KR101040518B1 - Methods for Identification and Culture of Anaerobic Ammonium Oxidizer in Microbial Resources - Google Patents
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Abstract
미생물 자원 내에 존재하는 혐기성 암모늄 산화균을 탐색하고, 탐색된 혐기성 암모늄 산화균을 농후 배양하는 방법이 개시된다. 혐기성 암모늄 산화균을 체계적으로 탐색 후 농후 배양하는 것이 가능하고, 빠른 시간 내에 혐기성 암모늄 산화 반응을 유도할 수 있다. Disclosed is a method of searching for anaerobic ammonium oxide bacteria present in a microbial source and enriching the searched anaerobic ammonium oxide bacteria. The anaerobic ammonium oxidizing bacteria can be systematically searched and then richly cultured, and the anaerobic ammonium oxidation reaction can be induced in a short time.
미생물 자원, 혐기성 암모늄 산화균, 농후 배양, PCR Microbial Resources, Anaerobic Ammonium Oxide, Rich Culture, PCR
Description
본 발명은 미생물 자원 내 혐기성 암모늄 산화균의 탐색 및 배양 방법에 관한 것이다. 더 상세하게는, 미생물 자원 내에 존재하는 혐기성 암모늄 산화균을 조기 탐색하고, 탐색된 혐기성 암모늄 산화균을 농후 배양하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for screening and culturing anaerobic ammonium oxide bacteria in microbial resources. More specifically, the present invention relates to a method of early searching for anaerobic ammonium oxide bacteria present in a microbial resource and enriching the searched anaerobic ammonium oxide bacteria.
하수 또는 폐수 내의 질소는 경제성과 안정성으로 인해 생물학적 공정을 통해 처리되었다. 암모니아(NH4 +)는 아질산화 미생물에 의해 먼저 아질산(NO2 -)으로 전환되고, 질산화 미생물에 의해 질산(NO3 -)으로 최종적으로 전환된다. Nitrogen in sewage or wastewater has been treated through biological processes because of its economy and stability. Ammonia (NH 4 + ) is first converted to nitrous acid (NO 2 − ) by nitrite microorganisms and finally converted to nitric acid (NO 3 − ) by nitrifying microorganisms.
아질산화 및 질산화 공정에서 이용되는 미생물은 호기성 독립영양 미생물로써 산소가 공급되는 조건에서 무기성 탄소를 에너지원으로 사용하게 된다. 따라 서, 무기 탄소원이 충분한 조건에서 산소공급을 위한 폭기를 시행하여야 한다. Microorganisms used in the nitridation and nitrification process are aerobic autotrophic microorganisms and use inorganic carbon as an energy source under oxygen supply conditions. Therefore, aeration for oxygen supply should be carried out under conditions sufficient for inorganic carbon sources.
이후, 하수 및 폐수는 탈질소화 공정으로 이어지는데, 아질산 혹은 질산은 질소가스로 전환되어 공기 중으로 배출되어 결국 폐수 내의 총 질소량이 감소하게 된다. 탈질 공정에서 이용되는 미생물은 혐기성 종속영양 미생물로써 산소가 차단된 조건에서 충분한 유기탄소를 공급해주어야 한다.Thereafter, the sewage and wastewater lead to a denitrification process, in which nitrous acid or nitric acid is converted to nitrogen gas and discharged into the air, thereby reducing the total amount of nitrogen in the wastewater. The microorganisms used in the denitrification process are anaerobic heterotrophic microorganisms and must provide sufficient organic carbon under oxygen-blocked conditions.
상기와 같은 전통적인 생물학적 질소제거 공정을 운영할 때에는, 질산화 단계에서 폭기에 소요되는 에너지 비용이 크고, 탈질소화 공정에서는 부족한 유기 탄소원을 공급하기 위한 약품비가 많이 소요된다. 따라서, 운영비용을 절감할 수 있는 질소처리 공정 개발이 요구되고 있다. When operating the conventional biological nitrogen removal process as described above, the energy cost of aeration in the nitrification step is large, and the denitrification process requires a large chemical cost for supplying a scarce organic carbon source. Therefore, it is required to develop a nitrogen treatment process that can reduce the operating cost.
이러한 에너지 및 비용상의 문제점들을 극복하기 위해서, 혐기성 암모늄 산화균을 질소처리 공정에 활용하기 위한 연구가 시도되었다. 혐기성 암모늄 산화균은, 혐기성 독립영양 조건에서 암모늄과 아질산을 기질로 사용하여 질소가스를 부산물로 생산하게 된다. 따라서, 폭기비용과 유기탄소 투하비용을 줄일 수 있는 경제적인 공정으로 인정받고 있다. To overcome these energy and cost problems, studies have been attempted to utilize anaerobic ammonium oxide bacteria in nitrogen treatment processes. Anaerobic ammonium oxidizing bacteria produce nitrogen gas as a by-product using ammonium and nitrite as substrates under anaerobic autotrophic conditions. Therefore, it is recognized as an economical process that can reduce the aeration cost and the organic carbon discharging cost.
그러나, 혐기성 암모늄 산화균은 성장속도가 매우 느리다는 문제점을 가지고 있다. 이러한 문제점 때문에, 기존 활성 슬러지 및 혐기성 공정 슬러지에서 혐기성 암모늄 산화균을 발굴하는데 큰 어려움을 겪고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서, 연속 회분식 반응기(Sequencing Batch Reactor), 생물막 반응기(Membrane Bioreactor) 등의 기법들을 활용하여 혐기성 암모늄 산화균의 발굴 및 농후 배양을 시도하고 있으나, 아직까지 주목할 만한 성과는 없는 실정이다.However, anaerobic ammonium oxide bacteria have a problem that the growth rate is very slow. Due to these problems, it is difficult to find anaerobic ammonium oxide bacteria in existing activated sludge and anaerobic process sludge. In order to solve this problem, the use of techniques such as sequencing batch reactors and membrane bioreactors is attempting to discover and enrich the anaerobic ammonium oxide bacteria, but there are no remarkable achievements. to be.
본 발명에 따른 첫 번째 목적은, 혐기성 암모늄이 다량 자생하고 있는 슬러지 및 미생물 자원을 선별하는 것이다.The first object according to the present invention is to select sludge and microbial resources in which large amounts of anaerobic ammonium are native.
본 발명에 따른 두 번째 목적은, 서로 상이한 군집을 이루고 있는 슬러지 및 미생물 자원을 농후 배양 함으로써 다양한 균주를 확보할 수 있는 확률을 높이는 것이다. The second object according to the present invention is to increase the probability of securing a variety of strains by rich culture of sludge and microbial resources constituting different communities.
본 발명에 따른 세 번째 목적은, 혐기성 암모늄 산화균의 선택적 배양을 통해 혐기성 암모늄 산화균의 증식을 앞당기는 것이다.A third object according to the present invention is to accelerate the proliferation of anaerobic ammonium oxidizing bacteria through selective culturing of anaerobic ammonium oxidizing bacteria.
본 발명은 미생물 자원 내에 존재하는 혐기성 암모늄 산화균을 탐색하고 탐색된 혐기성 암모늄 산화균을 농후 배양하는 방법으로서,The present invention is to search for the anaerobic ammonium oxide bacteria present in the microbial resources and to enrich the cultivated anaerobic ammonium oxide bacteria,
상기 방법은, (a) 한 종 이상의 미생물 자원을 채취하는 단계; (b) 상기 미생물 자원 내에 존재하는 혐기성 암모늄 산화균을 정량하여 혐기성 암모늄 산화균의 공급원으로서 적합한 미생물 자원을 선별하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 선별된 미생물 자원에 존재하는 혐기성 암모늄 산화균 외의 미생물들을 조기 사멸시키는 단계; 및 (d) 상기 혐기성 암모늄 산화균을 증폭 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. The method comprises the steps of: (a) harvesting one or more microbial resources; (b) quantifying the anaerobic ammonium oxide bacteria present in the microbial resource to select a suitable microbial resource as a source of anaerobic ammonium oxide bacteria; (c) prematurely killing microorganisms other than anaerobic ammonium oxide bacteria present in the microbial resources selected in step (b); And (d) characterized in that it comprises the step of amplifying the anaerobic ammonium oxide bacteria.
본 발명에 따른 혐기성 암모늄 산화균의 농후 배양 방법은, 혐기성 암모늄 산화균이 다량 자생하는 슬러지 및 미생물 자원을 분류하고 군집구조의 중복을 막아 효율적인 농후 배양을 가능하게 하는 효과가 있다. 또한, 혐기성 암모늄 산화균의 생장에 적절한 환경을 조성하여 혐기성 암모늄 산화 현상을 조기에 유도할 수 있다. The rich culture method of anaerobic ammonium oxidizing bacteria according to the present invention has the effect of classifying sludge and microbial resources in which anaerobic ammonium oxidizing bacteria grow in large quantities and preventing duplication of community structure to enable efficient rich culture. In addition, by creating an environment suitable for the growth of anaerobic ammonium oxidizing bacteria can be induced early anaerobic ammonium oxidation phenomenon.
본 명세서에서 사용된 “미생물 자원”이라 함은, 미생물을 공급하는 미생물 공급원을 의미하며 미생물을 공급하는 것이라면 그 종류에는 특별히 제한이 없다. 예컨대, 토양, 슬러지, 오수, 축산 폐기물 등을 들 수 있다. As used herein, the term "microbial resource" means a microorganism source for supplying microorganisms, and the type of microorganism is not particularly limited as long as it supplies microorganisms. For example, soil, sludge, sewage, livestock waste, etc. are mentioned.
본 발명에 따른 미생물 자원 내 혐기성 암모늄 산화균의 탐색 및 배양 방법은, 하수처리공정, 산업폐수처리공정 또는 축산폐수처리공정 등에서 채취한 다양한 슬러지 및 미생물 자원에서 혐기성 암모늄 산화균을 선택적으로 농후 배양하기 위한 것이다. The method for searching and culturing anaerobic ammonium oxidizing bacteria in a microbial resource according to the present invention comprises selectively enriching anaerobic ammonium oxidizing bacteria in various sludges and microbial resources collected in sewage treatment, industrial wastewater treatment or livestock wastewater treatment, etc. It is for.
하나의 실시예에서, 상기 미생물 자원 내 혐기성 암모늄 산화균의 탐색 및 배양 방법은 하기의 단계들을 포함할 수 있다. In one embodiment, the method for screening and culturing anaerobic ammonium oxide bacteria in the microbial resource may include the following steps.
상기 방법은, The method,
(a) 한 종 이상의 미생물 자원을 채취하는 단계;(a) harvesting one or more microbial resources;
(b) 상기 미생물 자원 내에 존재하는 혐기성 암모늄 산화균을 정량하여 혐기 성 암모늄 산화균의 공급원으로서 적합한 미생물 자원을 선별하는 단계;(b) quantifying the anaerobic ammonium oxide bacteria present in the microbial resource to select a suitable microbial resource as a source of anaerobic ammonium oxide bacteria;
(c) 상기 (b) 단계에서 선별된 미생물 자원에 존재하는 혐기성 암모늄 산화균 외의 미생물들을 조기 사멸시키는 단계; 및(c) prematurely killing microorganisms other than anaerobic ammonium oxide bacteria present in the microbial resources selected in step (b); And
(d) 상기 혐기성 암모늄 산화균을 증폭 배양하는 단계를 포함할 수 있다. (d) amplifying and culturing the anaerobic ammonium oxide bacteria.
먼저, 상기 (a) 단계는, 다양한 슬러지 및 미생물 자원을 채취하는 단계로써, 하수 및 폐수처리장의 기반 정보를 활용하여 공정과 대상 폐수 등을 최대한 다양화하고, 질소 처리 총량 및 처리 효율을 고려할 수 있다. 또한, 채취 지역을 다양화하여 생태계의 미생물 자원을 채취할 수 있다. 상기 슬러지는 오니(汚泥)라고도 하며, 하수처리장, 정수장, 공장폐수 처리시설 등에서 발생하는 액상 부유물질을 총칭하는 개념으로, 높은 함수율과 다량의 유기물을 함유하고 있는 것이 특징이다. First, the step (a) is to collect a variety of sludge and microbial resources, and to diversify the process and the target wastewater as much as possible using the base information of the sewage and wastewater treatment plant, and can consider the total amount of nitrogen treatment and treatment efficiency. have. In addition, the microbial resources of the ecosystem can be collected by diversifying the collection area. The sludge is also referred to as sludge and is a general term for liquid suspended solids generated in sewage treatment plants, water purification plants, and plant wastewater treatment facilities. The sludge contains a high water content and a large amount of organic matter.
상기 (a) 단계는, 종래에 개발되어 있는 다양한 시약 키트들을 사용하여, 미생물의 세포 파쇄 및 유전자 정제 과정을 포함할 수 있다. 사용 가능한 시약 키트로는, PowerSoilTM DNA KIT(MoBio Lab., USA) 등이 있으며, 정량 또는 정성 분석 과정에서 발생할 수 있는 실험 오차를 줄이는 효과가 있다. The step (a) may include cell disruption and gene purification of microorganisms using various reagent kits developed in the related art. Reagent kits that can be used include the PowerSoil ™ DNA KIT (MoBio Lab., USA) and the like, and have an effect of reducing experimental errors that may occur during quantitative or qualitative analysis.
상기 (b) 단계는, 상기 미생물 자원 내에 존재하는 혐기성 암모늄 산화균을 정량하여 혐기성 암모늄 산화균의 공급원으로서 적합한 미생물 자원을 선별하는 단계이다. Step (b) is a step of selecting the microbial resources suitable as a source of anaerobic ammonium oxide bacteria by quantifying the anaerobic ammonium oxide bacteria present in the microbial resources.
하나의 실시예에서, 상기 (b) 단계는, 혐기성 암모늄 산화균의 16S rRNA 유 전자를 증폭하여 혐기성 암모늄 산화균을 정량할 수 있다. 이는, 혐기성 암모늄 산화균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머를 부착하여 PCR을 통해 증폭하게 된다. 보다 바람직하게는, 상기 PCR은 Real-time qPCR 기기를 이용할 수 있다. 상기 Real-time qPCR은 PCR 증폭산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 해석하는 기술이다. 이는, 종래의 PCR에 비하여 정확한 정량이 가능하고, 전기영동이 필요없어 신속하고 간편한 해석이 가능할 뿐만 아니라, 오염의 위험성이 적다는 장점이 있다.In one embodiment, the step (b), it is possible to quantify the anaerobic ammonium oxide bacteria by amplifying the 16S rRNA gene of anaerobic ammonium oxide bacteria. This, by attaching a specific primer to the 16S rRNA gene of anaerobic ammonium oxide bacteria it is amplified by PCR. More preferably, the PCR may use a real-time qPCR instrument. The real-time qPCR is a technique for monitoring and interpreting an increase in PCR amplification products in real time. This has the advantage that accurate quantification is possible, and electrophoresis is required, as compared to conventional PCR, so that the analysis can be quick and easy, and the risk of contamination is small.
필요에 따라서는, 상기 (c) 단계 전에, (b-1) 상기 미생물 자원 내의 혐기성 암모늄 산화균의 군집 구조를 분석하여 유사한 군집들이 중복되어 배양되지 않도록 유사 군집을 배제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 (b) 단계에서 PCR을 통해 증폭된 혐기성 암모늄 산화균의 유전자에 대하여 제한효소를 처리하여 절단하고, 절단된 조각들의 분포경향을 조사함으로써, 혐기성 암모늄 산화균의 군집구조를 분석하게 된다. Optionally, before the step (c), the method may further include (b-1) analyzing the community structure of the anaerobic ammonium oxidizing bacteria in the microbial resource to exclude the similar community so that the similar communities are not duplicated and cultured. have. In the step (b), the anaerobic ammonium oxidized bacteria amplified by PCR are processed by restriction enzymes and cut, and the distribution structure of the cut pieces is analyzed, thereby analyzing the community structure of the anaerobic ammonium oxidized bacteria.
하나의 실시예에서, 상기 (b-1) 단계는, 표지물질이 부착된 프라이머를 이용하여 혐기성 암모늄 산화균의 16S rRNA 유전자를 증폭한 후 DNA 제한효소를 처리하여 군집 구조를 판별할 수 있다. In one embodiment, the step (b-1), by amplifying the 16S rRNA gene of anaerobic ammonium oxidizing bacteria using a primer attached to the labeling material can be treated by DNA restriction enzymes to determine the cluster structure.
상기 (b-1) 단계는, 하나의 바람직한 예로서, 서열번호 3의 정방향 프라이머; 서열번호 4의 역방향 프라이머; 및 Alu I 제한효소 및 Rsa I 제한효소 중 어느 하나 이상의 제한효소를 이용하며, 상기 정방향 프라이머는 표지물질이 부착된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 정방향 프라이머는 amx368F(5'-TTC GCA ATG CCC GAA AGG-3', 서열번호 3), 역방향 프라이머는 809R(5'-AGT GCC CAT CGT TTA CGG C-3', 서열번호 4)일 수 있다. 또한, 상기 제한효소로서, Alu I 제한효소와 Rsa I 제한효소, 두 가지를 활용하여 중복검사가 되도록 설정함으로써, 오차를 줄이는 효과가 있다. Step (b-1) is, as one preferred example, the forward primer of SEQ ID NO: 3; Reverse primer of SEQ ID NO: 4; And one or more restriction enzymes of Alu I restriction enzyme and Rsa I restriction enzyme, and the forward primer may be attached with a label. For example, the forward primer is amx368F (5'-TTC GCA ATG CCC GAA AGG-3 ', SEQ ID NO: 3), the reverse primer is 809R (5'-AGT GCC CAT CGT TTA CGG C-3', SEQ ID NO: 4 May be). In addition, by using the restriction enzyme, Alu I restriction enzyme and Rsa I restriction enzyme by setting the duplicate test, there is an effect of reducing the error.
상기 (c) 단계는, 상기 (b) 단계에서 선별된 미생물 자원에 존재하는 혐기성 암모늄 산화균과 경쟁하는 다른 미생물들을 조기에 사멸시키고 혐기성 암모늄 산화균의 생장에 적절한 환경을 조성하는 단계이다. The step (c) is to kill other microorganisms competing with the anaerobic ammonium oxide bacteria present in the microbial resources selected in the step (b) and to create an environment suitable for the growth of anaerobic ammonium oxide bacteria.
하나의 실시예에서, 상기 (c) 단계는 질산(NO3 -)을 처리하여 수행할 수 있다. In one embodiment, step (c) may be performed by treating nitric acid (NO 3 − ).
바람직한 예에서, 혐기조건에서 독립탄소원과 질산(NO3 -)을 투입하여 혐기성 암모늄 산화균 이외의 미생물이 조기에 사멸되도록 할 수 있다. 이러한 환경에서는, 종속영양 미생물과 호기성 독립영양 미생물이 사멸되고 세포질 내의 유기물들이 유출 된다. 동시에, 혐기성 탈질 미생물들이 투입된 NO3 --N을 탈질소화 시키기 위하여 유출된 유기물질들을 폭발적으로 소비하게 된다. 이러한 상태를 지속하게 되면, 반응기 내의 혐기성 암모늄 산화균과 경쟁하는 대부분의 미생물들이 사멸하게 되고, 유기물질의 잔존량이 낮아 혐기성 암모늄 산화균의 자생에 적절한 환경을 조성할 수 되게 된다.In a preferred embodiment, an independent carbon source and nitric acid (NO 3 − ) may be added under anaerobic conditions so that microorganisms other than anaerobic ammonium oxidizing bacteria are killed early. In this environment, heterotrophic and aerobic autotrophic microbes are killed and organics in the cytoplasm are released. At the same time, anaerobic denitrification microorganisms explode the spilled organics to denitrify the injected NO 3 -- N. If this condition is maintained, most of the microorganisms competing with the anaerobic ammonium oxidizing bacteria in the reactor will be killed, and the remaining amount of organic materials will be low to create an environment suitable for autogenous growth of anaerobic ammonium oxidizing bacteria.
따라서, 혐기성 암모늄 산화균 이외의 미생물들을 사멸시키고 유기물 소모를 유도하기 위해서는, 고농도의 질산(NO3 -)을 지속적으로 공급하여야 하며, NO3 --N의 농도는 50 ppm 이상인 것이 바람직하다. 여기서, NO3 --N의 농도는 NO3 -의 형태로 존재하는 물질 중의 질소(N)의 농도를 의미하는 것이다. Therefore, in order to kill microorganisms other than anaerobic ammonium oxidizing bacteria and induce organic consumption, high concentration of nitric acid (NO 3 − ) must be continuously supplied, and the concentration of NO 3 − -N is preferably 50 ppm or more. Here, NO 3 - -N concentration of the NO 3 - to sense the concentration of nitrogen (N) of the material present in the form of.
마지막으로, 상기 (d) 단계는, 상기 혐기성 암모늄 산화균을 증폭 배양하는 단계이다. 본 단계에서는, 예를 들어, 혐기성 암모늄 산화균의 기질인 아질산(NO2 -)과 암모니아(NH4 +)를 투입하여 혐기성 암모늄 산화균을 증폭 배양할 수 있다. 특히, 혐기성 암모늄 산화균은 아질산(NO2 -) 등에 민감하게 저해를 받기 때문에, 기질 농도를 서서히 높이는 것이 바람직하다.Finally, step (d) is a step of amplifying the anaerobic ammonium oxide bacteria. In this step, for example, nitrous acid (NO 2 − ) and ammonia (NH 4 + ), which are substrates of anaerobic ammonium oxidizing bacteria, may be added to amplify and culture the anaerobic ammonium oxidizing bacteria. In particular, since anaerobic ammonium oxide bacteria are sensitively inhibited by nitrous acid (NO 2 − ) or the like, it is preferable to gradually increase the substrate concentration.
이하, 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상술하지만, 하기의 실시예 등은 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범주가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the following examples and the like are for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.
[실시예 1] Real-time qPCR을 이용한 정량 시스템Example 1 Quantitative System Using Real-time qPCR
Real-time qPCR은 Applied Biosystems 사의 7300 Real time PCR SYSTEM 모델을 사용하였고, 형광 발광시료이 포함된 증폭시약은 Applied Biosystems 사의 1× SYBR Green master mix를 사용하였다. 혐기성 암모늄 산화균 특이적 프라이머를 사용하여야만 정확한 정량이 가능한데, 이를 위하여 정방향 프라이머로 667F (5'- GAG AGT GGA ACT TCT GGT -3', 서열번호 1)를, 역방향 프라이머로 809R (5‘- AGT GCC CAT CGT TTA CGG C -3', 서열번호 2)을 사용하였다. For real-time qPCR, Applied Biosystems '7300 Real time PCR SYSTEM model was used, and amplification reagents containing fluorescent samples were used with Applied Biosystems' 1 × SYBR Green master mix. Accurate quantification can only be achieved by using anaerobic ammonium oxidizing bacteria specific primers. GCC CAT CGT TTA CGG C-3 ′, SEQ ID NO: 2) was used.
정량을 위한 표준시료는 자체보유 중인 혐기성 암모늄 산화균 16S rRNA gene인 G1-80(기 발견되었던 planctomycetes KSU-1의 DNA와 유사)을 10배씩 희석하여 정량곡선을 구축하였다. 그 결과 101 copies부터 107 copies까지의 16S rRNA 유전자를 증폭할 수 있으며, 이를 하기 도 1에 나타내었다. The standard sample for quantitation was constructed by diluting 10-fold dilution of G1-80 (similar to the DNA of planctomycetes KSU-1, which was previously found) of anaerobic ammonium oxidizing bacteria 16S rRNA gene, which is in-house. As a result, it is possible to amplify 16S rRNA gene from 10 1 copies to 10 7 copies, which is shown in Figure 1 below.
도면 1에서 폭발적 증폭이 시작되는 시점인 Ct값과 시료에 포함된 16S rRNA 유전자의 양은 양(+)의 상관관계가 있다. 이러한 원리를 이용한 표준곡선은 도면 2와 같고, 본 실시예에 따른 Real-time qPCR이용하면 혐기성 암모늄 산화균의 16S rRNA 유전자를 102 copies부터 107 copies까지 정량 가능하다.In FIG. 1, the Ct value, which is the point at which the explosive amplification begins, and the amount of 16S rRNA gene included in the sample are positively correlated. The standard curve using this principle is shown in Figure 2, using the real-time qPCR according to the present embodiment can quantify the 16S rRNA gene of anaerobic ammonium oxide bacteria from 10 2 copies to 10 7 copies.
[실시예 2] T-RFLP를 이용한 군집구조 분석Example 2 Cluster Structure Analysis Using T-RFLP
정방향 프라이머로는 amx368F(5'-TTC GCA ATG CCC GAA AGG-3', 서열번호 3)를 사용하고, 역방향 프라이머는 809R(5'-AGT GCC CAT CGT TTA CGG C-3', 서열번호 4)을 사용하였다. 형광물질은 amx368F에 부착하였으며, T-RFLP 분석시에 amx368F 프라이머가 포함된 DNA 조각들이 검출되도록 하였다. DNA를 잘라주는 제한효소는 Alu I과 Rsa I 두가지를 활용하였다. Amx368F (5'-TTC GCA ATG CCC GAA AGG-3 ', SEQ ID NO: 3) is used as the forward primer, and 809R (5'-AGT GCC CAT CGT TTA CGG C-3', SEQ ID NO: 4) is used for the reverse primer. Was used. The fluorescent material was attached to amx368F, and DNA fragments containing amx368F primer were detected during T-RFLP analysis. Restriction enzymes that cut DNA were used for both Alu I and Rsa I.
본 실시예에서는, 16S rRNA 유전자가 저장되어 있는 인터넷 기반의 NCBI Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 검색된 혐기성 암모늄 산화균의 16S rRNA gene 염기서열을 이용하였다. In this example, the 16S rRNA gene base sequence of anaerobic ammonium oxidized bacteria, which was retrieved from the internet-based NCBI Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), in which the 16S rRNA gene is stored, was used.
상기 프라이머와 제한효소의 조합을 이용하였을 경우, 혐기성 암모늄 산화균의 군집구조에 대하여 하기 표 1과 같은 결과를 얻었다. When the combination of the primer and the restriction enzyme was used, the results as shown in Table 1 below were obtained for the community structure of anaerobic ammonium oxidizing bacteria.
상기 표 1을 참조하면, A 그룹은 해수에 자생하는 혐기성 암모늄 산화균이며, Candidatus Scalindua wagneri로 대표된다. B, C, D 그룹은 담수에 자생하는 혐기성 암모늄 산화균으로, 각각 Candidatus Kueneia stuttgartiensis, Candidatus Brocadia anammoxidans, Candidatus Anammoxoglobus propionicus로 대표된다. 상기 표 1의 결과를 실험대상 시료의 결과와 비교하면, 실험대상 혐기성 암모늄 산화균의 종을 판별할 수 있다. Referring to Table 1, group A is an anaerobic ammonium oxidizing bacterium native to seawater and is represented by Candidatus Scalindua wagneri. Groups B, C, and D are anaerobic ammonium oxidants native to freshwater, represented by Candidatus Kueneia stuttgartiensis, Candidatus Brocadia anammoxidans, and Candidatus Anammoxoglobus propionicus, respectively. Comparing the results of Table 1 with the results of the test sample, it is possible to determine the species of the anaerobic ammonium oxide bacteria.
[실시예 3] 혐기성 암모늄 산화균 외 미생물의 사멸 및 혐기성 암모늄 산화의 증폭 배양Example 3 Killing of Microorganisms other than Anaerobic Ammonium Oxide Bacteria and Amplification Culture of Anaerobic Ammonium Oxidation
험기성 암모늄 산화균을 농후 배양하기 위하여 500ml 부피의 연속 회분식 반응기를 구축하였다. 35 ℃ 항온반응기에서 100 rpm 속도로 교반하며 실험을 진행하였다. A 500 ml volume continuous batch reactor was constructed to enrich the ductile ammonium oxidants. The experiment was carried out while stirring at a speed of 100 rpm in a 35 ℃ incubator.
혐기성 암모늄 이외의 미생물에 대한 세포분해를 촉진하기 위하여, 유기탄소원을 투여하지 않고 무기탄소원만을 투여하였다. 또한, 혐기성 암모늄 산화균의 사멸을 막기 위하여, 암모니아(NH4 +) 아질산(NO2 -)을 지속적으로 공급하였다. In order to promote cytolysis to microorganisms other than anaerobic ammonium, only inorganic carbon sources were administered, not organic carbon sources. In addition, in order to prevent the killing of anaerobic ammonium oxidizing bacteria, ammonia (NH 4 + ) nitrous acid (NO 2 − ) was continuously supplied.
동시에, 유기물 소모 및 탈질을 촉진하기 위하여 NO3 --N 농도가 50 ppm인 질산(NO3 -)을 지속적으로 공급하였다. At the same time, NO 3, to facilitate the organic material consumption and denitrification-nitrate -N concentration of 50 ppm (NO 3 -) was supplied continuously.
상기 혐기성 암모늄 산화균의 산화 반응 여부를 관찰하였으며, 실험 개시 후 약 40일여 만에 산화 반응을 확인할 수 있었다. 이는, 기존에 보고된 연구 사례에 비하여 획기적으로 기간을 단축한 것이다.The oxidation reaction of the anaerobic ammonium oxide was observed, and the oxidation reaction could be confirmed in about 40 days after the start of the experiment. This is a significantly shorter period of time than previously reported research cases.
도 1은 Real-time qPCR을 이용한 혐기성 암모늄 산화균의 16S rRNA 유전자에 대한 증폭을 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing the amplification of the 16S rRNA gene of anaerobic ammonium oxide bacteria using real-time qPCR.
도 2는 Real-time qPCR을 이용한 정량시스템의 표준곡선을 나타낸 그래프이다.2 is a graph showing a standard curve of a quantitative system using real-time qPCR.
도 3은 고농도 질산(NO3 -) 투입을 통해 혐기성 암모늄 산화균의 산화 반응을 비교 확인한 그래프이다. 3 is a graph comparing the oxidation reaction of anaerobic ammonium oxidizing bacteria through high concentration nitric acid (NO 3 − ) injection.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Methods for Identification and Culture of Anaerobic Oxidizer in Microbial Resources <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gagagtggaa cttctggt 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agtgcccatc gtttacggc 19 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttcgcaatgc ccgaaagg 18 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agtgcccatc gtttacggc 19 <110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Methods for Identification and Culture of Anaerobic Oxidizer in Microbial resources <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gagagtggaa cttctggt 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agtgcccatc gtttacggc 19 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttcgcaatgc ccgaaagg 18 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agtgcccatc gtttacggc 19
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