KR101034151B1

KR101034151B1 - A novel protein from N. benthamiana interacting with Potato virus X coat protein

Info

Publication number: KR101034151B1
Application number: KR1020090045068A
Authority: KR
Inventors: 김국형; 박미리; 박상호; 조상윤
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-05-22
Filing date: 2009-05-22
Publication date: 2011-05-13
Also published as: KR20100126036A

Abstract

본 발명은 감자 바이러스 X(Potato virus X; PVX)의 외피 단백질(coat protein; CP)과 상호작용하는 담배 식물 (Nicotiana benthamiana) 유래의 단백질 및 이의 유전자에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 담배 식물 유래의 단백질은 감자 바이러스 X의 복제 및 이동에 관여하여 감자 바이러스 X 감염을 증가 또는 감소 중 어느 하나를 유도할 수 있으므로, 상기 유전자를 이용할 경우, 감자 바이러스 X의 증식이 조절된 형질전환 식물을 생산할 수 있을 것으로 기대된다.The present invention relates to proteins derived from tobacco plants (Nicotiana benthamiana) and their genes that interact with coat protein (CP) of Potato virus X (PVX). According to the present invention, the protein derived from tobacco plants may be involved in the replication and migration of potato virus X and induce any one of increasing or decreasing potato virus X infection. It is expected to be able to produce controlled transgenic plants.

NbPCIP1(N. benthamiana PVX CP-interacting protein 1), 감자 바이러스 X(Potato virus X;PVX), 담배(N. benthamiana) NbPCIP1 (N. benthamiana PVX CP-interacting protein 1), Potato virus X (PVX), Tobacco (N. benthamiana)

Description

A novel protein from N. benthamiana interacting with Potato virus X coat protein} that interacts with the envelope protein of potato virus Ｘ

본 발명은 감자 바이러스 X의 외피 단백질과 상호작용하는 담배 식물 유래의 단백질 및 이의 유전자에 관한 것이다. The present invention relates to proteins derived from tobacco plants and genes thereof which interact with the envelope protein of potato virus X.

RNA 바이러스에 의한 식물들의 감염은 기주와 바이러스 인자들 간의 상호 작용을 필요로 하므로 기주 인자들은 바이러스 감염에서 중요한 역할을 한다. 일반적으로 바이러스와 기주 인자들은 여러 단계에서 RNA-RNA, RNA-단백질, 단백질-단백질 상호작용을 안정화시킴으로써 RNA 복제 과정을 조절한다. 외피 단백질은 초기 감염 단계에서 가장 처음으로 기주 세포 내의 환경에 노출되어 기주 인자들과 상호 작용을 이룰 가능성이 가장 큰 바이러스 인자이다. 외피 단백질은 징후 발달, 바이러스 RNA 복제, 전신 이동, 인접 세포간의 이동, 교차보호 (cross-protection)에 중요한 역할을 하고, 이들 다양한 능력은 외피 단백질이 기주 인자들과 상호 작용 함으로써 몇몇 식물 방어 반응의 진압, 회피 등과 관련되어 있을 수 있다는 가능성을 제시한다. Infection of plants by RNA viruses requires interaction between host and viral factors, so host factors play an important role in viral infection. In general, viruses and host factors regulate the RNA replication process by stabilizing RNA-RNA, RNA-protein, and protein-protein interactions at various stages. Envelope proteins are the first viral factors that are most likely to interact with host factors by exposure to the environment within host cells at the earliest stages of infection. Envelope proteins play an important role in symptomatic development, viral RNA replication, systemic migration, transfer between neighboring cells, and cross-protection, and these various abilities are responsible for the development of some plant defense responses by interacting with envelope proteins with host factors. It suggests that it may be related to suppression, avoidance, etc.

기주 단백질의 몇몇은 다른 식물 RNA 바이러스의 외피 단백질과 상호 작용하는 것으로 입증되었다. 비록 몇몇 RNA 바이러스 외피 단백질이 기주-바이러스 단백질의 상호 작용에서 바이러스 복제에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있지만 감자 바이러스 X를 포함하여 다른 식물 RNA 바이러스들 대부분의 외피 단백질들과 상호 작용하는 기주 단백질에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다. Some of the host proteins have been demonstrated to interact with the envelope proteins of other plant RNA viruses. Although some RNA viral coat proteins are known to play an important role in viral replication in host-viral protein interactions, no host protein interacts with most coat proteins of most plant RNA viruses, including potato virus X. None known.

감자 바이러스 X는 6.44kb의 외가닥 (+)-strand RNA를 유전물질로 갖는 바이러스로서 크기는 보통 길이 510-520 nm이고 너비는 13nm인 사상형의 바이러스이고, Potexvirus 속의 대표 멤버이다. 감자 바이러스 X는 경제적으로 매우 중요한 작물들인 감자, 담배 등에 감염됨으로써 바이러스의 strain에 따라 괴사, 모자이크, 무병징 등의 병징을 보이고 기주 작물 재배지역에 전세계적으로 존재하여 경제적으로 많은 손실을 초래한다. 감자 바이러스 X의 ORF는 복제효소(ORF 1), 이동단백질(ORF2-4) 그리고 외피단백질(ORF 5)을 발현한다. 감자 바이러스 X의 ORF 5는 바이러스의 외피 단백질을 합성하고 0.9 kb 크기의 sgRNA로부터 생성되며 바이러스 입자형성의 기능 외에도 바이러스의 세포간 그리고 장거리 이동에도 관여한다. 외피 단백질의 항원 기능은 주로 N- 말단에 위치하는 것으로 나타나는데 이는 밝혀진 감자 바이러스 X의 구조와도 일치한다. 외피 단백질이 바이러스의 증식에 중요한 영향을 주는 것이 여러 바이러스 그룹에서 보고되었는데 감자 바이러스 X의 경우 외피 단백질을 삭제하거나 발현이 되지 않게 하는 변이를 도입하였을 경우 감자 바이러스 X의 (+)-strand RNA의 생성이 많이 감소하지만 (-)-strand RNA의 생성에는 영향을 주지 않는 것으로 보고되었다. 또한, 외피 단백질이 바이러스의 세포간 이동과 전신감염에 요구된다는 것은 외피 단백질의 일부나 또는 전체 삭제한 돌연변이체를 이용한 실험에 의해 증명되었다. 외피 단백질을 다른 단백질로 교환하였을 경우 변이 감자 바이러스 X는 감염된 세포의 주변 50개 정도 세포 이내로 전이가 제한되는 것으로 보고되었고 삭제된 돌연변이를 이용한 실험을 통해서는 외피 단백질의 중간 부분이나 C- 말단 아미노산들에 변이가 도입되면 세포간 이동이 제한되었고 N- 말단 변이의 경우 세포간 이동은 일어나지만 이동 속도와 비변이 strain에 비해 상당히 느리게 일어나고 병징에도 영향을 주어서 보다 약한 병징이 나타난다. 이러한 결과는 감자 바이러스 X의 외피 단백질이 바이러스의 세포간 이동에도 관여한다는 것을 의미한다. Potato virus X is a genetically engineered 6.44kb of extrastrand (+)-strand RNA that is a filamentous virus, usually 510-520 nm long and 13 nm wide, and a representative member of the genus Potexvirus . Potato virus X is infected with crops such as potatoes and tobacco, which are very economically important crops, causing necrosis, mosaic, and disease-free symptoms according to the strain of the virus. ORF of potato virus X expresses a transcriptase (ORF 1), a mobile protein (ORF2-4) and an envelope protein (ORF 5). ORF 5 of potato virus X synthesizes the envelope protein of the virus and is produced from 0.9 kb of sgRNA and is involved in the intercellular and long-distance migration of the virus in addition to its function in viral particle formation. The antigenic function of the envelope protein appears to be located primarily at the N-terminus, which is consistent with the structure of potato virus X found. It has been reported in several viral groups that envelope proteins have a significant effect on virus proliferation. For potato virus X, the generation of (+)-strand RNA of potato virus X is introduced by introducing a mutation that deletes or prevents the expression of the envelope protein. It is reported that this decreases a lot but does not affect the production of (-)-strand RNA. In addition, the requirement that the envelope protein is required for intercellular migration and systemic infection of the virus has been demonstrated by experiments using mutants that have deleted some or all of the envelope protein. Mutant potato virus X has been reported to have limited transfer within about 50 cells of infected cells when the coat protein is exchanged for another protein. Intramutational movement was restricted when the mutation was introduced, and in the case of N-terminal variation, intercellular movement occurred, but the movement speed and non-mutation occurred considerably slower than the strain and affected the symptoms. These results indicate that the envelope protein of potato virus X is also involved in the intercellular transport of the virus.

담배(N. benthamiana)는 식물 바이러스학에서 실험용 기주 식물로써 광범위하게 사용되고 있으며, 이는 대부분 식물 바이러스의 감염에 감수성을 보이기 때문이다. 담배는 단백질 위치, 상호작용, 또는 식물 발현 및 정제를 위한 식물 기초 시스템 연구 등 식물 생물학에서 특히 인기가 있는데 이는 유전적으로 변형율이나 재생산율이 높고, 유전자 기능을 특성화하기 위해 적용되기 용이하게 때문이다. Tobacco ( N. benthamiana ) is widely used as an experimental host plant in plant virology because most of them are susceptible to infection by plant viruses. Tobacco is particularly popular in plant biology, such as protein location, interaction, or the study of plant-based systems for plant expression and purification because of its genetically high rate of modification or reproduction and its ease of application to characterize gene function.

이하, 본 발명자들은 담배 cDNA 라이브러리를 구성하고 Yeast-Two Hybrid 방 법을 이용하여 cDNA 라이브러리에서부터 감자 바이러스 X의 외피 단백질과 상호 작용하는 기주 인자들을 스크리닝하여 찾아내고, 이러한 기주 단백질이 yeast 및 in vitro, in planta에서 감자 바이러스 X의 외피 단백질과 상호작용한다는 것을 밝히고 본원 발명을 완성하였다. Hereinafter, the present inventors construct a tobacco cDNA library and use the Yeast-Two Hybrid method to find and host host factors that interact with the coat protein of potato virus X from the cDNA library, and the host proteins are yeast and in vitro , in It was found that the planta interacts with the envelope protein of potato virus X and completed the present invention.

본 발명의 목적은 감자 바이러스 X의 외피 단백질과 상호작용하는 담배 식물 유래의 단백질 및 이의 유전자를 제공하기 위한 것이다. It is an object of the present invention to provide proteins from tobacco plant and genes thereof which interact with the envelope protein of potato virus X.

본 발명의 목적은 담배 식물 유래의 유전자의 안티센스 유전자를 포함하는 감자 바이러스 X 증식 억제용 조성물을 제공하기 위한 것이다. An object of the present invention is to provide a composition for inhibiting potato virus X growth comprising an antisense gene of a gene derived from tobacco plants.

본 발명의 목적은 담배 식물 유래의 단백질의 활성을 저해하거나 담배 식물 유래의 유전자 발현을 억제하는 것을 포함하는 감자 바이러스 X 증식 억제 방법을 제공하기 위한 것이다. It is an object of the present invention to provide a method for inhibiting potato virus X proliferation comprising inhibiting the activity of a protein derived from tobacco plants or inhibiting gene expression from tobacco plants.

일 양태로 본 발명은 감자 바이러스 X의 외피 단백질과 상호작용하는 담배 식물 유래의 단백질에 관한 것이다. In one aspect the present invention relates to a protein from tobacco plants that interacts with the envelope protein of potato virus X.

본 발명에서는 Yeast-Two hybrid system을 사용하여 담배 유래의 하나의 단백질을 분리하였고, 그 단백질은 감자 바이러스 X의 외피 단백질과 특이적으로 상호작용하는 것으로 나타났으며, 그 유전자를 NbPCIP 1(N. benthamiana PVX CP-interacting protein 1)라고 명명하였다. In the present invention, a yeast-derived protein was isolated using the Yeast-Two hybrid system, and the protein was shown to specifically interact with the envelope protein of potato virus X. The gene was NbPCIP 1 ( N. benthamiana PVX CP-interacting protein 1).

세포 내에서 일어나는 신호전달, 세포주기, 분화, DNA 복제 및 전사, 번역, 대사 등 거의 모든 반응들은 수많은 단백질의 상호작용을 통해 수행되고 조절되어 진다. 즉 cellular process의 이해는 이들의 조절에 관련되는 주요단백질과 이들 복합체를 구성하는 단백질간의 상호작용을 분석하여 각각의 기능을 밝히고 상대적인 관계를 규명하는데 있다. 따라서 기존에 알려진 단백질과 상호작용하는 새로운 단백질을 찾아내어 알려진 단백질들과의 관계를 밝혀 세포 내에서의 생화학적 현상과 기전을 연구하는 것은 현대생화학, 분자생물학의 주요한 연구대상이 되고 있다.Almost all of the reactions that occur within cells, such as signal transduction, cell cycle, differentiation, DNA replication and transcription, translation, and metabolism, are carried out and regulated through the interaction of numerous proteins. The understanding of cellular processes is to analyze the interactions between the major proteins involved in their regulation and the proteins that make up these complexes, to clarify their function and to determine their relative relationships. Therefore, finding new proteins that interact with known proteins and discovering their relationships with known proteins to study biochemical phenomena and mechanisms in cells has become a major research subject in modern biochemistry and molecular biology.

단백질 간의 상호작용을 연구하는데 있어서 Yeast-Two hybrid system은 효과적인 실험방법이라고 할 수 있다.Yeast-Two hybrid system is an effective method for studying the interaction between proteins.

Yeast-Two hybrid system는 이미 알고 있는 두 단백질간의 상호작용을 확인하고자 할 경우나 이미 알고 있는 단백질과 상호작용 하는 또 다른 단백질을 스크리닝 하고자 할 때 사용할 수 있다. 이 실험 방법은 세포 내에서의 단백질간의 상호작용을 확인하는 방법으로 단백질의 구조변형 없이 발현된다는 장점이 있으며 상대적으로 약한 상호작용도 확인할 수 있다. Yeast-Two hybrid 방법으로 확인된 단백질간의 상호작용은 직접 생물학적 기능과 연관시킬 수 있으며 물리적 상호작용을 저해하는 물질은 실제 세포 내에서의 이들 단백질의 기능에 영향을 줄 것으로 예측할 수 있다. 실질적으로 세포 내에서는 다양한 단백질들이 거대한 복합체를 이루어 기능을 수행하는 만큼 이들 복합체를 조절하는 것은 각각의 단백질들의 활성을 조절하는 방식과는 달리 보다 선택적으로 복합단백질의 기능을 조절할 수 있는 방법을 제시할 수 있다. 또한 Yeast-Two hybrid 방법을 이용할 경우 직접 상호작용에 관여하는 단백질내의 motif나 domain을 사용함으로써 단백질의 상호작용에 관여하 는 특정 부분을 조절하는 새로운 물질을 검색하는데도 이용할 수 있다. 본 발명에서는 특정단백질의 상호작용에 중요한 motif나 domain을 사용하여 이들의 상호작용을 효율적으로 조절할 수 있는 검색계로 Yeast-Two hybrid 방법을 사용하였다.Yeast-Two hybrid systems can be used to check the interaction between two known proteins or to screen for another protein that interacts with a known protein. This test method is a method of confirming the interaction between proteins in cells, which has the advantage of being expressed without structural modification of proteins, and can also identify relatively weak interactions. The interactions between proteins identified by the yeast-two hybrid method can directly correlate with biological functions, and substances that inhibit physical interactions can be expected to affect the function of these proteins in real cells. In practice, as various proteins function in large complexes in cells, regulating these complexes may provide a more selective method of regulating the function of complex proteins, unlike how they regulate the activity of individual proteins. Can be. The Yeast-Two hybrid method can also be used to search for new substances that regulate specific regions involved in protein interactions by using motifs or domains in proteins that directly interact. In the present invention, the Yeast-Two hybrid method is used as a search system that can efficiently control the interactions using motifs or domains important for the interaction of specific proteins.

Yeast two-hybrid assay는 많은 eukaryotic trans-acting transcriptional regulator들이 독립적인 기능을 수행하는, 물리적으로 분리된 domain으로 구성되어 졌다는 사실에 착안하여 이루어진 실험방법이다. 이 regulator들은 특정염기서열로 이루어진 promoter 부위와 결합하는 DNA binding domain과 RNA polymerase II 복합체와 직접적으로 작용하여 transcription에 관여하는 기능을 수행하는 activation domain으로 구성되어 있다. 이들 각 domain은 하나의 단백질을 구성하여 특정 유전자를 발현시킬 수 있는 기능을 수행하게 된다. Yeast two-hybrid assay is based on the fact that many eukaryotic trans-acting transcriptional regulators consist of physically separated domains that perform independent functions. These regulators consist of a DNA binding domain that binds to a promoter region consisting of a specific base sequence and an activation domain that directly interacts with the RNA polymerase II complex to perform transcriptional functions. Each of these domains constitutes a protein to perform a function of expressing a specific gene.

DNA binding domain과 activation domain은 recombinant DNA technology를 통해 물리적으로 분리하여 하나의 기주 내에서 별도로 발현시킬 수 있는데 이 때 이들은 서로 분리되어 있으므로 결합하여 유전자를 발현시킬 수는 없게 된다. 그러나 상호작용이 가능한 두 단백질을 각기 DNA binding domain의 유전자와 activation domain의 유전자에 결합시켜 효모에 도입해 발현시키면 두 단백질의 상호작용에 의해 분리되었던 DNA binding domain과 activation domain이 결합하여 전사와 관련된 기능을 하게 됨으로써 유전자발현이 가능해진다.DNA binding domains and activation domains can be physically separated through recombinant DNA technology and expressed separately within a single host, but these are separated from each other and cannot be combined to express genes. However, when two interactable proteins are introduced into the gene of the DNA binding domain and the gene of the activation domain and introduced into the yeast, the DNA binding domain and the activation domain, which were separated by the interaction of the two proteins, are linked to transcription-related functions. By doing this, gene expression becomes possible.

본 발명에서, 본 발명자는 새로운 담배 cDNA 즉, NbPCIP 1를 분리하였다. NbPCIP 1의 추정 번역 산물(putative translation product)은 Yeast two-hybrid system, in vitro binding assay 및 BiFC assay을 이용함으로써 감자 바이러스 X가 코딩하는 단백질과 상호작용할 수 있음을 밝혀냈다. In the present invention, we isolated a new tobacco cDNA, NbPCIP 1. The putative translation product of NbPCIP 1 was found to interact with the protein encoded by potato virus X using the Yeast two-hybrid system, in vitro binding assay and BiFC assay.

즉, 본 발명의 구체적인 실시 예에서는 Yeast two-hybrid 분석, in vitro binding assay, Bimolecular fluorescent complementation (BiFC) assay를 수행하여 담배 유래의 단백질, NbPCIP 1이 각각 yeast(도 2a), vitro(도 2b-d), planta(도 3) 내에서 감자 바이러스 X 외피 단백질과 상호작용한다는 것을 보여주었다.That is, in a specific embodiment of the present invention Yeast two-hybrid analysis, in vitro binding assay, Bimolecular fluorescent complementation (BiFC) assay was performed to confirm that tobacco-derived protein, NbPCIP 1, interacts with potato virus X envelope protein in yeast (Fig. 2a), vitro (Fig. 2b-d) and planta (Fig. 3), respectively. Showed.

상기 담배 식물 유래의 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 바람직하게는 상기 담배 식물은 N. benthamiana인 것을 특징으로 한다. The tobacco plant-derived protein preferably has an amino acid sequence of SEQ ID NO. In addition, preferably the tobacco plant is characterized in that N. benthamiana .

또한, 본 발명자는 담배 식물 유래의 단백질은 감자 바이러스 X의 복제 및 이동에 관여한다는 것을 밝혀냈다. In addition, the inventors have found that proteins derived from tobacco plants are involved in the replication and migration of potato virus X.

본 발명자는 real-time RT-PCR analysis을 수행함으로써 감자 바이러스 X에 감염되면, 바이러스 감염 초기 단계에 NbPCIP 1의 발현이 증가하고 NbPCIP 1 발현양이 최고조에 이르면 감자 바이러스 X RNA의 축적양도 상당히 증가한다는 것을 보였다(도 4). The inventors conducted real-time RT-PCR analysis to show that when infected with potato virus X, the expression level of NbPCIP 1 increases in the early stage of virus infection and the accumulation of potato virus X RNA increases significantly when the NbPCIP 1 expression peaks. (FIG. 4).

뿐만 아니라, 본 발명자는 NbPCIP 1는 담배에서 감자 바이러스 X 복제에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 밝혔다(도 9). NbPCIP 1의 과발현과 침묵(silencing) 의 징후 발달에 미치는 효과를 결정하기 위해 감자 바이러스 X 접종 후에 NbPCIP 1 과발현 및 침묵 식물의 표현형 변화를 관찰한 결과, NbPCIP 1 과발현 식물의 경우 바이러스 감염 후 심한 괴사 반응을 보이고(도 10 a) 대조군으로 버퍼 접종 후에도 시드는 증상을 보이는 반면(도 10b), NbPCIP 1 유전자 침묵 식물의 경우, 바이러스 접종 및 버퍼 접종 어느 경우에도 특이적인 표현형 상의 차이를 발견할 수가 없었다(도 10c, 도 10d). 이러한 결과들은 NbPCIP 1 과발현이 감자 바이러스 X의 증식에 영향을 미칠 뿐아니라 물리적인 상처에 의해서도 쉽게 감수성의 경향을 띄는 것을 확인할 수 있었다. 또한 대조군으로 정상적인 담배 식물의 잎에서는 심한 모자이크 징후가 나타난 반면(도 10f), NbPCIP 1 유전자 침묵 식물의 잎에서는 약한 모자이크 징후가 나타났다(도 10e). 이러한 결과들을 바탕으로 본 발명자는 NbPCIP 1의 존재가 감자 바이러스 X RNA 복제뿐만 아니라 바이러스 이동에도 직접적이든 간접적이든 양성적으로 영향을 미친다는 것을 밝혔다. In addition, the inventors found that NbPCIP 1 has a positive effect on potato virus X replication in tobacco (FIG. 9). Phenotypic changes in NbPCIP 1 overexpression and silent plants after potato virus X inoculation were determined to determine the effect on NbPCIP 1 overexpression and development of signs of silencing. (FIG. 10 a), the seeding symptoms after the buffer inoculation as a control (FIG. 10 b), whereas in the case of NbPCIP 1 gene silencing plants, no specific phenotypic difference was found in both virus inoculation and buffer inoculation (FIG. 10 b). 10c, FIG. 10d). These results indicate that NbPCIP 1 overexpression not only affects the proliferation of potato virus X but also tends to be susceptible to physical injury. In addition, as a control, severe mosaic signs appeared in the leaves of normal tobacco plants (FIG. 10F), while weak mosaic signs appeared in the leaves of NbPCIP 1 gene silencing plants (FIG. 10E). Based on these results, the inventors found that the presence of NbPCIP 1 positively influences not only potato virus X RNA replication but also virus migration either directly or indirectly.

식물체 내에서 NbPCIP 1의 발현에 따른 감자 바이러스 X 이동과의 관련성을 보다 구체적으로 조사한 결과, 본 발명자들은 NbPCIP 1는 감자 바이러스 X의 이동에도 영향을 미친다는 것을 확인하였다(도 11). As a result of more specifically examining the relationship with potato virus X migration according to the expression of NbPCIP 1 in plants, the inventors confirmed that NbPCIP 1 also affects the movement of potato virus X (FIG. 11).

다른 양태로 본 발명은 감자 바이러스 X의 외피 단백질과 상호작용하는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 담배 식물 유래의 단백질을 코팅하는 것을 특징으로 하는 담배 식물 유래의 유전자에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 담배 식물 유래의 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는다. In another aspect, the invention relates to a gene derived from a tobacco plant, characterized by coating a protein from the tobacco plant having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 interacting with the envelope protein of potato virus X. Preferably, the gene derived from the tobacco plant has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 담배 식물 유래의 유전자에서, 상기 유전자는 상기 아미노산 서열의 단백질을 코딩할 수 있는 어떤 염기서열도 가질 수 있으나, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 담배식물 유래의 유전자인 것이 바람직하다.In the gene derived from the tobacco plant of the present invention, the gene may have any nucleotide sequence capable of encoding the protein of the amino acid sequence, but the gene derived from the tobacco plant, characterized in that it has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 desirable.

상기 NbPCIP 1(N. benthamiana PVX CP-interacting protein 1)의 완전한 뉴클레오타이드 서열은 cDNA 아미노산 단백질을 코딩하는 457 bp을 나타냈다The complete nucleotide sequence of NbPCIP 1 ( N. benthamiana PVX CP-interacting protein 1) showed 457 bp encoding cDNA amino acid protein

또한, 다른 양태로 본 발명은 담배 식물 유래의 유전자의 안티센스 유전자를 포함하는 감자 바이러스 X 증식 억제용 조성물을 제공하기 위한 것이다. In another aspect, the present invention is to provide a composition for inhibiting potato virus X growth comprising an antisense gene of a gene derived from tobacco plants.

상기 "안티센스 유전자”이란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 서열은 담배 식물 유래의 유전자의 mRNA에 상보적이고 담배 식물 유래의 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 담배 식물 유래의 유전자의 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 상기 안티센스 유전자는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 유전자는 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 유전자는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 유전자는 상기 안티센스 유전자의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 유전자는 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다. The "antisense gene" refers to DNA or RNA or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a particular mRNA, and has the characteristic of binding to complementary sequences in the mRNA to inhibit the translation of the mRNA into a protein. The antisense sequence of the present invention means a DNA or RNA sequence that is complementary to mRNA of a gene derived from tobacco plants and capable of binding to mRNA of a gene derived from tobacco plants, and translates mRNA of a gene derived from tobacco plants into translocation into the cytoplasm. may inhibit essential activity on translocation, maturation or any other overall biological function The antisense gene may be modified at the position of one or more bases, sugars or backbones to enhance efficacy. (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5 (3): 343-55, 1995.) The nucleic acid backbone is phosphorothioate, phosphorus It may be modified with a ter, methyl phosphonate, short chain alkyl, cycloalkyl, short chain heteroatomic, heterocyclic intersaccharide linkage, etc. In addition, the antisense gene may include one or more substituted sugar moieties. Antisense genes may include modified bases, including hypoxanthine, 6-methyladenine, 5-me pyrimidine (particularly 5-methylcytosine), 5-hydroxymethylcytosine (HMC), glycosyl HMC, Gentobiosil HMC, 2-aminoadenine, 2-thiouracil, 2-thiothymine, 5-bromouracil, 5-hydroxymethyluracil, 8-azaguanine, 7-deazaguanine, N6 (6- Aminohexyl) adenine, 2,6-diaminopurine, etc. The antisense genes of the present invention are also chemically associated with one or more moieties or conjugates that enhance the activity and cellular adsorption of the antisense genes. Can be combined. Sterol moiety, cholesteryl moiety, cholic acid, thioether, thiocholesterol, aliphatic chain, phospholipid, polyamine, polyethylene glycol chain, adamantane acetic acid, palmityl moiety, octadecylamine, hexylamino-carbonyl-oxy Fat-soluble moieties such as a cholesterol ester moiety, and the like. Oligonucleotides comprising fat-soluble moieties and methods of preparation are already well known in the art (US Pat. Nos. 5,138,045, 5,218,105 and 5,459,255). The modified gene can increase stability to nucleases and increase the binding affinity of the antisense nucleic acid with the target mRNA.

안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제Ⅰ를 이용하는 것이다. In the case of antisense RNA, it may be synthesized in vitro in a conventional manner to be administered in vivo or to allow antisense RNA to be synthesized in vivo. One example of synthesizing antisense RNA in vitro is using RNA polymerase I.

또한, 상기 "안티센스 유전자"는“siRNA”를 포함한다. siRNA는 표적 유전자의 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNA 간섭(RNAi: RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 이중사슬 RNA를 의미하고, 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 (knockdown) 방법 또는 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(mismatch, 대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(bulge, 일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 본 발명의 siRNA는 코필린 mRNA를 특이적으로 감소시킬 수 있으면 서열과 길이는 특별히 제한되지 않는다. In addition, the "antisense gene" includes "siRNA". siRNA refers to a double-chain RNA that can induce RNA interference (RNAi) through cleavage of mRNA of a target gene, and sense RNA strands having complementary sequences with mRNAs of the target gene and complementary thereto. It consists of an antisense RNA strand having a sequence. Since siRNA can inhibit the expression of a target gene, it is provided by an efficient gene knockdown method or gene therapy method. siRNAs are not limited to the complete pairing of double-stranded RNA portions paired with RNA, but mismatches (the corresponding bases are not complementary), bulges (the bases that do not correspond to one chain), and the like. It may include parts that are not paired by. The siRNA of the present invention is not particularly limited in sequence and length as long as it can specifically reduce copilin mRNA.

siRNA 말단 구조는 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단 구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다. 이러한 경우를 shRNA라고 한다. siRNA terminal structures can be either blunt or cohesive. The cohesive end structure can be a three-terminal protruding structure or a five-terminal protruding structure, and the number of protruding bases is not limited. For example, the number of bases may be 1 to 8 bases, preferably 2 to 6 bases. In addition, siRNA is a low-molecular RNA (for example, natural RNA molecules such as tRNA, rRNA, viral RNA or artificial RNA molecules such as tRNA, rRNA, viral RNA, etc.) in a range capable of maintaining the expression inhibitory effect of the target gene. ) May be included. The siRNA terminal structure does not need to have a cleavage structure at both sides, and may be a stem loop type structure in which one terminal portion of the double chain RNA is connected by a linker RNA. The length of the linker is not particularly limited as long as it does not interfere with pairing of stem portions. This case is called shRNA.

상기 shRNA(small hairpin RNA)는 타겟유전자 siRNA 염기서열의 sense와 상 보적인 nonsense 사이에 3-10개의 염기 링커를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후 프라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스 (lentivirus) 및 아데노바이러스 (adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 loop가 있는 헤어핀 구조의 shRNA (short hairpin RNA)가 만들어지고 세포 내의 Dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다. 상기 shRNA는 siRNA에 비해 비교적 장기간 RNAi 효과를 나타낸다.The small hairpin RNA (shRNA) synthesizes oligo DNAs linking 3-10 base linkers between the sense of the target gene siRNA and complementary nonsense, and then clones into a plasmid vector or shRNA is a retrovirus lenti When inserted into and expressed in viruses (lentivirus) and adenovirus (adenovirus), a short hairpin RNA (shRNA) having a hairpin structure with a loop is produced and is converted into siRNA by Dicer in the cell and shows RNAi effect. The shRNA has a relatively long RNAi effect compared to siRNA.

siRNA의 세포내 지속효과 및 트랜스펙션 효과를 증가시키기 위해 siRNA 염기서열을 포함하는 헤어핀구조의 shRNA (small hairpin RNA)를 포함한 발현 컨스트럭트/벡터는 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 미국 출원제2004/106567 및 2004/0086884는 shRNA를 포함하는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터 외에 리포솜 전달 운반체, 플라스미드 주입 시스템, 인공 바이러스 엔벨로프 및 폴리라이신 컨쥬게이트를 포함한 전달 메커니즘 뿐만 아니라 많은 발현 컨스트럭트/벡터 관련 정보를 제공하고 있다.Expression constructs / vectors comprising small hairpin RNAs (shRNAs) including hairpin structures to increase the intracellular and transfection effects of siRNAs are known to those skilled in the art. For example, U.S. applications 2004/106567 and 2004/0086884 provide for delivery mechanisms including liposome delivery vehicles, plasmid injection systems, artificial viral envelopes, and polylysine conjugates in addition to viral vectors comprising shRNA, nonviral vectors. Many expression constructs / vectors are provided.

siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 유전자 전달감염(transfection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-derived siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 유전자 전달 또는 형질도입(transduction) 시키는 방법이 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 실험의 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다. The method of preparing siRNA is a method of directly synthesizing siRNA in vitro, introducing the cell into a cell through a gene transfection process, and an siRNA expression vector or a PCR-derived siRNA expression cassette prepared to express siRNA in a cell. There is a method of gene transfer or transduction into cells. The determination of how to prepare siRNAs and introduce them into cells or animals may depend on the purpose of the experiment and the cellular biological function of the target gene product.

상기 담배 식물 유래 단백질은 감자 바이러스 X의 복제 및 이동을 조절함으로써 궁극적으로 감자 바이러스 X의 증식을 조절할 수 있다. 상기 조성물을 식물체의 형질전환에 사용할 경우, 감자 바이러스 X 감염 식물에서 감자 바이러스 X의 증식이 조절가능한 형질전환체(transcripts)를 얻을 수 있다.The tobacco plant derived protein can ultimately regulate the growth of potato virus X by regulating the replication and migration of potato virus X. When the composition is used for transformation of plants, it is possible to obtain transcripts capable of controlling the growth of potato virus X in potato virus X infected plants.

또한, 다른 양태로 본 발명은 담배 식물 유래의 단백질의 활성을 저해하거나 NbPCIP의 유전자 발현을 억제하는 것을 포함하는 감자 바이러스 X 증식 억제 방법을 제공하기 위한 것이다. In another aspect, the present invention is to provide a method for inhibiting potato virus X proliferation comprising inhibiting the activity of a protein derived from tobacco plants or inhibiting gene expression of NbPCIP.

본 발명에 따르면, NbPCIP1는 감자 바이러스 X의 복제 및 이동에 관여하여 감자 바이러스 X의 감염을 증가 또는 감소 중 어느 하나를 유도할 수 있으므로, 상기 유전자를 이용할 경우, 감자 바이러스 X의 증식이 조절된 형질전환 식물을 생산할 수 있을 것으로 기대된다.According to the present invention, NbPCIP1 may be involved in the replication and migration of potato virus X to induce any one of increasing or decreasing infection of potato virus X. It is expected to be able to produce conversion plants.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for illustrating the present invention, and thus the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.

<실시예 1> 담배Example 1 Tobacco Nicotiana benthamiana Nicotiana benthamiana cDNA library 제작 cDNA library production

담배 cDNA library는 미국의 Stratagene사의 HybriZAP^®2.1 XR library construction kit와 HybriZAP^®2.1 XR cDNA synthesis kit를 이용하여 제작하였다. 파종하고 4주후의 건전한 담배 잎에서부터 Oligotex mRNA kit를 이용하여 Poly (A) mRNA를 추출하였고, 이를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA는 oligo (dT) 프라이머와 일반적인 dATP, dGTP, dTTP와 5-methyl dCTP를 포함한 dNTP mixture를 이용하여 합성되었다. Sepharose CL-2B gel을 사용하여, 합성된 다양한 크기의 cDNA로부터 의미있는 유전자일 것으로 추측되는 약 0.5-2 kb 크기의 cDNA를 얻었고, 이들 약 0.5-2 kb 크기의 cDNA를 HybriZAP^®2.1 벡터에 삽입하여 lambda phage에 넣어 1차 library를 준비하였다. 이렇게 준비된 1차 library는 사용하는데 그 양이 적기 때문에 담배 cDNA가 들어있는 lambda phage를 증식시켜 일정량이 되도록 (10⁸~10¹¹ pfu/ml) 증폭시켰다. Yeast-two hybrid 실험을 수행하기 위해 준비된 담배 cDNA library로부터 in vivo mass excision 방법을 이용하여 담배 cDNA가 삽입되어있는 pAD-GAL4-2.1 클론들을 분리하여 다음 실험에 이용하였다.Tobacco cDNA libraries were constructed using the HybriZAP ^® 2.1 XR library construction kit and the HybriZAP ^® 2.1 XR cDNA synthesis kit from Stratagene, USA. Poly (A) mRNA was extracted from healthy tobacco leaves 4 weeks after sowing using Oligotex mRNA kit, and cDNA was synthesized using this. cDNA was synthesized using oligo (dT) primers and dNTP mixtures containing common dATP, dGTP, dTTP and 5-methyl dCTP. Using the Sepharose CL-2B gel, obtained a cDNA of about 0.5 to 2 kb in size, probably one sense gene from cDNA of a variety of synthetic size, those of about 0.5-2 kb of cDNA insert size on 2.1 HybriZAP ^® vector The primary library was prepared by putting in lambda phage. The primary library prepared in this way is used, but because the amount is small, the lambda phage containing tobacco cDNA was multiplied and amplified to a certain amount (10 ⁸ to 10 ¹¹ pfu / ml). PAD-GAL4-2.1 clones containing tobacco cDNA were isolated from the tobacco cDNA library prepared for the yeast-two hybrid experiment using in vivo mass excision method and used in the next experiment.

<실시예 2> <Example 2> N. benthamianaN. benthamiana cDNA library screening cDNA library screening

PVX CP와 상호작용을 하는 담배 유전자를 선별하기위해, 위와같은 방법으로 제작된 담배 cDNA library를 이용하였다. 감자 바이러스 X 외피 단백질의 유전자는 PVX infectious clone (pSPVX)을 주형으로 하여 PCR 기법을 이용하여 증폭하여 준비하였고, DNA-binding domain이 포함되어있는 pAS2-1 벡터에 EcoR I 제한효소 부위를 이용하여 PVX CP 유전자를 삽입하였다 (PVX CP-BD). PCR 증폭에 사용된 프라이머들은 PVX CP-EcoRI-F와 PVX CP-EcoRI-R이다 (표 3). 이렇게 준비된 PVX CP-BD은 yeast cell (AH109 strain)에 담배 cDNA library에서 얻은, activation domain이 포함되어있는, pAD-GAL4-2.1와 동시에 transformation을 수행하였다 (Yeast two hybrid assay). 만약 PVX CP와 상호작용을 하는 담배유전자가 있으면, 그 유전자들의 결합에 의해 pAS2-1 벡터의 DNA-binding domain이 pAD-GAL4-2.1의 activation domain과 결합하여 yeast 내에 존재하는 selection marker 유전자 (lacZ, HIS3, ADE2)의 promoter를 작동시키게 된다. 따라서 선택배지에서 살아남는 yeast colony들을 취하여 다음 실험에 이용하였다.To select tobacco genes that interact with PVX CP, the tobacco cDNA library prepared as described above was used. The gene of potato virus X coat protein was amplified using PCR technique using PVX infectious clone (pSPVX) as a template, and PVX using EcoR I restriction enzyme site in pAS2-1 vector containing DNA-binding domain. CP gene was inserted (PVX CP-BD). Primers used for PCR amplification are PVX CP-EcoRI-F and PVX CP-EcoRI-R (Table 3). PVX CP-BD thus prepared was transformed simultaneously with pAD-GAL4-2.1, which contains an activation domain, obtained from the tobacco cDNA library in yeast cells (AH109 strain) (Yeast two hybrid assay). If there is a tobacco gene that interacts with PVX CP, the DNA-binding domain of the pAS2-1 vector binds to the activation domain of pAD-GAL4-2.1 by binding the genes, and the selection marker gene ( lacZ, HIS3, ADE2 ) will activate the promoter. Therefore, yeast colonies that survived the selection medium were taken and used in the next experiment.

<실시예 3> NbPCIP의 전체 ORF 유전자 분리Example 3 Whole ORF Gene Isolation of NbPCIP

담배 cDNA library에서 Yeast-two hybrid assay 기법을 이용하여 선별한, PVX CP와 상호작용을 하는 담배 유전자 후보들은 염기서열분석을 통해 각각 유전자의 기능을 유추할 수 있었다. 이들 유전자 중 하나를 선별하여 NbPCIP라고 명명하였다. 이 유전자의 염기서열 분석결과, 특정 부분의 염기서열이 다른 두 개의 유전자를 가지고 있음을 확인하였고, 따라서 각각 NbPCIP1과 NbPCIP2로 다시 명명하였다. 이 유전자의 특성을 구명하기 위해서 NbPCIP1과 NbPCIP2의 전체 ORF 유전자를 얻기로 하였고, 담배 library의 제작 시, 같은 조건의 담배 잎으로부터 Trizol reagent를 이용하여 total RNA을 추출하였고, cDNA는 total RNA, oligo (dT) 프라이머와 dATP, dGTP, dTTP와 dCTP를 포함한 dNTP mixture를 이용하여 합성하였다. PCR 기법을 이용하여 N. benthamiana 으로부터 NbPCIP의 전체 ORF 유전자를 얻기 위해서 프라이머를 제작하였다. NbPCIP 유전자는 기존에 NCBI gene bank에 보고가 된 담배 (N. tabaccum)에서 분리된 유전자 (Tomato mosaic virus(ToMV) CP와 상호작용하는 유전자, IP-L)와 유사성이 높음을 확인하였고, 이 유전자의 염기서열을 참고로 하여 프라이머 (NbPCIP(+2)-EcoRI-F와 NbPCIP-EcoRI-R, 표 3)를 준비하였다 (PCIP1-AD와 PCIP2-AD). 이 프라이머를 이용하여 얻어진 NbPCIP1과 NbPCIP2 유전자는 Yeast-two hybrid assay를 위해, activation domain을 포함하고 있는 pACT2 벡터에 각각 삽입되었다. Tobacco gene candidates interacting with PVX CP, selected by Yeast-two hybrid assay from the tobacco cDNA library, were able to infer the function of each gene through sequencing. One of these genes was selected and named NbPCIP. As a result of sequencing of the gene, it was confirmed that the nucleotide sequence of a specific part has two different genes, and thus, they were renamed NbPCIP1 and NbPCIP2, respectively. In order to elucidate the characteristics of the gene, the total ORF genes of NbPCIP1 and NbPCIP2 were obtained. Total tobacco was extracted from the tobacco leaf under the same conditions using Trizol reagent, and cDNA was total RNA, oligo ( dT) was synthesized using a primer and dNTP mixture including dATP, dGTP, dTTP and dCTP. Primers were prepared to obtain the total ORF gene of NbPCIP from N. benthamiana using PCR technique. The NbPCIP gene was found to have high similarity with the gene isolated from tobacco ( N. tabaccum ), which has been reported to the NCBI gene bank ( Tomato mosaic virus (ToMV) CP interacting gene, IP-L ). The primers (NbPCIP (+2) -EcoRI-F and NbPCIP-EcoRI-R, Table 3) were prepared with reference to the base sequence of (PCIP1-AD and PCIP2-AD). The NbPCIP1 and NbPCIP2 genes obtained using the primers were inserted into pACT2 vectors containing an activation domain for the Yeast-two hybrid assay.

<실시예 4> Yeast-two hybrid assayExample 4 Yeast-two Hybrid Assay

Yeast-two hybrid system의 원리는 다음과 같다. pAS2-1 벡터에는 아미노산 Tryptophan (Trp) 생합성 유전자와 pACT2 벡터에는 아미노산 Leucine (Leu) 생합성 유전자를 가지고 있다. 또한 이 두 벡터에 삽입되어있는 단백질들이 서로 상호작용하여 결합을 하면 yeast 내에 각각 존재하는 Histidine (His), lacZ, adenine (Ade)을 생합성하는 유전자의 promoter를 작동시켜 선택배지에서 살아남는 yeast colony를 선별함으로써 단백질간의 상호작용의 여부를 알 수 있다.The principle of the yeast-two hybrid system is as follows. The pAS2-1 vector contains the amino acid Tryptophan ( Trp ) biosynthesis gene and the pACT2 vector contains the amino acid Leucine ( Leu ) biosynthesis gene. In addition, when the proteins inserted into these two vectors interact with each other and bind to each other, yeast colony that survives the selection medium is selected by activating the promoters of the genes that biosynthesize Histidine ( His ), lacZ and adenine ( Ade ) in yeast. By doing so, it is possible to know whether the proteins interact.

이러한 원리를 이용하여, 선별한 NbPCIP1과 NbPCIP2가 PVX CP와 상호작용을 하는지 다시 yeast 내에서 확인하기위해 앞에서 준비한 PVX CP-BD와 NbPCIP1-AD, NbPCIP2-AD를 yeast strain AH109에 각각 동시에 transformation 하였다. Lithium acetate 방법을 이용하여 yeast에 transformation 하고 -LWHA 선택배지 (Leu, Trp, His, Ade만 결여되어있는 아미노산 배지)와 -LW 선택배지 (Leu과 Trp만 결여되어있는 아미노산 배지)에 이들을 도말하고 확인하였다. (+) control로써 SV40 large Tantigen_(84-708)(pTD1-1)과 murine p53_(72-390)(pVA3-1)을 사용하였고, (-) control로써 human lamine C_(66-230) (pLAM5'-1)을 사용하였다. Using this principle, PVX CP-BD, NbPCIP1-AD, and NbPCIP2-AD prepared above were simultaneously transformed into yeast strain AH109 to confirm whether yeast NbPCIP1 and NbPCIP2 interacted with PVX CP. Transform into yeast using Lithium acetate method and plate and identify them in -LWHA selective medium (amino acid medium lacking only Leu, Trp, His, Ade) and -LW selective medium (amino acid medium lacking only Leu and Trp) It was. SV40 large Tantigen _(84-708) (pTD1-1) and murine p53 _(72-390) (pVA3-1) were used as positive controls and human lamine C _(66-230) (pLAM5 ₎ as negative controls. '-1) was used.

<실시예 5> Example 5 In vitroIn vitro protein binding assay protein binding assay

각각의 단백질을 E. coli내에서 발현시켜 순화한 두 단백질들을 이용하여 이들 단백질간의 상호작용 여부를 In vitro에서 다시 확인하였다. PVX CP에는 6개의 His tag를 붙이고, NbPCIP1에는 maltose binding protein (MBP)를 붙여 in vitro protein binding assay를 수행하였다. PVX CP 유전자는 pSPVX를 주형으로하여 PCR기법을 이용해 증폭하였고, pET28a(+) 벡터에 제한효소 EcoR I 부위를 이용하여 삽입하였다. NbPCIP1의 경우, pNbPCIP1-BD clone을 주형으로하여 증폭하였고, pMAL-c2X 벡터에 제한효서 EcoR I 부위를 이용하여 삽입하였다. NbPCIP1 유전자의 증폭에 이용된 프라이머는 NbPCIP1-EcoRI-F와 NbPCIP1-EcoRI-R이고, PVX CP 유전자 증폭에 이용된 프라이머는 PVX CP-EcoRI-F와 PVX CP-TAA-EcoRI-R이다 (표 3). 100ug의 6개의 His가 달린 PVX CP (PVX CP-His)와 100ug의 MBP가 달린 NbPCIP1 (NbPCIP1-MBP)을 binding buffer (20mM Tris-HCl, pH 4.7, 150mM NaCl, 1mM EDTA) 에 같이 넣고, 1시간동안 4℃에서 rotary shaking incubation 하였다. 대조군으로써, PVX CP-His와 MBP를 같이 incubation 하였다. 1시간 incubation 후, 이들 시료를 원심분리하여 pellet을 취한 후, 얻은 pellet을 washing하기 위해, binding buffer를 넣고 원심분리하여 binding되지 않은 남은 단백질들을 buffer와 함께 씻어내고, pellet을 취하였다. 20ug의 amylose resins binding buffer와 함께 넣고 2시간동안 4℃에서 rotary shaking incubation 하였다. 그다음, 위의 방법으로 binding buffer를 이용하여 5번 반복 washing하였다. 최종적으로 resin과 함께 붙은 단백질들을 13,000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 pellet을 취한 후, 2X Laemmli loading buffer (4% SDS, 20% glycerol, 120mM Tris-HCl, pH6.8, 200mM DTT, 0.1% bromophenol blue)에 녹이고, 100℃에서 5분동안 끓인 후, 12% Acrylamide gel에 전기영동하여 단백질들을 gel 상에서 분리시킨다. Western blot 분석을 하기 위해, gel에 걸려있는 단백질들을 PVDF membrane에 옮긴다. Western blot 분석에서 PVX CP-His를 검정하기 위한 probe로 PVX CP polyclonal antibody를, NbPCIP1-MBP를 검정하기 위한 probe로 MBP monoclonal antibody를 사용하였다. 또한 Biotin/StreptAvidin kit을 이용하여, Western blot 분석을 가시화하였다.Each protein was expressed in E. coli and purified in vitro using the two purified proteins. Six His tags were attached to PVX CP and maltose binding protein (MBP) was attached to NbPCIP1 to perform in vitro protein binding assay. The PVX CP gene was amplified by PCR using pSPVX as a template and inserted into the pET28a (+) vector using the restriction enzyme EcoR I site. In the case of NbPCIP1, pNbPCIP1-BD clones were amplified and inserted into the pMAL-c2X vector using the restriction enzyme EcoR I site. Primers used for amplification of the NbPCIP1 gene are NbPCIP1-EcoRI-F and NbPCIP1-EcoRI-R, and primers used for amplification of the PVX CP gene are PVX CP-EcoRI-F and PVX CP-TAA-EcoRI-R (Table 3 ). Combine 100 ug of 6 His with PVX CP (PVX CP-His) and 100 ug of MBP with NbPCIP1 (NbPCIP1-MBP) in binding buffer (20 mM Tris-HCl, pH 4.7, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA), 1 Rotary shaking incubation was performed at 4 ° C. for a time. As a control, PVX CP-His and MBP were incubated together. After incubation for 1 hour, these samples were pelleted by centrifugation, and then, in order to wash the pellets, the binding buffer was added and centrifuged to wash the remaining unbound proteins with the buffer and pellets were taken. 20ug of amylose resins were added together with the binding buffer and rotary shaking incubation was performed at 4 ° C for 2 hours. Then, repeated washing 5 times using the binding buffer in the above method. Finally, pellets were collected by centrifuging the proteins attached with the resin at 13,000 rpm for 5 minutes, followed by 2X Laemmli loading buffer (4% SDS, 20% glycerol, 120 mM Tris-HCl, pH6.8, 200 mM DTT, 0.1% bromophenol). blue), boiled at 100 ° C. for 5 minutes, followed by electrophoresis on a 12% Acrylamide gel to separate proteins on the gel. For Western blot analysis, proteins suspended in gels are transferred to PVDF membranes. In Western blot analysis, PVX CP polyclonal antibody was used as a probe for assaying PVX CP-His and MBP monoclonal antibody was used as a probe for assaying NbPCIP1-MBP. In addition, Western blot analysis was visualized using the Biotin / StreptAvidin kit.

<실시예 6> Bimolecular fluorescent complementation (BiFC) assayExample 6 Bimolecular fluorescent complementation (BiFC) assay

NbPCIP1과 NbPCIP2가 PVX CP가 식물체내에서 상호작용을 하는지의 여부를 다시 확인하기 위해서, BiFC assay를 수행하였다. 원리는 다음과 같다. To confirm whether NbPCIP1 and NbPCIP2 interact with PVX CP in plants, a BiFC assay was performed. The principle is as follows.

Yellow fluorescent protein (YFP)는 두 개의 도메인을 가지고 있는데, 이 두 도메인이 서로 맞물리는 구조를 형성할 때 노란색 형광을 띄게 된다. 따라서 이러한 단백질 구조의 특성을 이용하여 한 쪽 벡터에는 YFP N-terminal 부분의 도메인 (1-154 아미노산)을 삽입하여 발현시키고, 다른 벡터에는 나머지 C-terminal 부분의 도메인 (155-238 아미노산)을 삽입하여 각각의 벡터를 준비한다. 이렇게 준비된 두 벡터에 각각 상호작용을 하는 단백질을 삽입하고 식물체내에 단백질 발현을 시켜 만약, 이들 단백질들이 상호작용을 식물체내에서 하게 되면, 이 두 단백질의 결합에 의해서 서로 떨어져있던 YFP의 두 도메인이 만나게 되면서 노란 형광을 띄게 된다. 이러한 원리를 이용하여, NbPCIP1와 NbPCIP2 유전자를 각각 pNbPCIP1-AD과 pNbPCIP2-AD를 주형으로하여, 프라이머 Hisx6 NbPCIP-BF와 NbPCIP1-BR 또는 NbPCIP2-BR을 이용하여 증폭하여 YFP의 N-terminal 도메인이 삽입되어있는, 단백질 발현 벡터인, pPZP212 벡터에 StuI 제한효소 위치를 이용하여 삽입하였다 (각각 pNbPCIP1-NYFP과 pNbPICP2-NYFP). 본 실험실에서 BiFC assay를 수행하기 위해 pPZP212 벡터에 Tobacco etch virus (TEV) translation leader (TL) sequence와 sGFP 유전자를 삽입하여 이용하였다. 또한, PVX CP 유전자는 pPVX CP-BD를 주형으로 하고, Hisx6 PVX CP-BF와 PVX CP-BR 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하여 YFP C-terminal 부분의 도메인이 삽입되어있는 pPZP212 벡터에 삽입하였다 (pPVX CP-CYFP). positive control과 negative control은 각각 pToMV CP-CYFP와 pCMV CP-CYFP를 사용하였다. ToMV CP 유전자와 Cucumber mosaic virus (CMV) CP 유전자는 각각 pToMV CP-BD와 pCR3(+)을 주형으로하고, Hisx6 ToMV CP-BF, ToMV CP-BR과 Hisx6 CMV CP-BF, CMV CP-BR 프라이머를 이용하여 증폭하였고, 이들 유전자를 YFP 의 C-terminal 부분의 도메인이 삽입되어있는 벡터에 삽입하였다 (pToMV CP-CYFP, pCMV CP-CYFP). 이렇게 준비된 clone들은 각각 agrobacterium GV2260에 transformation시키고, clone이 들어간 GV2260 콜로니를 취해 선택 항생제가 들어있는 YEP 배지에서 하루 동안 키우고, 원심분리기를 이용하여 배지를 버리고, MMA medium (10mM MES salt (pH5.6), 10mM MgCl₂ and 200M acetosyringone) 에 GV2260 pellet을 풀어서 OD₆₀₀에서 0.7이 되도록 맞춘다. 30℃에서 2-4시간 incubation한다. 식물체 내에서 외래유전자 또는 이미 가지고 있는 유전자의 과발현이 일어나면, 자체적으로 그 유전자를 제거하게 된다. 이를 유전자 침묵 (gene silencing)이라고 하는데, 이런 현상을 막기 위해서 본 실험에서는 gene silencing 현상을 차단하는 suppressor 역할을 하는, Tomato bushy stunt virus (TBSV)에 존재하는 p19 (pTBSV-p19)를 이용하였다. MES 배지에서 키운 각 clone이 들어있는 GV2260 현탁액에 pTBSV-p19를 1:1의 비율로 섞은 후, 담배 N. benthamiana 잎에 agro-infiltration하고, 3일 지난 후 GPF 발현을 형광현미경으로 관찰하였다.Yellow fluorescent protein (YFP) has two domains, which become yellow when they form interlocking structures. Therefore, by using the characteristics of this protein structure, one vector is inserted by expressing the domain of the YFP N-terminal portion (1-154 amino acids) and the other vector is inserted with the domain of the remaining C-terminal portions (155-238 amino acids). To prepare each vector. By inserting the interacting proteins into the two vectors thus prepared and expressing the protein in the plant, if these proteins interact in the plant, the two domains of YFP, which are separated from each other by the two proteins, meet. Yellow fluorescence becomes. Using this principle, the NbPCIP1 and NbPCIP2 genes were templated using pNbPCIP1-AD and pNbPCIP2-AD, respectively, and amplified using primers Hisx6 NbPCIP-BF and NbPCIP1-BR or NbPCIP2-BR to insert the N-terminal domain of YFP. The pPZP212 vector, a protein expression vector, was inserted using StuI restriction enzyme sites (pNbPCIP1-NYFP and pNbPICP2-NYFP, respectively). To carry out the BiFC assay, the Tobacco etch virus (TEV) translation leader (TL) sequence and sGFP gene were inserted into the pPZP212 vector. In addition, the PVX CP gene is a pPVX CP-BD template, amplified by PCR using Hisx6 PVX CP-BF and PVX CP-BR primers and inserted into the pPZP212 vector in which the domain of the YFP C-terminal region is inserted ( pPVX CP-CYFP). The positive and negative controls were pToMV CP-CYFP and pCMV CP-CYFP, respectively. The ToMV CP gene and the Cucumber mosaic virus (CMV) CP gene are based on pToMV CP-BD and pCR3 (+), respectively, Hisx6 ToMV CP-BF, ToMV CP-BR and Hisx6 CMV CP-BF, and CMV CP-BR primers. The genes were amplified by using the genes inserted into the vector into which the domain of the C-terminal portion of YFP was inserted (pToMV CP-CYFP, pCMV CP-CYFP). The clones thus prepared were each transformed into agrobacterium GV2260, take GV2260 colonies containing clones, grow on YEP medium containing the selected antibiotics for one day, discard the medium using a centrifuge, and remove MMA medium (10 mM MES salt (pH5.6) GV2260 pellet in 10mM MgCl ₂ and 200M acetosyringone) and set to OD ₆₀₀ at 0.7. Incubate at 30 ° C. for 2-4 hours. When overexpression of a foreign gene or a gene already in the plant occurs, the gene is removed by itself. This is called gene silencing. In order to prevent this phenomenon, we used p19 (pTBSV-p19) present in Tomato bushy stunt virus (TBSV), which acts as a suppressor to block gene silencing. PTBSV-p19 was mixed at a ratio of 1: 1 in GV2260 suspension containing each clone grown in MES medium, and then agro-infiltration to tobacco N. benthamiana leaves, and after 3 days, GPF expression was observed by fluorescence microscopy.

<실시예 7> <Example 7> N. benthamianaN. benthamiana protoplasts 및 epidermal cells 내에 NbPCIP1-sGFP 및 PVX CP-RFP의 세포 이하의 위치 Subcellular location of NbPCIP1-sGFP and PVX CP-RFP in protoplasts and epidermal cells

식물체 내에서 NbPCIP1이 단독으로 발현될 때, 또는 PVX CP가 존재할 때, 어느 기관으로 이동하는지를 알아 보기 위해서, sGFP 유전자가 붙어있는 NbPCIP1 (pNbPCIP1-sGFP)와 RFP 유전자가 붙어있는 PVX CP (pPVX CP-RFP)를 준비하였다. pNbPCIP1-BD를 주형으로, NbPCIP1-BF와 NbPCIP1-BR 프라이머를 이용하여 NbPCIP1 유전자를 PCR로 증폭하여 sGFP 유전자가 삽입되어있는 pPZP121 벡터에 Stu I 제한효소 위치를 이용하여 삽입하였다. PVX CP 유전자는 pSPVX를 주형으로하여, attPVX CP-F와 attPVX CP-R 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭한 유전자를 recombination 방법으로 RFP 유전자가 삽입되어있는 pSITE-4CA 벡터에 삽입하였다. Endoplasmic reticulum (ER)으로 이동하는 ER retention signal인 Histidine-Aspartate-Glutamate-Leucine (HDEL)을 삽입하고 있는 pRFP-ER을 ER marker로써 사용하였다. 모든 과발현 벡터는 CaMV 35S promoter의 조절에 의해 작동되는 벡터들이다. 이들 clone은 agrobacterium GV2260에 transformation되었고, 이들을 하루 동안 선택 항생제가 들어있는 YEP 배지에서 키운 후, OD₆₀₀에서 0.7이 되도록 MMA medium으로 녹인다. 30℃에서 2-4시간 incubation 하고 난 후, 담배 잎에 agro-infiltration하여 접종한다. 이때 silencing suppressor인 TBSV p19과 함께 pNbPCIP1-sGFP, pNbPCIP1-sGFP와 pPVX CP-RFP을 각각 담배 잎에 agro-infiltration하고 3일 후에 담배 잎에서부터 세포벽분해효소 (10% manitol, 0.25g cellulose, 25mg macerase, 25mg BSA)를 처리하여 원형질체 (protoplast)를 분리하여 NbPCIP1 단백질의 이동 위치를 PVX CP의 유무를 비교하여 원형질체와 담배 잎을 형광현미경으로 관찰하였다. 또한 NbPCIP1 단백질이 ER로 위치한다는 것을 관찰하기 위해, TBSV p19과 pRFP-ER함께 pNbPCIP1-sGFP를 담배 잎에서 agro-infiltration방법으로 접종하여 3일 후에 형광현미경으로 관찰하였다.NbPCIP1 (pNbPCIP1-sGFP) to which the sGFP gene is attached and PVX CP (pPVX CP-) to which the RFP gene is attached to find out which organs move to NbPCIP1 alone or when PVX CP is present in the plant. RFP) was prepared. pNbPCIP1-BD was used as a template, and NbPCIP1 gene was amplified by PCR using NbPCIP1-BF and NbPCIP1-BR primers and inserted into the pPZP121 vector containing the sGFP gene using Stu I restriction enzyme position. The PVX CP gene was used as the template for pSPVX, and the PCR amplified genes were inserted into the pSITE-4CA vector in which the RFP gene was inserted by recombination using attPVX CP-F and attPVX CP-R primers. PRFP-ER containing Histidine-Aspartate-Glutamate-Leucine (HDEL), an ER retention signal that moves to endoplasmic reticulum (ER), was used as an ER marker. All overexpression vectors are vectors driven by the regulation of the CaMV 35S promoter. These clones were transformed into agrobacterium GV2260, and they were grown on YEP medium containing the selected antibiotics for one day and then dissolved in MMA medium from OD ₆₀₀ to 0.7. After incubation at 30 ° C. for 2-4 hours, inoculate the leaves with agro-infiltration. At this time, pNbPCIP1-sGFP, pNbPCIP1-sGFP and pPVX CP-RFP together with silencing suppressor TBSV p19 were agro-infiltered onto tobacco leaves, and after 3 days, cell wall enzymes (10% manitol, 0.25g cellulose, 25mg macerase, 25 mg BSA) was used to isolate protoplasts and compare the presence or absence of NbPCIP1 protein with PVX CP. The protoplasts and tobacco leaves were observed by fluorescence microscopy. In addition, in order to observe that the NbPCIP1 protein is located in the ER, pNbPCIP1-sGFP together with TBSV p19 and pRFP-ER were inoculated by agro-infiltration method on tobacco leaves and observed by fluorescence microscope after 3 days.

<실시예 8> Quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR) analysisExample 8 Quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR) analysis

건전 담배 (Mock)와 PVX 감염된 담배 (PVX-infected)에서 total RNA를 Trizol reagent를 사용하여 추출하였다. genomic DNA를 완전하게 제거하기 위해 TURBO DNA-free^TM을 이용하여 제거하고 M-MuLV reverse transcriptase와 oligo (dT) 3' 프라이머를 사용하여 NbPCIP1 mRNA의 발현양을 측정하기 위한 cDNA를 합성하였다. PVX RNA 증식량을 측정하기 위해 M-MuLV reverse transcriptase와 PVX (510-490)-R 프라이머를 사용하여 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR을 수행하기 위해, SYBR Green 방법으로, NbPCIP1 mRNA의 발현양은 NbPCIP1 (199-215)-F와 NbPCIP1 (316-297)-R 프라이머를, PVX RNA의 증식량은 PVX (44-60)-F와 PVX (161-145)-R 프라이머를 이용하여 측정하였고, 장비는 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System 모델을 사용하였다. 두 개의 endogenous reference gene (항상 일정량이 발현되는 유전자), ubiquitin 3 (ubi3)와 elongation factor 1a (EF-1)을 사용하여 각각의 cDNA의 양을 동일하게 보정하였다 (normalization). Total RNA was extracted from healthy tobacco (Mock) and PVX infected tobacco (PVX-infected) using Trizol reagent. To completely remove genomic DNA, TURBO DNA-free ^TM was used to remove cDNA to measure the expression level of NbPCIP1 mRNA using M-MuLV reverse transcriptase and oligo (dT) 3 'primer. To measure PVX RNA proliferation, cDNA was synthesized using M-MuLV reverse transcriptase and PVX (510-490) -R primers. In order to perform qRT-PCR, by SYBR Green method, the expression level of NbPCIP1 mRNA was NbPCIP1 (199-215) -F and NbPCIP1 (316-297) -R primer, and the amount of PVX RNA was PVX (44-60). Measured using -F and PVX (161-145) -R primers, the instrument was used Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System model. Two endogenous reference genes (always expressed in constant amounts), ubiquitin 3 (ubi3) and elongation factor 1a (EF-1) were used to equalize each cDNA.

reference gene을 이용하여 normalization 하는 이유는 각 cDNA에서 mRNA의 측정량을 비교하기 위해서는 기준점이 필요하다. 이때 어떤 조건에서도 늘 동일한 양이 발현되는 reference gene을 기준으로 하여, 내가 원하는 유전자의 mRNA를 정확하게 비교할 수 있다. The reason for normalization using a reference gene is that a reference point is needed to compare the measured amount of mRNA in each cDNA. At this time, based on the reference gene that is always expressed in the same amount under any condition, I can compare the mRNA of the gene I want accurately.

각 실험의 결과 data 값은 threshold cycle (C_t) 값으로 나타내었고, 3번 반 복실험을 하여, 평균값을 나타내었다. 최종 data 값은 각각 C_t 값에서 reference gene인 ubi3의 값을 빼서 normalization 하였고 (△C_t), 다시 이 값들을 각 set의 0dpi (buffer 또는 PVX를 접종한지 0시간 지난 시료, Mock) 시료의 C_t 값으로 빼준 값 (△△C_t)을 나타내었다. 즉, 0dpi 시료의 값을 기준 (1) 으로 하여 다른 시료들의 값을 다시 보정하였다 (calibration). 이들 계산 값은 Applied Biosystem Detection v1.3.1 software에 의해 분석되었다. NbPCIP1의 mRNA 발현양을 EF-1의 mRNA 발현양과 상대비교하여 나타내었다. 또한, NbPCIP1의 over-expression 또는 silencing시킨 시료들도 같은 방법으로 발현양을 분석하였고, calibration 시료로는 각각 11dpi (silencing 시킨지 11일 후) 와 3dpi (over-expression 시킨지 3일 후)를 사용하였다. 단일 가닥의 PCR 산물과 사용한 프라이머의 dimer 형성여부는 melt curve로 확인하여 Real-time PCR을 수행하는데 적합한 프라이머임을 확인하였고 이 프라이머를 이용해 단일 가닥 PCR product를 얻었음을 확인하였다. 모든 실험은 각 시점에서부터 적어도 한번에 세 개체 이상의 식물을 이용하여 각각 3 반복씩 3번 실험을 수행하여 얻은 데이터 값이다. The data value of each experiment was represented by the threshold cycle (C _t ) value, and the average value was repeated three times. The final data value was normalized by subtracting the reference gene ubi3 from each C _t value (△ C _t ), and then resetting these values to 0dpi (sample after 0 hours of inoculation of buffer or PVX, Mock) of the sample. _The value subtracted by the _t value (ΔΔC _t ) is shown. That is, based on the value of the 0 dpi sample (1), the values of the other samples were again calibrated. These calculated values were analyzed by Applied Biosystem Detection v1.3.1 software. The mRNA expression level of NbPCIP1 was shown relative to the mRNA expression level of EF-1. In addition, NbPCIP1 over-expression or silencing samples were analyzed for the expression level, and 11dpi (11 days after silencing) and 3dpi (3 days after over-expression) were used as calibration samples, respectively. It was. Dimer formation of the single-stranded PCR product and the used primer was confirmed by the melt curve to confirm that the primer was suitable for performing real-time PCR, and it was confirmed that a single-stranded PCR product was obtained using this primer. All experiments are data values obtained by performing three experiments, each of three replicates, using at least three plants at least once from each time point.

<실시예 9> NbPCIP1의 일시적 과발현Example 9 Temporary Overexpression of NbPCIP1

sGFP가 붙어있지 않은 NbPCIP1 over-expression clone (pNbPCIP1)을 준비하여, N. benthamiana 담배식물에 접종하여 과발현을 시켰다. pNbPCIP1-BD를 주형으로하여, NbPCIP1-BF와 NbPCIP1-BR 프라이머를 이용하여 NbPCIP1의 전체 ORF를 PCR 기법으로 증폭하였고, 증폭된 평활말단 (blunt-end) NbPCIP1 PCR 산물을 sGFP를 제거한 pPZP212 벡터에 Stu I과 Nru I 제한효소 위치를 이용하여 cloning하였다. pNbPCIP1 clone은 agrobacterium GV2260에 transformation되었고, 이들을 하루 동안 선택 항생제가 들어있는 YEP 배지에서 키운 후, OD₆₀₀에서 0.7이 되도록 MMA medium으로 녹인다. 30℃에서 2-4시간 incubation 하고 난 후, 담배 잎에 agro-infiltration하여 접종한다. 이때 silencing suppressor인 TBSV p19과 함께 pNbPCIP1을 접종하고 3일 후에 PVX를 접종하여 PVX를 접종한 시점으로 하여 각각 0일, 1일, 2일 후에 담배 잎을 수확하였다. 대조군으로 pPZP212 벡터를 사용하였다.NbPCIP1 over-expression clone (pNbPCIP1) without sGFP was prepared and overexpressed by inoculating N. benthamiana tobacco plants. Using pNbPCIP1-BD as a template, the whole ORF of NbPCIP1 was amplified by PCR using NbPCIP1-BF and NbPCIP1-BR primers, and the amplified blunt-end NbPCIP1 PCR product was studded with pPZP212 vector without sGFP. Cloning was performed using I and Nru I restriction sites. pNbPCIP1 clones were transformed into agrobacterium GV2260, grown on YEP medium containing selective antibiotics for one day, and then dissolved in MMA medium from OD ₆₀₀ to 0.7. After incubation at 30 ° C. for 2-4 hours, inoculate the leaves with agro-infiltration. At this time, pNbPCIP1 was inoculated with TBSV p19, a silencing suppressor, and PVX was inoculated 3 days later to inoculate PVX. Tobacco leaves were harvested after 0, 1 and 2 days, respectively. PPZP212 vector was used as a control.

<실시예 10> NbPCIP1의 Transgene silencingExample 10 Transgene silencing of NbPCIP1

NbPCIP1의 silencing을 유도하기 위해서, NbPCIP1 유전자의 일부분 (162-465nt)을 PCR로 증폭하여 일렬로 세 개를 sGFP 제거된 pPZP212 벡터 또는 sGFP-pPZP212 벡터에 각각 삽입하였다 (pNbP3 or pNbP3-sGFP). NbPCIP1 유전자의 이 부분을 증폭하기 위해 NbP-BF와 NbPCIP1-BR 프라이머를 이용하였고, sGFP 제거된 pPZP212 벡터 또는 sGFP-pPZP212 벡터에 각각 Stu I과 Stu I, Nru I 제한효소 위치를 이용하여 삽입하였다. pNbP3 또는 pNbP3-sGFP clone들은 agrobacterium GV2260에 transformation되었고, 이들을 하루 동안 선택 항생제가 들어있는 YEP 배지에서 키운 후, OD₆₀₀에서 0.7이 되도록 MMA medium으로 녹인다. 30℃에서 2-4시간 incubation 하고 난 후, 담배 잎에 agro-infiltration하여 접종한다. 이때 pNbP3 또는 NbP3-sGFP을 각각 접종하고 silencing이 일어난 11일 후에 PVX를 접종하고 PVX를 접종한 시점으로 하여 각각 0일, 1일, 2일 후에 담배 잎을 수확하였다. 대조군으로는 pPZP212 벡터 또는 pPZP212-sGFP를 사용하였다.To induce silencing of NbPCIP1, a portion of the NbPCIP1 gene (162-465nt) was amplified by PCR and inserted into the sGFP-depleted pPZP212 vector or sGFP-pPZP212 vector (pNbP3 or pNbP3-sGFP), respectively. NbP-BF and NbPCIP1-BR primers were used to amplify this portion of the NbPCIP1 gene and inserted into sGFP-removed pPZP212 vector or sGFP-pPZP212 vector using Stu I, Stu I and Nru I restriction enzyme positions, respectively. pNbP3 or pNbP3-sGFP clones were transformed into agrobacterium GV2260 and grown on a YEP medium containing selective antibiotics for one day and then dissolved in MMA medium to OD ₆₀₀ to 0.7. After incubation at 30 ° C. for 2-4 hours, inoculate the leaves with agro-infiltration. At this time, pNbP3 or NbP3-sGFP was inoculated respectively, and 11 days after silencing, PVX was inoculated and PVX was inoculated at 0, 1 and 2 days after harvesting tobacco leaves, respectively. As a control, pPZP212 vector or pPZP212-sGFP was used.

<실시예 11> <Example 11> N. benthamianaN. benthamiana plants 내 PVX 이동의 검출 Detection of PVX Movement in Plants

NbPCIP1의 발현여부에 따른 PVX 바이러스의 이동을 식물체에서 관찰하기 위해서, PVX infectious clone (pSPVX)에 sGPF를 삽입 (pSPVX-sGFP)하여 GFP 형광을 이용하여 이동여부를 육안으로 확인하였다. pSPVX clone 역시 GV2260에 transformation시켰고, 위에서 언급한대로 각각 NbPCIP1을 over-expression 또는 silencing시킨 후, pSPVX-sGFP를 접종 (agro-infiltration) 하여 접종한 시점으로부터 5일 후에 Dark reader^TM Hand Lamp HL28T UV Lamp를 이용하여 NbPCIP1의 발현양에 따른 바이러스의 이동을 GFP 형광을 통해 관찰하였다. In order to observe the migration of PVX virus according to the expression of NbPCIP1 in plants, sGPF was inserted into the PVX infectious clone (pSPVX) (pSPVX-sGFP) and visually confirmed by migration using GFP fluorescence. pSPVX clone was also transformed to GV2260, using the Dark reader ^TM Hand Lamp HL28T UV Lamp 5 days after inoculation (agro-infiltration) of pSPVX-sGFP after over-expression or silencing NbPCIP1, respectively, as described above. The migration of virus according to the expression level of NbPCIP1 was observed through GFP fluorescence.

<실시예 12> 컴퓨터를 이용한 세포 이하의 위치 분석 Example 12 Subcellular Position Analysis Using a Computer

NbPCIP1에서의 subcellular localization signal을 찾기 위해 PSORT software를 이용하여 아미노산 서열의 motif를 예측하였다. 이 결과를 토대로 NbPCIP1 3'쪽 말단에 ER로 위치이동 되는 signal임으로 추측되는 motif를 찾았다.To find the subcellular localization signal in NbPCIP1, the PSORT software was used to predict the amino acid sequence motif. Based on these results, we found a motif that is supposed to be a ER-positioned signal at the 3 'end of NbPCIP1.

<실시예 13> 통계학적 분석(Statistical analysis)Example 13 Statistical Analysis

수치화한 데이터는 분산분석법 (ANOVA)과 최소유의차검정법 (Fisher's LSD test)을 이용하여 각각의 값들이 의미있는 값인지에 대해 검정하였다. The quantified data were analyzed using ANOVA and Fisher's LSD test to determine whether each value was meaningful.

도 1은 NbPCIP1와 기타 가능성 있는 orthologs 아미노산 서열의 배열을 도시한 것이다. 1 depicts the arrangement of NbPCIP1 and other possible orthologs amino acid sequences.

도 2는 NbPCIP1와 PVX CP 간의 상호작용을 도시한 것이다. 2 illustrates the interaction between NbPCIP1 and PVX CP.

도 3은 planta 내에서 NbPCIP1와 PVX CP 간의 상호작용에 대한 Bimolecular fluorescent complementation (BiFC) assay 결과이다. 3 shows the results of Bimolecular fluorescent complementation (BiFC) assay on the interaction between NbPCIP1 and PVX CP in planta.

도 4는 바이러스 감염된 N. benthamiana 식물과 건전한 N. benthamiana 식물 내의 NbPCIP1와 PVX CP 축적을 나타낸 것이다. 4 shows NbPCIP1 and PVX CP accumulation in virus infected N. benthamiana plants and healthy N. benthamiana plants.

도 5는 N. benthamiana의 agro-filtration 을 위해 사용된 일시적 과발현과 유전자 침묵 구조도를 나타낸 것이다.Figure 5 shows the transient overexpression and gene silencing structure used for agro-filtration of N. benthamiana .

도 6은 N. benthamiana protoplasts 내의 NbPCIP1와 PVX CP 위치를 나타낸 것이다. Figure 6 shows NbPCIP1 and PVX CP positions in N. benthamiana protoplasts.

도 7은 N. benthamiana epidermal cells의 ER 또는 ER-associated granular-like structure 내의 NbPCIP1-sGFP 위치를 나타낸 것이다. Figure 7 shows NbPCIP1-sGFP position in the ER or ER-associated granular-like structure of N. benthamiana epidermal cells.

도 8은 N. benthamiana protoplasts 내의 sGFP 유전자가 붙어있는 NbPCIP1 (pNbPCIP1-sGFP)와 RFP 유전자가 붙어있는 PVX CP (pPVX CP-RFP)의 co-localization을 나타낸 것이다.8 shows co-localization of NbPCIP1 (pNbPCIP1-sGFP) with sGFP gene and PVX CP (pPVX CP-RFP) with RFP gene in N. benthamiana protoplasts.

도 9는 NbPCIP1가 과발현된 N. benthamiana 식물과 침묵된 N. benthamiana 식물 내 NbPCIP1 mRNA 와 PVX RNA 축적을 나타낸 것이다. Figure 9 shows NbPCIP1 mRNA and PVX RNA accumulation in N. benthamiana plants overexpressed NbPCIP1 and silenced N. benthamiana plants.

도 10은 NbPCIP1가 과발현된 N. benthamiana 식물과 침묵된 N. benthamiana 식물 내 PVX를 접종하여 식물의 변화를 나타낸 것이다. Figure 10 shows the change of plants inoculated with PVX in N. benthamiana plants overexpressed NbPCIP1 and silent N. benthamiana plants.

도 11은 PVX 감염된 N. benthamiana 식물 내 바이러스 PVX 이동에 관한 NbPCIP1의 영향을 나타낸 것이다.11 shows the effect of NbPCIP1 on viral PVX migration in PVX infected N. benthamiana plants.

<110> SNU R&DB Foundation <120> novel protein from N. benthamiana interacting Potato virus X coat protein <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 456 <212> DNA <213> Nicotiana benthamiana <400> 1 atggttctcc aaactcaact tgggctgaac aagcaccaat cctacgctca cgaacaaaac 60 tactattgcg atagcagcca tggcggctct atgcaaatga caaggccttc gggctattcg 120 accttgccat atggtcagtc cactcacaac cacatgatga tgggtcatgg tggccaacac 180 catggcggac cctatggcgg tcatggccat ggccatggcg gacactatgg tagtcatgga 240 catcatgggg cgcatatgcc ccatgactcc accaactttt caagcagcac caatatggtc 300 catagtgatg gtggctatgg aagtggaatg gaacaatcta cccatatggg catggggtcg 360 accaattatc aaggccatgg ttatggtggc agccacccta gtcagtacag ccagagccag 420 aagctcaact gggcacttaa ggatctggag gaataa 456 <210> 2 <211> 151 <212> PRT <213> Nicotiana benthamiana <400> 2 Met Val Leu Gln Thr Gln Leu Gly Leu Asn Lys His Gln Ser Tyr Ala 1 5 10 15 His Glu Gln Asn Tyr Tyr Cys Asp Ser Ser His Gly Gly Ser Met Gln 20 25 30 Met Thr Arg Pro Ser Gly Tyr Ser Thr Leu Pro Tyr Gly Gln Ser Thr 35 40 45 His Asn His Met Met Met Gly His Gly Gly Gln His His Gly Gly Pro 50 55 60 Tyr Gly Gly His Gly His Gly His Gly Gly His Tyr Gly Ser His Gly 65 70 75 80 His His Gly Ala His Met Pro His Asp Ser Thr Asn Phe Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Asn Met Val His Ser Asp Gly Gly Tyr Gly Ser Gly Met Glu Gln 100 105 110 Ser Thr His Met Gly Met Gly Ser Thr Asn Tyr Gln Gly His Gly Tyr 115 120 125 Gly Gly Ser His Pro Ser Gln Tyr Ser Gln Ser Gln Lys Leu Asn Trp 130 135 140 Ala Leu Lys Asp Leu Glu Glu 145 150 <110> SNU R & DB Foundation <120> novel protein from N. benthamiana interacting Potato virus X coat protein <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 456 <212> DNA <213> Nicotiana benthamiana <400> 1 atggttctcc aaactcaact tgggctgaac aagcaccaat cctacgctca cgaacaaaac 60 tactattgcg atagcagcca tggcggctct atgcaaatga caaggccttc gggctattcg 120 accttgccat atggtcagtc cactcacaac cacatgatga tgggtcatgg tggccaacac 180 catggcggac cctatggcgg tcatggccat ggccatggcg gacactatgg tagtcatgga 240 catcatgggg cgcatatgcc ccatgactcc accaactttt caagcagcac caatatggtc 300 catagtgatg gtggctatgg aagtggaatg gaacaatcta cccatatggg catggggtcg 360 accaattatc aaggccatgg ttatggtggc agccacccta gtcagtacag ccagagccag 420 aagctcaact gggcacttaa ggatctggag gaataa 456 <210> 2 <211> 151 <212> PRT <213> Nicotiana benthamiana <400> 2 Met Val Leu Gln Thr Gln Leu Gly Leu Asn Lys His Gln Ser Tyr Ala 1 5 10 15 His Glu Gln Asn Tyr Tyr Cys Asp Ser Ser His Gly Gly Ser Met Gln 20 25 30 Met Thr Arg Pro Ser Gly Tyr Ser Thr Leu Pro Tyr Gly Gln Ser Thr 35 40 45 His Asn His Met Met Met Gly His Gly Gly Gln His His Gly Gly Pro 50 55 60 Tyr Gly Gly His Gly His Gly His Gly Gly His Tyr Gly Ser His Gly 65 70 75 80 His His Gly Ala His Met Pro His Asp Ser Thr Asn Phe Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Asn Met Val His Ser Asp Gly Gly Tyr Gly Ser Gly Met Glu Gln 100 105 110 Ser Thr His Met Gly Met Gly Ser Thr Asn Tyr Gln Gly His Gly Tyr 115 120 125 Gly Gly Ser His Pro Ser Gln Tyr Ser Gln Ser Gln Lys Leu Asn Trp 130 135 140 Ala Leu Lys Asp Leu Glu Glu 145 150

Claims

Tobacco plant ( Nicotiana ) interacts with coat protein (CP) of Potato virus X (PVX) benthamiana ) protein.

According to claim 1, wherein the tobacco plant-derived protein is a tobacco plant-derived protein, characterized in that having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

The method of claim 1, wherein the tobacco plant is N. benthamiana Protein derived from tobacco plants, characterized in that the.

The protein from tobacco plants according to claim 1, wherein the protein from tobacco plants is involved in the replication and migration of potato virus X.

A tobacco plant-derived gene, characterized by coating a protein from tobacco plants having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 interacting with the envelope protein of potato virus X.

According to claim 5, The tobacco plant-derived gene is a tobacco plant-derived gene, characterized in that it has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

Potato virus X growth inhibition composition comprising the antisense gene of the gene of claim 5.

Method for inhibiting potato virus X proliferation comprising inhibiting the activity of the protein of claim 1 or the gene expression of claim 5.