하는 경우는 냉 이질통의 결과로 추정하였다.

1.2.3. 온 이질통(warm allodynia) 측정을 위한 행동검사

실험은 냉 이질통과 같은 방식으로 시행하되 물의 온도를 40℃로 하였다. 수술 전보다 유의하게 빨리 회피하는 경우를 온 이질통의 결과로 추정하였다.

* 위에 기재된 행동검사 실험에서, 신경에 손상을 주기 전과 비교하여 신경손상 후에 유의한 회피반응을 보이면 통증이 유발된 것으로 추정하였다.

2. 약물주사

만성 신경병증성 통증에 대한 FVIA와 MVIIA의 진통효과를 알아보기 위해, 신경손상 후 14일간의 행동검사를 실시하여 신경병증성 통증이 잘 유발된 동물을 선택하여 약물검사를 실시하였다.

약물을 생리식염수에 현탁시키고 아래와 같은 방법으로 척수강내에 주사하였다. enflurane으로 래트를 얕게 마취시키고, 25 ㎕ Hamilton 주사기에 30-게이지 바늘을 연결하여 제5, 6 요추사이의 경질막(dura mater)을 통해 거미막밑공간(subarachnoid space)에 약물을 주사하였다. 약물은 6.5, 20, 65 또는 200 ng/kg 투여량으로 주사하되, 기계적 이질통에 대한 진통효과는 주사 후, 1시간까지는 15분 간격으로, 3시간까지는 30분 간격으로 하고, 5시간 및 24시간째에 각각 실시하였다. 냉, 온 이질통에 대한 진통효과는 주사 후 1, 3, 5 및 24시간에 각각 조사하였다.

평균 동맥압 측정

래트 (Sprague-Dawley, 150-200 g) 웅성을 대상으로 12시간의 광주기성을 유지하며 온도(22± 3℃)와 습도(40-60%)를 유지한 상태에서 물과 사료는 자유급식 하였다. 모든 수술 절차는 isoflurane로 흡입 마취 유도한 후 카테터(PE-10)를 대퇴동맥에 삽입하였다. 카테터를 식염수로 채우고 환자모니터링장치(필립스 MP30, Intellivue)에 연결하였다. MVIIA 또는 FVIA를 래트의 측부 꼬리 혈관에 투여하였다. 심전도 모니터링을 위해 양쪽 앞 무릎과 왼쪽 뒷다리의 피부 아래 스테인레스 선 전극을 위치시켰다.

통계처리

모든 결과는 평균± 표준오차평균(SEM)으로 나타낸다. 신경병증성 통증에 미치는 약물의 효과는 one-way repeated measured ANOVA 검정법과 Bonferroni t-검정법으로 비교 분석 되었다. p-값이 0.05보다 작을 때를 유의한 결과로 판정한다. 약물처리 후 회피 역치(withdrawal threshold)의 증가로서 항이질통 효과를 평가하였고, 이는 최대 가능 효과의 퍼센트(%MPE)로 나타낸다: (%MPE): %MPE = 100 x [(회피역치_치료후) - (회피 역치_수술후)/(회피 역치_수술전) - (회피 역치_수술후)].

실험 결과

코노펩타이드 분리

우선, 본 발명자들은 생화학적 방법을 이용하여 몇 개의 코노펩타이드 서열들의 특성을 연구하였다(독소 추출 및 HPLC). 동시에, 청자고둥 독소관의 mRNA 또는 gDNA를 이용하여 코노펩타이드 유전자를 클로닝을 하여 추가적인 결과를 얻었다. 약 50개의 코노펩타이드를 상기 방법에 의해 규명 하였다. 분리된 코노펩타이드 서열들은 O-슈퍼패밀리, A-슈퍼패밀리, M-슈퍼패밀리 및 기타 다른 패밀리에 속하는 것들이었다[1].

본 발명자들에 의해 규명된 서열들 중에서, FVIA는 공지의 ω-코노펩타이드 MVIIA와 높은 상동성(76%)을 나타내며, 필수 잔기 Tyr¹³, Lys² 및 Arg¹⁰을 갖는다(표 1). 전체 서열에서 6개의 잔기만이 상이하다. FVIA의 cDNA 서열은 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다는 것이 규명되었다.

ω-코노톡신 FVIA 및 다른 N-타입 칼슘 채널 블록커의 일차 서열

명칭	아미노산 서열	상동성
FVIA	C KGTGKS C SRIAYN CC TGS C R SGK C-NH 2	-
MVIIA	C KGKGAK C SRLMYD CC TGS C R SGK C-NH 2	76%
CVIA	C KSTGAS C RRTSYN CC TGS C R SGR C-NH 2	72%
GVIA	C KSPGSS C SPTSYN CC R S C NPYTKR C Y-NH 2	52%
CVID	C KSKGAK C SKLMYD CC SGS C SGTVGR C-NH 2	48%

펩타이드 합성

본 발명의 코노펩타이드, FVIA를 고상 화학 합성법에 따라 다량 합성하였다. TFA 절단 후, 모든 보호기가 제거된 FVIA의 선형 전구체를 20% 아세트산으로부터 추출하였다. 펩타이드의 공기 산화는 적합한 이황화 결합을 가지는 펩타이드를 제공하였고, 이는 이온교환 크로마토그래피 및 역상 HPLC로 정제되었다. FVIA는 중성 pH에서 +5의 전하를 가지는 강염기성 펩타이드이기 때문에, CM-셀룰로오스 CM52를 양이온 교환 크로마토그래피로 이용하고 NH₄OAc 완충액 구배를 용출액으로 이용하였다. 최종 정제 산물을 분석용 HPLC, 아미노산 분석 및 MALDI-TOF-MS 측정으로 확인하였다(도 1).

CD 측정

FVIA의 CD 스펙트럼은 약 205 nm에서 최소값을 나타낸다(도 2A). 5개의 주요한 이차구조(α-헬릭스, 반대평행 β-쉬트, 평행 β-쉬트, β-턴 및 랜덤 구조)에 대한 이차구조 스펙트럼에 기초하여, FVIA는 β-턴 구조 또는 반대평행 β-쉬트 구조를 가지고 있음을 알 수 있었다[18]. 따라서, FVIA의 이차구조는 산화적 폴딩에 의해 적합하게 형성되었음을 알 수 있다[19]. 또한 FVIA의 펩타이드 아날로그인 키메라-FMFF, 키메라-MFMM, FVIA[N14D] 및 FVIA[I11L, A12M]의 CD 스펙트럼에서, 이들의 이차구조는 FVIA와 거의 일치하며 활성의 차이는 이차구조의 변화로 인한 것이 아니라 잔기의 차이임을 보여준다(도 2B)

전기생리학적 분석

ω-코노톡신의 인 비트로 활성을 연구하기 위하여, 전기생리학적 분석을 실시하였다[20]. IC₅₀ 값은 ω-코노톡신의 활성을 나타내며, 이는 처리량-억제(반응) 곡선으로부터 계산된다. 처리량의 범위는 0.1 nM 내지 1 μM이다. 합성된 MVIIA 및 FVIA는 인간 배아 신장세포에서 발현된 인간 N-타입 칼슘 채널을 동일한 수준으로 억제 하였다(도 3). 곡선의 모양은 S자형이며, 0.1 μM부터 포화(거의 100% 억제)되는 경향을 보인다. MVIIA 및 FVIA의 IC₅₀ 값은 각각 7.96 ± 1.59 nM 및 11.5 ± 1.4 nM이었다.

이어, ω-코노톡신에 대한 전류-전압 곡선을 얻었다. 채널 차단제의 기전은 동공 차단 및 게이트 변형 작용으로 나눌 수 있다. MVIIA과 같은 ω-코노톡신은 동공 차단제이며 N-타입 칼슘 채널 동공 부위의 베스티튜불(vestitubule)에 결합한다는 것은 잘 알려져 있다. 본 발명의 FVIA도 곡선의 쉬프팅 없이 억제 곡선을 나타낸다[42](도 4).

마지막으로, 본 발명자들은 N-타입 VSCC에 대한 결합으로부터의 회복(recovery)을 분석하였다. 1 μM 농도에서 차단이 포화되었을 때, 코노톡신을 세척하였다. FVIA의 블롯킹 작용은 MVIIA 보다 신속하게 이루어졌으나, FVIA는 MVIIA 보다 우수한 해리 정도를 나타내었다(도 5).

NMR 분석

ω-코노톡신 FVIA의 2차원 ¹H NMR 스펙트럼을 표준 방법에 따라 얻었다[43]. 피크들은 잘 분산되어 있고, 루프 2와 4의 잔기들에서 오버랩이 있었다(표 2). DQF-COSY 및 TOCSY 실험에 의해 관찰되고 NOESY 측정 결과에 의해 보충된 스칼라 커플링 패턴에 기초하여, 아미노산 스핀 시스템을 밝혔다. 규명된 스핀 시스템들을, NOESY 스펙트럼에서 관찰된 잔기간 연속 NOEs를 통하여, FVIA의 일차구조를 따라 정렬하였다. 표 2는 NOESY 스펙트럼의 화학적 변위를 나타낸다.

298K 및 pH 3.5에서의 FVIA의 화학적 변위

잔기	Chemical shift (p.p.m)a
	NH	CαH	CβH	others
Cys1	-	4.503	3.095, 3.273	-
Lys2	9.101	4.503	1.930, 1.711	CγH 1.406 CδH 1.555
Gly3	8.770	3.827, 4.048	-	-
Thr4	8.280	3.713	3.934	CγH 1.235
Gly5	9.260	3.626, 4.344	-	-
Lys6	7.664	4.503	2.077, 1.901	CγH 1.478, CδH 1.627
Ser7	8.406	4.866	3.900, 3.946	-
Cys8	8.166	4.970	3.127, 3.275	-
Ser9	8.350	4.675	4.037, 3.821	-
Arg10	8.610	4.105	1.665	CγH 1.860
Ile11	7.618	4.184	1.888	CγH2 1.352, 1.159; CγH3 0.085
Ala12	7.698	4.355	1.233	-
Tyr13	7.846	4.628	3.164	C2, 6H 6.852; C3,5H 7.129
Asn14	8.257	4.779	2.672, 2.832	-
Cys15	8.313	4.960	2.556, 3.251	-
Cys16	9.590	4.412	2.921, 3.253	-
Thr17	8.441	4.472	4.072	CγH 1.119
Gly18	8.360	3.820, 4.097	-	-
Ser19	8.201	4.722	3.706, 3.786	-
Cys20	8.725	4.711	2.829, 2.899	-
Arg21	8.622	4.644	1.841	CγH 1.634, 1.544
Ser22	9.317	4.047	3.900, 4.127	-
Gly23	8.224	4.152, 3.786	-	-
Lys24	7.768	5.120	1.632, 1.520	CγH 1.260; CδH 1.357
Cys25	8.712	4.859	3.023, 3.228	-
아미드	-	-	-	NH2 8.441

도 8에 정리된 바와 같이, FVIA는 잔기 6-8, 21 및 24로 구성된 3개의 짧은 β-가닥을 포함하며, 이는 몇 개의 턴을 가지는 반대평행 방식으로 정렬되어 있다. β-가닥의 정도 및 β-쉬트 구조에서의 상대적인 배향성을 다음의 표준 기준에 따라 결정하였다: 큰 ³J_NH-Cα 커플링 상수(Lys⁶, Cys⁸, Ser⁹, Arg¹⁰, Ile¹¹, Ala¹², Tyr¹³, Cys¹⁵, Cys²⁰, Arg²¹ 및 Lys²⁴), 강한 연속 d_αN, 가닥 사이의 NH-NH 및 NH-C^αH 상호연결성(connectivities), 그리고 천천히 교환되는 아미드 양성자(Lys⁶, Cys⁸, Ile¹¹, Gly¹⁸, Gly²³, Arg²¹ 및 Lys²⁴). 상기의 기준은 β-쉬트 내의 주변 가닥 및 중심 가닥들의 구별을 가능하게 하였다.

FVIA의 용액 구조의 계산

본 발명자들은, FVIA의 3차원 구조를 계산하기 위하여 총 317개의 NMR 실험 제한을 이용하였고, 이는 301개의 실험적 거리 제한 및 16개의 이면각 제한을 포함하며, 잔기 당 평균 12.68 제한에 해당하는 것이다. 285개의 거리 제한 중에서, 128개의 내부잔기, 156개의 잔기간 NOE 거리 제한, 수소-중수소 교환 실험으로부터 결정한 8개의 수소결합 제한 및 9개의 이황화 결합 제한이 있었다. 수소결합과 관련된 3개의 거리 제한은 다음과 같다: Gly⁵ (NH) - Cys²⁵ (CO), Lys⁶ (NH) - Gly³ (CO), Cys⁸ (NH) - Gly²³ (CO), Ile¹¹ (NH) - Ser⁹ (OH), Gly¹⁸ (NH) - Cys¹⁵ (CO), Arg²¹ (CO) - Lys²⁴ (NH), 및 Arg²¹ (CO) - Lys²⁴ (NH).

100개의 랜덤 FVIA 구조들로부터 시작하여 모조의 어닐링 계산을 실시하였고, NMR 실험 제한들과 잘 일치되는, NOE 거리 및 토션각 위반이 각각 0.3 Å 및 3°보다 작은, 20개의 구조를 최종적으로 선택하였다. 수렴된 구조에 대한 통계를 구조 변수의 측면에서 평가하였다(표 3).

20개의 최저 에너지 구조들에 대한 구조적 통계

실험적 거리 제한으로부터 RMS 편차 (Å)a (301) 0.037± 0.008 실험적 이면각 제한으로부터 RMS 편차 (deg.)a (17) 0.037± 0.008

에너지 통계(kcal/mol)b

F NOE 0.245± 0.165

F tor 5.021± 0.359

F repel 4.109± 1.475

E L-J -54.690± 6.728

이상화 기하학으로부터의 RMs 편차

결합 (Å) 0.0033± 0.0001

각 (deg) 0.558± 0.02

임프라퍼스 (deg) 0.443± 0.0156

Ramanchandran 분석 (잔기 2-30)c

가장 선호적 (%) 42.9

추가적으로 허용됨 (%) 56.3

일반적으로 허용됨(%) 0.8

비허용 부위(%) 0.0

평균 페어 RMS 차이 (Å)c

백본 (잔기 2-30) 0.47± 0.10

모든 중 원자(잔기 2-30) 1.36± 0.21

a 계산에 이용된 각각의 실험 제한의 수가 괄호 내에 기재되어 있다.b F NOE, F tor 및 F repel는 각각 NOE 위반, 토션각 위반 및 반데르발스 배척 텀에 관련된 에너지이다. 상기의 항목에 이용된 역상수의 값은 X-PLOR 3.1 매뉴얼에 기재된 표준값이다. E L-J는 CHARMM 경험 에너지 함수로 계산된 Lennard-Jones 반데르발스 에너지이며, 모사의 어닐링 계산을 포함하지 않는다. c PROCHECK-NMR 프로그램을, 구조의 스테레오화학 질을 평가하기 위하여 사용하였다.

이상적인 공유 기하학으로부터의 편차는 매우 적었고, Lennard-Jones 반데스발스 에너지는 크고 네거티브이었으며, 이러한 결과는 보존 구조에서 왜곡이 없거나 또는 비결합성 악성 접촉이 없다는 것을 나타낸다. 총 서열에 대한 평균 배위 위치에 대한 원자 RMS 편차는, 백본 원자(N, C_α, C)에 대하여 0.47 ± 0.10 Å, 모든 중원자에 대하여 1.36 ± 0.21 Å이었다. 총 서열에 대한 백본 구조는 전체 서열에서 잘 정해져 있으며; Ramachandran 분석은 β-쉬트 부위 또는 일반적으로 허용되는 부위 내에 있는 백본 이면각을 보여준다.

FVIA의 분자적 구조

FVIA의 분자적 구조는 트리플-가닥의 반대평형 β-쉬트 및 4개의 사슬 역전으로 구성되어 있다. FVIA의의 전체적인 β-쉬트 토폴로지는 +2x, -1이며, 이는 “억제 시스테인 노트” 폴드를 가지는 독성의 억제 펩타이드에서 종종 발견되는 것이다[45]. 3개의 β-가닥은 잔기 Ser⁷-Cys⁸ (β-가닥 I), Arg²¹ (β-가닥 II) 및 Gly²³-Lys²⁴ (β-가닥 III)에 의해 형성되며, β-가닥 I은 이황화결합(Cys⁸-Cys²⁰)에 의해 β-가닥 II에 구속되어(tethered) 있으며, 반대평행 방식으로 약 45°의 각도로 중심의 β-가닥 III와 상호작용 한다. 처음의 사슬 역전은 잔기 Gly³-Lys⁶에서 발생되며, 이는 타입 II β-턴을 형성한다. 두 번째 및 세 번째 역전은 잔기 Ser⁹-Ala¹² 및 Cys¹⁵-Gly¹⁸에서 발생되며, 이는 각각 타입 IV β-턴 및 타입 I β-턴을 형성한다. 마지막 역전은 잔기 Arg²¹-Lys²⁴에서 발생되며, 이는 β-헤어핀 턴(타입 IV β-턴)을 형성하며 β-가닥 II 및 III 사이에서 백본의 방향을 역전시킨다.

FVIA의 부위특이 치환체의 제조, 칼슘 채널 억제 활성 및 회복도

본 발명에서 분리된 신규한 코노톡신인 FVIA의 활성 및 회복도에 영향을 미치는 부위 및 잔기를 규명하기 위하여, FVIA의 부위특이 치환체들을 제조하였다. FVIA의 부위특이 치환체들은 하기 표 4에 정리되어 있다.

FVIA 부위특이 치환체

펩타이드	아미노산 서열
FVIA	CKGTG KSCSR IAYNC CTGSC RSGKC NH2
MVIIA	CKGKG AKCSR LMYDC CTGSC RSGKC NH2
키메라-FMFF	CKGTG KSCSR LMYDC CTGSC RSGKC NH2
키메라-MFMM	CKGKG AKCSR IAYNC CTGSC RSGKC NH2
FVIA[N14D]	CKGTG KSCSR IAYDC CTGSC RSGKC NH2
FVIA[I11L, A12M]	CKGTG KSCSR LMYNC CTGSC RSGKC NH2

상기 FVIA의 부위특이 치환체들의 칼슘 채널 억제 활성 및 회복도를 분석하였다. 이 실험에서, 30 nM FVIA의 부위특이 치환체들을 이용하여 실험 하였다. 실험 결과는 다음 표 5에 정리되어 있다.

FVIA 부위특이 치환체의 칼슘 채널 차단 활성 및 회복도

펩타이드	억제활성(%)	회복도(%)
FVIA	94.7± 2.1	69.7± 6.5
MVIIA	81.5± 2.4	39.5± 6.8
키메라-FMFF	84.2± 2.9	24.7± 1.1
키메라-MFMM	93.4± 1.9	70.3± 10.6
FVIA[N14D]	54.4± 8.7	87.7± 7.8
FVIA[I11L, A12M]	84.3± 4.7	39.0± 5.7

상기 표 5의 결과로부터 알 수 있듯이, 키메라-MFMM은 종래의 코노톡신인 MVIIA을 주 백본으로 하면서 11-15번째 잔기가 본 발명의 FVIA로 치환된 것인데, 칼슘 채널 억제 활성도 우수하지만 회복도도 MVIIA와 비교하여 거의 2배 정도 증가하였다. 따라서, 11-15번째 잔기가 본 발명의 FVIA의 우수한 가역성을 결정하는 부분이라는 것을 알 수 있다.

보다 정밀한 분석을 위하여, FVIA의 11번 및 12번째 잔기인 Ile 및 Ala을 각각 Leu 및 Met으로 치환하여 FVIA[I11L, A12M] 치환체를 제조하였다. 이 치환체의 칼슘 채널 억제 활성은 FVIA와 거의 비슷하였지만, 가역성은 크게 감소하였다. 따라서, FVIA의 11번 및 12번째 잔기인 Ile 및 Ala이 회복도, 즉 가역성에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다.

진통 작용에 대한 동물 실험

본 발명의 FVIA가 마우스에서 진통 작용을 나타내는 지 여부를 조사하였다. 도 8A 및 8B의 테일 플릭 시험 및 플랜타르 시험의 결과를 보면, 0.01 μg/5μl의 FVIA를 투여한 래트에서 대조군에 비해 통증 현상을 나타내는 시간이 줄어들었으나 통계적 유의성은 없다.

도 9A 및 9B에 나타난 바와 같이, 대조군 마우스에서 글루타메이트 20 μg의 척수 주입, 서브스탠스 P 0.7 μg의 척수 주입은 30분간 지속되는 핥기, 할퀴기, 물어뜯기 등의 급성 행동 반응을 일으켰다. 반면에 FVIA를 척수 투여한 마우스에서는 누적된 통증 반응의 시간이 유의하게 감소하였다.

또한 식염수를 투여한 대조군 마우스에서 1% 아세트산 250 μl의 복강 주입은 몸비틀기 행동을 나타낸다. 반대로, 도 9C에서 보여지듯, FVIA를 투여한 마우스에서는 몸비틀기의 횟수가 유의하게 감소하였다.

도 10A를 보면 식염수를 척수 투여한 대조군 마우스의 좌측 발바닥 표면에 5% 포르말린 10 μl을 피하 주사하면 1차 반응으로 5분간 지속되는 움찔하기나 좌측 발바닥을 향해 핥기나 할퀴기 등의 급성 통증 반응을 나타내고 2차 반응으로서 포르말린 주입 후 20분 후부터 40분까지 통증 반응을 나타내었다. FVIA를 척수 투여한 마우스에서는 포르말린의 피하 주입에 의해 유도된 통증 행동의 누적 시간이 1차와 2차 반응이 유의하게 감소하는 것을 볼 수 있다. FVIA는 포르말린의 1차 반응보다는 2차 반응에서 더 크게 통증을 감소시키는 것을 알 수 있다.

도 10B에 나타난 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 농도 의존적으로 진통 효과를 발휘하는 것으로 조사되었다. 투여된 FVIA의 농도가 증가함에 따라(3.2 ng/5μl, 10 ng/5μl, 32 ng/5μl 및 100 ng/5μl) FVIA의 진통 효과가 증가되었다. 흥미롭게도, 100 ng FVIA 척수 투여시 2차 반응에서는 통증 행동을 거의 완벽히 억제하는 것을 볼 수 있다.

이러한 결과는 본 발명의 FVIA는 동물 개체 수준에서 성공적으로 진통 작용을 한다는 것을 보여준다.

신경병증성 통증에 대한 진통 효과

본 연구에서 두 가지의 신경병증성 통증 모델을 제작하였다. 제 5 및 6번 요척수 신경을 손상시킨 동물모델과 제 1,2 천수신경을 손상시킨 동물모델이다. 이렇게 신경이 손상된 래트들은 신경 병증성 통증을 일으키며 그 징후로 이질통을 느낀다.

기계적인 이질통은 von Frey hair를 이용하여 꼬리를 자극해 50% 회피반응을 보일 때의 von Frey hair의 그램으로 산정하였다. 도 11에서 볼 수 있듯이, FVIA와 MVIIA의 투여에 따른 50% 회피 역치가 시간에 따라 증가하다가 2시간 이후부터 감소하고 있음을 보인다. 도 12A는 FVIA 투여 시간에 따른 50% 회피 역치가 농도 의존적인 방식(6.5, 20, 65, 200ng/kg)으로 증가하고 있음을 나타낸다. 또한, 도 12B 및 도 12C에 나타나듯이, FIVA 펩타이드는 냉온 이질통에서 진통 효과를 나타낸다.

상술한 실험 결과에 따르면, 본 발명의 FVIA는 위의 두 가지 신경병증성 통증 동물 모델에서 성공적으로 진통 작용을 한다는 것을 알 수 있다.

심혈관계에 미치는 영향

FVIA 또는 MVIIA 100 μg/kg를 투여하고, 시간 경과에 따른 평균 혈압(MAP)을 모니터링 하였다. 도 13에서 볼 수 있듯이, MVIIA는 투여 후 혈압 수치가 초기로부터 급격하게 감소한 후 느린 회복을 보였다. 한편, FVIA는 투여 후 혈압 수치가 급격하게 감소하나 초기 수치로 MVIIA보다 빠른 회복을 나타내었다.

실험 결과에 대한 논의

코노펩타이드의 분리

코노펩타이드는 시그널 서열 및 Cys 패턴에 따라 다양한 패밀리 구성한다. 독소 성분들의 두 가지의 광범위한 구분이 기재되어 있다: 이황화결합-풍부 코노톡신 및 다수의 이황화결합이 결여된 펩타이드[1].

이들 패밀리 중에서, O 및 A 슈퍼패밀리는 다른 패밀리보다 많은 수로 본 발명에 의해 발견되었다. O-슈퍼패밀리 26종, A-슈퍼패밀리 18종이 생화학적 방법 및 유전자 클로닝으로 규명되었다. 나머지는 M-슈퍼패밀리 5종과 이황화 결합이 없는 한 종의 펩타이드이다.

코노펩타이드의 서열을 규명하기 위하여, 생화학적 방법 및 유전자 클로닝을 이용하였다. 생화학적 방법은 20개 이상의 청자고둥이 요구되며 펩타이드를 단리하기 위하여 힘겨운 공정을 실시하여야 했다. 그러나, 해독후 변형은 Edman 서열결정 및 분자량 정보로부터 규명될 수 있었다. 또한, 원래의 이황화 결합 패턴은 천연의 펩타이드로부터 결정하여야 한다. 유전자 클로닝에서, 하나의 청자고둥으로부터 얻은 cDNA 라이브러리는 실험을 하기에 충분하였으나 성숙 펩타이드에 대한 정보는 추론을 하여야 했다. 상기 두 실험 방법은 서로 상보적이었다. 50 종 이상의 펩타이드를 규명하였고, 보다 명확한 서열 정보를 위하여 추가적으로 정제하였다. 이 중 본 발명의 FVIA는 genomic DNA를 클로닝하여 얻어진 서열이다.

FVIA 구조의 분석 및 제한

연속적 지정(sequential assignment) 방식에 따라 FVIA 구조를 결정하였다. Gly 잔기들은 COSY 스펙트럼에서 대칭 정렬에 의해 즉시 규명되었다. Thr⁴ 및 Ala¹² 잔기도 TOCSY 스펙트럼에서 쉽게 확인할 수 있었다. Asn¹⁴의 NH² 및 Tyr¹³의 δ- 및 ε-양성자를 분석하였고, 이는 지정 과정에서 유용하게 이용되었다. TOCSY 및 COSY에 존재하는 NH₂를 펩타이드의 C-말단에 지정하였다. 그러나 피크 중첩 및 광역화 때문에 어려움이 있었다. 예컨대, Cys1, Lys2 및 Lys6의 C_αH(4.503 ppm) 그리고 Thr17의 NH 및 C-말단의 NH₂(8.441 ppm)는 중첩되었다. Gly¹⁸과 Gly²³의 피크 광역화는 주위 피크들을 감추었다. 상기의 문제점은, NOESY의 다른 온도, pH 및 믹싱 타임에서의 스펙트럼을 비교하여 극복하였다(표 2).

최종 계산에서 이용되는 제한(constraints)은, 커플링 상수 측정으로부터 얻은 128개의 내부잔기 거리, 72개의 연속 거리, 84개의 비연속 거리, 11개의 이면각 및 4개의 χ¹ 각 제한으로 구성되어 있다. χ¹ 각 커플링 상수 및 CβH 및 NH 사이의 NOE-유래 거리의 조합으로부터 β-메틸렌 양성자의 스테레오특이적 지정을 얻을 수 있었다.

FVIA 및 MVIIA의 구조-활성 관련성

N-타입 칼슘 채널은 신경 말단으로부터 분비되는 신경전달자의 조절에 중요한 역할을 담당하며 통증 및 허혈성 뇌 손상의 치료제의 주요한 타깃이다. 다양한 이소폼의 N-타입 칼슘 채널이 알려져 있다[46-48]. 이들 이소폼들의 기능 및 조직 분포는 서로 상이하며, 말초형태(peripheral isoform)가 특히 통증을 줄이는 데 중요하다.

다양한 코노톡신들이 선택적으로 전압-개구 Ca²⁺ 채널을 선택적으로 차단하며, 전압 민감성 채널들의 구조적 다양성 및 구조에 대한 중요한 정보를 제공한다. 이들 중에서, ω-코노톡신, GVIA 및 MVIIA는 N-타입 칼슘 채널의 도메인 III S5-S6 부위에 있는 외부 베스티뷸(vestibule)에 선택적으로 결합하여 동공 차단제로서 작용한다[8, 42, 44]. MVIIA(SNX111/Ziconotide/Prialt Elan)는 FDA에서 허가된 진통제로 잘 알려져 있는 ω-코노톡신이다. 그러나 MVIIA의 부작용이 많이 발표되고 있으며, 오스트리아 연구 그룹에서는 세척 실험에 기초하여 MVIIA가 말초신경 이소폼보다는 중추신경 이소폼에 특이성이 더 높으며 이는 부작용의 원인이 된다고 발표하였다[14]. 한편, GVIA는 칼슘 채널에 비가역적으로 결합하며, 따라서 이는 논의에서 배제되었다.

만일, MVIIA가 개선된 가역성을 얻는다면, 현재보다는 보다 우수한 의약이 될 것이다.

본 발명자들은 이러한 측면에서 구조 및 기능 연구를 하였다. 본 발명자들은 C-C-CC-C-C 모티프를 가지는 20 여 종의 O-슈퍼패밀리 코노톡신을 유전자 클로닝 및 전통적인 정제방법으로 발견하였다. 이들 중, FVIA가 MVIIA와 매우 유사한 구조를 나타내었다. 그러나, MVIIA 및 FVIA의 루프 1 및 2에 있는 6개의 잔기는 서로 상이하였다. 이러한 잔기의 차이는, 구조적 차이와 기전, 효능과 세척에 이은 회복과 같은 기능적 차이를 초래할 것으로 기대되었다. 또한, 효능 및 가역성과 관련된 분자적 구조가 있을 것으로 판단되었다.

우선, 본 발명자들은 전기생리학적 실험을 통해 효능을 조사하였다. 실험에 사용된 HEK 293 세포는, 인간 통증 시그널링과 직접적으로 연관이 있는 인간 N-타입 칼슘 채널을 발현한다. 효능은 처리양-억제(반응) 곡선에서의 IC₅₀ 값으로 나타내었다. MVIIA 및 FVIA의 IC₅₀ 값은 nM 스케일로 매우 유사하였다. 기능에 중요한 Lys², Tyr¹³, Arg¹⁰ 및 Arg²¹ 잔기가 FVIA에서 보존되어 있기 때문에(도 3), 상기 결과는 충분히 예측될 수 있었다. 두 번째로 전류-전압 곡선 실험을 하였다. 이 실험을 통하여, MVIIA 및 FVIA의 동공 차단 기전이 동일하다는 것을 알 수 있었다(도 4). 최종적으로, 독소를 주입한 다음 세척하는 실험을 실시하였다. 세척은 정상(안정된) 상태에 도달할 때까지 하였다. 도 5는, MVIIA로부터의 회복(35%)은 FVIA(75%)와 크게 차이가 있음을 명확하게 보여준다. 이러한 실험 결과, 즉 N-타입 칼슘 채널을 억제 하는 활성은 유사하면서도 가역성이 크게 차이가 있는 것은, 매우 흥미로운 사실이다. 그리고, 이 실험 결과는 ω-코노톡신의 효능(즉, 활성)과 가역성을 분리시킬 수 있으며, 명확하게 구별되는 분자구조(이 경우, 잔기들)가 있을 수 있다는 것을 보여준다(도 5).

구조적 차이가 상기한 가역성에 어떠한 영향을 미치며, 어떤 잔기가 기능에 중요한 지를 결정하기 위하여, ¹H NMR 실험을 실시하였다. 본 발명자는 본래의 서열 차이에 근거해 결합 루프인 루프 1 및 특히 루프 2에서 최종적인 구조 차이가 발생됨을 예측하였다. 예측한대로, 상기 두 펩타이드의 전체적인 토폴로지는 유사하지만, 루프 2의 구조는 차이가 있다.

따라서, 본 발명자는 루프 2의 구조적 차이는 하나의 잔기 차이가 아닌, 전체적으로 가역성에 영향을 준다는 가능성을 고려하였다. 이러한 구조적 차이는, ³JNH-CαH 커플링 상수의 다른 수에 의해 예상되었다. 8.0 Hz 이상의 ³JNH-CαH는, MVIIA 및 FVIA에서 각각 9 및 11 이었다[49]. 또한, Asn¹⁴ (Asp¹⁴) 및 Ile¹¹ (Leu¹¹) 치환은 기능적 차이를 유발할 수 있다. Asn¹⁴는 음전하를 가지며, 넷(net) 변화 또는 로컬 전하의 변화는 기능적 차이를 유발할 수 있다. MVIIA에서 Leu¹¹은 활성에 있어서 중요한 잔기이다[7]. 메틸기의 미소한 이동(Ile의 Leu에 의한 치환에 의해)은 결합을 약화시킬 수 있으며, 이는 FVIA이 채널로부터 방출되는 것을 용이하게 할 수 있다.

FVIA의 항통증 효과

통증은 기작에 따라 침해성, 염증성, 신경 병증성 통증으로 나눌 수 있다. 침해성 통증은 외부의 자극으로 발생되는 것이며 외부의 해로운 자극으로부터 자신을 방어를 하기 위하여 필요한 통증이다. 염증성 통증은 염증성 분자에 의해 야기되는 통증이며 신경 병증성 통증은 신경의 손상으로 야기되는 통증이다. 이러한 통증에 대하여 50여 가지의 동물 모델이 있다.

테일 플릭 시험과 플랜타르 시험은 열에 의한 급성 침해성 통증 모델 시험이며 FVIA 펩타이드는 두 시험에서 진통 효과가 있는 것으로 조사되었다(도 8A 및 8B).

글루타메이트와 서브스탠스피는 통증 신호 전달에 중요한 신경전달물질이다. 이 물질들을 인위적으로 척수에 투여하여 통증을 유도할 수 있다. 이러한 통증 모델에서 FVIA는 통계적으로 유의한 진통작용을 나타낸다(도 9A, 9B). 1% 아세트산을 복강 투여하면 통증으로 인한 몸비틀기를 하는데 FVIA는 통계적으로 유의하게 몸비틀기의 횟수를 감소시킨다(도 9C).

포르말린 시험에서 통증은 두 국면으로 나누어지는데 초기국면이 포르말린의 피하 주입으로 인한 침해성 통증에 의한 반응이고 두 번째 국면은 포르말린으로 인한 염증성 통증 반응이다. 이 시험에서 FVIA는 두 국면에서 모두 진통 현상을 보이나 염증성 통증인 두 번째 국면을 더욱 효과적으로 억제한다(도 10A). 또한 포르말린 시험에서 FVIA는 농도 의존적인 방식으로 통증 현상을 억제하며 두 번째 국면에서 통증을 효과적으로 억제하여 100ng FVIA은 통증을 거의 100% 억제한다(도 10B).

쥐의 제 5, 6 요척수 신경 또는 척수로부터 꼬리 쪽으로 향하는 제 1,2 천수신경 신경을 손상시키면 신경병증성 통증이 유도되고 증상으로서 통각과민(hyperalgesia)과 이질통증(allodynia) 현상을 나타낸다. FVIA는 신경 손상 후 유발되는 기계적 이질통증에 대하여 농도 의존적으로 50% 철회 역치를 상승시킨다(도 11, 12A). 또한 냉온 이질통에 대하여 FVIA는 효과적으로 통증을 억제하나 농도 의존적인 현상은 기계적 이질통에 비하여 약하다(도 12B, 12C). FVIA는 냉온 이질통에서 6.5ng의 투여에서도 200ng 투여와 비슷한 효과를 나타내고 있어 기계적 이질통과는 다른 기작으로 작용하고 있으며 냉온 이질통에 대하여는 FVIA의 투여에 더욱 민감하게 작용한다고 할 수 있다.

실험 결과를 종합하면, FVIA는 침해성 통증에 대하여 비교적 약한 진통 효과를 나타내며, 이는 테일 플릭 시험, 플랜타르 시험 및 포르말린 시험의 제1기 시험에 의해 확인되었다. 이와는 다르게, FVIA 펩타이드는 염증성 통증에 대하여는 우수한 약물 후보물질임이 증명되었는데, 이는 포르말린 시험, 그리고 글루타메이트, 서브스탠스 P 및 아세트산을 이용한 시험들에 의해 조사도었다. 또한 왼쪽 다리 신경 손상과 꼬리 신경 손상을 통한 신경병증성 통증 모델에서도 FVIA는 이질통증에 유효한 진통 효과를 나타내었다. 침해성 통증은 외부로부터 자신을 방어하고 경계하기 위해 필수적인 생체 반응이므로 침해성 통증이 과하게 억제되는 것은 바람직하지 않고 병적 통증인 염증성 통증과 신경병증성 통증에서 진통 효과가 유의해야 좋은 진통제의 후보 물질이 될 수 있다.

상술한 실험 결과에 기초하면, 한국산 청자고둥으로부터 유래된 본 발명의 FVIA 펩타이드 또는 그의 유사체는 유력한 유력한 진통제 후보 물질임이 명확하다는 결론을 내릴 수 있다.

FVIA의 부작용

MVIIA(Prialt, Elan Corp.)는 2004년 이미 FDA 승인을 받아 상업적으로 시판되고 있으나, 심각한 부작용과 투여방식 때문에 사용이 제한되고 있다. 보고된 주요한 부작용은 중추신경계의 N-타입 VSCCs를 억제하여 발생하는 신경계 부작용과 혈관에서 자율 신경계를 억제하여 혈압, 맥박수에 영향을 주는 심혈관계 부작용이 있다. 본 발명에서는 FVIA와 MVIIA를 래트의 혈액 내에 투여한 후에 평균 혈압를 측정하여 심혈관계 부작용을 측정하였다. FVIA와 MVIIA는 모두 단시간에 초기 혈압을 급격하게 감소시킨다. 그러나 시간이 경과함에 따라 FVIA가 초기 혈압으로 회복되는 반면 MVIIA는 회복속도가 더딜 뿐만 아니라 약 60 mmHg의 낮은 혈압을 유지하였다. 이러한 결과는 MVIIA의 낮은 가역성으로 인한 현상으로 유추해 볼 수 있다.

상기 실험 결과에 따르면, FVIA 및 그 유사체는 MVIIA와 유사한 칼슘 채널 차단 능력을 가지면서도 MVIIA보다 부작용이 훨씬 적다는 측면에서 우수한 진통제 후보 물질임을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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1. 삭제
2. 다음의 일반식 Ⅲ으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로하는 ω-코노톡신 펩타이드:
   일반식 Ⅲ
   Cys-Lys-Xaa₁-Xaa₂-Gly-Xaa₃-Xaa₄-Cys-Xaa₅-Xaa₆-Ile-Ala-Tyr-Xaa₉-Cys-Cys-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Cys-Xaa₁₃-Xaa₁₄-Xaa₁₅-Xaa₁₆-Cys
   상기 일반식에서, Xaa₁은 Gly 또는 Ser이며, Xaa₂는 Thr 또는 Lys이며, Xaa₃는 Lys 또는 Ala이고, Xaa₄는 Ser 또는 Lys이며, Xaa₅는 Ser 또는 Arg이고, Xaa₆는 Arg 이며, Xaa₉는 Asn 또는 Asp이고, Xaa₁₀은 Thr이며, Xaa₁₁은 Gly이고, Xaa₁₂는 Ser이며, Xaa₁₃은 Arg이고, Xaa₁₄는 Ser이며, Xaa₁₅는 Gly이고, Xaa₁₆은 Lys 또는 Arg 아미노산 잔기를 나타낸다.
   
3. (a) 서열목록 제2서열 또는 제3서열의 ω-코노톡신 펩타이드의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 만성 통증, 급성 통증 또는 수술 후 통증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.

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